Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 56

С Т Р .  56
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
Б Р О Й  28
Реагент
Количество
Крайна кон-
за реакция
центрация
Стерилна ултрачиста вода
12,925 µl
10X PCR буфер (1)
2,5 µl
1X
(1,5 mM MgCl2)
BSA (фракция V) (10 %)
0,25 µl
0,1 %
d-NTP микс (20 mM)
0,125 µl
0,1 mM
Праймер Rs-1-F (10 µM)
2 µl
0,8 µM
Праймер Rs-1-R (10 µM)
2 µl
0,8 µM
Taq полимераза (5U/µl) (1)
0,2 µl
1 U
Обем на пробата
5,0 µl
Общ обем:
25,0 µl
(1) Методите са валидирани, като е използвана Taq по-
лимераза от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.
(б) PCR специфичен за биовар 3/4/5
Реагент
Количество
Крайна кон-
за реакция
центрация
Стерилна ултрачиста вода
14,925 µl
10X PCR буфер (1)
2,5 µl
1X
(1,5 mM MgCl2)
BSA (фракция V) (10 %)
0,25 µl
0,1 %
d-NTP микс (20 mM)
0,125 µl
0,1 mM
Праймер Rs-1-F (10 µM)
1 µl
0,4 µM
Праймер Rs-3-R (10 µM)
1 µl
0,4 µM
Taq полимераза (5U/µl) (1)
0,2 µl
1 U
Обем на пробата
5,0 µl
Общ обем:
25,0 µl
(1) Методите са валидирани, като е използвана Taq по-
лимераза от Perkin Elmer (AmpliTaq) и Gibco BRL.
4.3. Условия за PCR реакцията
Преминават се следните програми за специфич-
ните реакции на двата биовар 1/2 и биовар 3/4/5:
1 цикъл от:
а) 5 минути при 95 °С (денатурация
на матрична ДНК)
35 цикъла от:
б) 30 секунди при 95 °С (денатура-
ция на матрична ДНК)
в) 30 секунди при 58 °С (хибриди-
зация на праймерите)
г) 45 секунди при 72 °С (удължава-
не на копията)
1 цикъл от:
д) 5 минути при 72 °С (окончател-
но удължаване)
е) спиране при 4 °С.
NB: Тази програма е оптимизирана за изпол-
зване с термоцикльор MJ Research PTC 200. При
използване с други модели може да е необходи-
ма модификация на продължителността на стъп-
ки б), в) и г).
4.4. Анализ на фрагментите по отношение на
рестрикционните ензими.
PCR продуктите, амплифицирани от ДНК на
R. solanacearum, като се използват праймерите
Rs-1-F и Rs-1-R, произвеждат ясно изразен поли-
морфизъм по дължината на рестрикционните
фрагменти с ензим Bsm I или с Isoschizomere (нап-
ример Mva 1269 I) след инкубация при 65 °С за 30
минути. PCR продуктите, амплифицирани от
ДНК на R. solanacearum, като се използват прай-
мерите Rs-1-F и Rs-3-R, нямат рестрикционни
местоположения.
5. Приготвяне на зареждащия буфер (loading
buffer)
5.1. Bromphenol blue (10 % стоков разтвор)
Bromphenol blue
5 g
Дестилирана вода
(двойно дестилирана)
50 ml
5.2. Зареждащ буфер (Loading buffer)
Glycerol (86 %)
3,5 ml
Bromphenol blue (5,1)
300 µl
Дестилирана вода
6,2 ml
(двойно дестилирана)
6. 10Х Tris Acetate EDTA (TAE) буфер, pH 8,0
Tris buffer
48,40 g
Ледена оцетна киселина
11,42 ml
EDTA (disodium salt)
3,72 g
Дестилирана вода
1,00 L
Разрежда се до 1Х преди употреба.
Разпространява се в търговската мрежа (нап-
ример Invitrogen или негов еквивалент).
__________________
Допълнение 7
Валидирани реагенти за FISH тест
1. Олиго-праймери
Специфичен праймер за R. solanacearum OLI-1-
CY3: 5'-ggc agg tag caa gct acc ccc-3'
Неспецифичен еубактериален праймер EUB-
338-FITC: 5'-gct gcc tcc cgt agg agt-3'
2. Фиксиращ разтвор
(ВНИМАНИЕ! ФИКСАТОРЪТ СЪДЪРЖА
ПАРАФОРМАЛДЕХИД, КОЙТО Е ТОКСИЧЕН.
ТРЯБВА ДА СЕ ИЗПОЛЗВАТ РЪКАВИЦИ, ДА
НЕ СЕ ВДИШВА И ДА СЕ РАБОТИ В КАМИНА.)
а) Загряват се 9 ml молекулярна вода (напри-
мер ултрачиста вода (UPW) до приблизително 60 °С
и се добавя 0,4 g параформалдехид. Параформал-
дехидът се разтваря след добавяне на 5 капки 1N
NaOH и разбъркване с магнитна бъркалка.
б) Регулира се pH до 7,0 чрез добавяне на 1 ml
0,1М фосфатен буфер (PB; pH 7,0) и 5 капки 1N
HCl. Проверява се pH с индикаторни лентички и
при необходимост се регулира с HCl или NaOH.
(ВНИМАНИЕ! ДА НЕ СЕ ИЗПОЛЗВА PH МЕ-
ТЪР В РАЗТВОРИ С ПАРАФОРМАЛДЕХИД.)
в) Разтворът се филтрира през 0,22 µm мембра-
нен филтър и се предпазва от запрашаване при 4 °С
до следващата употреба.
3. 3Х Hybmix
NaCl
2,7 М
Tris—HCl
60 mM (pH 7,4)
EDTA (филтриран и
15 mM
автоклавиран)
Разрежда се до 1Х съгласно изискванията.
4. Хибридизиращ разтвор (Hybridisation solution)
1Х Hybmix
Sodium dodecyl sulphate (SDS)
0,01 %
Formamide
30 %
Праймер EUB 338
5 ng/µl
Праймер OLI-1 или OLI-2
5 ng/µl
Приготвя се хибридизиращ разтвор в количес-
тва, които се определят по таблица 1. За всяко
предметно стъкло (съдържащо по два броя от 2
различни проби) е необходим 90 µl хибридизиращ
разтвор. ВАЖНО! ФОРМАМИДЪТ Е МНОГО
ТОКСИЧЕН И Е НЕОБХОДИМО ДА СЕ ИЗПОЛ-
ЗВАТ РЪКАВИЦИ И ДА СЕ ВЗЕМАТ НЕОБХО-
ДИМИТЕ ПРЕДПАЗНИ МЕРКИ!