# RNA interference
RNA interference หรือ RNAi เป็นกระบวนการในการควบคุมการแสดงออกของลักษณะทางพันธุกรรมอย่างหนึ่ง ซึ่งพบทั้งในพืช สัตว์ และมนุษย์ โดยอาศัยการทำงานของชิ้นส่วน double strand RNA (dsRNA) ซึ่งเมื่อผ่านกระบวนการต่าง ๆ แล้ว จะมีผลไปยับยั้งการทำงานของ messenger RNA (mRNA) ของยีนหนึ่ง ๆ อย่างจำเพาะ จึงมีผลยับยั้งการทำงานของยีนนั้นได้

 ความสำคัญ 
RNAi เป็นกระบวนการที่เกิดขึ้นโดยปกติตามธรรมชาติของเซลล์ยูคาริโอต ทั่วไป ซึ่งกระบวนการเหล่านี้มีความสำคัญมากต่อการดำรงอยู่ของสิ่งมีชีวิต โดยเฉพาะสิ่งมีชีวิตชั้นต่ำ หน้าที่สำคัญของกระบวนการนี้อาจกล่าวโดยสรุปได้เป็น 3 ข้อ คือ การป้องกันและต่อต้านการติดเชื้อไวรัส การป้องกันจีโนม (genome) จาก ยีนสัญจร (jumping genes)หรือทรานสโพซอน และ การควบคุมการแสดงออกของยีน

RNAi มีความสำคัญในกระบวนการป้องกันและต่อต้านการติดเชื้อไวรัส โดยเฉพาะอย่างยิ่งในสิ่งมีชีวิตชั้นต่ำ ไวรัสหลายชนิดมีสารพันธุกรรมเป็นแบบ dsRNA ซึ่งเมื่อไวรัสเหล่านี้ปลดปล่อยสารพันธุกรรมเข้าสู่เซลล์ dsRNA จะถูกตัดเป็น short interference RNA (siRNA) โดย Dicer ซึ่งเป็นเอ็นไซม์ที่มีอยู่แล้วในสิ่งมีชีวิตบางชนิด จากนั้น Dicer จะกระตุ้นให้ RISC complex เข้ามาจับ และตัดสาย RNA เกิดการยับยั้งการสร้างโปรตีน ทำให้ไวรัสไม่สามารถก่อโรคได้

RNAi ยังมีความสำคัญในการป้องกันจีโนม (genome) จาก ยีนสัญจร(transposons) ซึ่งเป็นลำดับของดีเอ็นเอ ที่สามารถเคลื่อนที่ไปได้ทั่วจีโนมของสิ่งมีชีวิต และพบยีนสัญจรได้ในสิ่งมีชีวิตทุกชนิด ซึ่งในกรณีที่ยีนสัญจรเคลื่อนไปอยู่ในตำแหน่งที่ไม่ถูกต้องและมีความสำคัญจะทำให้เกิดความเสียหายแก่เซลล์ของสิ่งมีชีวิตได้ ยีนสัญจรหลายๆชนิดทำงานโดยการถอดรหัส ดีเอ็นเอ ให้เป็น RNA ก่อน และจากนั้นจะถอดรหัสกลับเป็นดีเอ็นเอแล้วไปแทรกอยู่ในตำแหน่งอื่นๆของจีโนมต่อไป บ่อยครั้งที่ RNA ที่เกิดขึ้นจะเป็น dsRNA และเป็นตัวเริ่มต้นกระบวนการ RNAi ดังนั้น RNAi จึงมีบทบาทช่วยป้องกันจีโนมจากยีนสัญจรโดยการทำลาย dsRNA

นอกจากนั้น RNAi ยังเป็นกลไกสำคัญที่มีบทบาทในการควบคุมการแสดงออกของยีน ที่พบในสัตว์หลายชนิด ตั้งแต่ระดับกลุ่มหนอนพยาธิจนถึงระดับสัตว์เลี้ยงลูกด้วยน้ำนม พบว่ายีนหลายร้อยตำแหน่งในจีโนมของมนุษย์จะได้รับการถอดรหัสออกมาเป็น RNA ขนาดเล็กที่เรียกว่า microRNA (miRNA) ซึ่ง miRNA จะบรรจุชิ้นส่วนของลำดับของยีนต่างๆ ดังนั้น miRNA เหล่านี้จึงอาจเกิดเป็นโครงสร้างสายคู่ได้ เช่น เกิดเป็น hairpin RNA (hpRNA) เมื่อเกิดเป็น hpRNA ที่เป็น dsRNA ขึ้นจะเป็นการกระตุ้นให้เริ่มกระบวนการ RNAi ทำให้เกิดการยับยั้งการแสดงออกของยีน

ปัจจุบันเป็นที่ทราบกันว่า miRNA มีบทบาทสำคัญต่อการพัฒนาของสิ่งมีชีวิตและการควบคุมการทำงานของเซลล์ โดยมีส่วนร่วมในกระบวนการพื้นฐานทางชีววิทยาต่างๆ ไม่ว่าจะเป็นการเปลี่ยนแปลงไปทำหน้าที่เฉพาะของเซลล์ (cell differentiation) การตายตามโปรแกรมเฉพาะของเซลล์ (apoptosis) เป็นต้น

 ประวัติ 
พัฒนาการของความรู้ความเข้าใจเกี่ยวกับ RNAi คาดว่าเริ่มขึ้นเมื่อ ในปี 1990 Jorgensen และคณะ รายงานปรากฏการณ์ที่เขาทำการทดลองในการพยายามทำให้สีของดอกพิทูเนีย (petunia) มีสีเข้มขึ้น โดยการใส่ยีนที่จะกระตุ้นการสร้างรงควัตถุสีแดงจากภายนอกเข้าไป แต่ผลที่พบ คือ ยีนสารสีของดอกพิทูเนีย หยุดการทำงานลง ซึ่งในขณะนั้นยังไม่สามารถอธิบายได้ว่าอะไรเป็นสาเหตุของปรากฏการณ์ดังกล่าว แต่เมื่อมองย้อนกลับไป อาจถือได้ว่า Richard Jorgensen และคณะเป็นกลุ่มบุคคลแรกที่รายงานถึงลักษณะที่คล้ายกับผลจากการเกิดกระบวนการ RNAi ในปีเดียวกันนี้ยังมีการค้นพบปรากฏการณ์ที่คล้ายกันอีกโดย van der Krol และคณะเมื่อทำการใส่ dihydroflavonol-4-reductase (DFR) or chalcone synthase (CHS) genes เข้าไปในดอกพิทูเนียและ Smith และคณะเมื่อทำการใส่ chimaeric polygalacturonase (PG) gene ในมะเขือเทศ ซึ่งในปี1990 นี้ได้มีการกำหนดชื่อเรียกปรากฏการณ์ดังกล่าวว่า post transcriptional gene silencing (PTGS) ต่อมาในปี 1992 Macino และ Romano ได้มีการค้นพบปรากฏการณ์ที่ใกล้เคียงกันใน Neurospora crassa เมื่อใส่ยีนที่ทำให้มีการแสดงลักษณะเผือกโดยพบว่า Neurospora crassa บางส่วนไม่มีการแสดงลักษณะเผือก ซึ่งMacino และRomano เรียกปรากฏการณ์ดังกล่าวว่า quelling อย่างไรก็ตามยังไม่มีผู้ที่สามารถอธิบายได้ว่าอะไรคือกลไกที่ทำให้เกิดลักษณะดังกล่าว จนกระทั่งในปี 1998 มีนักวิทยาศาสตร์ชาวอเมริกัน 2 คน คือ Andrew Z. Fire และ Craig C. Mello ได้รายงานการศึกษา RNAi และกลไกที่เกี่ยวข้องจากการศึกษาแสดงออกของยีนในหนอนตัวกลม Caenorhabditis elegans (C. elegans) โดยพบว่าเมื่อฉีด mRNA (sense) ที่ควบคุมการสร้างโปรตีนกล้ามเนื้อ ร่วมกับ antisense RNA ของ mRNA ดังกล่าว ให้แก่ C. elegan พบว่าหนอนมีการเคลื่อนที่แบบกระตุก (twitching movements) คล้ายลักษณะการเคลื่อนที่ของหนอนกลุ่มที่ขาดยีนที่ทำหน้าที่สร้างโปรตีนกล้ามเนื้ออย่างสมบูรณ์ ในขณะที่ การฉีดเฉพาะ sense หรือ antisense RNAเพียงอย่างเดียวไม่พบการเปลี่ยนแปลงดังกล่าว

จากผลการทดลอง Fire และคณะตั้งสมมุติฐานว่า sense และ antisense RNA ที่ถูกฉีดเข้าไปอาจจับเข้าคู่กันเกิดเป็น dsRNA และ dsRNA ที่เกิดขึ้นมีผลไปยับยั้งการแสดงออกของยีนกล้ามเนื้อที่มีรหัสเดียวกันนั้น ต่อมาเมื่อได้ทดลองฉีด dsRNA ที่มีรหัสพันธุกรรมของโปรตีนหลายๆชนิดของหนอนตัวกลม พบว่า การฉีดอาร์เอ็นเอสายคู่ที่มีรหัสพันธุกรรมหนึ่งๆเข้าไป มีผลในการยับยั้งการแสดงออกของยีนที่มีรหัสจำเพาะนั้นๆ
เมื่อได้ผลการทดลองที่ชัดเจน Fire และคณะ จึงรายงานว่า dsRNA มีความสามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ และเรียกกระบวนการที่เกิดขึ้นทั้งหมดนี้ว่า RNA interference (RNAi) ซึ่ง RNAi มีความจำเพาะต่อยีนที่มีรหัสเข้าคู่กันกับ dsRNA ที่ฉีดเข้าไป นอกจากนี้ยังพบว่า ผลจาก RNAi ที่เกิดในเซลล์ที่ฉีด dsRNA เข้าไป ยังสามารถแพร่กระจายจากเซลล์หนึ่งไปยังอีกเซลล์หนึ่ง ต่อๆ กันไป จนทั่วทุกเซลล์ของตัวอ่อนของหนอนตัวกลม และยังสามารถถ่ายทอดไปยังรุ่นต่อไปได้ด้วย และจากที่พบว่าการฉีด dsRNA เข้าไปเพียงเล็กน้อยสามารถก่อให้เกิดผลยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ ทำให้เข้าใจว่ากระบวนการ RNAi เป็นกระบวนการที่อาจเกิดการสังเคราะห์เพิ่มขึ้นเองภายในเซลล์ได้ หลังจาก Andrew Fire และ Craig Mello รายงานการค้นพบกระบวนการ RNAi เผยแพร่ลงในวารสาร Nature เมื่อปี 1998 บทความนี้กระตุ้นให้เกิดความสนใจในการศึกษาเกี่ยวกับ RNAi เพิ่มขึ้นอีกมากมาย อาทิเช่น การศึกษาของ Misquitta และPaterson ที่พบการรบกวนการแสดงออกของ MyoD gene ใน Drosophila โดยใช้กระบวนการ RNAi การศึกษาของ Ngô และ คณะที่พบการกระตุ้นให้มีการทำลาย mRNA ใน Trypanosoma brucei โดยใช้ double strand RNA การศึกษาของ Waterhouse และ คณะที่พบกระบวนการต่อต้านการติดไวรัสในพืช ในปี 1998 และการศึกษาของ van West และคณะที่พบกระบวนการยับยั้งการแสดงออกของยีนใน Phytophthora infestans ในปี 1999 เป็นต้น ต่อมาในปี 2001 จากการศึกษาของ Elbashir และคณะพบว่า Duplexes of 21-nucleotide RNAs สามารถกระตุ้นให้เกิดกระบวนการ RNAi ในเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมได้ และในปี 2002 วารสาร Science ได้ยกย่องว่า RNAi เป็นเทคโนโลยีแห่งปี ซึ่งในปีเดียวกันนี้ยังมีการค้นพบ recombinant Dicer โดย Provost และคณะ จากนั้นองค์ความรู้เกี่ยวกับ RNAi ในด้านต่างๆ ทั้งความรู้เกี่ยวกับกลไก องค์ประกอบในกระบวนการ RNAi ก็พัฒนาขึ้นเรื่อยๆ ตามลำดับ และจากการค้นพบกระบวน
การ RNAi ทำให้ Andrew Fire และ Craig Mello ได้รับรางวัลโนเบล สาขาแพทยศาสตร์และสรีรศาสตร์ประจำปี 2006

 กลไกการเกิดกระบวนการ RNAi 
RNA interference (RNAi) ถือเป็นกระบวนการในการควบคุมการแสดงออกของลักษณะทางพันธุกรรมอย่างหนึ่ง ดังนั้นเพื่อความเข้าใจในกระบวนการ RNAi จึงขอกล่าวถึง การแสดงออกของยีนและการควบคุมการแสดงออกของยีนก่อนจะกล่าวถึงการทำงานของกระบวนการ RNAi

 การแสดงออกของยีน 
การแสดงออกของยีน (Nelson and Cox, 2000) หมายถึง การถอดรหัสพันธุกรรมของยีนจากดีเอ็นเอเป็น mRNA แล้วเกิดการแปลรหัสเป็นโปรตีน รหัสพันธุกรรมของยีนในดีเอ็นเอ เป็นตัวกำหนดชนิดของโปรตีนที่เซลล์สร้าง โดยเริ่มจากการถอดรหัสพันธุกรรมที่อยู่ในดีเอ็นเอเป็น mRNA ในนิวเคลียส และแปลรหัสเป็นโปรตีนในไซโตพลาสซึม ซึ่งโปรตีนนี้มีความเกี่ยวข้องในทุกกระบวนการของสิ่งมีชีวิต เช่น เป็นเอ็นไซม์ที่ใช้ในการย่อยอาหาร เป็นส่วนประกอบของตัวรับสัญญาณ (receptor) และ แอนติบอดี้ (antibody) ที่ปกป้องร่างกายจากสิ่งแปลกปลอมต่างๆ

จีโนมของคนประกอบด้วยยีนประมาณ 30,000 ชนิดแต่จะมีเพียงบางยีนเท่านั้นที่สามารถใช้งานได้ในแต่ละเซลล์ เพราะมีการควบคุมการแสดงออกของยีนให้เกิดขึ้นเฉพาะส่วนที่ต้องการเท่านั้น เรียกกระบวนการในการควบคุมให้มีการแสดงออกเฉพาะยีนที่ต้องการว่า การควบคุมการแสดงออกของยีน (regulation of gene expression)

 การควบคุมการแสดงออกของยีน 
การแสดงออกของยีน (Regulation of gene expression) (Nelson and Cox, 2000) เป็นการถ่ายทอดข้อความทางชีวภาพหรือข้อความทางพันธุกรรมที่บรรจุอยู่ใน ดีเอ็นเอไปยัง mRNA แล้วจึงแปลรหัสไปเป็นโปรตีน ในเซลล์ร่างกายของสิ่งมีชีวิตทุกเซลล์มีข้อมูลทางพันธุกรรมหรือยีนเหมือนกัน แต่ในระหว่างการเจริญเติบโตและการเปลี่ยนสภาพ (differentiation) แต่ละเซลล์มีกลไกการควบคุมการแสดงออกของยีนเหล่านี้ต่างเวลาหรือต่างวาระกัน การควบคุมการแสดงออกของยีนอาจแบ่งเป็น 2 ช่วงคือ
­* ช่วงระหว่างกระบวนการถอดรหัสพันธุกรรม (transcription) โดยเป็นการควบคุมการสังเคราะห์ mRNA ซึ่งลำดับเบสที่อยู่บนสาย mRNA ถูกกำหนดโดยลำดับของเบสในสายแม่พิมพ์ดีเอ็นเอ
­* ช่วงระหว่างกระบวนการแปลรหัสพันธุกรรมมาเป็นพอลิเพปไทด์ (polypeptide) หรือโปรตีนโดยเป็นการสังเคราะห์ พอลิเพปไทด์ หรือการสร้างโปรตีน

การควบคุมการแสดงออกของยีนมีผลต่อปริมาณของโปรตีนที่ถูกสร้างขึ้น และมีขั้นตอนการควบคุมดังนี้
 การควบคุมระดับจีโนม (Genomic control)
 การควบคุมการถอดรหัส (Transcriptional control)
 การควบคุมหลังการถอดรหัส (Post-transcriptional control)
 การควบคุมการแปลรหัส (Translation control)
 การควบคุมหลังการการแปลรหัส (Post-translation control)

 การควบคุมการแสดงออกของยีนโดย RNAi 
กระบวนการ RNAi เป็นการควบคุมการแสดงออกของยีนในขั้นตอนposttranscriptional processing ของ mRNA ซึ่งจากการศึกษาการควบคุมการแสดงออกของยีนโดยกระบวนการ RNAi ที่เกิดภายในเซลล์ของคนและสัตว์หลายชนิดพบว่ามีกลไกคล้ายกันโดยจีโนมมีการกำหนดการสร้างโมเลกุล RNA ขนาดเล็กที่เรียกว่า micro RNA (miRNA) ซึ่งเป็น double-stranded RNA (dsRNA) และเป็นจุดเริ่มต้นในการกระตุ้นกลไกการทำงานของ RNAi ในการขัดขวางการสร้างโปรตีน RNAi จึงมีบทบาทในการควบคุมการแสดงออกของยีน และมีบทบาทสำคัญต่อการควบคุมลักษณะทางพันธุกรรม ควบคุมการทำงานของเซลล์ และรวมถึงการพัฒนาของสิ่งมีชีวิต

 องค์ประกอบที่เกี่ยวข้องในกระบวนการ RNAi 

 Dicer 
Dicer คือ RNAse III nuclease ทำหน้าที่ตัด double-stranded RNA และ pre-microRNA ออกเป็น double-stranded RNA สายสั้นๆ ซึ่งยาว 20-25 นิวคลีโอไทด์ เรียกว่า small interfering RNA (siRNA) โครงสร้างของ Dicer ประกอบไปด้วย RNase 2 โดเมน (domain) และ PAZ 1 โดเมน (รูปที่ 4) Dicer เป็นตัวกระตุ้นปฏิกิริยา (catalyze) ในขั้นตอนแรกของ RNA interference pathway และเป็นจุดเริ่มต้นในการสร้าง RNA-induced silencing complex (RISC) (Provost et al, 2002; Macrae et al, 2006; Jaronczyk et al, 2005; Bernstein et al, 2001)

 Small Interfering RNA 
Small Interfering RNA (siRNA) (Elbashir et al. 2001) บางครั้งรู้จักกันในชื่อ short interfering RNA หรือ silencing RNA โครงสร้างโมเลกุลของ siRNA เป็น dsRNA สายสั้นๆ (ประมาณ 21 นิวคลีโอไทด์) โดยมีนิวคลีโอไทด์ 2 ตัวยื่นออกมา (overhange) จากปลาย 3' ของแต่ละสาย ผลจากการตัดของ Dicer ทำให้ได้สาย siRNA ที่มีปลาย 5' เป็นหมู่ฟอสเฟต และปลาย 3' เป็นหมู่ไฮดรอกซิล ปัจจุบันทราบว่า siRNA มีบทบาทในวิถี RNAi และเกี่ยวข้องกับกระบวนการทางชีวภาพที่หลากหลาย เช่น กระบวนการต่อต้านไวรัส หรือการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างโครมาตินในจีโนม

 Argonaute 
Argonaute (Ago) เป็นเอ็นไซม์ที่เป็นส่วนประกอบสำคัญของ RNA-induced silencing complex (RISC) complex ที่ทำหน้าที่แยก RNA สายคู่เป็นสายเดี่ยว และเป็นส่วนสำคัญในการนำ siRNA เข้าสู่กระบวนการ RNAi จากการศึกษาในแมลงหวี่ (Drosophila spp.) พบว่ามี Ago 5 ชนิด โดย Ago ต่างชนิดกันจะทำหน้าที่แตกต่างกัน แต่ Ago ที่มีความสำคัญคือ Ago1 ทำหน้าที่แยก miRNA สายคู่ให้เป็นสายเดี่ยว และ Ago2 ทำหน้าที่แยก siRNA สายคู่ให้เป็นสายเดี่ยว โครงสร้าง Ago แบ่งเป็น 2 โดเมน คือ PAZ และ Piwi โดย PAZ domain เป็นส่วนประกอบทั้งใน Ago และ Dicer (PAZ domain ใน Dicer อาจมีหน้าที่แตกต่างออกไป) โครงสร้างของ PAZ domain ประกอบด้วย 2 ส่วน คือ บริเวณที่มีลักษณะ oligonucleotide-binding (OB) fold ซึ่งทำหน้าที่ในการจับกับกรดนิวคลีอิก และบริเวณที่มีลักษณะเป็น beta-hairpin ตามด้วย alpha-helix โดย PAZ domain ทำหน้าที่จับกับกรดนิวคลีอิก 2 ตัว ที่ยื่นออกมาจากปลาย 3' ของ siRNA เพื่อช่วยให้ siRNA จับกับ mRNA เป้าหมายได้เสถียรมากขึ้น ส่วน Piwi domain มีคุณสมบัติคล้าย RNase ซึ่งเป็นเอ็นไซม์ที่ตัด RNA จาก DNA-RNA hybrids จึงเข้าใจว่า Piwi อาจทำหน้าที่ในการตัด mRNA ให้กับ RISC (Rand et al, 2005; Sen and Blau, 2005)

 RNA-induced silencing complex (RISC) 
RNA-induced silencing complex (RISC) คือกลุ่มของโปรตีนที่ทำหน้าที่ร่วมกันในการแยก siRNA สายคู่เป็นสายเดี่ยว แล้วช่วยจับสายที่เป็น antisence ของ siRNA ที่แยกออกมา แล้วรวมเข้ากับ RISC เป็น RISC complex โดยสาย antisence siRNA ที่เรียกว่า guide RNA มีเบสคู่สมกับ mRNA เป้าหมาย และช่วยให้ RISC complex เข้าจับและทำลาย mRNA เป้าหมายได้อย่างแม่นยำ RISC ประกอบด้วยไรโบนิวคลีโอโปรตีน(ribonucleoprotein complex; RNP) หลายชนิด แต่มีเพียงบางชนิดเท่านั้นที่สามารถทำงานในกระบวนการ RNAi ทั้งนี้สัตว์ต่างชนิดจะมีองค์ประกอบของ RISC ที่แตกต่างกัน เนื่องจาก RNAi ของสัตว์บางชนิดต้องอาศัย RISC complex เพื่อให้ทำงานได้ ในขณะที่สัตว์บางชนิดอาศัยการทำงานของ RISC เพียงอย่างเดียว (Preall et al, 2006; Gregory, 2005; Sen et al, 2005)

 กระบวนการทำงานของ RNAi 
Dicer ซึ่งมี dsRNA-specific endonuclease ที่สามารถจดจำและจับ dsRNA ที่มีความคล้ายคลึง (homologue) กับ mRNA เป้าหมาย จะตัดสาย dsRNA ออกเป็นสายสั้นๆ ที่เรียกว่า small interference RNA (siRNA) ที่มีความยาวประมาณ 21-25 คู่ จากนั้นArgonaute 2 จะเข้ามาจับ siRNA ดังกล่าวเกิดเป็น ribonucleoprotein complex (RNP) และเหนี่ยวนำให้โปรตีนชนิดอื่นเข้ามารวมกันเพื่อสร้างเป็น RNAi-silencing complex (RISC) RISC จะทำการแยก siRNA สายคู่ออกเป็นสายเดี่ยว โดยสายเดี่ยวที่เป็น antisense ของsiRNA จะมีลำดับเบสที่เป็นคู่สมกับ mRNA เป้าหมาย (sense) จึงเป็นตัวกำหนดความจำเพาะและการจดจำให้ RISC complex เข้าจับและทำลาย mRNA เป้าหมายได้อย่างแม่นยำ ซึ่งRISC ที่มี siRNA สายเดี่ยวรวมอยู่ด้วย (RISC complex) เข้าจับกับ mRNA เป้าหมายโดยอาศัยลำดับเบสคู่สมระหว่าง siRNA และ mRNA เป้าหมาย จากนั้น mRNA จะถูกย่อยโดย slicer ใน RISC complex

mRNA ที่ถูกย่อยจะถูกทำลาย เป็นผลให้ไม่มี mRNA ผ่านเข้าสู่กระบวนการแปลรหัสไปเป็นโปรตีน ทำให้ไม่มีการสร้างโปรตีนจากยีนนั้นเกิดขึ้น การทำงานของ RNAi จึงเป็น posttranscriptional regulation of gene expression หรือ posttranscriptional gene silencing

 การประยุกต์ใช้เทคโนโลยี RNAi 
ปัจจุบันมีการพัฒนาเทคโนโลยี RNAi มาใช้ประโยชน์อย่างหลากหลาย โดยอาศัยหลักในการนำ dsRNA หรือ siRNA เข้าสู่ร่างกาย (transfection) เพื่อกระตุ้นกลไกการทำงานของ RNAi (Genc et al, 2004) ซึ่งรูปแบบของ dsRNA หรือ siRNA ที่นำเข้าสู่ร่างกาย มีอยู่ 5 ชนิด คือ
 รูปของ dsRNA สังเคราะห์สายยาว
 รูปของ dsRNA สังเคราะห์ที่ผ่านการตัดโดย dicer เป็น siRNA
 รูปของ dsRNA ที่ผ่านการถอดรหัสจาก ดีเอ็นเอ ในหลอดทดลองและใช้ dicer ตัดเป็น siRNA
 รูปของ siRNA expression vector
 รูปของ PCR derived siRNA cassette

การนำ dsRNA เข้าสู่ร่างกายในรูปแบบข้างต้นนี้ สามารถแบ่งออกเป็น 2 กุล่ม คือ
 วิธีการข้อที่ 1-3 เป็นการนำเข้าสู่ไซโตพลาสซึม (cytoplasm)
 วิธีการข้อที่ 4-5 เป็นการนำเข้าสู่นิวเคลียส (nucleus) ในรูปของ short hairpin RNA (shRNA) เพื่อส่งออกไปสู่ไซโตพลาสซึม (cytoplasm) ต่อไป

 เทคโนโลยี RNAi ในปัจจุบันและอนาคต 
ในปัจจุบันมีการนำเทคโนโลยี RNAi ไปใช้เป็นเครื่องมือในงานวิจัยด้านต่างๆ มากมาย ซึ่งอาจสรุปโดยรวมได้เป็น 3 ด้าน คือ การนำไปใช้ในพืช การนำไปใช้ในทางการแพทย์ และการนำไปใช้ในด้านการศึกษา

 การนำเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในพืช 
การนำเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในพืช ส่วนใหญ่แล้วจะมุ่งเน้นการนำ RNAi ไปเป็นเครื่องมือในการยับยั้งการแสดงออกของยีนเป้าหมายที่จำเพาะ หรือตำแหน่ง promoters ของยีนนั้น เพื่อปรับปรุงพันธุ์พืชให้ได้ลักษณะใหม่ๆที่ต้องการซึ่งสามารถถ่ายทอดไปสู่รุ่นหลังได้ การสร้าง dsRNA ในพืชมีหลายวิธี เช่น การสร้างพืชปรับปรุงพันธุ์ที่ผลิต sense RNA และ พืชปรับปรุงพันธุ์ที่ผลิต antisense RNA แยกต้นกัน แล้วนำทั้ง 2 ต้นมาผสมข้ามกัน ทำให้เกิดต้นพืชที่ผลิต dsRNA พบว่า ต้นพืชที่ผลิต dsRNA มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการแสดงออกของยีนได้ดีกว่าต้นที่ผลิตเพียง sense หรือ anti-sense RNA เพียงอย่างเดียว (Wang et al, 2001) นอกจากนี้ วิธี hpRNA โดยการสร้างลำดับทั้ง sense และ antisense RNA ให้อยู่ใน promoter เดียวกันโดยมี intron คั่นกลางระหว่างลำดับ sense และ antisense ลำดับเหล่านี้จะสร้างเป็น hpRNA หลังจากผ่านกระบวนการถอดรหัส ซึ่งวิธีการใหม่นี้มีประสิทธิภาพในการยับยั้งการแสดงออกของยีนในพืชได้ดีกว่า dsRNA โดยจะให้ผล 80-100% (Mallory et al, 2001) ดังนั้นจึงมีการนำวิธี hpRNA มาใช้กันอย่างแพร่หลาย

ตัวอย่างการนำเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในพืช
 การใช้ RNAi ในการเปลี่ยนแปลงกระบวนการ metabolism ของพืชในการผลิตสารต่างๆให้ลดหรือเพิ่มปริมาณสารบางชนิดที่พืชสร้างและเก็บสะสมไว้ เพื่อการนำไปใช้ประโยชน์ในจุดประสงค์เฉพาะต่อไป เช่น
 ในธรรมชาติพบว่า ข้าวสายพันธุ์หนึ่งมี hpRNA ที่มีผลในการยับยั้งการแสดงออกของยีนของ glutelin ซึ่งเป็นโปรตีนหลักในเมล็ดข้าว ทำให้เกิดข้าวสายพันธุ์ที่มีโปรตีนต่ำ จึงมีการนำเทคโนโลยี RNAi ผลิตข้าวสายพันธุ์นี้มาใช้ในทางการค้า เป็นข้าวสำหรับผู้ป่วยโรคไตที่จำเป็นต้องควบคุมปริมาณโปรตีนในอาหาร (Meins, 2000)
 การสร้างพืชกาแฟให้มีปริมาณคาเฟอีนน้อยลง โดยปรับปรุงพันธุกรรมพืชให้สามารถสร้าง antisense hpRNA ของยีน CaMxMt1 ซึ่งเป็นยีนที่มีส่วนในกระบวนการสร้างคาเฟอีน antisense hpRNA กระตุ้นให้เกิดกระบวนการ RNAi จึงมีผลยับยั้งการสร้างสารคาเฟอีน ทำให้มีปริมาณคาเฟอีนลดลง (Ogita et al, 2003)
 การใช้ RNAi ในการเพิ่มความต้านทานต่อโรคในพืช เช่น
 การสร้างพืชยาสูบ (Nicotiana tabacum) ที่มีความต้านทานต่อ tobamovirus โดยใช้เทคโนโลยี RNAi ในการยับยั้งการแสดงออกของยีน TOM1 และ TOM3 ซึ่งเป็นยีนที่ถอดรหัสได้เป็นโปรตีนที่จำเป็นต่อการเพิ่มจำนวนของไวรัส ดังนั้นไวรัสจึงไม่สามารถเพิ่มจำนวนได้ ดังนั้นพืชยาสูบปรับปรุงพันธุ์จึงมีความต้านทานต่อเชื้อไวรัสชนิดนี้ (Asano et al, 2005)
 ไม้ผลยืนต้น พืชตระกูลถั่ว และพืชไม้ประดับหลายชนิดจะมียีน iaam และยีน ipt ซึ่งเป็นยีนที่มีความสำคัญที่ทำให้เกิดโรค Crown gall disease จากเชื้อแบคทีเรีย Agrobacterium tumefaciens จึงมีการใช้ RNAi ในการยับยั้งการแสดงออกของยีนทั้ง 2 ตำแหน่ง ทำให้พืชมีความต้านทานต่อโรค Crown gall disease (Dunoyer et al, 2006)

 การนำเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ทางการแพทย์ 

 การรักษาโรคที่เกิดจากเชื้อไวรัส 
ในปัจจุบันมีการนำเทคโนโลยี RNAi มาใช้ในการยับยั้งไวรัสก่อโรคหลายชนิด คือ hepatitis C virus (HCV) , dengue (DEN) virus, severe acute respiratory syndrome (SARS) coronavirus, poliovirus, influenza A virus, hepatitis delta virus (HDV) , human rhinovirus (HRV) , hepatitis B virus (HBV) , herpes simplex virus type-1 (HSV-1) , human papillomavirus (HPV) , JC virus (JCV) , Epstein Barr virus (EBV) และ cytomegalovirus (CMV) แต่ที่กำลังอยู่ในความสนใจและมีผู้ศึกษากันมาก คือ Human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)

การใช้ RNAi ในการยับยั้ง HIV-1 มีการศึกษารายงานไว้มากมาย โดยใช้ RNAi ทดลองยับยั้งการแสดงออกของยีนหลายตำแหน่ง และทดลองใช้เวกเตอร์หลายชนิด แต่ผลที่ได้ตรงกัน คือ การทำงานในระยะแรกสามารถยับยั้ง HIV-1 ได้ แต่เมื่อเลี้ยงเซลล์ไว้เป็นเวลานาน HIV-1 มีความสามารถในการหลบหลีก เพราะมีกลไกการยับยั้งการทำงานของ RNAi อย่างหลากหลาย เช่น point mutation, double point mutation, partial หรือ complete deletion of the target sequence เป็นต้น ดังนั้นจึงมีผู้เสนอว่า การใช้ siRNA combination therapy (SIRCT) คือ การใช้ siRNA เพื่อยับยั้งการแสดงออกของยีนไวรัสหลายตำแหน่งร่วมกันน่าจะเลี่ยงการหลบหลีกของไวรัสได้ แต่ยังไม่มีรายงานผลการทดลองดังกล่าว (Ben and Joost, 2006)

 การรักษามะเร็ง 
วิธีการในการรักษามะเร็งที่ใช้กันมากในปัจจุบันคือ เคมีบำบัด (chemotherapy) แต่วิธีการนี้มีข้อจำกัดในการใช้ คือ ร่างกายผู้เป็นมะเร็งจะสร้าง P-glycoprotein ซึ่งเป็นโปรตีนที่ทำให้ยาที่ผู้เป็นมะเร็งได้รับจากการทำการรักษาโดยเคมีบำบัดถูกกำจัดออกจากเซลล์ ทำให้การรักษาโดยเคมีบำบัดมีประสิทธิภาพต่ำ ดังนั้นการใช้เทคโนโลยี RNAi เพื่อยับยั้งการสร้าง P-glycoprotein ในร่างกายผู้ที่เป็นมะเร็ง ทำให้การรักษาโดยเคมีบำบัดมีประสิทธิภาพสูงขึ้น ซึ่งจากการศึกษาของ Rumpold และคณะในปี 2005 พบว่า สามารถใช้เทคโนโลยี RNAi ในการยับยั้งการสร้าง P-glycoprotein ซึ่งทำให้เซลล์มะเร็งไวต่อ imatinib ลดลงได้

 การปลูกถ่ายเนื้อเยื่อ 
การปลูกถ่ายไตส่วนใหญ่จะพบปัญหาการตาย (apoptosis) ของเซลล์บุผนังท่อไต (renal tubular epithelial cells) จากการบาดเจ็บที่เกิดจากเลือดมาเลี้ยงอีกครั้งหลังการขาดเลือด (ischemia-reperfusion injury) โปรตีนที่มีส่วนสำคัญในกระบวนการเหล่านี้ คือ Fas ซึ่งจากการศึกษาของ Hamar และคณะในปี2004 พบว่าสามารถใช้เทคโนโลยี RNAi ยับยั้งการสร้าง Fas ในหนูซึ่งทำให้เซลล์บุผนังท่อไตมีความต้านทานต่อการตายมากขึ้น และเกิดการบาดเจ็บที่เกิดจากเลือดมาเลี้ยงอีกครั้งหลังการขาดเลือดน้อยลงได้

 การชะลอวัย (anti-aging) 
ในปี 2003 Kenyon และคณะได้ทำการทดลองเพื่อเพิ่มอายุขัยในหนอนตัวกลม C. elegans โดยสามารถปรับปรุงพันธุกรรมให้มีอายุยืนยาวกว่าปกติ โดยใช้เทคโนโลยี RNAi ในการยับยั้งการแสดงออกของ Daf-2 ซึ่งเป็นยีนของตัวรับ (receptor) ของฮอร์โมนอินซูลิน (insulin) และ insulin-like growth factor 1 (IGF-1) นอกจากนี้ยีน Daf-2 ยังมีผลต่อการสืบพันธุ์ด้วย ในธรรมชาติพบว่าในสภาวะที่ไม่เหมาะสมหรือขาดแคลนอาหาร ยีน Daf-2 จะทำงานลดลง ทำให้ C. elegans ที่อายุน้อยแสดงอาการกระตือรือร้น มีชีวิตชีวา และมีการพัฒนาไปสู่การสืบพันธุ์ก่อนอายุที่แท้จริง แต่ C. elegans ที่โตเต็มวัยแล้วจะอายุยืนมากขึ้น จากการทดลองใช้ RNAi ในการยับยั้งการแสดงออกของยีนนี้ นอกจากจะพบว่าทำให้หนอนอายุยืนขึ้นแล้ว ยังพบว่าหนอนทดลองมีสุขภาพดีตลอดช่วงอายุที่ยาวนานขึ้น แสดงว่าการยับยั้งการแสดงออกของยีนนี้ไม่น่าจะรบกวนยีนอื่นๆ ที่จำเป็นของหนอน ผลการทดลองดังกล่าวทำให้เกิดความสนใจเป็นอย่างมาก เพราะ insulin/IGF-1 pathway เป็นวิถีที่ควบคุมการมีชีวิตยืนยาวในสัตว์หลายๆชนิด รวมทั้งในสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม

 การนำเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในการศึกษาวิจัย 
เทคโนโลยี RNAi จัดว่าเป็นเครื่องมือที่มีประโยชน์มากต่อการนำมาใช้เพื่อศึกษาหน้าที่ของยีน เพื่อนำความรู้เหล่านั้นไปประยุกต์ใช้สาขาวิชาต่างๆ เหตุผลที่วิธีการนี้มีการนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายและมีความนิยมเพิ่มขึ้นเรื่อยๆ เพราะการยับยั้งการแสดงออกของยีนด้วยวิธีการอื่นๆ เช่น ‘gene knock-out’ ต้องทำให้โครงสร้างของยีนเปลี่ยนแปลงไป อาจทำให้ยีนที่อยู่ในตำแหน่งนั้น หรือตำแหน่งข้างเคียงเสียหาย และอาจส่งผลต่อสิ่งมีชีวิตนั้นๆ แต่ด้วยเทคโนโลยี RNAi สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนหลังจากเกิดกระบวนการถอดรหัส ดังนั้นจึงไม่ทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงสารพันธุกรรมของสิ่งมีชีวิต

ตัวอย่างการนำเทคโนโลยี RNAi ไปใช้ในด้านการศึกษา
 การใช้เทคโนโลยี RNAi ในการศึกษาจีโนมของ C.elegans การใช้เทคโนโลยี RNAi ในการศึกษาจีโนมของ C.elegans โดยใช้แบคทีเรียเป็นสื่อนำให้เกิดกระบวนการ RNAi เพื่อสังเกตผลที่เกิดขึ้นจากการยับยั้งการแสดงออกของยีน 16,757 ยีน (จากทั้งหมด 19,757 ยีน) และจัดกลุ่มยีนที่แสดงออกเป็นลักษณะที่คล้ายกัน (Kamath et al, 2003)
 การใช้เทคโนโลยี RNAi ในการศึกษายีนที่จำเป็นต่อการอยู่รอดของ Heterodera glycines (H.glycines)  การใช้เทคโนโลยี RNAi ในการศึกษายีนที่จำเป็นต่อการอยู่รอดของ Heterodera glycines (H.glycines) ซึ่งเป็นหนอนพยาธิที่ก่อให้เกิดถุงน้ำ (cyst) ของต้นถั่วเหลือง (Glycine max) เพื่อนำไปใช้ในการควบคุมหนอนพยาธิชนิดนี้ โดยการใช้เทคโนโลยี RNAi ยับยั้งการแสดงออกของยีนที่คาดว่าเป็นยีนที่จำเป็นต่อหนอนพยาธิ และสังเกตว่าการขาดยีนใดจะทำให้หนอนพยาธิตาย (Alkharouf et al, 2007)
 การศึกษา RNAi ที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของยีนที่ควบคุมนาฬิกาชีวภาพของร่างกาย การศึกษา RNAi ที่เกี่ยวข้องกับการทำงานของยีนที่ควบคุมนาฬิกาชีวภาพของร่างกาย เป็นการศึกษาเพื่อให้เกิดความเข้าใจกลไกการทำงานของนาฬิกาชีวภาพที่มีอยู่ในร่างกายของสิ่งมีชีวิตตั้งแต่แบคทีเรียจนถึงมนุษย์ ซึ่งจะมี circadian rhythms ที่สอดคล้องกับการทำงานของร่างกายที่เกิดขึ้นในช่วงเวลากลางวัน หรือกลางคืน เช่น การหลับและการตื่น โดยทำการศึกษาใน Drosophila spp. (Nawathean et al, 2005) และแมลงอื่นๆ พบว่า สามารถพบ clock genes ได้ทั้งในสมองและอวัยวะอื่นๆ โดย clock genes ที่พบในระบบสืบพันธุ์เพศผู้จะควบคุมจังหวะที่ทำให้เกิดการผสมพันธุ์ และวงจรการปล่อย sperm ในแต่ละวัน ส่วนใน Drosophila spp. เพศเมีย clock genes มีความสัมพันธ์กับระดับความสามารถในการออกไข่ที่ขึ้นกับความสมบูรณ์ของโภชนาการ นอกจากนี้การทำงานของ clock genes อาจมีความเกี่ยวข้องกับการป้องกันสิ่งมีชีวิตจากความเครียดและการแก่ก่อนวัย การศึกษานี้ถูกนำไปประยุกต์ใช้ในการศึกษากลไกการทำงานของนาฬิกาชีวภาพที่เกี่ยวข้องกับมนุษย์ ในด้านของระบบสืบพันธุ์ โภชนาการ และ การยืดอายุขัยของมนุษย์

จากที่กล่าวมาข้างต้นจะเห็นได้ว่าในอนาคตเทคโนโลยี RNAi จะเป็นเทคโนโลยีที่สำคัญในการปรับปรุงพันธุ์พืช การป้องกันรักษาโรค ตลอดจนเป็นเครื่องมือในการศึกษาหน้าที่ของยีนในพืช สัตว์ และมนุษย์

 ข้อเสียของเทคโนโลยี RNAi 
เทคโนโลยีหลากหลายที่มีการนำมาใช้ในปัจจุบันต่างมีทั้งข้อดี และข้อเสีย ผู้ที่นำเทคโนโลยีนั้นไปใช้จึงต้องพิจารณาอย่างรอบคอบ เลือกวิธีการที่เหมาะสมที่สุดในการนำไปใช้เพื่อให้เกิดประโยชน์สูงสุด และลดผลกระทบหรือข้อเสียของเทคโนโลยีนั้น เทคโนโลยี RNAi ก็เช่นเดียวกัน แม้ว่าจะมีข้อดีมากมายดังที่กล่าวมาแล้ว แต่เทคโนโลยี RNAi ก็มีข้อเสียหลายประการ เช่น
 ไม่สามารถปรับตัวตามการหลบหลีกของไวรัสบางชนิดได้ ทำให้การใช้เทคโนโลยีนี้มีช่วงเวลาจำกัดในการยับยั้งการแสดงออกของยีน จนเมื่อไวรัสเปลี่ยนแปลงพันธุกรรมไปก็ไม่สามารถยับยั้งการแสดงออกของยีนได้
 ไม่สามารถประมาณช่วงเวลาที่ RNAi ให้ผลในการยับยั้งการแสดงออกของยีนได้
 ทำให้ลำดับพันธุกรรมของโฮสต์เปลี่ยนแปลง เนื่องจากชิ้นส่วน siRNA สามารถเข้าไปแทรกในลำดับพันธุกรรมของโฮสต์ได้
 อาจเกิดการยับยั้งการแสดงออกของยีนอื่นที่ไม่ใช่ยีนเป้าหมาย เนื่องจาก siRNA เป็นลำดับนิวคลีโอไทด์สายสั้น ๆ ซึ่งไม่เพียงแต่มีความจำเพาะกับ ตำแหน่งเบสที่เป็นคู่สมกันเท่านั้น แต่ยังมีโอกาสที่จะไปจับกับเบสคู่สมอื่นที่มีความคล้ายคลึงกันได้
 ไวรัสที่ใช้เป็นสื่อในการนำยีนเข้าสู่เซลล์อาจก่อโรคหรือไปกระตุ้นให้ oncogene ทำงาน
 RNAi ที่ใช้ในการดัดแปลงพันธุกรรมพืชที่ใช้เป็นอาหาร อาจส่งผลกับผู้บริโภค
 ประสิทธิภาพของ RNAi ขึ้นอยู่กับคุณสมบัติของ เวกเตอร์
 เป็นเทคโนโลยีที่ต้องอาศัยความเข้าใจและชำนาญในการวิเคราะห์
 ค่าใช้จ่ายในการทำการทดลองสูง เนื่องจากต้องใช้เครื่องมือประกอบหลายอย่าง
 เทคโนโลยีนี้เป็นเทคโนโลยีใหม่ มีการค้นพบมาไม่เกิน 10 ปี ดังนั้นข้อมูลต่างๆที่ได้มาจึงยังสามารถเปลี่ยนแปลงได้อยู่เสมอหากมีการค้นพบข้อมูลต่างๆเพิ่มขึ้น