Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 46

С Т Р .  46
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
7.1.3. Отстранява се надутайката (супернатан-
та) и утайката се разтваря в 200 µl от фиксиращия
разтвор, приготвен < 24 часа предварително. Раз-
бърква се и се инкубира за един час в хладилник.
7.1.4. Центрофугира се за 7 минути при 7000 g,
отстранява се надутайката и утайката се разтваря
в 75 µl 0,01 М РВ (виж Допълнение 7).
7.1.5. Накапват се по 16 µl от фиксиращата сус-
пензия върху чисто многогнездно предметно стък-
ло, както е показано на фиг. 7.1. На всяко стъкло
се слагат по две различни проби, неразредени, и се
използват 10 µl за разреждане 1:100 (в 0,01 М РВ).
Останалият разтвор от пробата (49 µl) може да се
съхрани при -20 °С след добавяне на 1 обем 96 %
етанол. Ако е необходимо да се повтори FISH
тестът, етанолът се отстранява чрез центрофуги-
ране и се добавя равен обем 0,01 РВ (размесен
чрез разбъркване).
Фиг. 7.1. Схема на разположение на предметно
стъкло за FISH тест
Проба 1 Празно Празно Празно Проба 2
Ў
1
2
3
4
5
Проба 1 Празно Празно Празно Проба 2
6
7
8
9
10
Покривно стъкло 1
Покривно стъкло 2
7.1.6. Предметните стъкла се изсушават на въз-
дух (или в сушилня при 37 °С) и се фиксират на
пламък.
На този етап процедурата може да се прекъсне
и да се продължи с хибридизацията на другия ден.
Предметните стъкла се съхраняват обезпрашени
и сухи на стайна температура.
7.2. Хибридизация
7.2.1. Клетките се дехидрират, като всяко пред-
метно стъкло се поставя за 1 минута в етанолова
серия с нарастващ процент—50 %, 80 % и 96 %.
Предметните стъкла се изсушават на въздух, пос-
тавени в държател.
7.2.2. Приготвя се влажна камера за инкубация,
като дъното на херметизирана кутия се покрива
със салфетка или филтърна хартия, напоена с 1x
hybmix (Допълнение7). Кутията се преинкубира в
хибридизационна пещ при 45 °С за не по-малко от
10 минути.
7.2.3. Разпределят се по 10 µl от хибридизаци-
онния разтвор (Допълнение 7) в 8 прозореца (про-
зорци 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 и 10; виж фиг. 7.1) върху всяко
предметно стъкло, като двата централни прозоре-
ца (3 и 8) се оставят празни.
7.2.4. Върху първите и последните четири про-
зореца се поставят покривни стъкла (24 Ч 24 mm),
без да се отстранява въздухът. Предметните стък-
ла се поставят в предварително затоплената влаж-
на камера и се хибридизират за пет часа в пещта
при 45 °С на тъмно.
7.2.5. Приготвят се три химични чаши, съдър-
жащи 1 L Milli Q (молекулярно качество) вода, 1 L
1x hybmix (334 ml 3x hybmix и 666 ml Milli Q вода)
и 1 L 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix и 958 ml Milli Q
вода). Всяка чаша предварително се инкубира на
водна баня при 45 °С.
7.2.6. Отстраняват се покривните стъкла от
предметните стъкла и последните се поставят в
държател.
7.2.7. Отмива се излишъкът от пробата чрез
инкубиране за 15 минути в химичната чаша с 1x
hybmix при 45 °С.
7.2.8. Държателят се поставя в 1/8x hybmix миещ
разтвор и се инкубира за още 15 минути.
7.2.9. Предметните стъкла се потапят за крат-
ко време в Milli Q вода и се поставят върху филтър-
на хартия. Отстранява се излишната вода чрез
внимателно покриване на повърхността с филтър-
на хартия. Отмерва се с пипета 5 до 10 ml предпаз-
ващ от обезцветяване клей (например Vectashield,
Vecta Laboratories, Калифорния, САЩ, или равнос-
тоен) и върху цялото предметно стъкло се поставя
голямо покривно стъкло (24 Ч 60 mm).
7.3. Отчитане на резултатите от FISH теста
7.3.1. Предметните стъкла се наблюдават под
микроскоп, пригоден за епифлуоресцентна мик-
роскопия с увеличение от 630х или 1000х, с имер-
сионно масло. С филтър, подходящ за флуоресцен-
тен изотиоцианат (FITC), еубактериалните клет-
ки (включително и повечето грам-отрицателни
клетки) в пробата се оцветяват във флуоресцент-
но зелено. При използването на филтър за тетра-
метилродамин-5-изотиоцианат Су3—клетките на
R. solanacearum се оцветяват във флуоресциращо
червено. Сравнява се морфологията на клетките с
тази на положителните контроли. Клетките тряб-
ва да са светли, флуоресциращи и напълно оцвете-
ни. Ако оцветяването е нетипично, FISH тестът
(раздел VI.А.7) трябва да се повтори. Кладенчета-
та на стъклата се наблюдават по дължината на два
перпендикулярни диаметъра и по периметъра. За
пробите, които не показват никакви клетки или
малък брой клетки, се наблюдават поне 40 микро-
скопски полета.
7.3.2. Кладенчетата се наблюдават за светли,
флуоресциращи клетки с характерната морфоло-
гия на R. solanacearum (виж интернет страница
http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/
main). Интензитетът на флуоресценцията трябва
да е равен или по-силен от този на положителната
контрола. Клетките с непълно оцветяване или със
слаба флуоресценция не се зачитат.
7.3.3. При съмнение за заразяване тестът тряб-
ва да се повтори. Това става, когато всички пред-
метни стъкла в партидата показват положителни
клетки, поради заразяване на буфера или ако се
открият положителни клетки (извън кладенчета-
та на предметните стъкла) върху покритието на
предметните стъкла.
7.3.4. Няколко проблема са присъщи за спе-
цификата на FISH теста. В екстрактите от кар-
тофени конуси и растителни части от стъблата
могат да се появят фонови популации от флуо-
ресциращи клетки с атипична морфология и сап-
рофитни бактерии с кръстосано действие, чиито
размер и морфология са сходни до тези на R.
solanacearum.
7.3.5. Разглеждат се само флуоресциращите
клетки с типичен размер и морфология.
7.3.6. Интерпретиране на резултата от FISH
теста: