Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 18

С Т Р .  18
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  27
— Валидирането на всички методи за откриване,
описани по-долу, е базирано на тестването на проби
от по 200 клубена.
— Картофеният извлек (мацерат), описан по-долу,
може също да бъде използван за откриване на бак-
терията на кафявото гниене по картофите—Ralstonia
solanacearum.
Незадължителна предварителна обработка
преди приготвянето на пробата:
Измийте клубените. Използвайте подходящ
дезинфектант (хлорна съставка, когато ще се из-
ползва PCR тест с оглед да се премахне ДНК на
евентуален патоген) и детергенти между всяка
проба. Изсушете на въздух клубените. Тази проце-
дура за измиване е особено полезна (но не е задъл-
жителна) за проби с много почва и ако ще се прави
PCR тест или директно изолиране.
3.1.1. Премахнете с чист и дезинфектиран скал-
пел или нож за зеленчуци кожата при столоните
от всеки клубен така, че проводящата тъкан да
стане видима. Внимателно изрежете малко сърце-
вина (под формата на конус) от проводящата тъ-
кан при столоните и поддържайте количеството
непроводяща тъкан в минимално количество (виж
интернет сайта: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/
sanco/Home/main).
Забележка.
Отделете настрани всички клубени с предпола-
гаеми симптоми на пръстеновидно гниене и ги тест-
вайте отделно.
Ако по време на вземане на конуси се наблюда-
ват симптоми на пръстеновидно гниене, клубенът
трябва да се прегледа визуално след разрез близо
до столона. Всеки клубен с предполагаеми сим-
птоми трябва да бъде суберизиран при стайна тем-
пература за два дни и съхранен под карантина (при
темп. от 4 до 10 °C), докато не завършат всички
изпитвания. Всички клубени в пробата (включи-
телно тези с предполагаеми симптоми) трябва да
се съхраняват съгласно Приложение II.
3.1.2. Събирайте конусите в неупотребявани
контейнери за еднократна употреба, които могат
да бъдат затворени и/или запечатани (в случай че
контейнерите се използват повторно, те трябва да
бъдат щателно почистени и дезинфекцирани, като
се използват хлорни съединения). Препоръчител-
но е конусите да се обработят незабавно. Ако това
не е възможно, ги съхранете в контейнер, без да
добавяте буфер, в хладилник за не по-дълго от 72 h
или не по-дълго от 24 h при стайна температура.
Изсушаването и суберизацията на конусите и раз-
витието на сапрофити по време на съхранението
може да възпрепятства откриването на бактерия-
та на пръстеновидното гниене.
3.1.3. Обработете конусите по една от следните
процедури: или
(а) покрийте конусите с достатъчен по обем
(приблизително 40 ml) екстракционен буфер (До-
пълнение 3) и разклатете на ротационна клатачка
(50 до 100 rpm) за четири часа при под 24 °C или от
16 до 24 h охладени,
или
(б) хомогенизирайте конусите с достатъчен обем
(приблизително 40 ml) екстракционен буфер (До-
пълнение 3) или в блендер (напр. Waring или Ultra
Thurax), или чрез стриване в запечатана торбичка
за мацерация за еднократна употреба (напр.
Stomacher или Вioreba—здрав полиетилен, 150 mm Ч
250 mm; стерилизиран с облъчване), използвайки
гумено чукче или подходящ апарат за стриване
(напр. Homex).
Забележка.
Рискът от кръстосано заразяване на пробите е
висок, когато хомогенизирането им се извършва с
блендер. Вземете предпазни мерки, за да избегнете
аерозолно заразяване или разпиляване по време на
процеса на екстракция. Уверете се, че остриета на
блендера и съдовете за всяка проба се използват
стерилизирани. Когато се предвижда PCR тест, из-
бягвайте остатъците от ДНК по контейнерите или
апарата за стриване. Стриването на пробите в тор-
бички за еднократна употреба и използването на ед-
нократни епруветки се препоръчва там, където ще
се използва PCR.
3.1.4. Прелейте супернатантата. Ако течността
е твърде мътна, я избистрете с центрофугиране на
ниска скорост (при не повече от 180 g за 10 min при
температура между 4 и 10 °C) или чрез вакуумна
филтрация (40 до 100 µm), измивайки филтъра с
допълнителен (10 ml) екстракционен буфер (До-
пълнение 3).
3.1.5. Концентрирайте бактериалната фракция
чрез центрофугиране при 7000 g за 15 min (или
10 000 g за 10 min) при температура между 4 и 10 °C
и изхвърлете супернатантата, без да разклащате
утайката.
3.1.6. Ресуспендирайте (разтворете отново)
утайката в 1,5 ml буфер за разтваряне на утайката
(Допълнение 3). Пробата се разделя на 3 равни
части (аликвоти). Използвайте 500 µl за тестване
за C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl за Ralstonia
solanacearum и 500 µl за референтни цели (съхра-
нява се за бъдещи тестове).
Добавете стерилен глицерол до крайна концен-
трация от 10 до 25 % (v/v) към 500-те µl от референ-
тната част, разбийте и съхранете при—16 до—24 °C
(за седмици) или 68 to—86 °C (за месеци). Съхра-
нявайте пробите при 4 до 10 °C по време на тества-
нето. Не е желателно повторно замразяване и раз-
мразяване. Ако се налага транспортиране на екс-
тракта, осигурете доставянето му в хладилна ку-
тия в рамките на 24 до 48 h.
3.1.7. Задължително е всички положителни
контроли и проби от C. m. subsp. sepedonicus да се
третират отделно, за да се избегне заразяване. Това
се отнася за стъклата за имунофлуоресценция и за
всички тестове.
3.2. Картофени растения
Забележка.
За откриване на латентни популации от C. m.
subsp. sepedonicus е препоръчително да се тестват
сложни (смесени) проби. Процедурата може да бъде
подходящо приложена за смесени проби от/до
200 части от стъбла. (Там, където се извършват наб-
людения, те трябва да се основават на статистичес-
ки представителна проба от растителната попула-
ция под проучване.)
3.2.1. С чист дезинфекциран нож или лозарски
ножици премахнете участък от 1—2 cm от основа-
та на всяко стъбло над нивото на почвата.
Дезинфекцирайте стъблените части за кратко
в етанол 70 % и незабавно ги подсушете на фил-
търна хартия. Съхранявайте ги в затворен стери-
лен контейнер съгласно следните процедури за
обработване на пробата: