Държавен вестник, бр. 12, 2006 г., стр. 36

С Т Р .  36
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  12
карат през 450 nm мембранен филтър, да се доба-
вят други антибиотици и да се инокулират в коко-
ши ембриони по описания начин.
3. Диференциална диагноза
Всички положителни резултати, получени от
регионалните лаборатории, се изпращат на наци-
оналната референтна лаборатория по чл. 22 за пот-
върждаване на резултатите и пълно антигенно и
биологично типизиране на вируса. До потвържда-
ването на резултатите се прилагат всички мерки,
насочени към ограничаване на възможността за
разпространение на вируса.
а) Потвърдителна идентификация (доказване)
Националната референтна лаборатория по
чл. 22 извършва пълно определяне на всички хе-
маглутиниращи агенти. Присъствието на вируса
на НБП се доказва чрез реакция за задържане на
хемаглутинацията чрез моноспецифични птичи ан-
титела. Реакцията е описана в т. 6. Положителна
хемаглутинация на алантоисната течност при раз-
реждане 24 или повече, при използване на моно-
специфичен антисерум срещу вируса на Нюкасъл-
ската болест с титър, за който се знае, че е със
стойност най-малко 109, следва да послужи като
предварително идентифициране и се изисква на-
лагането на всички контролни мерки за предпаз-
ване от разпространение на болестта.
Тестовете за доказване на интрацеребрален па-
тогенен индекс по т. 7 се извършват на всички
изолати, дали положителен резултат за наличие
на вируса на НБП. Патогенен индекс, по-висок от
0,7, показва наличие на щам на вируса, който изис-
ква прилагането на всички контролни мерки за
предпазване от разпространение на болестта.
Някои моноклонални антитела, специфични за
ваксиналните щамове, могат да бъдат използвани
при реакция за задържане на хемаглутинацията.
Такива антитела се осигуряват от референтната
лаборатория на Общността и служат за доказване
на ваксиналния щам на вируса на НБП в пробите.
Националната референтна лаборатория преда-
ва всички хемаглутиниращи агенти на референт-
ната лаборатория на Общността.
б) Типизиране на изолатите
Хемаглутиниращите агенти, предадени на ре-
ферентната лаборатория, се подлагат на по-ната-
тъшно антигенно и генетично проучване с цел
получаване на по-добра информация относно епи-
зоотологията на псевдочумата по птиците.
4. Бързи тестове за откриване на вируса на
Нюкасълска болест при ваксинирани птици
За откриване на вируса на НБП при ваксинира-
ни птици може да се използват флуоресцентни
тестове за доказване на антитела върху надлъжни
разрези от трахеи и пероксидазни тестове за до-
казване на антитела върху мозъчна тъкан.
5. Откриване на антитела при неваксинирани
птици
а) Проби
Кръвни проби се вземат от всички птици, кога-
то числеността на птичите стада е под 20 глави, и
от 20 птици—за по-големите стада (това би дало
99% вероятност за откриване на поне един поло-
жителен серум, ако 25 % или по-висок процент от
стадото е с положителен резултат, независимо от
големината на стадото). Кръвта се оставя да се
съсири и след това серумът се отделя за тестване.
б) Изследване за наличие на антитела
За откриването на антитела срещу вируса може
да се използва методът ЕЛАЙЗА (ензимно свър-
зан имуносорбентен анализ).
Отделните серумни проби се тестват за способ-
ността им да възпират хемаглутиниращата актив-
ност на вируса на Нюкасълската болест при усло-
вията на стандартната реакция за задържане на
хемаглутинацията, описана в т 7.
Националната референтна лаборатория на Бъл-
гария определя за работно разреждане на вируса
да се използват 4 хемоглутинационни единици.
При 4 хемоглутинационни единици (ХАЕ) за
положителен следва да се приема всеки серум с
титър, равен на 24 или по-голям.
6. Реакция хемаглутинация
Реагенти
1. Изотоничен фосфатно буфериран физиоло-
гичен разтвор (0,05 М) със стойност на рН между
7,0 и 7,4.
2. Еритроцити (RBC) —взети и събрани в обща
проба от най-малко три свободни от патогенни
микроорганизми кокошки (ако няма такива, кръвта
се взима от птици, които са били обект на редовно
наблюдение и са показали, че са свободни от анти-
тела срещу вируса на Нюкасълската болест) в ра-
вен обем разтвор на Алсевер. Преди използването
им клетките трикратно се промиват с PBS. За тес-
та се използва 1 % суспензия в PBS.
3. Като стандартен антиген се използва щам на
НБП от вида “Ulster 2C”.
Процедури
1. Във всяка ямка на микротитърната плака
се накапват по 0,025 мл PBS (за предпочитане са
V-образните дъна на ямките).
2. В първата ямка се поставят 0,025 мл вирусна
суспензия (т.е. алантоисна течност).
3. След внимателно размесване от първата ямка
се прехвърлят по 0,025 мл в следващата, след това
от нея—в по-следващата и т. н., при което се полу-
чават двукратни разреждания на вируса, като се
започва от 1:2 и се достигне до 1:4096.
4. Добавят се още 0,025 мл PBS във всяка ямка;
5. Добавят се по 0,025 мл 1 % разтвор на ерит-
роцити във всяка ямка.
6. Размесват се чрез внимателно потупване и се
поставят при 4 °С.
7. Контроли —положителна за аглутинация (две
ямки, в които се поставят по 0,025 мл PBS, 0,025 мл
неразредена вирусна суспензия и 0,025 мл еритро-
цити) и отрицателна за хемаглутинация (две ямки,
в които се поставят по 0,050 мл PBS и по 0,025 мл
еритроцити).
8. Плаките се разчитат след 30—40 мин. чрез
накланянето им и отчитане наличието или липса-
та на отвесна черта, получена от стичането на ерит-
роцитите. Ямките без хемаглутинация трябва да
изглеждат по същия начин както контролните
проби без вирус.
9. Хемаглутинационният титър представлява
най-голямото разреждане, при което се предизвик-
ва аглутинация на еритроцитите. Това разреждане
се приема за 1 хемаглутинационна единица.