Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 105

Б Р О Й  109
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  105
се идентифицират хемаглутиниращи вирусни изолати
на ИП от субтип Н5 или Н7, както и на вируса на ню-
кясълската болест по птиците.
За идентифициране на хемаглутинина се провежда
реакция възпиране на хемаглутинацията (РВХА). Из-
ползват се събраните хемаглутинационни течности и
стандартни положителни и отрицателни серуми съг-
ласно т. 5 и 6.
Основанията за налагане на ограничителни мерки
на терена са положителните за инфлуенца титри 24 и
повече срещу субтиповете Н5 и Н7. Теренните изолати
обикновено показват титри 29 и повече.
2. Потвърждаване на предварителната диференци-
ална диагноза:
Тъй като досега са идентифицирани 15 субтипа на
основата на хемаглутитина (от Н1 до Н15) и 9 субтипа
на основата на антиген неураминитоза (от N1 до N9),
както и на различни комбинации между тях, не е прак-
тично и финансово изгодно националните лаборатории
да разполагат с всички субтипове антисеруми, които
позволяват да се извърши пълно антигенно характери-
зиране на изолираните инфлуенчни вируси.
3. Националната референтна лаборатория следва да
извърши следното:
а) потвърждаване на диагнозата чрез използване на
двойно дифузионната реакция преципитация в агаров
гел (РПАГ), с която се разкрива общия за всички ин-
флуенчни вируси групов антиген, описан в т. 9; със съ-
щата цел мотат да бъдат използвани и тестовете ЕЛАЙ-
ЗА и имунофлуоресцентният метод (ИФМ);
б) да потвърди или отхвърли, че изолатът е от суб-
тип Н5 и Н7;
в) да определи интравенозния патогенен индекс
(ИВПИ) в шестседмични пилета съобразно описание-
то в т. 7.
Интравенозен патогенен индекс (ИВПИ), по-висок
от 1,2, е показател за налагане на ограничителни мерки
срещу установения изолат на инфлуенчния вирус. Със
същата цел може да се използва тестът за плакообра-
зуване в монослойни клетъчни култури (КК) от ембри-
онални пилешки фибробласти (ЕПФ).
Националната референтна лаборатория следва не-
забавно да изпраща всички изолирани и идентифицира-
ни от нея изолати на вируса на инфлуенцата по птиците
и особено на тези от Н5 и Н7 в Референтна лаборатория
на Европейския съюз.
4. Серологични тестове за разкриване на специфич-
ни антитела срещу вируса на инфлуенцата по птиците:
а) При провеждане на програми за ерадикация (из-
кореняване) на огнищата на инфлуенцата, за които хе-
маглутининовият субтип на вирусния причинител е ус-
тановен, той може да бъде използван като антиген в
РВХА съобразно т. 5 и 6. Със същата цел за антиген
може да бъде използван и всеки друг инфлуенчен вирус
от същия (хомоложен) субтип.
В случаите, когато субтипът на вируса—причини-
тел на инфлуенцата, не е известен, диагнозата може да
бъде потвърдена чрез разкриване на специфични анти-
тела в серуми от засегнати птици чрез тестовете за
доказване на групово специфичните антигени—РПАГ,
ЕЛАЙЗА, ИФМ. При провеждане на ЕЛАЙЗА е въз-
можно да възникне проблем в специфичността є във
връзка с гостоприемниковите (като вид птици) имуно-
глобулинови субстанции.
б) Проби.
Кръвни проби за лабораторно изследване се вземат от
подкрилната вена, както следва: от всички птици на стада
до 20 бр.; по 20 проби от по-големите по размер стада
(това гарантира откриване поне на една положителна
проба с вероятност 99 %; при заразеност на 25 % от пти-
ците в стадата този брой проби е достатъчен за сигурно
откриване на инфекцията независимо от големината им).
След съсирване (коагулация) на кръвта в пробите серу-
мите се декаптират и съхраняват на 4 °С за изследване до
4 дни и на 20—25 °С за по-продължителен период.
в) Изследване за наличие на специфични антитела.
Способността на серумите да инхибират (възпират,
задържат) хемаглутинационната активност на инфлу-
енчните вируси се доказва чрез РВХА в постановки,
описани в т. 6. Тя може да се проведе чрез използване
на 4 или 8 хемаглутинационни единици (ХАЕ) съобраз-
но желанието на Националната референтна лаборато-
рия. За положителна се счита всяка проба с възпиращ
(задържащ) титър 24 и по-голям в тест с 4 ХАЕ и титър
23 и повече в тест с 8 ХАЕ.
5. Реакция хемаглутинация (РХА):
Реагенти:
а) Фосфатно-буфериран физиологичен разтвор с рН
7,0—7,4 (PBS).
б) Кръв за изготвяне на еритроцитна суспензия се
взема от минимум 3 кокошки, доказано свободни за
специфични антитела срещу вируса на инфлуенцата по
птиците, за предпочитане от СПФ стадо.
Кръвта при вземането се смесва с антикоагулант—
равно количество разтвор на Алсевер или 4 % натриев
цитрат в съотношение 1:5. Червените кръвни клетки
(ЧКК) преди употреба се промиват с РВS 3-кратно в
центрофуга при 300—500 g. Препоръчва се от промити-
те ЧКК да се изготви 1 % суспензия в РВS.
в) За антиген в РВХА се използва птичи инфлуенчен
вирус. Референтната лаборатория към Европейския
съюз препоръчва използване като антигени вируси от
субтип Н5 или Н7 с доказана ниска вирулентност, кои-
то тя е длъжна да предостави.
г) Процедури за изпълнение в микровариант:
—разлива се PBS във всички ямки на микроплаката
с V-образни дъна в обем 0,025 мл;
—добавя се 0,025 мл вирусна суспензия (т.е. аланто-
амнионова течност от инфектирани КЕ) само в първа-
та ямка от редицата;
—с микротитрационна пипета се изготвят 2-кратно
нарастващи разреждания на вирусния антиген—от 1:2
до 1:4096;
—допълнително се поставя PBS към всяка ямка от
редицата в обем 0,025;
—добавя се във всяка ямка 1 % суспензия от ЧКК в
обем 0,025 мл;
—в няколко (2—5 бр.) ямки се поставя контролът
на еритроцитите без вирус;
—следва внимателно разклащане на плаката за раз-
месване на инградиентите и инкубиране при 4 °С;
—отчитането на резултатите се извършва след 30—
40 мин, т.е. когато ЧКК в контролните ямки са оформе-
ни на дъното във вид на точка; при отчитането плаките
се държат в наклонено положение; еритроцитите в кон-
тролните ямки и тези с отрицателна хемаглутинация
“текат”, а ЧКК в ямките с положителна хемаглутина-
ция оформят нежна пелена на дъното и раменете на
ямките, без да “текат”;
—хемаглутинационният титър на антигена пред-
ставлява най-високото му разреждане, което аглутини-
ра напълно ЧКК; това разреждане на вируса съдържа
1 ХАЕ; за по-точно определяне на хемаглутинацион-
ния титър се препоръчват и паралелни тест-редици от
вирус със стартови разреждания от 1:3 и 1:5; това се
прави с оглед на по-прецизно изготвяне на работното
разреждане на антигени при използване в РВХА.
6. Реакция възпиране (задръжка, инхибиция) на
хемаглутинацията:
Компоненти:
а) фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS);
б) вируссъдържаща аланто-амнионова течност, раз-
творена с PBS, така че да съдържат 4 или 8 ХАЕ анти-
ген в 0,025 мл (антиген);
в) суспензия от птичи ЧКК в 1 % суспензия;
г) отрицателен контролен серум;
д) положителен контролен серум.
Процедури за изпълнение в микровариант:
а) разлива се PBS във всяка ямка на микроплаката
с V-образни дъна в обем 0,025 мл;