Palmitic acid inhibits the autophagic flux in hypothalamic neurons.

La obesidad es considerada una epidemia mundial, tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo. Uno de los factores más importantes que promueven el desarrollo de obesidad es el consumo de dietas altas en grasas (HFD) ricas en ácidos grasos saturados, como el ácido palmítico (PA). La ingesta crónica de una HFD se ha asociado con el incremento de enfermedades metabólicas, como la resistencia a la insulina. Se ha observado en ratones, que luego del consumo crónico de una HFD el PA se acumula en el hipotálamo, el área del cerebro encargada de mantener la homeostasis energética y de regular el metabolismo corporal. Uno de los mecanismos homeostáticos celulares clave que es afectado después del consumo de una HFD es la autofagia, el cual es un proceso catabólico mediado por los lisosomas, destinado a la degradación y reciclaje de componentes citoplasmáticos y orgánulos dañados. Durante el proceso de autofagia, el cargo celular es secuestrado dentro de una vesícula de doble membrana, llamada autofagosoma, la cual se fusiona con un lisosoma, formando un autolisosoma, donde, gracias a la actividad de las enzimas lisosómales, el cargo autofágico es degradado. Todo el proceso desde la síntesis del autofagosoma hasta su degradación lisosomal se denomina flujo autofágico. Es importante destacar que la desregulación del proceso de autofagia en neuronas del hipotálamo promueve el desarrollo de trastornos metabólicos, lo que sugiere que la autofagia hipotalámica tendría un papel clave en el control del metabolismo corporal. Además, niveles elevados de PA se han asociado con una disminución de la autofagia y con resistencia a la insulina en el hipotálamo. Sin embargo, actualmente se desconoce el mecanismo específico por el cual el PA disminuye la autofagia en las neuronas hipotalámicas. En este proyecto, proponemos que la inhibición de la autofagia inducida por el PA en neuronas hipotalámicas posee un papel fundamental en el desarrollo de trastornos metabólicos asociados a la obesidad, como la resistencia a la insulina. La hipótesis de esta tesis es que el ácido palmítico inhibe el flujo autofágico y disminuye la sensibilidad a la insulina en las células neuronales hipotalámicas. Los resultados arrojaron que, en la línea celular hipotalámica N43/5 y en cultivo primario de neuronas hipotalámicas de rata, el PA aumentó el número de estructuras autofágicas y los niveles de SQSTM1/p62, una proteína degradada durante el proceso de autofagia, sugiriendo que el PA inhibe el flujo autofágico en células neuronales hipotalámicas. Además, los niveles de expresión de distintos genes relacionados con la autofagia y que son esenciales para la formación del autofagosoma no variaron por la exposición al PA, lo que sugiere que el PA promueve la acumulación de estructuras autofágicas como consecuencia de la disminución del flujo autofágico en las células N43/5. Adicionalmente, mediante microscopía electrónica, observamos que el PA indujo la acumulación de grandes compartimentos celulares degradativos en las células neuronales hipotalámicas N43/5. Sin embargo, el PA no disminuyó la acidez lisosomal ni su actividad enzimática en la línea de células hipotalámicas. No obstante, la exposición de PA si afectó la dinámica de vesículas endolisosomales, disminuyendo la velocidad y la distancia recorrida por éstas, en las células N43/5. Luego, evaluamos por inmunofluorescencia la fusión de los autofagosomas con los lisosomas utilizando células N43/5 transfectadas con el constructo mcherry-GFP-LC3, y también mediante el análisis de colocalización entre marcadores de autofagosomas y lisosomas. Observamos que el PA es capaz de disminuir la fusión entre ambos organelos, así como de incrementar la acumulación de estructuras autofágicas de gran tamaño. Además, mediante un ensayo de pull-down cuantificamos el estado de activación de Rab7, una proteína involucrada tanto en la fusión del autofagosoma con el lisosoma como también en el tráfico endolisosomal, y observamos que en células N43/5 expuestas a PA los niveles Rab7 unida a GTP incrementaron, sugiriendo que el PA podría perjudicar la formación de autolisosomas a través de regulación de la actividad de Rab7. Además, mediante la técnica de etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular (SILAC), encontramos en lisosomas aislados de células N43/5 tratadas con PA, un aumento en los niveles de diversas proteínas involucradas con el control del tráfico endolisosomal y con la maduración autofágica, lo que podría explicar el mecanismo por el cual el PA afecta la autofagia en las neuronas hipotalámicas. Finalmente, se evaluó si la exposición al PA contribuye al desarrollo de desórdenes metabólicos, confirmando que el PA disminuye la sensibilidad a la insulina en las células hipotalámicas N43/5. Además, tanto la inhibición de la autofagia como del flujo autofágico redujeron la sensibilidad a la insulina en estas células. En resumen, este estudio sugiere que, en células neuronales hipotalámicas, la inhibición del flujo autofágico inducida por PA desregula el tráfico endolisosomal y reduce la sensibilidad a la insulina. Este estudio puede ayudar a dilucidar los mecanismos celulares que subyacen a los efectos del PA en la promoción de trastornos metabólicos asociados con la obesidad.