# อโกรแบคทีเรียม
อโกรแบคทีเรียม  เป็นสกุลของแบคทีเรียแกรมลบที่ค้นพบโดย H. J. Conn ซึ่งใช้การถ่ายทอดยีนในแนวราบเป็นเหตุทำให้เกิดเนื้องอกในพืช Agrobacterium tumefaciens เป็นสายพันธุ์ที่ศึกษากันมากที่สุดในสกุลนี้ อโกรแบคทีเรียมเป็นที่รู้จักกันดีสำหรับความสามารถในการถ่ายโอนดีเอ็นเอ ระหว่างตัวมันเองและพืช และด้วยเหตุนี้จึงกลายเป็นเครื่องมือสำคัญสำหรับงานทางพันธุวิศวกรรม

อโกรแบคทีเรียมในสกุลนี้มีความแตกต่างกันมาก การศึกษาอนุกรมวิธานล่าสุดได้จัดประเภทใหม่ของ อโกรแบคทีเรียมไปสู่สกุลใหม่เช่น Ahrensia, Pseudorhodobacter, Ruegeria และ Stappia แต่ยังมีความเห็นขัดแย้งกันสำหรับชนิดพันธุ์ส่วนใหญ่ซึ่งได้รับการจัดประเภทเป็นชนิดในสกุล Rhizobium

 การก่อโรคในพืช 
left|thumb|การเจริญเติบโตที่ผิดปกติเป็นปุ่มปมจากเชื้อ Agrobacterium sp.
อโกรแบคทีเรียม ชนิดพันธุ์ Agrobacterium tumefaciens ทำให้เกิดโรคคราวน์กอลล์ (Crown gall) ในพืช โรคนี้มีลักษณะโดยการเจริญเติบโตเหมือนเนื้องอกหรือถุงน้ำดีบนพืชที่ติดเชื้อ ซึ่งมักจะอยู่ที่รอยต่อระหว่างรากและหน่อ ปุ่มปมถูกกระตุ้นโดยการถ่ายโอนคอนจูเกตของส่วนของสายดีเอ็นเอ (T-DNA) จากพลาสมิดของแบคทีเรียที่ก่อให้เกิดปุ่มปม (Ti) ในอีกชนิดพันธุ์ที่มีความเกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดคือ Agrobacterium rhizogenes ก็ชักนำให้เกิดปุ่มปมในราก และมีพลาสมิดของ Ri (Root-inducing) ซึ่งเป็นพลาสมิดที่แตกต่างกัน ถึงแม้ว่าอนุกรมวิธานของ อโกรแบคทีเรียม จะอยู่ภายใต้การแก้ไข แต่ก็สามารถสรุปได้ว่าในสกุลมี 3 Biovars คือชนิดพันธุ์ Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes และ Agrobacterium vitis สำหรับสายพันธุ์ย่อยของ Agrobacterium tumefaciens และ Agrobacterium rhizogenes นั้นเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถเป็นที่อยู่ของ Ti หรือ Ri-plasmid ได้ในขณะที่สายพันธุ์โดยทั่วไปของ Agrobacterium vitis (จำกัดเฉพาะที่พบในเถาองุ่น) สามารถเป็นที่อยู่ของ Ti-plasmid เท่านั้น ขณะเดียวกันสายพันธุ์ที่ไม่ใช่อโกรแบคทีเรียม ที่ถูกแยกออกจากตัวอย่างแวดล้อมก็สามารถเป็นที่อยู่ของ Ri-plasmid ได้ ในขณะที่การศึกษาในห้องปฏิบัติการแสดงให้เห็นว่าสายพันธุ์ที่ไม่ใช่อโกรแบคทีเรียม ยังสามารถเป็นที่อยู่ของ Ti-plasmid ด้วย แต่อโกรแบคทีเรียมสายพันธุ์แวดล้อมบางสายพันธุ์ไม่มีทั้ง Ti และ Ri-plasmid ทำให้สายพันธุ์เหล่านี้มีความสามารถก่อโรคได้ต่ำ

พลาสมิด T-DNA นั้นถูกรวมเข้าแบบกึ่งสุ่มเข้าไปในจีโนมของเซลล์เจ้าบ้าน และยีนกำหนดสัณฐานวิทยาของปุ่มปมบน T-DNA นั้นแสดงออกมา ทำให้เกิดการสร้างปุ่มปม สำหรับ T-DNA ที่นำพายีนของเอนไซม์สำหรับการสังเคราะห์ทางชีวภาพในการผลิตกรดอะมิโนที่ผิดปกตินั้นโดยทั่วไปจะเป็น Octopine หรือ Nopaline ยังมียีนสำหรับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของฮอร์โมนพืชคือ ออกซินและไซโตไคนิน และสำหรับการสังเคราะห์ทางชีวภาพของ Opine ซึ่งจัดหาแหล่งคาร์บอนและไนโตรเจนสำหรับแบคทีเรีย ซึ่งจุลินทรีย์ชนิดอื่น ๆ ส่วนใหญ่ไม่สามารถใช้ได้ ทำให้อโกรแบคทีเรียมเป็นชนิดที่ถูกคัดสรรให้ได้รับประโยชน์ดังกล่าว จากการปรับสมดุลฮอร์โมนในเซลล์พืชทำให้การแบ่งเซลล์เหล่านั้น ไม่สามารถควบคุมได้โดยพืชและก่อให้เกิดปุ่มปม อัตราส่วนของออกซินต่อไซโตไคนินที่ผลิตโดยยีนของปุ่มปมกำหนดลักษณะสัณฐานวิทยาของปุ่มปม (ลักษณะคล้ายรากที่ไม่เป็นระเบียบหรือยอดอ่อนที่ไม่เป็นระเบียบ)

 กลไกการก่อโรคในพืช 
 Transformation คือ T-DNA เข้าสู่จีโนมพืช  
 Tumorigenis  คือ เซลล์พืชเกิดการเปลี่ยนโดยการแบ่งเซลล์ตลอดเวลาเป็นจำนวนมากก่อให้เกิดปุ่มปม

 องค์ประกอบในจีโนมของอโกรแบคทีเรียม  
 โครโมโซม  
 พลาสมิด  ได้แก่
พลาสมิดที่เหนี่ยวนำให้เกิดเนื้องอก Tumor inducer plasmid (Ti plasmid), พลาสมิดที่เหนี่ยวนำให้เกิดราก Root inducer plasmid (Ri plasmid)

 พลาสมิด Ti 
มีขนาด 200-800 กิโลเบส ประกอบด้วย 
 Transfer DNA (T-DNA) มีขนาด 10-30 กิโลเบส ขึ้นอยู่กับสายพันธุ์แบคทีเรีย เป็นเพียง 10% ของพลาสมิด หลังจากเกิดการบุกรุกโดยแบคทีเรียบโมเลกุลของ T-DNA จะอยู่อย่างถาวรในเซลล์พืชและส่งผ่านไปสู่เซลล์ลูกเป็นส่วนหนึ่งของโครโมโซม T-DNA มียีนประมาณ 8 ยีน มียีนทีกำหนดการสร้างสารต่าง ๆ ที่จำเป็นต่อการเจริญเติบโตของแบคทีเรียเอง โดยใช้เอนไซม์และสารตั้งต้นจากพืช ตัวอย่างเช่นยีนที่กำหนดการสร้างโอปีน Opaline synthase (nos) ซึ่งแบคทีเรียจะใช้เป็นอาหารดังนั้นการที่ A. tumefaciens ถ่ายยีนเข้าสู่พืชมีวัตถุประสงค์คือต้องการอาหารจากพืชเพื่อประโยชน์ของแบคทีเรียเอง นอกจากนี้ยังประกอบด้วยยีน tra รวมทั้งยีนที่กำหนดให้แบคทีเรียสามารถใช้สารบางชนิดเป็นแหล่งพลังงานได้ เช่น Arginine catabolism, Nopaline catabolism, Octopine catabolism นอกจากนี้ยังมียีนสร้างฮอร์โมนพวกออกซินและไซโตไคนินอีกด้วย ทำให้พืชที่ได้รับ T-DNA มีการเจริญเติบโตเร็วไม่จำกัดซึ่งแสดงออกในเซลล์พืชเมื่อบุกรุกเข้าไปในเซลล์ ทำให้เกิดเนื้องอกเป็นปุ่มปม ในพืชใบเลี้ยงคู่หลายชนิด และสามารถตรวจสอบพืชที่ได้รับยีนนี้โดยพิจารณาจากปุ่มปมที่เกิดขึ้นในเซลล์ที่ได้รับยีนนี้ จากนั้น T-DNA จะเข้าไปรวมกับโครโมโซมของพืช
 Virulence genes หรือ Vir genes มีลักษณะเป็นกลุ่มยีนที่ทำงานร่วมกันโดยใช้โปรโมเตอร์ชนิดเดียวกัน เรียกว่า โอเปอรอน (Operon) โดย Vir genes มีหน้าที่ส่ง T-DNA เข้าสู่จีโนมพืช Vir genesประกอบด้วย
 VirA/VirG เป็นระบบที่ทำหน้าที่ควบคุม ได้แก่ โปรตีน VirA มีหน้าที่สังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตแก่ VirA เอง และสังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตให้แก่ VirG โดย VirA จะทำการกระตุ้นการทำงานของ VirG เมื่อ VirG ทำงานก็จะกระตุ้นการทำงานของ Vir อื่น ๆ ต่อไป
 VirD1/VirD2 ทำหน้าที่ตัดบริเวณส่วน T-DNA บริเวณ Right border, Left border เพื่อให้ได้ T-DNA สายเดี่ยวจากสายคู่เพื่อที่จะได้เข้าสู่เซลล์พืชแบบ Single strand T-DNA 
 VirE2 ทำหน้าที่ห่อหุ้ม T-DNA สายเดี่ยวเพื่อป้องกันไม่ให้โดนทำลาย โดยสร้างส่วนห่อหุ้มเรียกว่า T-complex 
 Octopine catabolism ทำหน้าที่สร้างแหล่งพลังงานประเภทสารประกอบไนโตรเจนให้แก่อโกรแบคทีเรียม
 Conjugation transfer gene
 Ori เป็นบริเวณที่เริ่มการจำลองตัว

 พลาสมิด Ri 
มีความสนใจในการพัฒนาพืชที่ถูกโคลนด้วยพาหะที่มีพื้นฐานมาจากพลาสมิด Ri ของ A. rhizogenes พลาสมิด Ri และ Ti เหมือนกันมากแต่ที่ต่างกันคือการถ่ายทอดพลาสมิด Ri ไปสู่พืชไม่ทำให้เกิดปุ่มปมแต่จะทำให้เกิดปุ่มปมแต่จะทำให้เกิดรากฝอยขึ้นแทน มีความเป็นไปได้ในการเลี้ยงรากที่ได้รับการถ่ายยีนให้มีปริมาณมากในอาหารเหลว เพื่อที่จะนำไปสกัดโปรตีนที่ผลิตจากยีนที่ต้องการในปริมาณสูงได้

 กลไกการถ่าย T-DNA เข้าสู่พืช 
thumb|300px|right|A: Agrobacterium tumefaciens
B: จีโนมของอโกรแบคทีเรียม  C: พลาสมิด Ti 
 a: T-DNA
, b: ยีน Vir
, c: Replication origin
, d: Opines catabolism genes 
D: เซลล์พืช
E: ไมโตรคอนเดรีย
F: คลอโรพลาสต์
G: นิวเคลียส

 Bacterial colonization แบคทีเรียอโกรแบคทีเรียม จะมาเกาะรวมกันบริเวณขอบเซลล์พืช ที่บริเวณพื้นผิวเซลล์พืชมีสารพอลิแซ็กคาไรด์ซึ่งมีส่วนสำคัญในการยึดเกาะของแบคทีเรีย
 Induction of bacterial virulence system เมื่อพืชเกิดบาดแผลจะปล่อยสารออกมาจากบาดแผล เช่น กรด, สารฟีโนลิก, สารอะซิโตไซริงโกน โดยสารเหล่านี้จะไปกระตุ้น Periplasmic domain ที่เป็นตัวรับสัญญาณของ VirA  และส่วน TM2 ที่ทำหน้าที่ผลิตเอนไซม์ Kinase ใน VirA  โปรตีน VirA จะทำหน้าที่สังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตแก่ VirA เอง และสังเคราะห์หมู่ฟอสเฟตให้แก่ VirG โดย VirA จะทำการกระตุ้นการทำงานของ VirG เมื่อ VirG ทำงานก็จะกระตุ้นการทำงานของ Vir อื่น ๆ ต่อไป
 Generation of T-DNA transfer complex การสร้าง T-DNA ให้มีความซับซ้อนขึ้นเพื่อป้องกันการถูกทำลาย โดย VirD1/VirD2 ซึ่งเป็นเอนไซม์เอนโดนิวคลีเอสจะตัดพันธะฟอสโฟไดเอสเตอร์ที่ตำแหน่ง Right border (RB), Left border (LB) ที่ขนาบด้านขวาและซ้ายของ T-DNA ตามลำดับ เกิดเป็น T-DNA สายเดี่ยวจากสายคู่เพื่อที่จะได้เข้าสู่เซลล์พืชแบบ single strand T-DNA จากนั้น VirE2 ทำหน้าที่ห่อหุ้ม T-DNA สายเดี่ยว เพื่อป้องกันไม่ให้โดนทำลาย เป็นโครงสร้าง เรียกว่า T-complex ทั้ง VirD2 และ VirE2 จะทำงานร่วมกันโดยรับสัญญาณเพื่อนำ T-DNA เข้าไปสู่นิวเคลียสของเซลล์พืช
 T-DNA transfer T-DNA ถูกย้ายสู่พืช
 Integration of T-DNA into plant genome การขนย้าย T-complex จากอโกรแบคทีเรียมเข้าสู่จีโนมพืช  VirD2 และ VirE2 จะทำงานร่วมกันโดยรับสัญญาณเพื่อนำ T-DNA เข้าไปสู่นิวเคลียสของพืช โดยเกิดการแทรกแบบสุ่มชนิด Nonspecific recombination (Illegimate)

 ข้อจำกัดของการโคลนด้วยพลาสมิด A. tumefaciens 
ธรรมชาติของ A. tumefaciens และ A. rhizogenes จะบุกรุกเฉพาะพืชใบเลี้ยงคู่เท่านั้นส่วนพืชใบเลี้ยงเดี่ยวไม่ใช่เจ้าบ้าน และปัญหาอีกประการคือการพัฒนาเป็นพืชที่สมบูรณ์จากโปรโทพลาสต์ หรือจากเซลล์เพาะเลี้ยงทำได้ยากและจำกัดในพืชบางชนิด ความยากง่ายของการเจริญเป็นต้นขึ้นอยู่กับชนิดของพืช และที่พัฒนาได้ยากก็คือพืชใบเลี้ยงเดี่ยว

 การติดเชื้อในมนุษย์ 
แม้ว่าโดยทั่วไปแล้วจะพบว่าเป็นการติดเชื้อในพืช อโกรแบกทีเรียมสามารถเป็นสาเหตุของการติดเชื้อฉวยโอกาสในมนุษย์ที่มีระบบภูมิคุ้มกันอ่อนแอ แต่ไม่ได้แสดงให้เห็นว่าเป็นเชื้อก่อโรคในบุคคลที่มีสุขภาพดี หนึ่งในกรณีแรก ๆ ของโรคในมนุษย์ที่เกิดขึ้นโดยมีส่วนร่วมของ Agrobacterium radiobacter ถูกรายงานโดย J. R. Cain ในสกอตแลนด์ (พ.ศ. 2531) การศึกษาในภายหลังชี้ให้เห็นว่า อโกรแบคทีเรียม เชื่อมต่อและเปลี่ยนพันธุกรรมในของเซลล์มนุษย์หลายชนิดโดยการรวม T-DNA ของมันเข้ากับจีโนมของเซลล์มนุษย์ การศึกษาดำเนินการโดยใช้เนื้อเยื่อของมนุษย์ที่ได้รับการเพาะเลี้ยงและไม่ได้ข้อสรุปใด ๆ ว่าเกี่ยวข้องกับกิจกรรมทางชีวภาพในธรรมชาติ

 การใช้ในเทคโนโลยีชีวภาพ 

ความสามารถของ อโกรแบคทีเรียม ในการถ่ายโอนยีนไปยังพืชและเชื้อราถูกนำมาใช้ในเทคโนโลยีชีวภาพโดยเฉพาะอย่างยิ่งพันธุวิศวกรรม ในการปรับปรุงพืชโดยใช้พลาสมิด Ti หรือ Ri ที่ดัดแปลงแล้ว พลาสมิดจะทำการ 'ปลดอาวุธ' โดยการลบยีนที่ก่อให้เกิดปุ่มปมเนื้องอก ส่วนที่สำคัญเพียงอย่างเดียวของ T-DNA คือยีนบริเวณขอบขนาดเล็ก (25 คู่ฐาน) สองส่วน ซึ่งอย่างน้อยหนึ่งส่วนนั้นจำเป็นสำหรับการแปลงสภาพพืช ยีนที่จะถูกนำเข้าไปในพืชนั้นจะถูกโคลนเข้าไปในเวกเตอร์การแปลงของพืชที่มีบริเวณ T-DNA ของพลาสมิดที่ปลดอาวุธพร้อมกับเครื่องหมายที่สามารถเลือกได้ (เช่นการดื้อยาปฏิชีวนะ) เพื่อให้สามารถเลือกพืชที่ประสบความสำเร็จ พืชมีการปลูกบนวัสดุที่มีการใช้ยาปฏิชีวนะตามหลังการแปลงสภาพ และพืชที่ไม่มี T-DNA รวมอยู่ในจีโนมจะตาย วิธีอื่นคือการกรองแบบ Agroinfiltration 
thumb|right|พืช (S. chacoense) ที่ถูกเปลี่ยนรูปโดยใช้อโกรแบคทีเรียม เซลล์ที่ถูกเปลี่ยนจะเริ่มก่อชั้นหนา (แคลลัส) ที่ด้านข้างของชิ้นใบ

การเปลี่ยนแปลงด้วย อโกรแบคทีเรียม สามารถทำได้หลายวิธี โปรโตพลาสต์หรือชิ้นตัดของแผ่นใบสามารถเพาะฟักด้วย อโกรแบกทีเรียม และพืชที่สมบูรณ์ถูกสร้างขึ้นโดยใช้การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อพืช หรือในการกรองเชื้อแบคทีเรีย อโกรแบคทีเรียม อาจถูกฉีดเข้าเนื้อเยื่อใบของพืชโดยตรง วิธีนี้จะเปลี่ยนเฉพาะเซลล์เมื่อสัมผัสกับแบคทีเรียทันที และส่งผลให้เกิดการแสดงออกชั่วคราวของพลาสมิดดีเอ็นเอ

อโกรอินฟิวเตรชัน (Agroinfiltration) หรือการแทรกซึมผ่านการกรอง ใช้ทั่วไปในการดัดแปลงพืชตระกูลยาสูบ (Nicotiana) ซึ่งระเบียบวิธีปกติที่ใช้ในการดัดแปลงสำหรับพืชในวงศ์ผักกาด (สกุล Arabidopsis) เป็นวิธีการจุ่มส่วนของดอกไม้ โดยช่อดอกจะจุ่มลงในสารแขวนลอยที่มีอโกรแบคทีเรียม และแบคทีเรียจะเปลี่ยนสายพันธุกรรมของเซลล์ที่ทำให้เกิดเซลล์สืบพันธุ์เพศหญิง เมล็ดนั้นจะสามารถคัดกรองสำหรับการต้านทานยาปฏิชีวนะ (หรือคัดกรองสำหรับเครื่องหมายอื่นที่สนใจ) และพืชที่ไม่ได้รวมดีเอ็นเอพลาสมิดจะตายเมื่อสัมผัสกับสภาวะที่เหมาะสมของยาปฏิชีวนะ

อโกรแบทีเรียม ไม่ได้แพร่เชื้อในพืชทุกชนิด แต่มีเทคนิคที่มีประสิทธิภาพหลายประการสำหรับการดัดแปลงพืชรวมถึงปืนยิงยีน (Gene gun)

อโกรแบคทีเรียม ได้รับการขึ้นทะเบียนว่าเป็นเวกเตอร์ที่ถ่ายโอนสารพันธุกรรมไปยังสิ่งมีชีวิตดัดแปลงพันธุกรรม (GMO) ของสหรัฐอเมริกาThe FDA List of Completed Consultations on Bioengineered Foods  เช่น
 ถั่วเหลือง
 ฝ้าย
 ข้าวโพด
 ชูการ์บีท
 อัลฟัลฟา
 ข้าวสาลี
 ผักกาดก้านขาว (น้ำมันคาโนลา)
 หญ้า Creeping bentgrass (สำหรับอาหารสัตว์)
 ข้าว (ข้าวทอง)

การดัดแปลงของเชื้อราโดยใช้อโกรแบคทีเรียมนั้น ใช้เพื่อการวิจัยเป็นหลัก และทำตามวิธีการที่คล้ายคลึงเช่นเดียวกับการดัดแปลงของพืช ระบบพลาสมิด Ti ได้รับการปรับเปลี่ยนเพื่อรวมองค์ประกอบของดีเอ็นเอสำหรับการดัดแปลงสายพันธุ์ของเชื้อราตามที่ต้องการ ซึ่งเกิดขึ้นหลังจากการบ่มร่วมของ อโกรแบคทีเรียม สายพันธุ์ที่มีพลาสมิดกับสายพันธุ์ของเชื้อราเหล่านี้

 จีโนมิกส์ 
การหาลำดับจีโนมของ อโกรแบคทีเรียม หลายชนิด เป็นโอกาสให้ทำการศึกษาประวัติวิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิตเหล่านี้ และได้ให้ข้อมูลเกี่ยวกับยีนและระบบที่เกี่ยวข้องกับการเกิดโรค การควบคุมทางชีวภาพ และการอยู่ร่วมกันแบบสมชีพ (Symbiosis) การค้นพบที่สำคัญอย่างหนึ่งคือ ความเป็นไปได้ที่โครโมโซมกำลังพัฒนาจากพลาสมิดหลายชนิดในแบคทีเรียเหล่านี้ การค้นพบอีกอย่างหนึ่งก็คือ โครงสร้างของโครโมโซมที่หลากหลายในกลุ่มนี้ดูเหมือนจะสามารถรองรับการใช้ชีวิตแบบการอยู่ร่วมกัน และแบบที่ทำให้เกิดโรค การหาลำดับจีโนมของชนิดพันธุ์อโกรแบคทีเรียม ที่สำเร็จและเผยแพร่แล้วยังคงเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง ส่งผลให้มีข้อมูลเชิงลึกอย่างมีนัยสำคัญในกลไก และประวัติการวิวัฒนาการของจุลินทรีย์ที่เกี่ยวข้องกับพืชกลุ่มนี้

 ประวัติ 
มาร์ก ฟัน มงตากู (Marc Van Montagu) และ โยเซฟ สเคลล์ (Jozef Schell) จากมหาวิทยาลัยเคนต์  ในเบลเยียม ค้นพบกลไกการถ่ายโอนยีนระหว่าง อโกรแบคทีเรียมและพืช ซึ่งส่งผลให้เกิดการพัฒนาวิธีการเปลี่ยนอโกรแบคทีเรียม ให้เป็นระบบการนำส่งที่มีประสิทธิภาพสำหรับกระบวนการพันธุวิศวกรรมในพืช ทีมนักวิจัยนำโดยดร. แมรี-เดลล์ ชิลตัน เป็นทีมแรกที่แสดงให้เห็นว่ายีนที่ก่อโรคสามารถนำออกได้ โดยไม่ส่งผลกระทบต่อความสามารถของอโกรแบคทีเรียม ในการแทรกดีเอ็นเอของตัวเองลงในจีโนมของพืช (พ.ศ. 2526)