Държавен вестник, бр. 27, 2007 г., стр. 16

С Т Р .  16
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  27
(1)
Стандартният размер на пробата е 200 клубена,
въпреки че процедурата може да бъде използ-
вана при по-малки проби, ако няма на разполо-
жение 200 клубена.
(2)
Методите на екстракция и концентрация
на патогена са описани в раздел 3.1.
(3)
Ако най-малко два теста, на базата на различни
биологични принципи, са положителни, трябва
да се направи изолация и потвърждаване. Из-
вършва се поне един скринингов тест. Когато
той е отрицателен, се счита, че пробата е отри-
цателна. Когато той е положителен, трябва да
се направи втори или няколко скринингови тес-
та, на базата на различни биологични принци-
пи, за да се провери първият положителен ре-
зултат. Ако вторият или другите тестове са от-
рицателни, се счита, че пробата е отрицателна.
Не са необходими допълнителни тестове.
(4)
Имунофлуоресцентен тест (IF).
Винаги използвайте поликлонално антитяло за
IF скрининг, допълнителни моноклонални ан-
титела могат да осигурят повече специфичност
(виж раздел 4).
(5)
PCR тест. Използвайте подходящи валидирани
реагенти и протоколи (виж раздел 6).
(6)
FISH тест. Използвайте валидирани реагенти и
протоколи (виж раздел 5).
(7)
Селективно изолиране.
С MTNA среда или NCP-88 и разреждане 1/100
от разтворената утайка това в много случаи е
подходящ метод за директно изолиране на C.
m. subsp. sepedonicus. Типични колонии се наб-
людават от 3 до 10 дни след посявка. След това
патогенът може да бъде пречистен и иденти-
фициран. За пълно използване на възможнос-
тите, които дава този тест, е необходимо вни-
мателна подготовка на конусчетата, за да се
избегнат зарази от сапрофитни бактерии, кои-
то се явяват конкуренти на C. m. subsp.
sepedonicus върху средата и могат да се развият
по-бързо от патогена. Ако тестовете с блюда-
та се провалят, трябва да се направи изолира-
не от растения, използвани за биологичния тест
(виж раздел 8).
(8)
Биологичният тест се използва за изолиране на
C. m. subsp. sepedonicus от утайки от растителен
екстракт, чрез селективно обогатяване в патла-
джан (Solanum melongena). Тестът изисква оп-
тимални условия на инкубация, както е опреде-
лено в този метод. Бактерии, инхибиращи C. m.
subsp. sepedonicus на MTNA или NCP-88 среда,
най-вероятно няма да повлияят в този тест (виж
раздел 7).
(9)
Типичната морфология на колонията е описана
в раздел 8.
(10)
Култивирането или биологичният тест могат да
се провалят поради конкуренция или подтиска-
не от сапрофитни бактерии. Ако се получат по-
ложителни резултати при скрининговите тес-
тове, но тестовете за изолация са отрицателни,
повторете тестовете за изолация от същата утай-
ка или чрез вземане на допълнителна проводя-
ща тъкан в близост до конусчетата от разряза-
ни клубени от същата проба и ако е необходи-
мо, тествайте допълнителни проби.
(11)
Сигурната идентификация на предполагаеми
чисти култури от C. m. subsp. sepedonicus се по-
лучава, като се използват тестовете, описани в
раздел 9.
(12)
Патогенният тест е описан в раздел 10.
(3)
Въпреки че директното изолиране на па-
тогена от растителна тъкан с типични симпто-
ми чрез разстилане е лесно осъществимо, то
отглеждането на културата може да пропадне
от по-напредналите стадии на инфекцията. Сап-
рофитните бактерии, които се развиват на бол-
ната тъкан, могат да изпреварят в растежа си
или да подтиснат патогена върху средата за изо-
лация. Следователно е препоръчително да се
използват както основни, така и селективни хра-
нителни среди, за предпочитане MTNA (раздел
8) или биологичен тест (раздел 7).
(4)
Описание на типичната морфология на коло-
нията е дадено в раздел 8.
(5)
Ако тестът за изолация е отрицателен, но сим-
птомите на болестта са типични, тогава изоли-
рането трябва да се повтори.
(6)
Сигурната идентификация на чиста култура от
C. m. subsp. sepedonicus се получава чрез изпол-
зване на тестовете, изброени в раздел 9.
(7)
Патогенният тест е описан в раздел 10.
1.2. Схема за установяване и идентифициране
на Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus в проби
от картофени клубени без симптоми
Принцип
Процедурата на изпитване е предназначена за
откриване на латентни инфекции в картофени
клубени. Положителен резултат от поне два скри-
нингови теста, на базата на различни биологични
принципи, трябва да се допълни от изолирането на
патогена; последвано, при изолирането на типич-
ни колонии, от потвърждаването на чиста култура
като C. m. subsp. sepedonicus. Положителен резул-
тат само от един от скрининговите тестове не е
достатъчен, за да се счете пробата за съмнителна.
Скрининговите тестове и изолационните тес-
тове трябва да позволяват откриване на 103 до 104
клетки/ml от повторно суспендирана утайка, вклю-
чени като положителни контроли във всяка се-
рия тестове.