Държавен вестник, бр. 91, 2002 г., стр. 87

Б Р О Й  91
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  87
Прибавя се 1 g калциев хлорид (2.10) и се разклаща
енергично. Филтрува се през филтърна хартия (3.9) в
делителна фуния от 250 cm3  (ml), съдържаща 75 cm3  (ml)
диетилов етер и се разклаща енергично в продължение
на 1 min. Оставя се да се разделят слоевете и водният
слой се излива в конична колба 250 cm3 (ml). Етерният
слой се отстранява.
Като се използва индикаторна хартия (3.10), рН на
водния слой се довежда до около 2 с помощта на 4 М
солна киселина (2.8). Прибавят се 10 cm3 (ml) диетилов
етер (2.3), колбата се запушва и се разбърква енергично
в продължение на 1 min. Оставя се да се разделят сло-
евете и етерният слой се прехвърля в ротационен изпа-
рител (3.12). Водният слой се изхвърля.
Етерният слой се изпарява почти до сухо и остатъ-
кът се разтваря в 1 cm3 (ml) диетилов етер (2.3). Разтво-
рът се прехвърля в шишенце за проби (3.11).
4.2. Тънкослойна хроматография
За всички стандартни разтвори и от проби, които
ще се хроматографират, се нанасят със спринцовка (3.5)
по около 3 µl от разтвора на литиев карбонат (2.20) на
еднакви разстояния върху стартовата линия на концент-
риращата зона на плаката за ТСХ (3.4) и тя се изсушава
в поток от студен въздух.
Плаката се поставя върху нагревателната плоча
(3.13), загрята до 40 °С, за да остават петната колкото
е възможно по-малки. С микроспринцовка (3.5) точно
върху петната от литиев карбонат се нанасят по 10 µl от
стандартните разтвори (2.18) и от разтвора на пробата
(4.1) върху стартовата линия на плаката.
Накрая се нанасят по около 15 µl от реактива за
дериватизация (2.19) (2-бром-2'-ацетонафтон), отново
точно върху петната, където са нанесени стандартните
разтвори и разтворът на пробата, както и разтворът на
литиев карбонат.
Плаката се нагрява в сушилня (3.7) при температу-
ра 80 °С в продължение на 45 min. След охлаждане пла-
ката се поставя в хроматографската вана (3.2), която
предварително е доведена до равновесие за 15 min (без
да се прилага облицоване с филтърна хартия) с подвиж-
ната фаза (2.21). Плаката престоява, докато фронтът на
елуента достигне разстояние 15 cm от стартовата линия
(това може да отнеме приблизително 80 min).
Плаката се изсушава в ток от студен въздух и по-
лучените петна се разглеждат под УВ светлина (3.3).
За засилване на флуоресценцията на бледите петна
плаката може да се потопи в сместа течен парафин/
n-хексан (2.22).
5. Отчитане на резултатите
Изчислява се Rf-стойността на всяко петно.
Сравнява се Rf-стойността и поведението при УВ
облъчване на петната от пробата и петната от стандарт-
ните разтвори.
Прави се предварително заключение относно при-
съствието и идентичността на наличните консерванти.
Провежда се ВЕТХ, описана в част Б, или ако се докаже
пропионова киселина—газова хроматография, описана
в част Б. Сравняват се получените времена на задържа-
не с тези на стандартните разтвори.
Обобщават се резултатите от ТСХ, ВЕТХ или ГХ и
на тази база се определя окончателната идентифика-
ция на присъстващите в пробата консерванти.
Б. Определяне на бензоена киселина, 4-хидрокси-
бензоена киселина, сорбинова киселина и салицилова
киселина
1. Принцип
След подкисляване пробата се екстрахира със смес
от етанол и вода. След филтруване консервантите се
определят посредством високоефективна течна хрома-
тография (ВЕТХ).
2. Реактиви
2.1. Всички реактиви трябва да са с квалификация
“чист за анализ” (ч.з.а.), а където е необходимо с чис-
тота “за ВЕТХ”.
Използваната вода трябва да бъде бидестилирана
или с еквивалентна чистота.
2.2. Етанол, абсолютен.
2.3. 4-хидроксибензоена киселина.
2.4. Салицилова киселина.
2.5. Бензоена киселина.
2.6. Сорбинова киселина.
2.7. Натриев ацетат (CH3COONa.3H2O).
2.8. Оцетна киселина (d420 = 1,05 g/cm3 (ml).
2.9. Ацетонитрил.
2.10. Сярна киселина—2 М.
2.11. Калиев хидроксид—0,2 М.
2.12. 2-метоксибензоена киселина.
2.13. Смес етанол-вода: смесват се девет обема ета-
нол (2.2) и един обем вода (2.1).
2.14. Разтвор на вътрешен стандарт
Приготвя се разтвор, който съдържа около 1g с точ-
ност 0,001 g 2-метоксибензоена киселина (2.12) в
500 cm3 (ml) смес етанол-вода (2.13).
2.15. Подвижна фаза за ВЕТХ.
2.15.1. Ацетатен буфер: към 1 dm3 (l) вода се приба-
вят 6,35 g натриев ацетат (2.7) и 20,0 cm3 (ml) оцетна
киселина (2.8) и се разбърква.
2.15.2. Подвижната фаза се приготвя чрез смесване
на 9 обема ацетатен буфер (2.15.1) и един обем ацето-
нитрил (2.9).
2.16. Основен разтвор на консервантите
Претеглят се с точност 0,001 g около 0,05 g 4-хид-
роксибензоена киселина (2.3), 0,2 g салицилова кисели-
на (2.4), 0,2 g бензоена киселина (2.5) и 0,05 g сорбинова
киселина (2.6) в мерителна колба от 50 cm3 (ml) и се
долива до марката със смес етанол-вода (2.13). Разтво-
рът се съхранява в хладилник и е стабилен в продълже-
ние на една седмица.
2.17. Стандартни разтвори на консервантите
В серия от мерителни колби от 20 cm3 (ml) се поста-
вят съответно 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 и 0,50 cm3 (ml) от
основния разтвор (2.16). Във всяка колба се прибавят
по 10,00 cm3  (ml) от разтвора на вътрешен стандарт (2.14)
и по 0,5 cm3 (ml) 2 М сярна киселина (2.10). Допълва се
до марката със смес етанол-вода (2.13). Тези разтвори
се приготвят непосредствено преди употреба.
3. Апаратура
Стандартно лабораторно оборудване.
3.1. Водна баня, нагласена на 60 °С.
3.2. Високоефективен течен хроматограф с УВ де-
тектор с променлива дължина на вълната и 10 µl дози-
раща капиляра.
3.3. Аналитична колона
Неръждаема стомана: дължина—12,5 до 25 cm, вът-
решен диаметър—4,6 mm, пълнеж—Nucleosil 5C18 или
еквивалентен.
3.4. Филтърна хартия—диаметър 90 mm, Schleicher
& Schull, № 5892, бяла лента или еквивалентна.
3.5. Стъклени епруветки от 50 cm3  (ml) със запушал-
ки на винт.
3.6. Стъклени шишенца за проби от 5 cm3 (ml).
3.7. Парченца карборунд за кипене, размер 2 до 4 mm
или еквивалентни.
4. Процедура
4.1. Приготвяне на пробата
4.1.1. Приготвяне на проба без добавяне на вътре-
шен стандарт
В стъклена епруветка (3.5) 50 cm3  (ml) се претегля
1 g от пробата с точност 0,001 g. С пипета в епрувет-
ката се прибавя 1,00 cm3  (ml) 2 М сярна киселина (2.10)