Държавен вестник, бр. 19, 2006 г., стр. 64

С Т Р .  64
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  19
Във всеки две ямки след аплицирането на раз-
редител (50 µl) се накапват пробите (серум, плаз-
ма или органа суспензия 1:10) в количество 150 µl.
Едновременно с пробите се накапват и по две ямки
с положителна и отрицателна контрола.
Компонентите се смесват чрез внимателно
тръскане на плаката, тя се покрива и се инкубира
60 min при 37 °С във влажна камера.
Плаката се промива двукратно.
Във всяка ямка се накапва разреден 1:200 ко-
нюгат, 200 µl и се инкубира за 60 min при 37 °С във
влажна камера.
Плаката се промива двукратно.
Във всички ямки се накапва по 200 µl хро-
моген.
Резултатите се отчитат чрез фотометриране
(ридер на “Санофи”), след като разликата между
оптичните плътности на отрицателната и поло-
жителната контрола е по-голяма или равна на 0,4.
Това се отчита обикновено след 15 до 40 min след
апликацията на хромогена. Във всяка от ямките се
накапва по 50 µl стопиращ реакцията разтвор.
V. Доказване на антитела
1. ELISA за откриване на антитела срещу гли-
копротеин Е2 (gp 55)
Плаките са покрити с рекомбинантен Е2 глико-
протеин. В случай на присъствие на антитела в про-
бите същите се свързват с антигена и предотвратяват
свързването му с белязан с пероксидаза Е2 специфи-
чен конюгат. Несвързаните компоненти се отмиват
от плаката. Ако в пробата има специфични антите-
ла, цветът не се променя след добавянето на хромо-
ген. В случай че няма антитела, се наблюдава зелено
оцветяване. Степента на цветната реакция е право-
пропорционална на присъствието на специфични ан-
титела в пробата. Диагностичната стойност на теста
се определя по оптичната плътност на положител-
ната и отрицателната контрола.
Процедура
Всички реагенти се темперират.
Концентрираните разтвори за миене на плаки-
те и за разреждане на контролите, пробите и ко-
нюгата се разреждат по описание.
Във всяка плака се аплицира по 75 µl разреди-
тел във всяка ямка и се накапва в две последова-
телни ямки по 50 µl от пробата (серум или плазма).
Компонентите се смесват чрез внимателно
разклащане на плаката и същата се покрива и
инкубира за 90 min във влажна камера.
Плаката се промива двукратно.
Във всяка ямка на плаката се накапва по 100 µl
конюгат в разреждане 1:200. Инкубира се при 37 °С
за 30 min.
Плаката се промива двукратно.
Във всяка ямка се накапва по 100 µl хромоген.
След като разликата между оптичната плът-
ност на отрицателната и положителната контрола
стане по-голяма или равна на 0,3, реакцията се
отчита със “Санофи” ридер фотометрично (20 до
30 min след добавянето на хромоген). Преди отчи-
тането реакцията се спира чрез добавяне във всяка
ямка по 50 µl стопинг разтвор.
2. ELISA за доказване на антитела срещу
CSFV—Erns (разграничителен тест)
Кратко описание:
Тестът се използва за детекция в серум на анти-
тела срещу Еrns—протеина на вируса на КЧС. Тес-
тът е основан на блокиране чрез специфичните се-
румни антитела на свързването между Еrns—с па-
цифични моноклонални антитела и Еrns—протеи-
на. Предназначен е за разграничаване на антитела-
та, образувани след ваксинация с Е2 субединична
ваксина, и на тези, образувани след ваксинация с
конвенционална ваксина или след размножаването
на теренен вирус на КЧС в организма на свинете.
Процедура
2.1. Всички реагенти, съдържащи се в кита и
допълнителните плаки, се темперират.
2.2. Референтните серуми се реконституират с
деминерализирана вода.
2.3. Конският серум и антигенът се реконсти-
туират с дестилирана или деминерализирана вода.
2.4. Приготвя се ELISA буфер от предварител-
но разредения с дестилирана или деминерализи-
рана вода разтварящ буфер и 5 % конски серум.
2.5. Антигенът и конюгатът се довеждат до
работно разреждане с ELISA буфер.
2.6. Приготвя се миещ разтвор.
2.7. Върху допълнителните плаки се диспенси-
рат по 12 µl ELISA буфер в А1 и В1 и по 45 µl от
същия буфер в останалите ямки.
2.8. В А1 и В1 се диспенсира по 30 µl от референ-
тен серум 1, в С1 и 1—също, в Е1 и F1—30 µl от
референтен серум 2, и в G1, Н1—по 30 µl от рефе-
рентен серум 3.
2.9. В ямки от А12 до Н12 се диспенсира по 30 µl
от 88 изследвани серума.
2.10. В ямки от С1 до Н12 се диспенсира по
75 µl от работния разтвор на антигена, плаката се
затваря, разклаща се леко и се инкубира за 30 min
при 37 °С.
2.11. След приключване на инкубацията се от-
варят покритите с антитела ELISA плаки, диспен-
сират се по 50 µl работен разтвор на конюгата във
всички ямки и с помощта на 12-канална пипета се
прехвърлят във всички ямки по 50 µl от обема на
всички ямки в допълнителните плаки.
2.12. Плаките се покриват, леко се разклащат и
се инкубират за 1 h при 37 °С.
2.13. ELISA плаките се мият 6 пъти с разчет
200—300 µl миещ разтвор на ямка. След всеки
цикъл плаките внимателно се затварят.
2.14. Във всяка ямка се диспенсира по 100 µl
разтвор на хромоген/субстрат и се инкубира за
30 min при стайна температура.
2.15. Реакцията се спира чрез добавяне на 100 µl
стопразтвор във всяка ямка.
2.16. Реакцията се отчита не по-късно от 15 min
след добавянето на стопразтвор. Измерва се оптич-
ната плътност на всяка ямка и резултатите се кал-
кулират по указана от производителя формула.
Валидация и интерпретация на резултатите
Тестът е валиден при ODmax
най-малко 1.000.
Стойността на blank OD450
по-малко от 0.150.
Процент инхибиция на референтен серум 2 по-
голяма от 50 %.
Процент инхибиция на референтен серум 3 по-
малка от 50 %.
Като положителни (има наличие на специфич-
ни антитела срещу протеин Еrns на вируса на КЧС)
се определят всички серуми със стойности на про-
цент инхибиция, по-големи от 50 %.
Като отрицателни (няма наличност на специ-
фични антитела срещу протеин Еrns на вируса на
КЧС) се определят всички серуми със стойности
на процент инхибиция, по-малки от 50 %.