Efectos de la incretina glp-1 sobre el acoplamiento retículo endoplásmico-mitocondria en células de músculo liso vascular : rol de pka y mitofusina-2

La hormona GLP-1 es una reguladora importante de la homeostasis de la glucosa, favoreciendo su metabolismo en varios tejidos a través de la activación de la vía del AMP cíclico-proteína kinasa A. En las células de músculo liso vascular (VSMC), el control del metabolismo de la glucosa es esencial para la mantención de la función y el fenotipo celular, ya que al favorecer su oxidación en las mitocondrias, se previene la aparición de un fenotipo desdiferenciado, característico de patologías cardiovasculares. Un mecanismo que promueve la actividad mitocondrial es su acoplamiento con el retículo endoplásmico (RE), pues se favorece el traspaso de metabolitos y Ca2+ desde el RE a la mitocondria. Estructuralmente, el acoplamiento entre ambos organelos depende de Mitofusina-2 (Mfn-2). Existe evidencia de que una disminución en el acoplamiento entre RE y mitocondrias en VSMC conduce a la aparición de un fenotipo proliferativo, mientras que el uso de GLP-1 previene el desarrollo de este fenotipo. Además, datos de nuestro grupo de trabajo sugieren que esta hormona potencia la actividad mitocondrial. Basados en estos antecedentes, quisimos estudiar si GLP-1 era capaz de promover el acoplamiento entre RE y mitocondrias en la línea celular vascular A7r5, y evaluar el posible rol de PKA y de Mfn-2 en el fenómeno. A través de inmunofluorescencia indirecta con marcación de RE y mitocondrias, se observó un aumento en la colocalización entre ambos organelos en células estimuladas con GLP-1 (100 nM, 3 h). Además, mediante el uso de la sonda fluorescente Rhod-FF, sensible a Ca2+ mitocondrial, se determinó que la pre-incubación de estas células con GLP-1 favorecía la entrada de Ca2+ reticular a la mitocondria. En forma paralela, se determinó que el tratamiento por 3 h con GLP-1 aumentó los niveles de Mfn-2, efecto que se perdió cuando las células se pre-incubaron con el inhibidor de PKA, H-89. Finalmente, se determinó que el incremento en la colocalización entre RE y mitocondrias y el aumento en la entrada de Ca2+ reticular a las mitocondrias en respuesta al tratamiento con GLP-1, se inhibían en células pre-tratadas con H-89. Así, concluimos que la incretina GLP-1 promueve el acoplamiento funcional entre RE y mitocondrias en células de la musculatura lisa vascular, a través de un mecanismo que requiere de la activación de PKA, y presumiblemente, del aumento de la proteína Mfn-2.
 The hormone GLP-1 is an important regulator of glucose homeostasis that promotes its metabolism on several tissues through a cyclic AMP-protein kinase A pathway. In vascular smooth muscle cells (VSMC) glucose metabolism is involved in the control of both cellular function and phenotype, given that promoting its oxidation in the mitochondria prevents the appearance of VSMC undifferentiated phenotype, a hallmark of cardiovascular pathologies. Mitochondrial activity is activated by their coupling with the endoplasmic reticulum (ER), which enhances metabolite and Ca2+ transfer from the ER to the mitochondria. Structurally, the coupling between these organelles depends on Mitofusin-2 (Mfn-2). A decrease on ER-mitochondria coupling in VSMC leads to a proliferative phenotype, while GLP-1 treatment prevents its appearance. Besides, data from our work group suggests that this hormone enhances mitochondrial activity. Based on this background, we evaluated whether GLP-1 modulated functional coupling between ER and mitochondria in the vascular cell line A7r5, and the involvement of PKA and Mfn-2 on this phenomenon. Inmunofluorescence analysis of ER and mitochondria stained cells revealed that GLP-1 (3 h, 100 nM) treatment increased colocalization of these two organelles. Furthermore, by using the mitochondrial Ca2+ sensitive fluorescence probe, Rhod-FF, we determined that pre-incubation of these cells with GLP-1 enhanced reticular Ca2+ entry into the mitochondria. Moreover, the treatment with GLP-1 by 3 h increased Mfn-2 levels, an effect that was prevented by the pre-incubation with the PKA inhibitor, H-89. Finally, the increment of ER and mitochondria colocalization and the increase on reticular Ca2+ entry into the mitochondria in response to GLP-1 stimulation were both abolished in H-89 pre-treated cells. Therefore, we concluded that the hormone GLP-1 promotes ER and mitochondria coupling in VSMC, through a mechanism that requires PKA activation, and presumably, an increment of Mfn-2 levels.