Държавен вестник, бр. 109, 2002 г., стр. 38

С Т Р .  38
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  109
Пробата се екстрахира с Tween80—метано-
лов разтвор. След центрофугиране и филтруване
екстрактът се разрежда и неговата антибиотич-
на активност се определя чрез измерване дифу-
зията на виржиниамицина в агарова среда, зася-
та със Sarcina lutea. Дифузията става видима по
образуването на зони на инхибиране в присъст-
вието на микроорганизма. Диаметърът на тези
зони е право пропорционален на логаритъма на
концентрацията на антибиотика.
3. Микроорганизъм—Sarcina lutea, ATCC
№ 9341
3.1. Поддържане на родителския щам
Инокулира се със Sarcina lutea епруветка
скосен агар с хранителна среда (4.1). Инкубира
се в течение на 24 h при около 35°C. Културата
се съхранява в хладилник и с нея всеки 14 дни се
реинокулира скосен агар.
3.2. Приготвяне на бактериална суспенсия
Бактериите се събират от наскоро приготве-
на епруветка скосен агар (3.1) в 2 до 3 ml физи-
ологичен разтвор (4.3). С тази суспенсия се
инокулира колба на Roux, съдържаща 250 ml
хранителна среда (4.1). Култивира се в продъл-
жение на 24 h при температура 35°C, след което
бактериите се събират в 25 ml физиологичен
разтвор (4.3). Суспенсията се хомогенизира и се
разрежда така, че да се получи пропускливост
на светлината 75% при 650 nm. Тази суспенсия
се съхранява в хладилник и може да се използва
една седмица.
За различните концентрации на виржиниа-
мицин, които се използват, предварително се
определя количеството на инокулума, който
дава възможно най-големите и ясни зони на
инхибиране. Това се извършва върху стъклени
плочи с основната среда за определянето (4.1).
Хранителната среда се инокулира при темпе-
ратура от 48 до 50°C.
4. Хранителна среда и реактиви
4.1. Основна среда за определянето:
глюкоза—1 g;
трипсинов пептон—10 g;
месен екстракт—1,5 g;
дрождев екстракт—3 g;
агар, в зависимост от качеството—от 10 до 20 g;
дестилирана вода—до 1000 ml;
рН се коригира до стойност 6,5 преди упот-
реба.
4.2. Разтвор на фосфатен буфер с рН 6:
монокалиев фосфат, KH2PO4, ч.з.а.—8,0 g;
дикалиев фосфат, K2HPO4.2H2O, ч.з.а.—2,0 g;
дестилирана вода—до 1000 ml.
4.3. Стерилен физиологичен разтвор.
4.4. Чист метанол.
4.5. Смес от разтвор на фосфатен буфер (4.2)
и чист метанол в съотношение 80/20 по обем.
4.6. 0,5%-ен (т/о) разтвор на Tween80 в мета-
нол.
4.7. Стандартна субстанция: виржиниамицин
с известна активност.
5. Стандартни разтвори
Приготвя се метанолов разтвор на стандар-
тната субстанция (4.7), съдържащ 800 µg/ml
виржиниамицин. От този резервен разтвор чрез
разреждане със сместа (4.5) се приготвя стан-
дартен работен разтвор S8, съдържащ 1 µg/ml
виржиниамицин. Като се използва сместа (4.5),
чрез серийни разреждания (1+1) се приготвят
следните концентрации:
S4—0,5 µg/ml;
S2—0,25 µg/ml;
S1—0,125 µg/ml.
6. Екстракция
6.1. Продукти със съдържание на виржини-
амицин 50 ppm или по-малко
Взема се проба от 10 до 20 g, добавят се 100
ml от разтвора (4.6) и се разклащат в продълже-
ние на 30 min на клатачния апарат. Центрофу-
гира се или се филтрува, вземат се 20 ml от чис-
тия разтвор и се изпаряват до сухо на ротацио-
нен изпарител. Утайката се разтваря в 20 ml
или повече от сместа (4.5), за да се получи пред-
полагаема концентрация на виржиниамицин
1 µg/ml (= U8). След това чрез серийни разреж-
дания (1+1), като се използва сместа (4.5), се
приготвят концентрациите U4, U2 и U1.
6.2. Продукти със съдържание на виржини-
амицин повече от 50 ppm
Взема се проба от 1 до 10 g, добавят се 100 ml
от разтвора (4.6) и се разклащат в продължение
на 30 min на клатачния апарат. Центрофугира
се или се филтрува, филтратът се разрежда със
сместа (4.5), за да се получи предполагаема
концентрация на виржиниамицин 1 µg/ml (= U8).
След това се приготвят концентрациите U4, U2
и U1, както е указано в т. 6.1.
7. Метод за определяне
7.1. Инокулиране на хранителната среда
Основната среда за определянето (4.1) се
инокулира с бактериалната суспензия (3.2) при
температура от 48 до 50°C.
7.2. Подготовка на паничките
Дифузията в агар се провежда в панички, като
се използват четири концентрации на стандар-
тния разтвор (S8, S4, S2, S1) и четири концентра-
ции на екстракта (U8, U4, U2, U1). Във всяка
паничка трябва да бъдат разположени четири-
те концентрации на стандартния разтвор и на
екстракта.
За тази цел се избират достатъчно големи
панички, така че в агаровата среда да могат да
бъдат направени най-малко 8 кладенчета с ди-
аметър от 10 до 13 mm. Пресмята се количест-
вото на инокулираната хранителна среда (7.1)
да бъде такова, че да осигури равномерен слой
с дебелина 2 mm. За предпочитане е изследва-
нето да се провежда в съдчета, състоящи се от
стъклена плочка със съвършено пасващ пласт-
масов или алуминиев пръстен с диаметър
200 mm и височина 20 mm.