Estudio de la respuesta bioquímica de neutrófilos humanos frente a patógenos periodontales

Los neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) son un tipo de leucocito que tiene participación en la primera etapa de la inmunidad innata. Constituyen la primera línea de defensa del hospedero frente a un agente patógeno, pero la liberación de sus componentes puede causar destrucción de tejido. Estas células al activarse secretan citoquinas inflamatorias, fagocitan a las bacterias y las destruyen a través de agentes microbicidas como intermediarios de oxígeno reactivo (ROS) y óxido nítrico (NO) y, también, a través de la secreción de metaloproteinasas (MMPs). Las MMPs son enzimas hidrolíticas con características neutras que degradan colágeno, gelatina, laminina y otros componentes de la matriz extracelular, secretándose desde neutrófilos la MMP-8 (colagenasa) y la MMP-9 (gelatinasa B). La periodontitis es una enfermedad que causa la destrucción del colágeno en el ligamento periodontal provocando inflamación. El proceso destructivo es el resultado de una compleja interacción entre estas bacterias, la inmunidad del hospedero y los sistemas inflamatorios.Las principales bacterias implicadas en la enfermedad periodontal son anaeróbicas y gram-negativaseincluyen Porphyromonas gingivalis (Pg) y Actinobacillus actinomycetemcomitans(Aa), entre otras. El reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), por parte de los neutrófilos lo realiza una importante familia de receptores llamada receptores de tipo Toll (TLR). Los objetivos de esta tesis fueron: 1) estudiar la respuesta de los neutrófilos periféricos (circulantes) frente a periodontopatógenos como Pg y Aa y, además, de algunos de los PAMPs más conocidos como LPS de Escherichia coli (componente de la pared celular), Zymosan A (extracto de Saccharomyces cerevisiae) y la lectina fitohemaglutinina (PHA); y 2) comparar la respuesta de neutrófilos provenientes de pacientes con periodontitis con la de individuos sanos. La respuesta de los neutrófilos frente a agentes potencialmente estimuladores o activadores se estudió, tanto en sangre completa como en neutrófilos purificados, a través del análisis de la secreción de la enzima MMP-9 y la citoquina IL-8, intentándose además medir la liberación al medio de óxido nítrico (NO). La actividad de MMP-9 se determinó por zimografía en geles de poliacrilamida en presencia de gelatina (colágeno desnaturalizado) como sustrato, en condiciones desnaturantes, lo que permite evaluar las formas activa y latente de la gelatinasa. Los niveles de IL-8 se determinaron utilizando el método ELISA. Los intentos de demostrar un aumento de liberación de NO en respuesta a los estimuladores fueron infructuosos, no obstante se trataron de cuantificar los niveles de sus metabolitos estables (nitrito y nitrato) por el sensible método de electroforesis capilar. En sangre completa, al comparar la condición estimulada con la condición basal en ausencia de estimulador, PHA aumentó la liberación de MMP-9 en ambos grupos (sanos y pacientes). Por otra parte, LPS y Pg estimularon la secreción de IL-8 sólo en el grupo de pacientes. No se encontraron diferencias significativas entre el grupo de pacientes con enfermedad periodontal y el grupo control de los individuos sanos en cuanto la liberación de MMP-9 e IL-8. Al trabajar con neutrófilos purificados, en ambos grupos LPS y Pg aumentó significativamente la liberación de MMP-9 respecto a la condición basal, encontrándose además un aumento significativo en el grupo de pacientes comparado con el grupo sano. La secreción de IL-8 respecto a la condición basal aumentó sólo en pacientes por efecto de LPS y Zymosan A. La comparación entre los dos grupos mostró diferencias significativas en la liberación de IL-8 al incubar con LPS, Pg, Aa y Zymosan A, observándose una mayor activación en los neutrófilos de los pacientes. La secreción de IL-8 se encontró atenuada en pacientes, pero se observó una gran aumento en su secreción (activación) por todos los estimuladores estudiados (entre 3 y 7 veces), a diferencia del grupo control. Los resultados en neutrófilos purificados apoyan la hipótesis propuesta de que este tipo de leucocitos periféricos en pacientes con periodontitis son más reactivos (hiper-reactivos) que los de individuos sanos. La determinación de la respuesta de los neutrófilos periféricos podría ser una herramienta útil para el seguimiento de la eficacia del tratamiento en los pacientes con periodontitis. La baja proporción de neutrófilos en las muestras de sangre completa no permitió observar esta hiper-reactividad, ni tampoco la respuesta estimuladora en general
 Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are a kind of leukocyte involved in the early innate immune response. They constitute the first line of host defense against a pathogenic agent, but the release of their components may cause tissue destruction. When these cells are activated they release proinflammatory cytokines, they phagocyte bacteria and destroy them through microbicidal agents like oxygen intermediates (ROS), nitric oxide (NO) and, also, through the release of metalloproteinases (MMPs). MMPs are hydrolytic enzymes with neutral characteristics which are able to degradate collagen, gelatin, laminin and other extracellular matrix components, releasing from neutrophils MMP-8 (collagenase) and MMP-9 (gelatinase B). Periodontitis is a disease that destroys collagen in the periodontal ligament producing inflammation. The destructive process is the result of a complex interaction between these bacteria, the host immunity and the inflammatory systems. The main bacteria involved in the periodontal disease are anaerobic and gram-negative and they include Porphyromonas gingivalis (Pg) and Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), among others. Recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) by neutrophils is carried out by an important family of receptors called Toll like receptors (TLR). The objectives of this thesis were two: 1) to study the response of peripheric (circulating) neutrophils against periodontopathogens Pg and Aa and, also against some of well known PAMPs such like LPS from Escherichia coli (cell wall component), Zymosan A (Saccharomyces cerevisiae extract) and the lectin phytohemagglutinin (PHA); and 2) to compare the response of neutrophils from patients with periodontitis to those from healthy individuals. The response of neutrophils against potentially stimulating agents or activators was studied in both whole blood and purified neutrophils, through the analysis of the release of the MMP-9 enzyme and the cytokine IL-8, trying to measure also the release of nitric oxide (NO) to the incubation medium. The activity of the MMP-9 was determinated by zymography on polyacrylamide gels, including gelatin (denaturalized collagen) as a substrate, in denaturating conditions, to evaluate both the active and latent forms of the gelatinase. The IL-8 levels were assayed using the ELISA method. Attempts to demonstrate an increase in the release of NO in response to the stimulators were unsuccessful, even though the nitrite and nitrate determination was used in an attempt to quantify the levels of its stable metabolites by the sensitive method of capillary electrophoresis. In whole blood, when comparing the stimulated condition with the basal condition in absence of a stimulator, PHA increased the release of MMP-9 in both groups (healthy and patients). On the other hand, LPS and Pg stimulated the release of IL-8 only in the patient group. Significant differences between the group of patients with periodontal disease and the control group of healthy individuals in terms of the release of MMP-9 and IL-8 were not found. When working with purified neutrophils, in both groups LPS and Pg significantly increased the release of MMP-9 with respect to the basal condition; a significant increase in the patients group compared to the healthy group was also found. The release of IL-8 with respect to the basal condition increased only in patients due to the effects of LPS and Zymosan A. The comparison between the two groups showed significant differences in the release of IL-8, during incubation with LPS, Pg, Aa and Zymosan, with a greater activation in the neutrophils from patients. The secretion of IL-8 was reduced in patients, but with all the stimulators studied a larger secretion (activation) between 3 and 7 fold was observed in patient neutrophils as compared to that of the healthy group. The results in purified neutrophils support the proposed hypothesis that this type of peripheric leucocyte in patients with periodontitis is more reactive (hyper-reactive) than in healthy individuals. Determination of peripheral neutrophil response can be an useful tool for monitoring the efficacy of the treatment in periodontitis-affected patients. The proportion of neutrophils in whole blood samples was too low to observe this hyper-reactivity, or the stimulating response in general