Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 64

С Т Р .  64
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
бавно се добавят 100 ml етилов ацетат (3.4) и се
разклаща силно с ръка в продължение на 15 s.
След това тръбичката се поставя за 3 min в ул-
тразвукова баня (4.1) и се разхлабва запушалка-
та. Центрофугира се в продължение на 2 min и
се прелива фазата на етиловия ацетат през фил-
тър от стъкловлакно (4.6) в разделителна фу-
ния с вместимост 500 ml. Екстрахирането на
пробата се повтаря с втора част от 100 ml ети-
лов ацетат. Комбинираните екстракти се изми-
ват в продължение на 1 min с 50 ml разтвор на
натриев хлорид—наситен натриев карбонат
(3.16) и се изхвърля водният слой.
Екстрахира се органичният слой в продъл-
жение на 1 min с 50 ml солна киселина (3.17).
Оставя се долният слой на киселината да изте-
че в разделителна фуния с вместимост 250 ml.
Повторно се екстрахира органичният слой в про-
дължение на една минута и половина с нови
50 ml разтвор на натриев хлорид и се комбини-
ра с първия екстракт. Измиват се комбини-
раните киселинни екстракти посредством за-
въртане в продължение на приблизително 10 s
с 10 ml етилов ацетат (3.4).
Водният слой се прехвърля количествено в
250 ml колба с кръгло дъно и се изхвърля орга-
ничната фаза. Изпарява се целият останал ети-
лов ацетат от киселинния разтвор, като се из-
ползва ротационен филмов (тънкослоен) изпа-
рител (2.4). Температурата на водната баня не
трябва да превишава 40°С. Под вакуум от приб-
лизително 25 mbar целият остатъчен етилов
ацетат ще бъде отстранен в рамките на 5 min
при температура 38°С.
5.3. Почистване
5.3.1. Подготвяне на колоната с амберлит
За всеки екстракт на пробата се подготвя по
една колона XAD-2. 10 g от подготвения амбер-
лит се прехвърлят (3.19) в стъклена колона (4.5)
с метанол (3.8). Добавя се една малка запушал-
ка от стъклен памук  в горната част на корито-
то от смола. Оставя се метанолът да изтече от
колоната и смолата се измива със 100 ml вода,
като потокът се спира веднага, щом течността
достигне горната част на коритото от смола.
Оставя се колоната да се уравновеси за 10 min
преди употреба. Не се допуска колоната да из-
тече напълно до сухо.
5.3.2. Почистване на пробата
Екстрактът се прехвърля (5.2) количестве-
но към горната част на подготвената колона от
амберлит (5.3.1) и се отмива, като се изхвърля
елюатът (отмитият разтвор). Скоростта на от-
миване не трябва да превишава 20 ml/min. Кол-
бата с кръгло дъно се изплаква с 20 ml солна
киселина (3.17), която се използва и за да се
измие колоната от смола. Евентуално остана-
лият киселинен разтвор се продухва с въздушен
поток. Изхвърлят се отмитите разтвори. Доба-
вят се 100 ml метанол (3.8) към колоната и се
оставя 5 до 10 min да изтече, като отмитият
разтвор се събира в 250 ml колба с кръгло дъно.
Оставя се останалият метанол за 10 min, за да
влезе в равновесие със смолата, и се продължа-
ва отмиването със скорост 20 ml/min, като от-
митият разтвор се събира в същата 250 ml колба
с кръгло дъно. Изпарява се метанолът върху
ротационния тънкослоен изпарител (4.2), като
температурата на водната баня не трябва да
превишава 40 °С. Остатъкът се прехвърля ко-
личествено в 10 ml калибрована колба, като се
използва подвижната фаза (3.21). Долива се до
маркировката с мобилната фаза и се смесва.
Една аликвотна (кратна) част се филтрува през
мембранен филтър (4.7). Този разтвор се запаз-
ва за определяне посредством високочестотна
хроматография със запазена фаза HPLC (5.4).
5.4. Определяне посредством HPLC
5.4.1. Параметри
Следните условия се предлагат като ръко-
водство, могат да се използват и други условия,
при условие че с тях се получават еквивалентни
резултати:
течна хроматографска колона (4.4.1);
мобилна фаза на HPLC (3.21);
скорост на потока: 1,5 до 2 ml/min;
дължина на вълната за откриване: 243 nm;
обем за инжектиране: 40 до 100 ml;
проверява се стабилността на хроматографска-
та система, като се инжектира калибриращият
разтвор (3.6.2), съдържащ 3 mg/ml, няколко пъти,
докато се постигне постоянна височина на пи-
ковете (или участъците) и време на задържане.
5.4.2. Графика на калибриране
Всеки калибриращ разтвор се инжектира
(3.6.2) няколко пъти и се измерват височините
на пиковете (или участъците) за всяка концен-
трация. Начертава се графиката на калибрира-
не, като се използват средните височини на
пиковете (участъците) на калибриращите раз-
твори като ординати, а съответните концент-
рации в mg/ml—като абсциси.
5.4.3. Разтвор на пробата
От пробата се инжектира (5.3.2) няколко
пъти, като се използва същият обем, който е
взет за калибриращите разтвори, и се определя
средната височина на пиковете (участъкът) за
халофугинона.
6. Изчисляване на резултатите
Концентрацията на разтвора на пробата в
mg/ml се определя от средната височина (учас-
тък) на пиковете за халофугинона, като се из-
ползват препратки към графиката на калибри-
рането (5.4.2).
Съдържанието на халофугинона в тегловни
проценти w (mg/kg) в пробата се дава със след-
ната формула:
c.10m
w = –––– ,
m
където:
c е концентрацията на халофугинона в разт-
вора на пробата в mg/ml;
m - масата на изпробваната част в грамове.