Държавен вестник, бр. 31, 2008 г., стр. 28

С Т Р .  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  31
Е. Плазмена аглутинация
Плазмата, извлечена в съответствие с раздел
Д, буква “a”, може да бъде използвана незабавно
след центрофугиране, без да е нужно термично
стабилизиране. 0,05 ml плазма се смесват с 1 ml
антиген за 50 % серумна аглутинация, която съот-
ветства на разреждане 1:20 за серумна аглутина-
ция. Отчитането се извършва след 18 до 24 h инку-
биране при 37 °C. Като положителна се приема 50 %
или повече аглутинация.
Ж. Тест за микроаглутинация
1. Разредители се изготвят от 0,85 % физиоло-
гичен разтвор, фенолизиран при 0,5 %.
2. Антигенът се приготвя, както е описано в
раздел A, т. 6, 7 и 8, и се титрира, както е описано
в раздел A, т. 5. При използване на антиген се до-
бавя сафран O при 0,02 % (финално разреждане).
3. Стандартният серум е като по A.1.
4. Стандартният серум се доставя от Bundes-
gesundheitsamt, Berlin.
5. Тестът за микроаглутинация се провежда в
корита с клетки с конусовидни дъна с обем 0,250
ml, както следва:
a) предварително разреждане на серума: 0,050
ml от всеки серум, който ще се тества, се добавят
към всяка клетка, съдържаща 0,075 ml разреди-
тел; смесите се разклащат за 30 s;
б) постепенно серумно разреждане: приготвят
се най-малко три разреждания за всеки серум, за
целта предварително разредените (1:2,5) 0,025 ml
от всеки серум се взимат и прехвърлят към клет-
ка, съдържаща 0,025 ml разредител; по този начин
първото разреждане достига сила 1:5 и следващи-
те разреждания се изпълняват чрез дублиране;
в) добавяне на антиген: 0,025 ml антиген се
добавя към всяка клетка, съдържаща различните
серумни разреждания, след като бъдат разклаща-
ни за 30 s, коритата се затварят със съответните
им капаци и се държат при 37 °C за 20 до 24 h във
влажна атмосфера;
г) отчитане на резултатите: видът на седимен-
тация на антигена се оценява чрез изследване на
дъното на клетката, отразено във вдлъбнато огле-
дало, поставено върху нея; ако има негативна ре-
акция, антигенът формира седимент във формата
на компактна пъпка с чисти краища и с наситен
червен цвят; ако има положителна реакция от дру-
га страна, се формира равномерно разположено
разпръснато розово покривало; различните про-
центи на аглутинация се определят чрез сравнение
с антигенни проверки, показващи 0, 25, 50, 75 и
100 % аглутинация; заглавието на всеки серум се
изразява в международни единици на аглутинация
на милилитър; тестът включва проверки с отрица-
телен и положителен серум, разредени така, че да
съдържат 30 международни аглутиниращи едини-
ци на един ml.
З. Имуноензимен метод (ЕЛАЙЗА) за откри-
ване бруцелоза по говедата
1. Материалите и реагентите, които се използ-
ват, са, както следва:
a) твърда фаза—микроплаки, епруветки и дру-
га твърда фаза;
б) антиген, фиксиран към твърдата фаза със
или без помощ на поликлонални или моноклонал-
ни улавящи антитела;
в) тествана биологична течност;
г) субстрат, адаптиран към използвания ензим;
д) спиращ разтвор, ако е необходимо;
е) разтвори за разреждането на тестовите про-
би за приготвяне на реагенти и за измиване;
ж) отчитаща система, подходяща за използва-
ния субстрат.
2. Стандартизация и чувствителност на тест:
(1) Насипните млечни проби се класифицират
като отрицателни, ако дават реакция, по-малка от
50 % от онази, дадена от 1 в 10 000 разреждане на
втория международен бруцелозен стандартен се-
рум, изпълнен в “отрицателно” мляко.
(2) Индивидуалните серум проби се класифи-
цират като отрицателни, ако дават реакция, по-
малка от 10 % на тази, дадена от 1 в 200 разрежда-
не на втория международен бруцелозен стандар-
тен серум, направен във физиологичен разтвор или
друг признат разтвор, в съответствие с процедура-
та по чл. 17 след получаване на становището на
научния ветеринарен комитет.
Бруцелозните ЕЛАЙЗА стандарти са, както са
уточнени в раздел A, т. 1 и 2 (използват се при
разреждането, посочено върху етикета).
3. Условия за използване на ЕЛАЙЗА теста за
бруцелоза по говедата.
Методът ЕЛАЙЗА може да бъде използван при
проба от мляко или суроватка, взета от събраното
от ферма мляко с най-малко 30 % млечни крави в
процес на лактация.
Ако този метод е използван, се вземат мерки,
за да се гарантира, че взетите проби могат да бъ-
дат идентифицирани с животните, от които е било
взето млякото или серумите.
Приложение № 4
към чл. 41, т. 2
I. Тестове за ензоотична левкоза по говедата
Тестове за ензоотична левкоза по говедата се
провеждат чрез имунодифузионен тест при усло-
вията, описани в раздели A и Б, или чрез имуноен-
зимен метод (ЕЛАЙЗА) при условията, описани в
раздел В. Дифузионният метод може да бъде из-
ползван само за индивидуални тестове. Ако резул-
татите от теста бъдат оспорени с надлежно по-
твърдени доказателства, допълнителна проверка се
прави чрез средствата на имунодифузионния тест.
А. Агар гел имунодифузионен тест за ензоотич-
на левкоза по говедата
1. Антигенът, който следва да бъде използ-
ван, трябва да съдържа гликопротеини на левко-
зен вирус по говедата, да бъде стандартизиран
срещу стандартен серум (El серум), доставен от
Държавната ветеринарна серумна лаборатория,
Копенхаген.
2. Официалните институти, които отговарят за
калибрирането на стандартни работни антигени
на лабораторията срещу официалния EИО стан-
дартен серум (El серум), осигурен от State Veterinary
Serum Laboratory, Copenhagen, са:
а) Германия: Bundesforschungsanstalt fur
Viruskrankheiten der Tiere, Tubingen;
б) Белгия: Institut national de recherches vйtйrinaires,
Brussels;
в) Франция: Laboratoire national de pathologie
bovine, Lyon;