# ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (,) เป็นการทดสอบทางชีวเคมี เชิงวิเคราะห์ที่ใช้กันทั่วไป ถูกใช้ครั้งแรกโดย Eva Engvall และ Peter Perlmann ในปี พ.ศ. 2514 โดยในการทดสอบดังกล่าวนี้เป็นการ ทดสอบเอนไซม์อิมมูโนแอสเซย์ (EIA) เพื่อตรวจจับการมีอยู่ของ ลิแกนด์ (โดยทั่วไปคือกรดอะมิโน) ในตัวอย่างของเหลวโดยใช้แอนติบอดีที่มุ่งเป้าไปที่ลิแกนด์ที่ต้องการวัด 

ELISA ถูกนำมาใช้เป็นเครื่องมือวินิจฉัยในทางการแพทย์ โรคในพืช และ เทคโนโลยีชีวภาพ รวมถึงการตรวจสอบ การควบคุมคุณภาพในอุตสาหกรรมต่าง ๆ

หนึ่งในรูปแบบที่เข้าใจง่ายที่สุดของการตรวจ ELISA คือ การนำแอนติเจน จากตัวอย่างที่ต้องการทดสอบมาเคลือบไว้บนพื้นผิว จากนั้นจะนำ แอนติบอดี ที่เหมาะสมมาใส่ในลงบนพื้นผิวเพื่อให้สามารถจับกับแอนติเจนที่เคลือบไว้บนผิวได้ แอนติบอดีนี้จะเชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ในที่นี้คือแอนติเจน) จากนั้นแอนติบอดีที่ไม่จับกับเอนไซม์ก็จะถูกกำจัดออก ในขั้นตอนสุดท้ายจะเติม substrate ของลงไป หากมีการจับกัน ปฏิกิริยาที่ตามมาจะก่อให้เกิดสัญญาณที่ตรวจจับได้ ซึ่งส่วนใหญ่คือการเปลี่ยนสี

การทำ ELISA ต้องใช้แอนติบอดีอย่างน้อยหนึ่งชนิดที่มีความจำเพาะต่อแอนติเจนนั้น ๆ ตัวอย่างที่มีแอนติเจนในปริมาณที่ไม่ทราบค่าจะถูกทำให้เคลื่อนที่บนตัวรองรับแบบของแข็ง (solid support โดยปกติจะเป็นแผ่นไมโครไทเตอร์โพลีส ไตรีน) แบบไม่จำเพาะ (ผ่าน การดูดซับ บนพื้นผิว) หรือแบบจำเพาะ (ผ่านการจับโดยแอนติบอดีตัวอื่นที่เฉพาะเจาะจงกับแอนติเจนเดียวกันในการทดสอบ ELISA แบบ "แซนด์วิช") 

หลังจากแอนติเจนถูกตรึงแล้ว จะเติมแอนติบอดีลงไป เพื่อสร้างสารเชิงซ้อนกับแอนติเจน แอนติบอดีในการตรวจจับสามารถเชื่อมโยงอย่างโควาเลนต์กับเอนไซม์ หรือสามารถตรวจจับตัวมันเองได้โดยใช้ แอนติบอดีรอง (secondary antibody) ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ผ่าน ไบโอคอนจูเกชัน ระหว่างแต่ละขั้นตอน โดยทั่วไปแผ่นจะถูกล้างด้วยสารละลาย detergent อ่อน ๆ เพื่อขจัดโปรตีนหรือแอนติบอดีที่ไม่ได้จับกันอย่างจำเพาะ หลังจากขั้นตอนการล้างครั้งสุดท้าย แผ่นจะได้รับการพัฒนาโดยการเติม substrate เอนไซม์เพื่อสร้าง สัญญาณ ที่มองเห็นได้ ซึ่งระบุปริมาณของแอนติเจนในตัวอย่าง

ที่น่าสังเกตคือ ELISA สามารถทำการทดสอบการจับกับลิแกนด์ รูปแบบอื่น ๆ แทนการทดสอบแบบ "immunoassays" ได้ แม้ว่าชื่อจะใช้คำว่า "อิมมูโน" ดั้งเดิมก็ตาม เนื่องจากการใช้กันทั่วไปและประวัติการพัฒนาของวิธีนี้ เทคนิคนี้ต้องการสารเชื่อมชนิดใดก็ได้ที่สามารถตรึงบนเฟสแข็งได้ พร้อมด้วยสารตรวจจับที่จะจับกับสารอื่นโดยเฉพาะและใช้เอนไซม์เพื่อสร้างสัญญาณที่สามารถวัดปริมาณได้อย่างถูกต้อง ในระหว่างการล้าง มีเพียงลิแกนด์และสารยึดจับจำเพาะที่เทียบเท่าเท่านั้นที่ยังคงถูกจับจำเพาะหรือ "ดูดซับภูมิคุ้มกัน" โดยปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจน-แอนติบอดี กับเฟสแข็ง ในขณะที่ส่วนประกอบที่ไม่จำเพาะหรือไม่จับจะถูกชะล้างออกไป ต่างจากรูปแบบการทดสอบในห้องปฏิบัติการแบบเปียกด้วยสเปกโตรโฟโตเมตริกอื่น ๆ ที่หลุมปฏิกิริยาเดียวกัน (เช่น คิวเวตต์) สามารถนำกลับมาใช้ซ้ำได้หลังจากการล้าง แต่เพลท ELISA จะมีผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาที่ดูดซับภูมิคุ้มกันบนเฟสแข็ง ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของเพลท จึงไม่สามารถนำกลับมาใช้ซ้ำได้ง่าย

 หลักการ 
ELISA เป็นเทคนิคทางชีวเคมีเชิงวิเคราะห์และเทคนิค "wet lab" ซึ่งเกี่ยวข้องกับการตรวจหา สารวิเคราะห์ (กล่าวคือ สารเฉพาะที่กำลังวิเคราะห์เชิงปริมาณหรือเชิงคุณภาพ) ในตัวอย่างของเหลวโดยใช้วิธีที่ยังคงใช้รีเอเจนต์ของเหลวในระหว่าง การวิเคราะห์ (กล่าวคือ ลำดับปฏิกิริยาทางชีวเคมีที่ควบคุมไว้ซึ่งจะสร้างสัญญาณที่สามารถวัดปริมาณและตีความได้ง่ายว่าเป็นการวัดปริมาณของสารวิเคราะห์ในตัวอย่าง) ที่ยังคงเป็นของเหลวและคงอยู่ในห้องปฏิกิริยาหรือบ่อน้ำที่จำเป็นในการกักเก็บสารตั้งต้น ซึ่งแตกต่างจากเทคนิค “dry lab” ที่ใช้แถบแห้ง แม้ว่าตัวอย่างจะเป็นของเหลว (เช่น หยดของเหลวเล็ก ๆ ที่วัดได้) ขั้นตอนการตรวจจับขั้นสุดท้ายในการวิเคราะห์แบบ "แห้ง" เกี่ยวข้องกับการอ่านแถบแห้งโดยใช้วิธีการต่าง ๆ เช่น การรีเฟลคโตเมตรี และไม่จำเป็นต้องใช้ห้องกักเก็บปฏิกิริยาเพื่อป้องกันการล้นหรือการผสมระหว่างตัวอย่าง

ในกรณีการทดสอบแบบไม่เป็นเนื้อเดียวกัน ELISA จะแยกส่วนประกอบบางส่วนของส่วนผสมปฏิกิริยาวิเคราะห์โดยการดูดซับส่วนประกอบบางส่วนลงบนเฟสของแข็งซึ่งถูกทำให้เคลื่อนที่ไม่ได้ทางกายภาพ ในการทดสอบ ELISA จะมีการเติมตัวอย่างของเหลวลงบนเฟสของแข็งคงที่ที่มีคุณสมบัติในการจับตัวเป็นพิเศษ จากนั้นตามด้วยรีเอเจนต์ของเหลวหลายชนิดที่เติมลงไป ฟัก และล้างตามลำดับ ตามด้วยการเปลี่ยนแปลงทางแสงบางอย่าง (เช่น การพัฒนาสีจากผลิตภัณฑ์ของปฏิกิริยาทางเอนไซม์) ในของเหลวขั้นสุดท้ายในหลุมที่ใช้วัดปริมาณของสารวิเคราะห์ การ "อ่าน" เชิงปริมาณโดยปกติจะใช้การตรวจจับความเข้มของแสงที่ส่งผ่านโดยใช้ เครื่องสเปกโตรโฟโตเมตรี ซึ่งเกี่ยวข้องกับการหาปริมาณการส่งผ่านแสงที่มีความยาวคลื่นเฉพาะบางส่วนผ่านของเหลว (รวมถึงก้นโปร่งใสของหลุมในรูปแบบแผ่นหลายหลุม)Msagati, T.A. (2017). Food Forensics and Toxicology. John Wiley & Sons. p. PT229. ISBN 9781119101383.Crowther, J.R. (1995). "Chapter 2: Basic Principles of ELISA". ELISA: Theory and Practice. Methods in Molecular Biology. Vol. 42. Humana Press. pp. 35–62. doi:10.1385/0-89603-279-5:1. ISBN 0896032795. PMID 7655571. ความไวในการตรวจจับขึ้นอยู่กับการขยายสัญญาณในระหว่างปฏิกิริยาวิเคราะห์ เนื่องจากปฏิกิริยาเอนไซม์เป็นกระบวนการขยายที่รู้จักกันดี สัญญาณจึงถูกสร้างขึ้นโดยเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับรีเอเจนต์ตรวจจับในสัดส่วนคงที่เพื่อให้สามารถวัดปริมาณได้อย่างแม่นยำ ดังนั้นจึงเรียกกันว่า "enzyme-linked"

สารวิเคราะห์นี้เรียกอีกอย่างว่าลิแกนด์ เนื่องจากจะจับหรือเชื่อมกับรีเอเจนต์ตรวจจับโดยเฉพาะ ดังนั้น ELISA จึงจัดอยู่ในหมวดหมู่ที่ใหญ่กว่าของ การทดสอบการจับกับลิแกนด์Msagati, T.A. (2017). Food Forensics and Toxicology. John Wiley & Sons. p. PT229. ISBN 9781119101383. รีเอเจนต์ยึดจับจำเพาะลิแกนด์จะถูก "ทำให้เคลื่อนที่ไม่ได้" กล่าวคือ โดยปกติจะเคลือบและทำให้แห้งที่ก้นโปร่งใส และบางครั้งยังรวมถึงผนังด้านข้างของหลุมด้วย (ซึ่งในที่นี้ "เฟสแข็ง" หรือ "สารตั้งต้นแข็ง" เป็นแบบคงที่ ตรงข้ามกับไมโครอนุภาค/เม็ดแข็งที่สามารถชะล้างออกไปได้) ซึ่งโดยปกติแล้วจะถูกสร้างขึ้นเป็นเพลตหลายหลุมที่เรียกว่า "เพลต ELISA" โดยทั่วไป เช่นเดียวกับรูปแบบอื่น ๆ ของ การวิเคราะห์ทางภูมิคุ้มกัน จะใช้ความจำเพาะของปฏิกิริยาประเภท แอนติเจน - แอนติบอดี เพราะสามารถสร้างแอนติบอดีเฉพาะต่อแอนติเจนจำนวนมากได้อย่างง่ายดายโดยใช้เป็นรีเอเจนต์ นอกจากนี้ หากสารวิเคราะห์นั้นเป็นแอนติบอดี แอนติเจนเป้าหมายสามารถใช้เป็นรีเอเจนต์ยึดได้

 ประวัติศาสตร์ 
ก่อนจะมีการพัฒนา ELISA ทางเลือกเดียวสำหรับการดำเนินการตรวจภูมิคุ้มกันคือ การตรวจด้วยเรดิโออิมมูโนแอสเซย์ ซึ่งเป็นเทคนิคที่ใช้แอนติเจนหรือแอนติบอดีที่ติดฉลากด้วย กัมมันตภาพรังสี ในการทดสอบภูมิคุ้มกันทางรังสี กัมมันตภาพรังสีจะส่งสัญญาณซึ่งบ่งบอกว่ามีแอนติเจนหรือแอนติบอดีเฉพาะอยู่ในตัวอย่างหรือไม่ การทดสอบภูมิคุ้มกันวิทยุได้รับการอธิบายครั้งแรกในเอกสารทางวิทยาศาสตร์โดย Rosalyn Sussman Yalow และ Solomon Berson ซึ่งตีพิมพ์ในปี พ.ศ. 2503

เนื่องจากกัมมันตภาพรังสีอาจก่อให้เกิดภัยคุกคามต่อสุขภาพ จึงมีการแสวงหาทางเลือกที่ปลอดภัยกว่านี้ ทางเลือกที่เหมาะสมในการทดสอบภูมิคุ้มกันทางรังสีคือการแทนที่สัญญาณที่ไม่กัมมันตภาพรังสี เมื่อเอนไซม์ (เช่น เอนไซม์เปอร์ออกซิเดสจากพืชตระกูลฮอร์สแรดิช) ทำปฏิกิริยากับสารตั้งต้นที่เหมาะสม (เช่น ABTS หรือ TMB) จะเกิดการเปลี่ยนสี ซึ่งถือเป็นสัญญาณ อย่างไรก็ตาม สัญญาณจะต้องเกี่ยวข้องกับการมีอยู่ของแอนติบอดีหรือแอนติเจน ซึ่งเป็นเหตุผลว่าทำไมจึงต้องเชื่อมโยงเอนไซม์กับแอนติบอดีที่เหมาะสม กระบวนการเชื่อมโยงนี้ได้รับการพัฒนาโดยอิสระโดย Stratis Avrameas และ GB Pierce เนื่องจากจำเป็นต้องกำจัดแอนติบอดีหรือแอนติเจนที่ไม่จับกันใด ๆ ออกด้วยการล้าง จึงต้องตรึงแอนติบอดีหรือแอนติเจนไว้กับพื้นผิวของภาชนะ กล่าวคือ จะต้องเตรียมสารดูดซับภูมิคุ้มกัน เทคนิคในการบรรลุผลดังกล่าวได้รับการตีพิมพ์โดย Wide และ Jerker Porath ในปี พ.ศ. 2509

ในปี พ.ศ. 2514 Peter Perlmann และ Eva Engvall จากมหาวิทยาลัยสตอกโฮล์มในสวีเดน และ Anton Schuurs และ Bauke van Weemen ในเนเธอร์แลนด์ ได้เผยแพร่เอกสารที่รวบรวมความรู้ดังกล่าวเป็นวิธีดำเนินการ EIA/ELISA โดยอิสระ

ELISA แบบดั้งเดิมโดยทั่วไปเกี่ยวข้องกับรายงาน โครโมเจนิก และสารตั้งต้นที่สร้างการเปลี่ยนแปลงสีที่สังเกตได้เพื่อบ่งชี้การมีอยู่ของแอนติเจนหรือสารวิเคราะห์ เทคนิคคล้าย ELISA ใหม่ใช้รีพอร์ตเตอร์ PCR แบบ ฟลูออ โรเจนิก อิเล็กโตรเคมีเรืองแสง และเชิงปริมาณ เพื่อสร้างสัญญาณที่วัดปริมาณได้ นักข่าวใหม่เหล่านี้อาจมีข้อดีหลายประการ รวมถึง ความไว ที่สูงขึ้นและ การมัลติเพล็กซ์ ในแง่ทางเทคนิค การทดสอบที่ใหม่กว่าประเภทนี้ไม่ถือเป็น ELISA อย่างแท้จริง เนื่องจากไม่ได้ "เชื่อมโยงกับเอนไซม์" แต่จะเชื่อมโยงกับรายงานที่ไม่ใช่เอนไซม์แทน อย่างไรก็ตาม เนื่องจากหลักการทั่วไปในการทดสอบเหล่านี้ค่อนข้างคล้ายคลึงกัน จึงมักถูกจัดกลุ่มอยู่ในประเภทเดียวกับ ELISA

ในปี 2012 การทดสอบ ELISA แบบใช้เอนไซม์ที่มีความไวสูงซึ่งใช้ อนุภาคขนาดนาโน เป็นตัวรายงานโครโมเจนิกสามารถให้สัญญาณสีได้ด้วยตาเปล่าจากการตรวจจับ แอตโตแกรม ของสารวิเคราะห์เพียงเล็กน้อย สีฟ้าจะปรากฏสำหรับผลลัพธ์เชิงบวก และสีแดงสำหรับผลลัพธ์เชิงลบ โปรดทราบว่าการตรวจจับนี้สามารถยืนยันการมีอยู่หรือการไม่มีอยู่ของสารวิเคราะห์ได้เท่านั้น ไม่ใช่ความเข้มข้นที่แท้จริง

 ประเภท 
มีการทดสอบ ELISA หลายวิธีสำหรับโมเลกุลเฉพาะที่ใช้แอนติบอดีที่ตรงกัน การทดสอบ ELISA แบ่งออกเป็นหลายประเภทขึ้นอยู่กับวิธีการจับและการใช้สารวิเคราะห์และแอนติบอดี ประเภทหลัก ๆ จะอธิบายไว้ที่นี่

 Direct 
thumb|530x530px| แผนภาพ ELISA โดยตรง
ขั้นตอนของ ELISA โดยตรง ปฏิบัติตามกลไกด้านล่าง:

 เติมสารละลายบัฟเฟอร์ของแอนติเจนที่ต้องการทดสอบลงในแต่ละหลุม (โดยทั่วไปคือเพลต 96-well plates) ของ เพลตไมโครไทเตอร์ จากนั้นให้เวลาเพื่อให้ยึดติดกับพลาสติกผ่านปฏิกิริยาประจุ
 เติมสารละลายโปรตีนที่ไม่ทำปฏิกิริยา เช่น อัลบูมินในซีรั่มวัว หรือ เคซีน ลงในแต่ละหลุม เพื่อปิดพื้นผิวพลาสติกในหลุมที่ยังไม่ได้เคลือบด้วยแอนติเจน
 เติม แอนติบอดีปฐมภูมิ ที่มีเอนไซม์ที่ติดอยู่ (คอนจูเกต) ซึ่งจะจับกับแอนติเจนทดสอบที่เคลือบหลุมโดยเฉพาะ
 จากนั้นจึงเติมสารตั้งต้นสำหรับเอนไซม์นี้ บ่อยครั้งที่สารตั้งต้นนี้จะเปลี่ยนสีเมื่อทำปฏิกิริยากับเอนไซม์
 ยิ่งความเข้มข้นของแอนติบอดีหลักในซีรั่มสูงขึ้น การเปลี่ยนสีจะยิ่งชัดเจนมากขึ้น มักใช้เครื่องสเปกโตรมิเตอร์เพื่อให้ค่าเชิงปริมาณสำหรับความเข้มของสี

เอนไซม์ทำหน้าที่เป็นตัวขยายสัญญาณ ถึงแม้ว่าจะมีแอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์เพียงไม่กี่ตัวที่ยังคงจับกันอยู่ โมเลกุลเอนไซม์ก็ยังจะสร้างโมเลกุลสัญญาณจำนวนมาก ภายใต้ข้อจำกัดตามสามัญสำนึก เอนไซม์สามารถผลิตสีได้อย่างไม่มีสิ้นสุด แต่ยิ่งมีแอนติบอดีจับได้มาก สีก็จะพัฒนาเร็วขึ้นเท่านั้น ข้อเสียเปรียบที่สำคัญของการตรวจ ELISA โดยตรงคือ วิธีการตรึงแอนติเจนไม่เฉพาะเจาะจง เมื่อใช้ซีรั่มเป็นแหล่งแอนติเจนทดสอบ โปรตีนทั้งหมดในตัวอย่างอาจเกาะติดกับหลุมเพลตไมโครไทเตอร์ ดังนั้น ความเข้มข้นเล็กน้อยของสารวิเคราะห์ในซีรั่มจะต้องแข่งขันกับโปรตีนในซีรั่มอื่น ๆ เมื่อจับกับพื้นผิวหลุม แซนวิชหรือ ELISA ทางอ้อมให้แนวทางแก้ไขปัญหานี้ด้วยการใช้แอนติบอดี "จับ" ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับแอนติเจนทดสอบเพื่อดึงออกจากส่วนผสมโมเลกุลของซีรั่ม[ จำเป็นต้องมีการอ้างอิง ]

ELISA อาจดำเนินการในรูปแบบเชิงคุณภาพหรือเชิงปริมาณ ผลเชิงคุณภาพให้ผลลัพธ์เชิงบวกหรือเชิงลบอย่างง่าย (ใช่หรือไม่) สำหรับตัวอย่าง การตัดสินใจระหว่างผลบวกและผลลบจะถูกกำหนดโดยนักวิเคราะห์และอาจเป็นวิธีทางสถิติ มักใช้ค่าสองหรือสามเท่าของค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (ข้อผิดพลาดที่เกิดขึ้นในการทดสอบ) เพื่อแยกแยะตัวอย่างเชิงบวกจากเชิงลบ ในการวิเคราะห์ ELISA เชิงปริมาณ ความหนาแน่นทางแสง (OD) ของตัวอย่างจะถูกเปรียบเทียบกับเส้นโค้งมาตรฐาน ซึ่งโดยทั่วไปจะเป็นการเจือจางแบบต่อเนื่องของสารละลายที่มีความเข้มข้นที่ทราบของโมเลกุลเป้าหมาย ตัวอย่างเช่น หากตัวอย่างการทดสอบส่งคืน OD ที่ 1.0 จุดบนเส้นโค้งมาตรฐานที่ให้ OD = 1.0 ต้องมีความเข้มข้นของสารวิเคราะห์เท่ากับตัวอย่าง[ จำเป็นต้องมีการอ้างอิง ]

การใช้และความหมายของชื่อ "ELISA ทางอ้อม" และ "ELISA โดยตรง" แตกต่างกันไปในเอกสารและบนเว็บไซต์ ขึ้นอยู่กับบริบทของการทดลอง เมื่อมีการวิเคราะห์การมีอยู่ของแอนติเจน ชื่อ "ELISA โดยตรง" หมายถึง ELISA ที่ใช้แอนติบอดีปฐมภูมิที่ติดฉลากเท่านั้น และคำว่า "ELISA ทางอ้อม" หมายถึง ELISA ที่แอนติเจนถูกจับโดยแอนติบอดีปฐมภูมิ จากนั้นจึงตรวจพบโดยแอนติบอดีทุติยภูมิที่ติดฉลาก ในกรณีหลังนี้ การวิเคราะห์ ELISA แบบแซนด์วิชจะแตกต่างจากการวิเคราะห์ ELISA ทางอ้อมอย่างชัดเจน เมื่อสนใจแอนติบอดี "หลัก" เช่น ในกรณีของการวิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน แอนติบอดีนี้จะตรวจพบโดยแอนติบอดีรองโดยตรง และคำว่า "ELISA ทางอ้อม" จะใช้กับการตั้งค่าที่มีแอนติบอดีสองตัว[ จำเป็นต้องมีการอ้างอิง ]

 Sandwich 
thumb|300x300px|แซนวิช ELISA (1) แผ่นเคลือบด้วยแอนติบอดีจับยึด (2) เติมตัวอย่าง และแอนติเจนใด ๆ ที่มีอยู่จะจับกับแอนติบอดีจับยึด (3) เติมแอนติบอดีตรวจจับ และจับกับแอนติเจน (4) เติมแอนติบอดีรองที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ และจับกับแอนติบอดีตรวจจับ (5) เติมสารตั้งต้น และเอนไซม์จะแปลงเป็นรูปแบบที่ตรวจจับได้
ELISA แบบ "แซนวิช" ใช้ในการตรวจหาแอนติเจนตัวอย่าง ขั้นตอนมีดังนี้:

 พื้นผิวจะถูกเตรียมโดยใช้แอนติบอดีจับตัวในปริมาณที่ทราบ
 ไซต์ยึดเกาะที่ไม่จำเพาะใด ๆ บนพื้นผิวจะถูกบล็อค
 ตัวอย่างที่ประกอบด้วยแอนติเจนจะถูกนำลงบนแผ่น และจับด้วยแอนติบอดี
 แผ่นจะถูกล้างเพื่อกำจัดแอนติเจนที่ไม่จับกันออก
 มีการเติมแอนติบอดีจำเพาะลงไป แล้วจับกับแอนติเจน (จึงเรียกว่า 'แซนวิช': แอนติเจนติดอยู่ระหว่างแอนติบอดีสองตัว) แอนติบอดีปฐมภูมินี้อาจอยู่ในซีรั่มของผู้บริจาค เพื่อทดสอบปฏิกิริยาต่อแอนติเจน
 แอนติบอดีรองที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์จะถูกนำไปใช้เป็นแอนติบอดีในการตรวจจับ ซึ่งจะจับกับบริเวณ Fc ของแอนติบอดีโดยเฉพาะ (ไม่จำเพาะ)
 แผ่นจะถูกล้างเพื่อกำจัดคอนจูเกตแอนติบอดี-เอนไซม์ที่ไม่จับกัน
 สารเคมีจะถูกเติมลงไปเพื่อให้เอนไซม์แปลงให้เป็นสัญญาณสี เรืองแสง หรือไฟฟ้าเคมี
 วัดค่าการดูดกลืนแสง การเรืองแสง หรือสัญญาณไฟฟ้าเคมี (เช่น กระแสไฟฟ้า) ของหลุมแผ่น เพื่อตรวจสอบการมีอยู่และปริมาณของแอนติเจน

รูปภาพทางด้านขวาประกอบด้วยการใช้แอนติบอดีรองที่จับคู่กับเอนไซม์ แม้ว่าในแง่ทางเทคนิคแล้ว ไม่จำเป็นต้องใช้วิธีนี้หากแอนติบอดีหลักที่จับคู่กับเอนไซม์ (ซึ่งจะเป็น ELISA โดยตรง) อย่างไรก็ตาม การใช้คอนจูเกตแอนติบอดีรองช่วยหลีกเลี่ยงกระบวนการราคาแพงในการสร้างแอนติบอดีเชื่อมโยงกับเอนไซม์สำหรับแอนติเจนทุกตัวที่ต้องการตรวจจับ โดยการใช้แอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ที่จับกับบริเวณ Fc ของแอนติบอดีอื่น ทำให้สามารถใช้แอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ตัวเดียวกันนี้ได้ในสถานการณ์ต่าง ๆ หากไม่มีชั้นแรกของแอนติบอดี "จับ" โปรตีนใด ๆ ในตัวอย่าง (รวมทั้งโปรตีนในซีรั่ม) อาจดูดซับแข่งขันกับพื้นผิวแผ่น ทำให้ปริมาณแอนติเจนที่ถูกตรึงลดลง การใช้แอนติบอดีจำเพาะที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์เพื่อยึดแอนติเจนเข้ากับพลาสติกจะช่วยลดความจำเป็นในการทำให้แอนติเจนบริสุทธิ์จากส่วนผสมที่ซับซ้อนก่อนการวัด ทำให้การทดสอบง่ายขึ้น และเพิ่มความจำเพาะและความไวของการทดสอบ ดังนั้น ELISA แบบแซนวิชที่ใช้ในการวิจัยมักต้องได้รับการตรวจยืนยันเพื่อลดความเสี่ยงของผลลัพธ์บวกปลอม

 Competitive 
การใช้ ELISA ครั้งที่สามคือโดยการจับคู่แบบแข่งขัน ขั้นตอนสำหรับ ELISA นี้แตกต่างจากสองตัวอย่างแรกเล็กน้อย:

แอนติบอดีที่ไม่ได้ติดฉลากจะถูกฟักในสภาวะที่มีแอนติเจน (ตัวอย่าง) ของแอนติบอดีนั้น

 จากนั้นคอมเพล็กซ์แอนติบอดี/แอนติเจนที่ผูกไว้เหล่านี้จะถูกเติมลงในหลุมเคลือบแอนติเจน
 แผ่นจะถูกล้างเพื่อกำจัดแอนติบอดีที่ไม่จับกันออก (ยิ่งมีแอนติเจนในตัวอย่างมากเท่าไร ก็จะยิ่งมีคอมเพล็กซ์ Ag-Ab เกิดขึ้นมากขึ้นเท่านั้น และด้วยเหตุนี้ จึงมีแอนติบอดีที่ไม่จับกับแอนติเจนในหลุมน้อยลง จึงเกิด "การแข่งขัน")
 เติม แอนติบอดีรอง ที่จำเพาะกับแอนติบอดีหลักลงไป แอนติบอดีตัวที่สองนี้จะจับคู่กับเอนไซม์
 เมื่อเติมสารตั้งต้นเข้าไปแล้ว เอนไซม์ที่เหลือจะกระตุ้นสัญญาณโครโมเจนิกหรือเรืองแสง
 ปฏิกิริยาจะหยุดลงเพื่อป้องกันไม่ให้สัญญาณอิ่มตัวในที่สุด

ชุด ELISA ที่แข่งขันกันบางชุดประกอบด้วยแอนติเจนที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ แทนที่จะเป็นแอนติบอดีที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ แอนติเจนที่ติดฉลากจะแข่งขันเพื่อตำแหน่งการจับแอนติบอดีหลักกับแอนติเจนตัวอย่าง (ไม่ได้ติดฉลาก) ยิ่งแอนติเจนในตัวอย่างน้อยลง แอนติเจนที่ถูกติดฉลากก็จะยิ่งถูกเก็บไว้ในหลุมมากขึ้น และสัญญาณก็จะยิ่งแรงมากขึ้น

โดยทั่วไป แอนติเจนจะไม่ถูกวางตำแหน่งไว้ในหลุมก่อน

ในการตรวจหาแอนติบอดีต่อ HIV จะมีการเคลือบแอนติเจน HIV ลงในหลุมของไมโครไทเตอร์เพลต มีการใช้แอนติบอดีจำเพาะสองชนิด โดยชนิดหนึ่งจับคู่กับเอนไซม์ และอีกชนิดหนึ่งอยู่ในซีรั่ม (หากซีรั่มตรวจพบแอนติบอดีเป็นบวก) การแข่งขันสะสมเกิดขึ้นระหว่างแอนติบอดีสองตัวสำหรับแอนติเจนเดียวกัน ส่งผลให้มองเห็นสัญญาณที่แรงขึ้น ซีรั่มที่จะทดสอบจะถูกเติมลงในบ่อน้ำเหล่านี้และฟักที่อุณหภูมิ 37 °C แล้วจึงซัก หากมีแอนติบอดีจะเกิดปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดี ไม่มีแอนติเจนเหลืออยู่สำหรับแอนติบอดี HIV เฉพาะที่ติดฉลากด้วยเอนไซม์ แอนติบอดีเหล่านี้จะยังคงเป็นอิสระเมื่อเติมเข้าไปและจะถูกชะล้างออกไปในระหว่างการล้าง มีการเติมสารตั้งต้นลงไป แต่ไม่มีเอนไซม์ไปทำปฏิกิริยากับสารนั้น ดังนั้นผลบวกจึงแสดงว่าไม่มีการเปลี่ยนแปลงสี

 Indirect 
การทดสอบ ELISA ครั้งที่สี่ไม่ใช้หลุมแบบดั้งเดิม แต่ปล่อยให้แอนติเจนแขวนลอยอยู่ในของเหลวทดสอบ

 แอนติบอดีที่ไม่ติดฉลากจะถูกฟักในสภาวะที่มีแอนติเจน (ตัวอย่าง)
 จัดให้มีระยะฟักตัวที่เพียงพอเพื่อให้แอนติบอดีสามารถจับกับแอนติเจนได้
 จากนั้นตัวอย่างจะถูกส่งผ่านภาชนะ Scavenger อาจเป็นหลอดทดลองหรือช่องไหลผ่านที่ออกแบบมาเฉพาะ พื้นผิวของภาชนะหรือช่องทาง Scavenger จะมี "แอนติเจน Scavenger" ยึดติดอยู่ สิ่งเหล่านี้อาจเหมือนกันหรือคล้ายคลึงกันเพียงพอที่จะทำให้แอนติบอดีอิสระจับได้
 ภาชนะ Scavenger จะต้องมีพื้นที่ผิวเพียงพอและมีเวลาเพียงพอที่จะให้แอนติเจน Scavenger จับกับแอนติบอดีส่วนเกินทั้งหมดที่ใส่ลงในตัวอย่าง
 ตัวอย่างที่ขณะนี้มีแอนติบอดีที่ติดแท็กและผูกไว้จะถูกส่งผ่านเครื่องตรวจจับ อุปกรณ์นี้สามารถเป็น เครื่องไซโตมิเตอร์แบบไหลเวียน หรืออุปกรณ์อื่นที่ส่องสว่างแท็กและลงทะเบียนการตอบสนอง

การทดสอบนี้ช่วยให้สามารถแท็กและนับแอนติเจนหลายตัวได้ในเวลาเดียวกัน วิธีนี้ช่วยให้สามารถระบุสายพันธุ์แบคทีเรียเฉพาะได้โดยใช้แท็กสีที่ต่างกันสองสี (หรือมากกว่า) หากมีทั้งสองแท็กอยู่ในเซลล์ แสดงว่าเซลล์นั้นเป็นสายพันธุ์เฉพาะนั้น ถ้ามีเพียงอันเดียวก็ไม่มี

โดยทั่วไปการทดสอบนี้จะทำครั้งละหนึ่งการทดสอบ และไม่สามารถทำโดยใช้แผ่น ไมโครไทเตอร์ ได้ อุปกรณ์ที่ต้องใช้มักจะไม่ซับซ้อนมากและสามารถใช้งานได้ในภาคสนาม

 Commonly used enzymatic markers 
ตารางต่อไปนี้จะแสดง enzymatic markers ที่ใช้ทั่วไปในการทดสอบ ELISA ซึ่งช่วยให้สามารถวัดผลการทดสอบเมื่อเสร็จสิ้นได้

 OPD (o -phenylenediamine dihydrochloride) เปลี่ยนเป็นสีเหลืองอำพันเพื่อตรวจจับ HRP (horseradish peroxidase) ซึ่งมักใช้เป็น โปรตีนคอนจูเกต
 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) จะเปลี่ยนเป็นสีน้ำเงินเมื่อตรวจพบ HRP และเปลี่ยนเป็นสีเหลืองหลังจากเติมกรดซัลฟิวริกหรือกรดฟอสฟอริก
 ABTS (2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt) เปลี่ยนเป็นสีเขียวเมื่อตรวจพบ HRP
 PNPP (p -Nitrophenyl Phosphate, Disodium Salt) เปลี่ยนเป็นสีเหลืองเมื่อตรวจจับ ฟอสฟาเตสด่าง

 การประยุกต์ใช้ 
right|thumb|แอนตี้-IgG ของมนุษย์, แซนวิชแอนติบอดีคู่ ELISA
เนื่องจากสามารถทำ ELISA เพื่อประเมินการมีอยู่ของแอนติเจนหรือการมีอยู่ของแอนติบอดีในตัวอย่างได้ จึงเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์ในการกำหนดความเข้มข้นของแอนติบอดี ในซีรั่ม (เช่น การทดสอบ HIV หรือ ไวรัสเวสต์ไนล์) นอกจากนี้ ยังพบการประยุกต์ใช้ในอุตสาหกรรม อาหาร ในการตรวจจับ สารก่อภูมิแพ้ในอาหาร เช่น นม ถั่ว ลิสง วอลนัท อั ลมอนด์ และ ไข่ และเป็นการทดสอบเลือดทางซีรัมวิทยาสำหรับ โรค celiac สามารถใช้ ELISA ในการตรวจพิษวิทยาเพื่อคัดกรองเบื้องต้นอย่างรวดเร็วสำหรับยาบางประเภทได้
right|thumb| แผ่นทดสอบการดูดซับภูมิคุ้มกันที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์
ELISA เป็นการทดสอบคัดกรองเชื้อ HIV แบบแรกที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากมีความไวสูง ในการตรวจ ELISA ซีรั่มของบุคคลจะถูกเจือจาง 400 เท่า และนำไปทาบนแผ่นที่มีแอนติเจน HIV ติดอยู่ หากมีแอนติบอดีต่อ HIV อยู่ในซีรั่มก็อาจจับกับแอนติเจน HIV เหล่านี้ได้ จากนั้นล้างจานเพื่อเอาส่วนประกอบอื่น ๆ ของเซรั่มออกทั้งหมด จากนั้นจึงนำ “แอนติบอดีรอง” ที่เตรียมไว้เป็นพิเศษมาทาลงบนแผ่นเพลท จากนั้นจึงล้างอีกครั้ง แอนติบอดีรองนี้จะเชื่อมกับเอนไซม์ทางเคมีล่วงหน้า

ดังนั้นแผ่นจะประกอบด้วยเอนไซม์ตามปริมาณของแอนติบอดีรองที่จับกับแผ่น มีการนำสารตั้งต้นมาใช้เพื่อให้เอนไซม์ทำงาน และเมื่อเอนไซม์ทำงานตามกระบวนการเร่งปฏิกิริยา จะทำให้สีหรือการเรืองแสงเปลี่ยนไป ผล ELISA จะรายงานเป็นตัวเลข ซึ่งประเด็นที่ถกเถียงกันมากที่สุดเกี่ยวกับการทดสอบนี้คือการกำหนดจุด "ตัดขาด" ระหว่างผลบวกและผลลบ

จุดตัดอาจกำหนดได้โดยการเปรียบเทียบกับมาตรฐานที่ทราบ หากใช้การทดสอบ ELISA เพื่อคัดกรองยาที่สถานที่ทำงาน ความเข้มข้นขั้นต่ำคือ 50 ตัวอย่างเช่น จะกำหนด ng/ml และเตรียมตัวอย่างที่ประกอบด้วยความเข้มข้นมาตรฐานของสารวิเคราะห์ สิ่งที่ไม่รู้จักที่สร้างสัญญาณที่แรงกว่าตัวอย่างที่รู้จักถือว่าเป็น "บวก" ส่วนที่สร้างสัญญาณอ่อนกว่าคือ "เชิงลบ"

มีการทดสอบ ELISA เพื่อตรวจหาโรคต่าง ๆ เช่น ไข้เลือดออก มาเลเรีย โรคชาคัส โรคจอห์น และอื่น ๆ การทดสอบ ELISA ยังใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับ การวินิจฉัย <i id="mwAVU">ในหลอดทดลอง</i> ใน ห้องปฏิบัติการทางการแพทย์ การใช้ ELISA อื่น ๆ ได้แก่:

 การตรวจหาแอนติบอดี SARS-CoV-2 ในตัวอย่างเลือด

thumb| แผนผังกระบวนการ: ELISA และ COVID-19 doi.org/10.7717/peerj.10180
ตั้งแต่ปี 2023 เป็นต้นมา ELISA ถือเป็นวิธีหลักในการตรวจหาเชื้อก่อโรคพืชทั่วโลก

 Enzyme-Linked Single Molecule Array (eSimoa) 
eSimoa (enzyme-linked single molecule array) ถือเป็นวิวัฒนาการครั้งสำคัญของเทคนิค ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) แบบดั้งเดิม ซึ่งใช้กันอย่างแพร่หลายในการวินิจฉัยทางคลินิกและการวิจัย ด้วยการเพิ่มความไวและความละเอียดในการตรวจจับไบโอโมเลกุลอย่างมีนัยสำคัญ eSimoa จึงขยายขีดความสามารถของ ELISA ทำให้สามารถตรวจจับไบโอโมเลกุลได้ในความเข้มข้นที่ไม่สามารถทำได้ด้วยการทดสอบมาตรฐานมาก่อน

 เทคโนโลยี 
โดยอาศัยหลักการพื้นฐานของ ELISA eSimoa ใช้ลูกปัดพาราแมกเนติกเพื่อแยกไบโอโมเลกุลหรือเอนไซม์ในลักษณะเดียวกับการตรวจจับแบบแผ่นของ ELISA อย่างไรก็ตาม eSimoa พัฒนาแนวคิดนี้โดยทำให้สามารถวัดปฏิกิริยาทางเอนไซม์ได้ในระดับโมเลกุลเดี่ยว ซึ่งช่วยปรับปรุงขีดจำกัดการตรวจจับเอนไซม์และไบโอโมเลกุลต่าง ๆ อย่างมาก วิธีการนี้ช่วยให้สามารถวัดปริมาณโปรตีนที่มีปริมาณต่ำและกิจกรรมของเอนไซม์ที่สำคัญ เช่น โปรตีนไคเนสและเทโลเมอเรสได้อย่างแม่นยำ ซึ่งมักจะมีค่าต่ำกว่าเกณฑ์การตรวจจับใน ELISA ทั่วไป

 ประยุกต์ใช้ 
ความไวที่เพิ่มขึ้นของ eSimoa เป็นสิ่งสำคัญสำหรับการตรวจจับไบโอมาร์กเกอร์ในระยะเริ่มต้นและแม่นยำในการวินิจฉัยทางคลินิก ช่วยให้การติดตามและการจัดการโรคดีขึ้น ในการค้นพบยา ความสามารถในการติดตามการเปลี่ยนแปลงที่ละเอียดอ่อนในกิจกรรมของเอนไซม์ช่วยในการพัฒนายาที่มีประสิทธิภาพมากขึ้นโดยให้ข้อมูลเชิงลึกโดยละเอียดเกี่ยวกับกลไกการยับยั้งเอนไซม์

 Origins and Controversy 
ชีอัน เฉิง จากมหาวิทยาลัยแห่งชาติไต้หวัน (NTU) อ้างว่าทีมของเธอได้พัฒนาเทคโนโลยีเชิงนวัตกรรมนี้ อย่างไรก็ตาม ข้อเรียกร้องนี้ถูกโต้แย้งเนื่องจากมีการตีพิมพ์ผลงานก่อนหน้านี้โดยทีมงานของ David R. Walt จากมหาวิทยาลัยฮาร์วาร์ด ซึ่งตีพิมพ์ผลงานเกี่ยวกับ eSimoa ในปี 2020Wang, Xu; Ogata, Alana F.; Walt, David R. (2 September 2020). "Ultrasensitive Detection of Enzymatic Activity Using Single Molecule Arrays". Journal of the American Chemical Society. 142 (35): 15098–15106. doi:10.1021/jacs.0c06599. PMC 7472518. PMID 32797755. เอกสารก่อนหน้านี้ที่จัดทำโดยทีมของ Walt ชี้ให้เห็นถึงการมีส่วนสนับสนุนในการพัฒนาเทคโนโลยีก่อนหน้านี้