# การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยวิธีอิลลูมินา
การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยวิธีอิลลูมินา (Illumina dye sequencing) เป็นเทคนิคที่ใช้ในการตรวจหาลำดับเบสในดีเอ็นเอ หรือที่รู้จักกันในนาม การหาลำดับดีเอ็นเอ (DNA sequencing) แนวคิดนี้คิดค้นโดย Bruno Canard และ Simon Sarfati และพัฒนาโดย Shankar Balasubramanian และ David Klenerman ซึ่งต่อมาได้ก่อตั้ง Solexa โดยบริษัท Illumina ซึ่งวิธีการหาลำดับเบสนี้ขึ้นอยู่กับการเกิดสีที่ปลายนิวคลีโอไทด์ (dye-terminators) ซึ่งช่วยให้ระบุชนิดของเบส (single bases) ในขณะที่นำเข้าสู่สาย DNA นอกจากนี้ยังสามารถใช้หาลำดับจีโนมและ region sequencing การวิเคราะห์ทรานสคริปโตม (transcriptome) การศึกษากลุ่มของสารพันธุกรรมทั้งหมดของกลุ่มประชากรจุลินทรีย์ในสิ่งแวดล้อมที่จำเพาะ การค้นพบการเติมหมู่เมทิลในดีเอ็นเอ (DNA methylation profiling) และการวิเคราะห์ปฏิสัมพันธ์ของกรดนิวคลีอิก โปรตีน และจีโนม

ภาพรวม
อิลลูมินา เป็นเทคโนโลยีที่ใช้ในการหาลำดับ โดยมีการทำงานสามขั้นตอนคือ  การเพิ่มจำนวน การจัดลำดับ และการวิเคราะห์ เริ่มต้นกระบวนการด้วยการนำดีเอ็นเอที่บริสุทธิ์ มาตัดเป็นชิ้นเล็ก ๆ และต่อกับตัวรับหรือที่เรียกว่าอะแดปเตอร์ จากนั้นทำดัดแปลงโมเลกุลแล้วบรรจุลงในชิปเพื่อที่จะเพิ่มจำนวนและการจัดลำดับ ด้านล่างของชิปมีโอลิโกนิวคลีโอไทด์นับแสน (ดีเอ็นเอสายสั้นๆ) มันจะติดกับชิปและสามารถที่จะจับชิ้นส่วนดีเอ็นเอ เมื่อชิ้นส่วนของดีเอ็นเอเชื่อมต่อแล้วเฟสที่เรียกว่าการสร้างคลัสเตอร์จะเริ่มต้นขึ้น ขั้นตอนนี้ทำการคัดลอกชิ้นส่วนของดีเอ็นเอประมาณหนึ่งพันก๊อปปี้ ขั้นตอนถัดไป นำไพรเมอร์และนิวคลีโอไทด์ที่ถูกดัดแปลงจะเข้าสู่ชิป นิวคลีโอไทด์เหล่านี้มีตัวบล็อคที่ 3’ สามารถย้อนกลับได้ซึ่งบังคับให้โพลีเมอเรสมีการเพิ่มขึ้น ในนิวคลีโอไทด์เพียงหนึ่งครั้งเท่านั้นพร้อมกับติดแท็กสารเรืองแสง หลังจากการสังเคราะห์แต่ละรอบ กล้องจะถ่ายรูปชิปไว้และคอมพิวเตอร์จะตรวจสอบว่าเบสใดที่ถูกเพิ่มเข้ามาด้วยความยาวคลื่นของแท็กสารเรืองแสงและบันทึกทุกจุดบนชิป หลังจากแต่ละรอบ โมเลกุลที่ไม่มีการรวมกันจะถูกล้างออกไป จากนั้นจะใช้ขั้นตอนทางเคมีในการกำจัดปลาย 3’ และทำการย้อมสีย้อมในขั้นตอนเดียว กระบวนการนี้จะดำเนินต่อไปจนกระทั่งลำดับของดีเอ็นเอสมบรูณ์ ดังนั้นเทคโนโลยีนี้สามารถจัดลำดับดีเอ็นดีที่มีมากและขนาดใหญ่ได้พร้อมกัน

ขั้นตอน
การติดตัวติดตามบนดีเอ็นเอ ขั้นแรกหลังจากทำบริสุทธิ์ดีเอ็นเอแล้วนำดีเอ็นเอมาทำการหั่นให้ได้ดีเอ็นเอชิ้นเล็กๆแบบสุ่มโดยใช้เอ็นไซม์ทรานโพเอส  (Transposases)  จากนั้นจะนำอะแดปเตอร์ต่อเข้ากับปลายทั้งสองข้างของดีเอ็นเอที่ถูกตัด(กระบวนการไลเกชั่น) ส่วนสายที่ไม่ถูกต่อด้วยอะแดปเตอร์ จะถูกล้างออกไป

Reduced cycle amplification เป็นขั้นตอนที่เติม adapters ซึ่งประกอบด้วย Primer binding, indices และTerminal sequence ให้กับสายดีเอ็นเอแม่แบบโดยที่ indices ส่วนใหญ่มีความยาว 6 เบสใช้เพื่อแยกดีเอ็นเอตัวอย่างแต่ละชิ้นในระหว่างการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ตัวอย่าง โดย indices ที่ใช้จะมีลำดับแต่แตกต่างกันถึง 96 แบบ ซึ่งเมื่อคอมพิวเตอร์ทำการวิเคราะห์จะทำการรวมกลุ่ม indices ที่เหมือนกันเข้าด้วยกันแล้ววิเคราะห์ Terminal sequence ใช้เพื่อให้ดีเอ็นเอยึดกับ flow cell ซึ่งใน flow cell มีลำดับนิวคลีโอไทด์สายสั้นๆเคลือบอยู่ส่วนฐานของ flow cell ซึ่งทำหน้าที่ยึดกับดีเอ็นเอไว้กับที่ในระหว่างที่ทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ Terminal sequence สองแบบจะถูกเติมให้กับดีเอ็นเอ เมื่อดีเอ็นเอเข้าสู่ flow cell adapter แต่ละตัวก็จะจับกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell

Bridge amplification หลังจากที่ดีเอ็นเอตัวอย่างลงจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell  cluster generation จะเกิดขึ้นเพื่อที่จะสร้างดีเอ็นเอที่มีหน้าตาเหมือนดีเอ็นเอตัวอย่างทุกประการจำนวนมากโดยดีเอ็นเอที่ได้จะมีทั้งสาย forward strands  และ reverse strands โดยที่เอ็นไซม์พอลีเมอเรสเคลื่อนที่ไปตามดีเอ็นเอตัวอย่างเพื่อสร้างดีเอ็นคู่สม จากนั้นจะทำการล้างดีเอ็นเอตัวอย่างทิ้งไปโดยจะเหลือเส้น reverse strands ที่ติดกับ flow cell เท่านั้นที่ส่วนบนสุดของสายดีเอ็นเอ reverse strands มี adapters ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่สามารถจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell ได้จากนั้นเอ็นไซม์พอรีเมอเรสจับกับ reverse strands เพื่อสร้างสายดีเอ็นเอคู่สมซึ่งดีเอ็นเอคู่สมจะมีลำดับนิวคลีโอไทด์เหมือน forward strands  จากนั้นทำการแยกสายของดีเอ็นเอออกจากกันเพื่อให้ดีเอ็นเอจับกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell แล้วเกิดการต่อสายดีเอ็นเอขึ้น ซึ่งกระบวนการนี้เป็นการต่อสายดีเอ็เอหลายพันกลุ่มได้ในครั้งเดียว

Clonal amplification ดีเอ็นเอจะเกิดการโค้งงอและยึดติดกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell เรื่อยๆโดยเอ็นไซม์พอลีเมอเรสจะสังเคราะห์เพื่อสร้างสายดีเอ็นเอคู่สม(เกลียวคู่)จากนั้นจะถูกทำให้แยกสายเพื่อให้ดีเอ็นเอทั้งเส้น forward strands  และ reverse strands ยึดติดกับนิวคลีโอไทด์ที่อยู่บนฐานของ flow cell ที่ตำแหน่งข้างเคียง โดยในขั้น Clonal amplification มีความสำคัญในการควบคุมคุณภาพโดยสามารถตรวจสอบจากเส้น reverse strands ได้โดยที่เส้น forward strands  และ reverse strands สามารถใช้ตรวจเช็คเพื่อป้องกันข้อผิดพลาดได้ เนื่องจาก Illumina dye sequencing ใช้เอ็นไซม์ในปฏิกิริยาดังนั้นจึงอาจมีข้อผิดพลาดที่เกิดการแทนที่ได้ โดยเฉพาะที่ด้านปลาย 3’ โดยดีเอ็นเอทั้ง forward strands  และ reverse strands ควรมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เป็นคู่สมกัน ดังนั้นถ้ามีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันออกไปจะแสดงให้เห็นว่ามีข้อผิดพลาดเกิดขึ้น ซึ่งในห้องปฏิบัติการบางแห่งใช้เกณฑ์ยอมรับขั้นต่ำต้องเหมือนกันอย่างน้อย 97%

การหาลำดับนิวคลีโอไทด์ หลังจากสิ้นสุดขั้นตอน Clonal amplification สายดีเอ็นเอ reverse strands จะถูกตัดและล้างออกให้เหลือแต่ดีเอ็นเอ forward strands  Primers จะเกาะกับดีเอ็นเอ forward strands จากนั้น DNA Polymerase จะทำการต่อสายดีเอ็นเอโดยนำนิวคลีโอไทด์ที่ติดตามด้วย Fluorescent  โดยจะเกิดการเติมเบสเพียงหนึ่งเบสต่อรอบเท่านั้น ซึ่งในแต่ละนิวคลีโอไทด์จะมีการบล็อคปลาย 3’ (reversible terminator) เพื่อป้องกันการเติมเบสหลายเบสในหนึ่งรอบ โดยในเบสแต่ละแบบจะติดตามด้วย Fluorescent ที่มีสีและค่า emission ที่แตกต่างกันโดยเครื่องจะทำการอ่านสีในแต่ละรอบที่เติมเบส โดยเมื่ออ่านสายดีเอ็นเอแล้วดีเอ็นเอคู่สมที่ถูกสร้างมาจะถูกล้างออก จากนั้นให้ Index 1 primer เข้าจับกับ Index 1 ทำการต่อสาย Index จากนั้นทำการล้างสาย Index 1 ออก จากนั้นทำ Bridge amplification อีกครั้งโดยให้ปลาย3’ของสายดีเอ็นเอจับกับนิวคลีโอไทด์บนฐานของ flow cell เพื่อให้เกิดการต่อสายของดีเอ็นเอ reverse strands เมื่อได้สายดีเอ็นเอ reverse strands จะทำการตัดและล้างดีเอ็นเอ forward strands  ออกจากนั้นให้ทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ซ้ำอีกรอบกับสายดีเอ็นเอ reverse strands 

การวิเคราะห์ข้อมูล ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เกิดขึ้นมานับล้านนิวคลีโอไทด์ในครั้งเดียวจะถูกจัดกลุ่มตาม indices ซึ่งในแต่ละกลุ่มจะมีลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมือนกันประมาณ 1000 ชุด โดยลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้จากการวิเคราะห์ที่มีลำดับเหมือนกันจะถูกนำมาซ้อนทับกันซึ่งหากมีลำดับนิวคลีโอไทด์อ้างอิงสามารถนำข้อมูลมาเทียบกับลำดับอ้างอิงได้

การเปรียบเทียบกับวิธีการหาลำดับนิวคลีโอไทด์วิธีอื่น
เทคนิคการหาลำดับนิวคลีโอไทด์นี้มีข้อดีมากกว่าวิธีการหาลำดับนิวคลีโอไทด์แบบเดิม เช่น  Sanger sequencing เนื่องจาก เทคนิคการทำ Illumina sequencing สามารถที่จะหาลำดับนิวคลีโอไทด์ได้พร้อมกันหลายเส้น ซึ่งมีความถูกต้องแม่นยำที่สูงและรวดเร็ว นอกจากนี้ เทคนิคการทำ Illumina sequencing ใช้ DNA polymerase ที่มีราคาถูกกว่าที่ใช้ในเทคนิคอื่น

ตัวอย่างการใช้
เทคนิคการทำการหาลำดับนิวคลีโอไทด์ด้วยวิธี (Illumina dye sequencing) ถูกใช้เพื่องานวิจัย  การวิเคราะห์ทรานสคริปโตม (transcriptome) ในมันเทศ และการทำ  gymnosperm ในพืช จีนัส Taxus