Държавен вестник, бр. 95, 2006 г., стр. 62

С Т Р .  62
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  95
“Приложение № 2а
към чл. 7, ал. 1, т. 3
Африканска чума по конете (АЧК)
Диагноза
Реактивите за описания ензим, свързан имуно-
сорбентен анализ (ЕЛАЙЗА), могат да бъдат по-
лучени от референтните лаборатории по АЧК на
Европейската общност или референтните лабора-
тории на Международното бюро по епизоотии.
1. СРАВНИТЕЛНА ЕЛАЙЗА ЗА ДОКАЗВАНЕ
НА АНТИТЕЛА НА ВИРУСА НА АФРИКАНСКА
ЧУМА ПО КОНЕТЕ (АЧКВ) (ПРЕДПИСАН ТЕСТ)
Сравнителната ЕЛАЙЗА се използва за доказва-
не на специфични АКЧВ антитела в серуми от който
и да е вид еднокопитни. Широкоспектърният, по-
ликлонален, имунен анти-АЧКВ серум от морско
свинче (наричан за по-кратко антисерум “морско
свинче”) е специфичен за серогрупата и може да до-
каже всички познати серотипове на вируса на АЧК.
Принципът на тестуването се изразява в пре-
късване на реакцията между АЧКВ антигена и
антисерума “морско свинче” чрез тест серумна
проба. АЧКВ антителата в тест серумната проба
взаимодействат с тези в антисерума “морско свин-
че”, което води до редукция на очаквания цвят (след
добавяне на ензим, обозначен анти-морско свинче
антитяло и субстрат). Серумите могат да бъдат
тестувани при единично разреждане 1:5 (метод на
петната) или могат да бъдат титрирани (метод на
серумна титрация), за да се получи крайно разреж-
дане. Инхибиторни стойности, по-високи от 50 %,
могат да се считат за положителни.
Описаният протокол от изследване се използ-
ва в регионалната референтна лаборатория за АЧК
в Пъртбрайт, Великобритания.
1.1. Тест процедура
1.1.1. Подготовка на плаките
1.1.1.1. ЕЛАЙЗА плаките се посяват с АЧКВ
антиген, екстрахиран (извлечен) от заразени кле-
тъчни култури и разреден в карбонатен/бикарбо-
натен буфер, pH 9,6. ЕЛАЙЗА плаките се инкуби-
рат за една нощ при 4 °C.
1.1.1.2. Плаките се измиват три пъти чрез пос-
ледователно пълнене и изпразване на гнездата
(ямките) с фосфатно буфериран физ. (ФБФ), pH
7,2 до 7,4 pH, след което се изсушават и попиват с
хигроскопична хартия.
1.1.2. Контролни ямки на плаките
1.1.2.1. Положителните контролни серуми се тит-
рират в двойна серия разреждане, от 1 : 5 до 1 : 640,
в колона 1 в блокиращ буфер (ФБФ, съдържащ
0,05 % (v/v)Tween-20, 5,0 % (w/v) обезмаслено мля-
ко на прах (Cadbury’s Marvel TM ) и 1 % (v/v) серум
от възрастно говедо) до получаване на краен обем
от 50 µl/ямка.
1.1.2.2. Към ямки A и B от колона 2 се добавя
50 µl от отрицателния контролен серум при раз-
реждане 1 : 5 (10 µl серум+ 40 µl блокиращ буфер).
1.1.2.3. Към ямки C и D от колона 2 (празна) се
добавя 100 µl/ямка блокиращ буфер.
1.1.2.4. Към ямки E, F, G и H от колона 2 (кон-
трол на морското свинче) се добавят 50 µl блоки-
ращ буфер.
1.1.3. Метод на петната
1.1.3.1. Добавя се 1 към 5 на всеки тест серум в
блокиращ буфер за дублиране на ямки от колони 3
до 12 (10 µl серуми + 40 µl блокиращ буфер).
или
1.1.4. Метод на серумната титрация
1.1.4.1. Подготвя се двойна серия разреждане на
всяка тест проба (1 : 5 до 1 : 640) в блокиращ буфер
в осем ямки от единични колони (3 до 12),
след което
1.1.5. Добавят се 50 µl антисерум “морско свин-
че”, предварително разреден в блокиращ буфер,
във всички ямки на ЕЛАЙЗА плаката с изключе-
ние на празните (така крайното количество, което
се съдържа във всички ямки, е 100 µl).
1.1.5.1. Инкубира се в продължение на един час
при 37 °C на/върху орбитален шейкър.
1.1.5.2. Плаките се измиват три пъти, след ко-
ето се подсушават, както е описано в 1.1.1.2.
1.1.5.3. Към всяка ямка се добавят 50 µl коню-
гат: заешки анти-морско свинче/пероксидаза (HRP),
предварително разтворен в блокиращ буфер.
1.1.5.4. Инкубира се в продължение на един час
при 37 °C на/върху орбитален шейкър.
1.1.5.5. Плаките се измиват три пъти и се под-
сушават, както е описано в 1.1.1.2.
1.1.6. Хромоген
Подготвя се хромогенният ОФД (ОФД = ор-
то-фенилдиамин) разтвор съгласно инструкциите
на производителя (0,4 mg/ml в стерилна дестили-
рана вода) непосредствено преди употреба. Доба-
вя се субстрат (водороден диоксид прекис = H2O2)
до получаване на крайна концентрация от 0,05 % (v/v)
(1 : 2000 на 30 % разтвор на H2O2).
Към всяко кладенче се добавят по 50 µl от ОФД
разтвора, след което плаките се оставят на постав-
ката за 10 минути при стайна температура. Реак-
цията се прекъсва чрез добавяне на 50 µl/кладен-
че на 1M сярна киселина (H2SO4).
1.1.7. Разчитане
Разчитането става спектрофотометрично при
492 nm.
1.2. Представяне на резултатите
1.2.1. С помощта на пакет от софтуерни програ-
ми се отпечатват стойностите на оптичната плът-
ност (ОП) и процентът на инхибиция (ПИ) за тест
серумите и контролните серуми въз основа на сред-
ната стойност, отчетена в четирите “морско свин-
че” контролни кладенчета на плаката.
Данните, представени като стойности на ОП и
ПИ, се използват, за да се определи дали изследва-
нето е в приемливи граници. Горните контролни
граници (ГКГ) и долните контролни граници (ДКГ)
за контрола на морското свинче са между ОП стой-
ности съответно 1,4 и 0,4. Крайният титър за поло-
жителния контрол, базиран на 50 % ПИ, трябва да
бъде 1 : 240 (в граници от 1 : 120 до 1 : 480).
Всяка плака, която не отговаря на тези крите-
рии, следва да се отхвърли. Въпреки това, ако ти-
търът на серума за положителен контрол е повече
от 1 : 480 и пробите са все още отрицателни, отри-
цателните проби могат да се приемат.
Двойните серумни гнезда за отрицателен кон-
трол и двойните празни гнезда трябва да дават ПИ
стойности съответно между + 25 % и—25 % и
между + 95 % и + 105 %. Когато стойностите са
извън посочените граници, това не означава, че
плаката е невалидна, а е признак на оцветяване.
1.2.2. Диагностичният праг (пределна стой-
ност) за тест серумите е 50 % (ПИ 50 %). Проби,
даващи ПИ стойности, по-високи от 50 %, се от-
читат като положителни. Проби, при които се от-
читат ПИ стойности, по-ниски от 50 %, се считат
за отрицателни.
Проби, при които се отчитат ПИ стойности над
и под прага за двойните кладенчета, се считат за
съмнителни. Подобни проби могат да се тестват
отново с тест на петната и чрез титриране. Поло-
жителните проби също могат да се титрират с цел
да се установи степента на положителност.