# การทดลองเชิงโมเลกุลเดี่ยว
การทดลองเชิงโมเลกุลเดี่ยว (หรือ SME) เป็นการติดตามผลที่เกิดจากแต่ละโมเลกุล ไม่ไดัวัดผลทั้งกลุ่มก้อน

การทดลองโดยทั่วไปที่รู้จักกันเป็นการวัดค่าหรือการสังเกตผลอันเกิดจากโมเลกุลต่าง ๆ ที่อยู่ในระบบ สิ่งที่วัดได้นั้นมักจะเป็นผลมาจากโมเลกุลจำนวนมากและอาจกล่าวว่าค่าที่วัดได้ก็จะเป็นค่าโดยเฉลี่ยจากพฤติกรรมของโมเกลกุลเหล่านี้ในช่วงเวลาหนึ่ง การวัดค่าด้วยวิธีดั้งเดิมนี้จึงอาจเรียกได้ว่าเป็น การวัดโดยรวมทั้งกลุ่มก้อน (Bulk measurement) ซึ่งถ้าทุกโมเลกุลมีพฤติกรรมคล้ายคลึงกันแล้ว ค่าที่วัดได้ก็สามารถเป็นตัวแทนที่ดีของทั้งระบบและของโมเลกุลเองด้วย

อย่างไรก็ตามค่าที่วัดได้จากกลุ่มก้อน ก็ไม่จำเป็นจะเป็นตัวแทนที่ดีของโมเลกุลเสมอไป โดยเฉพาะในกรณีที่แต่ละโมเลกุลมีพฤติกรรมแตกต่างกันมาก ดังนั้นเพื่อการทำความเข้าใจปรากฏการณ์ที่เกิดขึ้นในแต่ละโมเลกุล จึงมีการทดลองอีกประเภทหนึ่งซึ่งเป็นการติดตามผลที่เกิดจากแต่ละโมเลกุลเดี่ยว เรียกว่าการทดลองเชิงโมเลกุลเดี่ยว ซึ่งช่วยทำให้เราสามารถเปรียบเทียบสิ่งที่วัดได้จากการวัดโดยรวมทั้งกลุ่มก้อน ว่าเป็นตัวแทนที่ดีของแต่ละโมเลกุลหรือไม่ ถ้าไม่ใช่ตัวแทนที่ดีแล้ว แต่ละโมเลกุลมีพฤติกรรมแตกต่างกันออกไปอย่างไร ซึ่งมักจะทำให้สามารถค้นพบคุณสมบัติพิเศษของโมเลกุลที่ไม่อาจวัดได้ด้วยวิธีปกติ เนื่องจากสัญญาณรบกวนจากสิ่งแวดล้อมหรือสัญญาณของโมเลกุลอื่น ๆ มาบดบัง

สำหรับเทคนิคในการวัดนั้นอาจจำแนกออกเป็นเทคนิคที่เคลื่อนไหวโมเลกุลโดยตรงและเทคนิควัดการเรืองแสง

 เทคนิคการวัดการเคลื่อนไหวของโมเลกุลโดยตรง 

เทคนิคการวัดการเคลื่อนไหวของโมเลกุลโดยตรง (Single-molecule manipulation technique) สนใจศึกษาสมบัติเชิงกลของโมเลกุล โดยมีความสัมพันธ์ที่เป็นหัวใจของการวัดคือความสัมพันธ์ ระหว่างแรงและการยืดตัวของโมเลกุล (Force-Extension Curve:FEC) ซึ่งทำให้เข้าใจโครงสร้างภายในหรือการเปลี่ยนแปลงที่มีผลต่อสมบัติเชิงกลเหล่านี้ได้ โดยเทคนิคต่าง ๆ จะมีช่วงการวัดที่แตกต่างกันไปดังแสดงในตาราง สิ่งที่พึงพิจารณาคือขนาดของแรงที่สนใจศึกษาและขนาดของระบบที่ต้องการวัดเพื่อให้สามารถเลือกใช้เทคนิคที่เหมาะสมกับระบบที่ต้องการได้

 AFM LOTs MTs BFP Force resolution 20 pN – 10 nN 0.1-100 pN .01-10 pN pN Stiffness 10-1000 pN/nm น้อยกว่า AFM  เท่า  pN/nm 0.1-1 pN/nm

 Atomic-Force Microscopy 
Atomic-Force Microscopy (AFM) เป็นเครื่องมือที่พัฒนาจาก Scanning Tunneling Microscope (STM) ซึ่งเป็นเครื่องถ่ายภาพความละเอียดระดับอังสตรอมด้วย quantum tunneling effect ในขณะที่ AFM ใช้หลักการเชิงกลของเข็มวัดขนาดจิ๋ว (tip) ที่ยึดติดกับคาน (cantilever) เคลื่อนไปตามพื้นผิวของวัสดุทำให้สามารถรับรู้ถึงสภาพพื้นผิวของวัสดุได้โดยแบ่งรูปแบบการทำงานออกเป็น

 Contact mode หรือ Static mode แรงระหว่างเข็มวัดและตัวอย่างถูกควบคุมให้คงที่ มักใช้กับตัวอย่างที่มีแรงผลักกับเข็มวัด
 Tapping mode ควบคุมระยะการสั่น (amplitude of oscillation) ให้คงที่ โดยระบบ feedback loop จะปรับเข็มวัดขึ้นลงเพื่อควบคุมระยะการสั่น การวัดด้วยวิธีนี้ช่วยลดการรบกวนจากแรงเสียดทานที่เกิดขึ้นกับผิวตัวอย่างและสัญญาณรบกวนอื่น ๆ และใช้ระยะห่างของเข็มวัดไปสร้างเป็นภาพของตัวอย่าง
 Jumping mode ใช้ในการวัดตัวอย่างทางชีววิทยาที่อยู่ในของเหลว

นอกจากการสร้างภาพพื้นผิวของตัวอย่างแล้ว AFM ใช้ใน SMEs โดยการเคลือบผิวเข็มวัดด้วยสารที่สามารถจับกับโมเลกุลที่ต้องการศึกษา แล้วนำโมเลกุลที่ต้องการศึกษาไปยึดติดไว้กับผิวรองรับ (substrate) เราสามารถนำเข็มวัดนี้ดึงโมเลกุลที่สนใจออกทีละโมเลกุลทำให้ได้ FEC ออกมาตามต้องการ โดยข้อดีของ AFM คือ มีช่วงในการวัดที่กว้างและมีประสิทธิภาพสูง อย่างไรก็ตามยังมีข้อจำกัดจากปัจจัยบางประการคือ

 อาจมีแรงดึงดูดระหว่างเข็มวัดและผิวรองรับของโมเลกุล
 อาจดึงโมเลกุลขึ้นมาทีละหลายโมเลกุลได้ ซึ่งต้องพึงระวังไว้ในการพิจารณาผลการทดลอง
 ควบคุมตำแหน่งที่หัววัดจะพบกับโมเลกุลที่สนใจบนผิวได้ยาก

ซึ่งได้มีการใช้ Single-molecule marker และเทคนิค functionalization เพื่อแก้ไขข้อจำกัดเหล่านี้ได้ แต่ข้อจำกัดเกี่ยวกับความละเอียดของการวัดแรงและการกระจัด จะเกิดจาก thermal fluctuation เป็นสำคัญ ซึ่งทำให้ AFM ไม่สามารถวัดแรงที่มีค่าน้อยได้ดีนัก (S/N มีค่าต่ำสำหรับ weak interaction) เราจึงนิยมใช้ AFM ในการศึกษาพันธะที่มีความแข็งแรงสูงถึงพันธะโควาเลนต์ ทั้งภายในและระหว่างโมเลกุล โดยเฉพาะ pulling experiment ในชีวโพลิเมอร์เช่น คาร์โบไฮเดรต โปรตีน และกรดนิวคลีอิก

 Laser Optical Tweezers 
Laser Optical Tweezers (LOTs) อาศัยหลักการของวัตถุที่มีดัชนีหักเหสูงกว่าสิ่งแวดล้อม จะทำให้เกิดการหักเหของแสงในทิศทางที่จะทำให้เกิดแรงขึ้นได้หากวัตถุนั้นไม่อยู่ในตำแหน่งที่เหมาะสม คล้ายมีสปริงมายึดวัตถุนั้นไว้ให้อยู่ในบริเวณที่ต้องการ Ashkin เป็นผู้ค้นพบปรากฏการณ์นี้ในปี 1970 และทำการยึดจับอนุภาคไดอิเล็กทริกไว้ได้ด้วยลำแสง และต่อมาได้มีการพัฒนาขึ้นเป็นลำดับโดยสามารถจับอะตอมที่ไม่มีประจุ ไวรัส และเซลล์ของสัตว์ชั้นสูงได้ในที่สุด

สำหรับการทดลอง LOTs จะใช้ Near IR LASER เป็นต้นกำเนิดแสงและใช้เม็ดพลาสติกโพลิสไตรีนหรือซิลิกาเป็นวัสดุหักเหแสงโดยมักจะใช้ความเข้มแสงให้ต่ำที่สุด เพื่อลดผลจากความร้อนที่อาจทำลายวัสดุหักเหแสงหรือตัวอย่างได้ ทั้งนี้เราอาจประมาณศักย์ของระบบได้เป็นแบบฮาร์มอนิค ซึ่งสามารถใช้สมการกฎของฮุค F = kx ได้เช่นเดียวกับในกรณีของ AFM อย่างไรก็ตามด้วยค่าความแข็ง (stiffness) ที่น้อยกว่า AFM 102-104 เท่า ทำให้ความละเอียดในการวัดแรงและระยะทางเพิ่มขึ้นอย่างมาก เราสามารถติดตามการเคลื่อนไหวของโมเลกุลที่สนใจด้วยกล้อง CCD หรือสำหรับในระบบที่ซับซ้อนมีการใช้สำแสงอ้างอิง และอาจใช้เสียง (แรงสั่นสะเทือน) ช่วยเพิ่มความแม่นยำในการติดตามโมเลกุลได้ตัวอย่างระบบการวัดด้วย LOTs อาศัยเม็ดวัสดุสองเม็ด ที่เคลือบด้วยสารต่างชนิดกัน เม็ดหนึ่งถูกจับไว้ด้วยแสง (optical trap) อีกเม็ดหนึ่งถูกดูดไว้ด้วยระบบสุญญากาศ โมเลกุลที่สนใจจะถูกติดฉลากที่ต่างกันไว้ ทำให้แต่ละด้านเข้าไปติดกับเม็ดวัสดุแต่ละอันได้อย่างถูกต้องด้วยการจับอย่างจำเพาะ (specific interaction, lock and key, antigen-antibody) ตัวอย่างคือ biotin จับกับ streptavidin หรือ avidin และ digoxigenin จับกับ anti-dig เป็นต้น เมื่อยึดตรึงโมเลกุลไว้เรียบร้อยแล้วก็สามารถทำการดึงโมเลกุลและวัดแรงได้ FEC ออกมา ระบบที่นิยมใช้ LOTs ในการวัดได้แก่กรดนิวคลีอิกและมอเตอร์โมเลกุล

 Magnetic tweezers 
Magnetic tweezers (MTs) ทำงานด้วยหลักการคล้ายกับ LOTs เม็ดวัสดุแม่เหล็กจะถูกยึดอยู่ภายใต้บ่อศักย์อันเกิดจากสนามแม่เหล็ก โดยการทดลองนี้ให้ปลายข้างหนึ่งของโมเลกุลยึดกับเม็ดวัสดุแม่เหล็กและปลายอีกข้างยึดกับผิวแก้ว ทำการเคลื่อนไหวโมเลกุลโดยขยับสนามแม่เหล็กภายนอกส่งผลให้เม็ดวัสดุแม่เหล็กดึงโมโลกุลให้ขยับตามไป แล้วใช้กล้อง CCD ในการติดตามเม็ดวัสดุ ข้อดีของ MTs มีหลายประการดังนี้

 ไวต่อการวัดแรงที่มีขนาดน้อย
 ควบคุมแรงให้มีค่าคงที่ได้ดีกว่า AFM และ LOT ช่วยเพิ่ม time resolution
 สามารถบิดโมเลกุลได้โดยการเพิ่มเม็ดวัสดุอีกเม็ดหนึ่ง

ด้วยข้อดีเหล่านี้ จึงทำให้ MTs มักใช้ในการศึกษาสมบัติยืดหยุ่นและการหมุน (elastic and torsional properties) ของ DNA ซึ่งมีขนาดของแรงน้อยมากและเกี่ยวข้องกับการบิดหมุนของโมเลกุล

 Biomembrane Force Probe 
Biomembrane Force Probe (BFP) มักใช้ในการศึกษาผลของการยึดจับระหว่าง ligand-receptor โดยมีเซลล์เม็ดเลือดแดงช่วยทำหน้าที่เป็นสปริงในระบบ และเอาโมเลกุลที่สนใจศึกษาเคลือบไว้บนเม็ดวัสดุ โดยทั้งสองข้างของระบบจะถูกดูดไว้ด้วยปิเปตแล้วจะถูกดึงออกจากันอย่างช้า ๆ โดยความดันภายในเซลล์เม็ดเลือดแดงจะเป็นตัวกำหนดแรงตึงของผิวเซลล์และค่าความแข็งของสปริง เราสามารถติดตามปรากฏการณ์ที่เกิดขึ้นได้ด้วยกล้อง CCD เช่นเดียวกับการทดลองอื่น ๆ

 เทคนิควัดการเรืองแสงของโมเลกุลเดี่ยว 

เทคนิควัดการเรืองแสงของโมเลกุลเดี่ยว (Single-molecule fluorescence: SMF) เป็นเทคนิคที่แตกต่างจากวิธีที่กล่าวมาข้างต้นโดยสิ้นเชิง อาศัยหลักการเมื่อโฟตอนหรือแสงตกกระทบโมเลกุล และโมเลกุลดูดกลืนไว้ จะทำการให้เกิดการเปลี่ยนแปลงไปสู่สถานะกระตุ้นและต้องคายพลังงานออกมาผ่านกระบวนการต่าง ๆ หนึ่งในกระบวนการที่เกิดขึ้นได้คือการเรืองแสง โดยจะต้องมีส่วนของโมเลกุลที่ทำให้เกิดการเรืองแสงเรียกว่า fluorophore ทั้งนี้สำหรับ SME การเรืองแสงที่เกิดขึ้นต้องเกิดจากหนึ่งโมเลกุลเท่านั้น จึงต้องทำในสารละลายที่เจือจางมาก และแสงที่เกิดขึ้นก็มีความเข้มต่ำมากต้องใช้เครื่องมือวัดที่ละเอียดเป็นพิเศษ ข้อดีที่สำคัญคือ เทคนิคนี้มีความละเอียดในเชิงเวลา (time resolution) สูง และทำการวัดได้โดยไม่ทำลายเซลล์ (noninvasive) ซึ่งทำให้สามารถทำการศึกษาระบบทางชีววิทยาอย่างที่เรียกว่า in vivo ได้

ทั้งนี้ข้อจำกัดสำคัญของการวัดระยะ (spatial resolution) คือ การกระเจิงของแสงของRayleigh ซึ่งสามารถแก้ไขได้โดยเทคนิค FIONA และ TIRF ด้วยวิธีเหล่านี้ทำให้เราสามารถพิสูจน์ลักษณะการเดินของ myosin V เดินบนเส้นใย actin ได้

นอกจากนี้แล้วยังมีอีกเทคนิคที่สำคัญอย่างยิ่งคือ Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ซึ่งค้นพบโดย Förster ซึ่งเป็นการถ่ายทอดพลังงานระหว่างหมู่ที่ดูดกลืนแสงและถ่ายทอดพลังงาน (donor) และหมู่ที่รับพลังงานและเรืองแสง (acceptor) ภายในโมเลกุลเดียวกัน ซึ่งความเข้มของการเรืองแสงจะเป็นตัวบ่งบอกระยะทางระหว่างหมู่ทั้งสองนี้ จึงเป็นประโยชน์อย่างมากในการติดตามระยะทางระหว่างสองจุดในโมเลกุลที่สนใจขณะเกิดการเปลี่ยนแปลง

ปัญหาสำคัญของ SMF คือการแทรก fluorophore เข้าไปในโมเลกุล ซึ่งต้องทดลองไปเรื่อย ๆ จนกว่าจะพบวิธีการที่เหมาะสมโดยเฉพาะ FRET ต้องแทรกเข้าไปถึงสองตำแหน่งและต้องหา dipolar orientation ของ fluorophore (แก้ไขโดยใช้เทคนิคอื่นเข้าช่วย เช่น EM และ XRD) นอกจากนี้แล้วยังมีปัญหา photobleaching อันเกิดจาก fluorophore ที่ไม่เสถียรทำปฏิกิริยาเคมีแล้วสูญเสียความสามารถในการเรืองแสงไป

อย่างไรก็ตาม SMF ก็มักจะใช้ในการศึกษาการขนส่งโมเลกุล การพับตัวของโปรตีน และการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างใน enzymatic reaction ซึ่งเมื่อใช้ร่วมกับเทคนิคที่วัดแรงก็จะทำให้ได้ข้อมูลที่แม่นยำเกี่ยวกับการทำงานของชีวโมเลกุล

ในอดีตเราอาจจำแนกประเภทของการวัดออกเป็น การสังเกตโดยตรงปราศจากเครื่องมือวัดการวัดโดยใช้เครื่องมือวัด ทั้งทางตรงและทางอ้อม หรือการวัดที่อาศัยโฟตอนหรือแสง อาศัยหลักการทางไฟฟ้า อาศัยหลักการเชิงกล ซึ่งก็เป็นแง่มุมที่แตกต่างกันไปสำหรับหลักการในการวัด แต่ในปัจจุบันเมื่อเราได้ให้ความสนใจส่วนใหญ่ไปกับการทำงานระดับโมเลกุล การวัดเชิงโมเลกุลเดี่ยวจึงเป็นอีกแง่มุมของการทดลองที่ได้รับความสนใจเป็นอย่างมาก