Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 26

С Т Р .  26
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
5.3.2.4. Закрита хидролиза
Флаконът, съдържащ сместа, приготвена в
съответствие с 5.3.2.1 или 5.3.2.2 в пещ (4.3), се
поставя при 110 °С. По време на първия час, за
да се предотврати повишаването на налягането
(поради отделяне на газообразни субстанции) и
да се избегне експлозия, се поставя винтовата
капачка над върха на съда. Съдът не се затваря
с капачката. След един час съдът се запушва с
капачката и се оставя в пещта (4.3) в про-
дължение на 23 h. След приключване на хидро-
лизата флаконът се маха от пещта, внимателно
се отвива капачката на флакона, който се по-
ставя в ледена водна вана. Оставя се да се охла-
ди.
В зависимост от процедурата за коригиране
на рН (5.3.3) количествено съдържанието на
флакона се прехвърля в бехерова чаша от 250 ml
или облодънна колба от 250 ml, като се изпол-
зва цитратен буфер (5.24).
Продължава се съгласно 5.3.3.
5.3.3. Коригиране на рН
В зависимост от натриевия толеранс на ана-
лизатора на аминокиселини (4.9) продължава
се съгласно 5.3.3.1 или 5.3.3.2, за да се кориги-
ра рН.
5.3.3.1. За хроматографски системи (4.9),
изискващи ниска концентрация на натрий:
Препоръчително е да се използва вътрешен
изходен еталонен разтвор (3.27.3), когато се
използват анализатори на аминокиселини, изис-
кващи ниско съдържание на натрий (когато
трябва да се намали обемът на киселината).
В този случай се прибавят 2 ml вътрешен
изходен еталонен разтвор (3.27.3) към хид-
ролизата преди изпаряването.
Прибавят се 2 капки 1-октанол (3.15) към
хидролизата, получен съгласно 5.3.2.3 или 5.3.2.4.
Като се използва ротационен изпарител (4.7),
намалява се обемът до 5—10 ml под вакуум при
40 °С. Ако случайно обемът спадне под 5 ml,
хидролизатът трябва да се изхвърли и анализът
да се започне отново.
Коригира се рН на 2,20 с разтвор на натриев
хидроокис (3.18) и се преминава към 5.3.4.
5.3.3.2. За всички други анализатори на ами-
нокиселини (4.9)
Хидролизатите се вземат, получени съглас-
но 5.3.2.3 или 5.3.2.4, и се неутрализират час-
тично, като внимателно се добавят при непре-
къснато разбъркване на 17 ml разтвор на натри-
ев хидроокис (3.17), като се осигурява темпера-
турата да се поддържа под 40 °С. рН се коригира
на 2,20 при стайна температура, като се изпол-
зва разтвор на натриев хидроокис (3.17) и нак-
рая разтвор на натриев хидроокис (3.18) и се
преминава към 5.3.4.
5.3.4. Разтвор на пробата за хроматография
Количествено се прехвърля хидролизатът с
коригирана рН (5.3.3.1 или 5.3.3.2) с цитратен
буфер (3.24) в мерителна обемна колба 200 ml и
се долива до отметката с буфера (3.24).
Ако вътрешният еталон още не е бил изпол-
зван, се прибавят 2 ml от вътрешния еталон
(3.27.3) и се долива до отметката цитратен бу-
фер (3.24). Разбърква се старателно.
Преминава се към етап хроматография (5.4).
Ако разтворите на пробите не се изследват
същия ден, те се съхраняват при температура
под 5 °С.
5.4. Хроматография
Преди хроматографията екстрактът (5.2) или
хидролизата (5.3.4) се привежда до стайна тем-
пература. Сместа се разбърква и подходяща част
от нея се филтрира през мембранен филтър 0,2
µm (4.5). Полученият бистър разтвор се подла-
га на йоннообменна хроматография, като се
използва анализатор на аминокиселини (4.9).
Инжектирането може да се извърши ръчно
или автоматично. Важно е едно и също коли-
чество разтвор (± 0,5 %) да се добавя в колоната
за анализ на еталоните и пробите, освен когато
се използва вътрешен еталон, и когато отноше-
нията натрий / аминокиселина  в разтворите на
еталоните и пробите са практически подобни.
По принцип честотата на калибриране зави-
си от стабилността на нинхидриновия реактив
и системата за анализ. Еталонът или пробата
се разреждат с цитратен буфер (3.24), за да се
получи пикова повърхност на еталона от 30—
200 % от пиковата площ на пробата аминокисе-
лина.
Хроматографията на аминокиселините ва-
рира в малки граници според вида на използва-
ния анализатор на използваната смола. Избра-
ната система трябва да може да разделя амино-
киселините една от друга и от веществата, реа-
гиращи положително на нинхидрина. В обхвата
на работа хроматографската система трябва да
даде линейна реакция на промените в количес-
твата аминокиселини, прибавени в колоната.
По време на хроматографията, когато се
анализира еквимоларен разтвор (на аминоки-
селините, които се определят), се прилагат съ-
отношения между основата и върха на пикове-
те, описани по-долу. Този еквимоларен разтвор
трябва да съдържа най-малко 30 % от макси-
малното съдържание на всяка аминокиселина,
което може да бъде точно измерено с анализа-
тора на аминокиселини (4.9).
При отделянето на треонин-серин съотно-
шение между основата и върха на пиковете на
двете застъпващи се аминокиселини на хрома-
тограмата не трябва да превишава 2:10 (ако се
определят само  цистеин, метионин, треонин и
лизин, недостатъчната сепарация на съседни
пикове ще има неблагоприятен ефект върху
определянето). За всички останали аминоки-
селини сепарацията трябва да бъде по-добра
от 1:10.
Системата трябва да осигурява отделянето
на лизина от “структурите на лизина” и на ор-
нитина.