Държавен вестник, бр. 68, 2010 г., стр. 105

БРОЙ  68	
Д Ъ Р Ж А В Е Н  В Е С Т Н И К 	
СТР.  105  
21.5. Лабораторията трябва да установи според 
метода подходящи концентрации на активатора, 
като: минимална (прагова), средна (50 % активация) 
и максимална (плато на активацията), при които 
се активират достатъчен процент от лимфоцитите. 
21.6. Заедно с кръвта на изследваните пациенти 
като контрола се изследва кръв от здрав донор.
21.7. Всяко определяне включва негативна 
контрола (нестимулирана проба) за спонтанна 
активация и пролиферация на лимфоцити.
21.8. При флоуцитометричния метод вся­
ко определяне на активацията на лимфоцити 
включва изотипна контрола на активирана и 
неактивирана кръв. 
21.9. Когато се работи с изолирани клетки, 
концентрацията им трябва да бъде еднаква, а ко­
гато се работи с цяла кръв, обемът на материала 
е еднакъв във всяка ямка (епруветка). 
21.10. Строго се съблюдава качеството на 
използваната хранителна среда и допълващите я 
ингредиенти. По възможност се работи с продук­
тите на един установен производител. 
21.11. При използването на изотопен метод:
21.11.1. да се работи с една и съща минимална 
активност на изотопа;
21.11.2. внасянето на изотопа и прекъсването 
на култивирането се извършва винаги в точно 
определен час от общото време за култивиране;
21.11.3. използваните филтри за утаяване на 
клетките са с една и съща големина на порите.
21.12. За определяне на степента на активация 
чрез флоуцитометрия:
21.12.1. се използва експресията на повърхност­
ни активационни маркери (като CD69, HLA-DR 
и др.); препоръчва се моноклоналните антитела 
за активационните маркери да бъдат конюгирани 
с флуорохрома фикоеритрин и да се използват в 
комбинация с поне едно антитяло, определящо 
вида на лимфоцитната субпопулация (напр. CD3, 
CD4, CD8, CD56 и др.);
21.12.2. анализът е за най-малко 2500 клетки 
в аналитичния прозорец на изследваната субпо­
пулация.
21.13. Лабораторията има разработени кри­
терии за определяне степента на активация и 
пролиферация.
22. Количествено определяне на цитокини в 
супернатанти от стимулирани in vitro мононукле­
арни клетки.
22.1. Лабораторията може да определя количе­
ството на цитокини в супернатанти от стимулирани 
in vitro мононуклеарни клетки.
22.2. Прилагат се утвърдени методики за сти­
мулиране синтеза на цитокини in vitro.
22.3. За стимулатори на мононуклеарни клетки 
се използват митогени или специфични антигени.
22.4. Вариантът на метода (с изолирани лимфо­
цити или с цяла кръв) се подбира според целите 
на изследването.
22.5. Всички процедури по изолирането и 
култивирането на клетките, както и по обработ­
ването на цялата кръв, се извършват в стерилна 
непирогенна полистиренова посуда.
22.6. Когато се работи с изолирани клетки, 
концентрацията им във всички ямки трябва да 
бъде еднаква, а когато се работи с цяла кръв, 
обемът на материала е еднакъв във всяка ямка. 
22.7. Лабораторията определя времето за кул­
тивиране на клетките според характеристиката на 
търсения цитокин.
22.8. Лабораторията използва утвърдени методи, 
като имуноензимен метод, за определяне количе­
ството на съответния цитокин в супернатаната.
23. Количествено определяне на антиген-спе­
цифични CD4 и CD8 Т лимфоцити.
23.1. Лабораторията е в състояние да опреде­
ля количествено антиген специфичните CD4+ и 
CD8+ Т клетки чрез флоуцитометрия и ИЕМ на 
ниво единична клетка.
23.2. За неспецифичен активатор се използва 
най-често митоген в предварително определена 
работна концентрация. 
23.3. За специфичен активатор се използват 
съответни пептидни антигени в предварително 
определена работна концентрация. 
23.4. Всяко определяне на активацията на 
лимфоцити включва:
23.4.1. негативна контрола (нестимулирана 
проба);
23.4.2. положителна контрола – кръв, стимули­
рана с подходящ неспецифичен активатор-митоген.
23.5. При определяне на антиген-специфични 
Т лимфоцити на ниво единична клетка:
23.5.1. натоварването на плаките със съответните 
специфични моноклонални антитела, посяването и 
култивирането на клетъчния материал се извърш­
ват при спазване на общоприетите изисквания за 
стерилност;
23.5.2. лабораторията определя броя на антиген-
специфичните клетки по продукцията на цитокина 
IFN-g на ниво единична клетка;
23.5.3. работи се винаги с една и съща концен­
трация на клетките във всички ямки;
23.5.4. плаката се отчита изключително прециз­
но, като се изброява всеки отделен спот (петната), 
представляващ единичната цитокин-продуцираща 
антиген-специфична клетка; 
23.5.5. броят на антиген-специфичните клетки 
се отчита с помощта на стереомикроскоп или 
апарат за отчитане на спотовете (ELISpot Reader);
23.5.6. след отчитането плаките се съхраняват 
на тъмно и сухо място поне за една година.
23.6. При флоуцитометричния метод:
23.6.1. всяко определяне на активацията на 
лимфоцитите включва изотипна контрола на 
активирана (със специфичен антиген) и неакти­
вирана кръв;
23.6.2. за определяне на антиген специфичните 
клетки се използват моноклонални антитела, ко­
нюгирани с флуорохром, чрез които се установява 
коекспресията на повърхностни активационни 
маркери (като CD69) и вътреклетъчни цитокини 
(интерферон-g, TNF-a и др.);
23.6.3. антителата срещу активационните мар­
кери и интрацелуларните цитокини се използват 
в комбинация с поне едно антитяло, определящо 
вида на лимфоцитната субпопулация (напр. CD3, 
CD4, CD8, CD56 и др.);
23.6.4. изброяването обхваща най-малко 20 000 
лимфоцити в аналитичния прозорец (CD4 или 
CD8 Т лимфоцити). 
24. Определяне на фагоцитоза и оксидативен 
взрив.