La mutación p.ALA359ASP en la enzima esfingomielinasa ácida causante de la enfermedad de Niemann-Pick tipo B : estudio genético, bioquímico y su efecto en el daño hepático

La enfermedad Niemann-Pick tipo B (NPB) es un desorden de depósito lisosomal causado por deficiencia de la enzima esfingomielinasa ácida (ASM), que cataliza la degradación de la esfingomielina a ceramida y fosforilcolina. La ASM es codificada por el gen SMPD1, se han descrito diversas mutaciones causantes de NPB, pero la mutación p.Ala359Asp ha sido identificada sólo en pacientes chilenos. Al analizar 22 pacientes chilenos se determinó que todos presentan esta mutación en al menos un alelo. Además, en nuestro laboratorio se determinó que la frecuencia de la mutación de forma heterocigota en población sana es de un 0,95%. A partir de estos datos la prevalencia teórica de la enfermedad sería de 1/44.267, bastante mayor a los casos que se conocen actualmente. NPB presenta distintas manifestaciones clínicas, siendo las más frecuentes la hepatoesplenomegalia, el daño hepático y pulmonar. La caracterización clínica de los pacientes NPB chilenos homocigotos para la mutación p.Ala359Asp ha mostrado que algunos de ellos presentan daño hepático. En esta tesis nos propusimos 3 objetivos (i) Determinar que la mutación p.Ala359Asp es la única variante potencialmente patogénica en el gen SMPD1 en los pacientes chilenos y determinar si proviene de un ancestro común; (ii) Modelar la estructura tridimensional de la ASM, determinar si la mutación puntual p.Ala359Asp produce cambios en la localización, expresión y actividad de la enzima; (iii) Caracterizar el daño hepático y el metabolismo de la esfingomielina en pacientes homocigotos para la mutación p.Ala359Asp.La metodología incluye el uso de DNA genómico, células y biopsias hepáticas de pacientes homocigotos p.Ala359Asp. Se secuenció el gen SMPD1, analizamos marcadores genéticos para deteminar el origen común y estudiamos el origen poblacional. Además, se realizó un modelamiento bioinfomático de la ASM, se generaron plásmidos con la mutación p.Ala359Asp para estudiar su expresión, localización y actividad, que también fue analizada en fibroblastos y biopsias hepáticas de pacientes. Finalmente, caracterizamos el daño hepático en 3 pacientes que fueron trasplantados y estudiamos el metabolismo de la ASM cuantificando los niveles de enzimas y de lípidos involucrados en esta vía. Nuestros resultados muestran que los pacientes comparten un haplotipo en la zona cercana al gen y éste junto con el haplogrupo de DNA mitocondrial indican que el origen de la mutación p.Ala359Asp es probablemente Americano. También se confirmó por secuenciación del gen (exones e intrones) y sus regiones cercanas que no hay otras variantes potencialmente patogénicas. No se encontraron cambios en la expresión de mRNA ni proteína, la secreción o localización de la enzima mutada, pero sí una disminución significativa en la actividad. Además, se comprobó que no es la herencia del haplotipo completo la que causa una disminución en la actividad ASM, si no que específicamente lo produce la mutación puntual p.Ala359Asp. Por último, recopilamos los datos clínicos de 3 pacientes jóvenes que fueron trasplantados de hígado y utilizando sus biopsias se estudiaron algunos cambios histológicos y a nivel proteico, como un aumento de algunas proteínas lisosomales como la catepsina D, catepsina B y NPC2.Además, se encontró que en un paciente, los niveles hepáticos de esfingomielina, ceramida y esfingosina están elevados, lo que indica que hay otras maneras de compensar la formación de los lípidos río abajo de la esfingomielina, como el aumento de la actividad de la esfingomielinasa neutra. Con nuestros resultados, proponemos que la ceramida y la esfingosina podrían estar produciendo daño celular y activando vías de fibrosis en el hígado, en las que podrían estar involucradas las catepsinas D y B, pero se necesitan futuros experimentos para comprobarlo. En conclusión, nuestros resultados sugieren que la mutación proviene de un ancestro común probablemente Americano, y que se habría originado hace 40-­‐60 generaciones. Por otra parte, esta mutación produce una disminución en la actividad enzimática sin alterar la expresión y localización de la ASM. Finalmente, los pacientes presentan daño hepático en edades tempranas, con aumento de marcadores fibróticos, que podrían estar relacionados con la acumulación de esfingomielina y otros esfingolípidos.