Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 36

С Т Р .  36
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
или Ultra Thurax) или чрез стриване в запечатана
торбичка за мацерация за еднократна употреба
(например Stomacher или Bioreba от усилен поли-
етилен, 150 mm Ч 250 mm; стерилизирана чрез об-
лъчване), като се използва гумен чук или подхо-
дящ апарат за мелене (например Homex).
Забележка: При използване на блендер за хо-
могенизиране има голяма опасност от кръстосано
заразяване на пробите. Необходимо е да се вземат
предпазни мерки, за да се избегне създаването на
аерозоли или разливане по време на процеса на
екстракция. За всяка проба се осигуряват прясно
стерилизирани ножове на блендера и съдове. Ако
ще се използва PCR тест, избягвайте пренасянето
на ДНК върху съдовете и апаратите за мелене.
Препоръчва се стриване в торбички за еднократна
употреба и използването на еднократни епрувет-
ки, когато ще се използва PCR.
1.1.3. Прелива се супернатанта. Ако течността
е много мътна, се налага избистряне чрез центро-
фугиране при ниска скорост (при не повече от 180 g
за 10 минути при температура между 4 и 10 °С) или
чрез вакуумна филтрация (40 до 100 µm), като фил-
търът се измива с допълнителен (около 10 ml)
екстракционен буфер.
1.1.4. Концентрира се бактериалната фракция
чрез центрофугиране при 7000 g за 15 минути (или
10 000 g за 10 минути) при температура между 4 и
10 °С и се отстранява супернатантата, без да се
нарушава утайката.
1.1.5. Повторно се суспендира утайката в 1,5 ml
буфер за разтваряне на утайката (допълнение 4).
Използват се 500 µl за тестване за R. solanacearum,
500 µl за Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
и 500 µl за сравняване. Добавя се стерилен глице-
рин до окончателна концентрация от 10 до 25 %
(v/v) към 500 µl от референтната аликвотна част
и към останалата аликвотна част за изпитване,
разбърква се и се оставя при температура от—16
до—24 °С (седмици) или от—68 до—86 °С (месе-
ци). Аликвотните части за изпитване се съхраня-
ват при температура от 4 до 10 °С по време на
изпитването.
Не се препоръчва многократно замразяване и
размразяване на пробите.
Ако се налага транспортиране на екстракта,
осигурява се доставка в охладена кутия в рамките
на 24 до 48 часа.
1.1.6. Задължително е отделното третиране на
всички R. solanacearum положителни контроли и
проби, за да се избегне заразяване. Това се отнася
за предметните стъкла за IF тест и за всички други
тестове.
1.2. Изпитване
Виж схемата и описанието на тестовете и опти-
мизираните протоколи в съответните допълнения:
Селективна изолация (виж раздел VI.А.4)
IF тест (виж раздел VI.А.5)
PCR тестове (виж раздел VI.А.6)
FISH тест (виж раздел VI.А.7)
ЕLISA тестове (виж раздел VI.А.8)
Биологичен тест (виж раздел VI.А.9)
2. Подробни методи за установяване и иденти-
фициране на R. solanacearum в проби от картофе-
ни, доматени или други растения без симптоми
2.1. Подготовка на пробата
Забележка: За установяване наличието на ла-
тентни популации на R. solanacearum се препоръч-
ва използването на съставни проби. Процедурата
е удобна за използване при съставни проби от не
повече от 200 стъблени части. Когато се правят
мониторингови наблюдения, те трябва да се бази-
рат на статистическа представителна извадка на
изследваната растителна популация.
2.1.1. Събират се части от стеблото с дължина
1 до 2 cm в затворен стерилен съд в съответствие
със следната процедура за пробовземане:
Доматен разсад от оранжерии: С чист дезин-
фекциран нож се отстранява сегмент с дължина
1 cm от основата на всяко стъбло точно над нивото
на почвата.
Полски или парникови доматени растения: С чист
дезинфекциран нож се отстранява най-ниското
странично клонче на всяко растение, като се реже
точно над връзката с главното стъбло. Отстранява
се сегмент с дължина 1 cm от най-долната част на
всяко странично клонче.
Други гостоприемници: С чист дезинфекциран
нож или градинарски ножици се отстранява сег-
мент с дължина 1 cm от основата на всяко стъбло
точно над нивото на почвата. При S. dulcamara или
други растения гостоприемници, които виреят във
вода, се отстраняват участъци с дължина 1—2 cm
от частта на стъблото под водата или от ластуни-
те, пуснали корени във водата.
Когато се взимат проби от определено място,
се препоръчва да се изпитва статистическа предс-
тавителна извадка, съставена от най-малко 10 рас-
тения от всяко място на пробовземане за всеки
потенциален плевелен гостоприемник. Установя-
ването на наличие на патоген е най-надеждно през
късна пролет, лятото и есента, въпреки че естест-
вените инфекции могат да се откриват през цялата
година в многогодишни Solanum dulcamara, растя-
щи в реките. Познатите гостоприемници включ-
ват саморасли картофени растения (задържащи
почвата), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura
stramonium и други членове на семейство
Solanaceaе. Други гостоприемници са Pelargonium
spp. и Portulaca oleracea. Някои европейски пле-
велни видове, които потенциално могат да задър-
жат популации на R. solanacearum биовар 2/Race 3
в корени и/или ризосфери при специфични усло-
вия на околната среда, включват Atriplex hastata,
Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium
album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora,
Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene
alba, S. nutans., Tussilago farfarra и Urtica dioica.
Забележка: Визуалната проверка за установя-
ване на вътрешни симптоми (оцветяване на про-
водящите тъкани или бактериален ексудат) може
да се направи на този етап. Всички сегменти от
стъблото със симптоми се отделят и се изпитват
отделно (Виж раздел II).
2.1.2. Сегментите от стъблото се дезинфекци-
рат за кратко със 70 % етанол и веднага се подсу-
шават върху попивателна хартия. След това сег-
ментите от стъблото се обработват с помощта на
една от следните процедури:
а) Сегментите се покриват с достатъчно коли-
чество (около 40 ml) екстракционен буфер (допъл-
нение 4) и се разбъркват на ротационна клатачна
машина (50—100 rpm) в продължение на четири
часа при температура под 24 °С или в продължение
на 16 до 24 часа охладени, или