Държавен вестник, бр. 28, 2007 г., стр. 35

Б Р О Й  28
Д Ъ Р Ж А В Е Н   В Е С Т Н И К
С Т Р .  35
Гранулите PHB в клетките на Ralstonia
solanacearum се визуализират след поставяне на
капка от заразената тъкан и оцветяване с Нилско
синьо А или със Суданска чернилка (Виж раздел
VI.А.2 )
2.3. Серологични аглутинационни тестове
(Виж раздел VI.А.3.).
2.4. Други тестове
Други подходящи скринингови тестове са: IF
тест (виж раздел VI.А.5), FISH тест (виж раздел
VI.А.7), ELISA тест (виж раздел VI.А.8) и PCR тест
(виж раздел VI.А.6).
3. Процедура за изолиране
а) Взема се капка ексудат или участък обез-
цветена тъкан от проводящия пръстен на карто-
фения клубен или от проводящите снопчета на
стъблото от картофени, доматени или други увех-
нали растения гостоприемници. Суспендира се в
малък обем стерилна дестилирана вода или
50 mM фосфатен буфер (допълнение 4) и се оста-
вят за 5 до 10 минути.
б) Изготвя се серия десетични разреждания на
суспензията.
в) 50—100 µl от суспензията и разрежданията
се прехвърлят върху основна хранителна среда (NA,
YPGA или SPA; виж допълнение 2) и/или тетразо-
лиева среда на Келман (допълнение 2) и/или вали-
дирана селективна среда (например SMSA; виж
допълнение 2). Разстила се или се прави щрихово
посяване с подходяща техника за разреждане. Ако
е целесъобразно, се подготвят отделни блюда с
разредена клетъчна суспензия на R. solanacearum
биовар 2 като положителна контрола.
г) Блюдата се инкубират за период от 2 до 6 дни
при 28 °С.
—Върху основните хранителни среди вирулент-
ните изолати на R. solanacearum развиват перлени
кремаво-бели плоски, течни колонии с неправил-
на форма, често с характерни розетки в центъра.
Авирулентните форми на R. solanacearum образу-
ват малки, кръгли, по-слабо разлети, маслени ко-
лонии, които са изцяло кремаво-бели.
—Върху тетразолиева среда на Келман и SMSA
колониите са с кървавочервен център. Авирулент-
ните форми на R. solanacearum образуват малки,
кръгли, по-слабо разлети, маслени колонии, кои-
то са изцяло тъмночервени.
4. Идентификационни тестове за R. solanacearum
Тестове за потвърждаване идентичността на
предполагаеми изолати на R. solanacearum са да-
дени в раздел VI.Б.
Раздел III
1. Подробни методи за установяване и иденти-
фициране на R. solanacearum в проби от картофени
клубени без симптоми
1.1. Подготовка на пробата
Забележка:
—Размерът на стандартната проба е 200 клубе-
на за едно изпитване. По-интензивното пробовзе-
мане изисква повече тестове върху проби с такъв
размер. По-големият брой на клубените в пробата
води до инхибиране или трудности при интерпре-
тиране на резултатите. Но процедурата е удобна за
използване при проби с по-малко от 200 клубена,
когато наличните клубени не достигат.
—Валидирането на всички методи за установя-
ване на наличие, описани по-долу, става на базата
на изпитване на проби от 200 клубена.
—Картофеният екстракт, описан по-долу, може
също да се използва за установяване наличието на
бактерията Clavibacter michiganensis (Smith) Davis
et al. ssp. sepedonicus, причиняваща пръстеновидно
гниене по картофите.
Незадължително предварително третиране
преди подготовката на пробата:
а) Инкубация на пробите при 25 до 30 °С за
период до две седмици преди изпитването с цел
насърчаване на мултиплицирането на евентуални
популации на R. solanacearum.
б) Измиване на клубените. Използват се подхо-
дящи дезинфектанти (хлорни съединения, когато
ще се използва PCR тест, за да се отстрани пато-
генната ДНК) и детергенти между всяка проба.
Клубените се изсушават на въздух. Тази процедура
за измиване е особено полезна (но не е задължи-
телна) за силно замърсени с пръст проби или ако
трябва да се направи PCR тест или процедура за
директна изолация.
1.1.1. Отстранява се с чист и дезинфекциран
скалпел или нож за зеленчуци кората в края откъм
столона на всеки клубен така, че да се вижда про-
водящата тъкан. Внимателно се изрязва малка част
(конус) от проводящата тъкан в края откъм столо-
на с минимално количество непроводяща тъкан.
(Виж Интернет страница http://forum.europa.eu.int/
Public/irc/sanco/Home/main).
Забележка: Отделят се всички (загнили) клубе-
ни с предполагаеми симптоми на кафяво гниене и
се изпитват отделно.
Ако при вземането на конус се наблюдават симп-
томи на кафяво гниене, се прави визуална проверка
на клубена и той се разрязва близо до края откъм
столона. Всеки разрязан клубен с предполагаеми
симптоми трябва да се запази най-малко два дена
при стайна температура, за да се създаде възмож-
ност за суберизация, и да се съхрани в хладилник
(при температури от 4 до 10 °С) при подходящи
карантинни условия. Всички клубени, включител-
но тези с предполагаеми симптоми, се съхраняват в
съответствие с изискванията на Приложение III.
1.1.2. Събират се конусчетата в неизползвани
съдове за еднократна употреба, които могат да се
затварят и/или запечатват (ако се използват пов-
торно, съдовете трябва да се почистят основно и
да се дезинфекцират с хлорни съединения). За пред-
почитане е конусите да се обработят незабавно.
Когато това не е възможно, те се съхраняват в съда,
без да се прибавя буфер, в хладилник за не повече
от 72 часа или за 24 часа при стайна температура.
Конусите се обработват с една от следните про-
цедури:
а) Конусите се покриват с достатъчно количес-
тво (около 40 ml) екстракционен буфер (Допълне-
ние 4) и се разбъркват на ротационна клатачна
машина (50—100 rpm) в продължение на 4 часа
при температура под 24 °С или в продължение на
16 до 24 часа охладени,
или
б) Конусите се хомогенизират с достатъчно
количество (около 40 ml) екстракционен буфер
(допълнение 4) или в блендер (например Waring