Regulación de los canales formados por panexina 1 por PKA y CAMKII.

Los canales formados por panexina 1 permiten el paso de iones monovalentes, metabolitos y pequeñas moléculas de señalización entre los compartimentos intra y extracelulares. La actividad de estos canales se puede modular mediante modificaciones postraduccionales, tales como N-glicosilación y S-nitrosilación, como también por fosforilación en las tirosinas 198 y 308 y en la serina 206. Sin embargo, se desconoce si son afectados por otros cambios en su estado de fosforilación. En general, se cree que los canales formados por panexina 1 se abren en respuesta al estrés mecánico, sin embargo el mecanismo subyacente no ha sido identificado. En esta tesis se plantea que en este proceso de activación de los canales formados por panexina 1 participan canales mecanosensibles permeables al Ca2+ , seguido de la activación de una vía de señalización de proteína cinasa dependiente de Ca2+ , la que al fosforilar el canal aumenta su actividad funcional. Se evaluó la actividad de los canales formados por panexina 1 a través de ensayos de captación de DAPI, un colorante al cual estos canales son permeables, en células HeLa transfectadas con el cDNA de panexina 1 de rata y células HeLa sin transfectar, como control negativo. Para inducir la activación de los canales formados por panexina 1, se sometió las células a estrés mecánico realizado mediante el goteo de 6 ml de solución de registro a una distancia de 10 cm. La captación de DAPI inducida por el estrés mecánico se detectó sólo en las células HeLa transfectadas con el cDNA de panexina 1. La activación de los canales formados por panexina 1 requirió de la presencia de Ca2+ y no de Mg2+ en el medio extracelular y fue prevenida por La3+, un bloqueador de canales permeables a Ca2+ incluidos los canales mecanosensibles. La activación del canal mecanosensible Piezo 1 con su agonista Yoda 1 aumentó la captación de colorante de células HeLa Panx1 y este efecto fue bloqueado por 10 µM CBX, indicando que dicho aumento en la captación de colorante es mediado por los canales formados por panexina 1. Por otro lado, la activación de los canales formados por panexina 1 mediante estimulación mecánica fue prevenida parcialmente con el uso de un morfolino contra Piezo 1. Estos dos resultados dan cuenta de que tanto la estimulación farmacológica como mecánica de Piezo 1 activa a los canales formados por panexina 1. La activación de los canales formados por panexina 1 requirió de la formación del complejo Ca2+ - calmodulina seguido de la activación de la cinasa CaMKII, ya que el antagonista de calmodulina W-7 y el inhibidor de CaMKII KN62 previnieron la activación de los canales. La mutación de panexina 1 en la serina 394 a alanina, un sitio potencial de fosforilación por CaMKII localizado en el extremo carboxilo terminal previno la activación de los canales formados por panexina 1, lo que indica que este residuo aminoacídico participa en la activación de los canales formados por panexina 1 inducida por estrés mecánico y sugiere fuertemente que CaMKII fosforila a panexina 1, produciendo un cambio conformacional del canal causando su activación. Por el contrario y en línea con lo anterior, la mutación fosfomimética de la serina 394 por aspartato (S394D) generó un canal hiperactivo que en forma basal favoreció su internalización, la que fue parcialmente prevenida por suramina (un bloqueador de receptores P2, que participan en la internalización del canal formado por panexina 1 inducida por una alta concentración de ATP extracelular, favoreciendo la detección del canal hiperactivo en la superficie celular. Por otro lado, el tratamiento agudo con adenosina o con análogos de AMP cíclico que cruzan la membrana plasmática inhibió la actividad de los canales formados por panexina 1 previamente activados por estrés mecánico. Usando inhibición farmacológica selectiva, se encontró que el efecto del análogo de AMP cíclico Db-cAMP dependía de PKA pero no de PKC, p38 MAPK, Akt o PKG, ya que fue prevenida por PKI, un inhibidor de PKA y no así por bisindolilmaleimida, SB302580, AKTi y KT5823, inhibidores respectivos de las cinasas PKC, p38 MAPK, Akt y PKG. Por lo tanto, se propuso que PKA podría fosforilar a panexina 1 y así reduciría la actividad de los canales formados por ésta. La mutación de panexina 1 en la treonina 302 o en la serina 328 a alanina, dos sitios potenciales de fosforilación por PKA localizados en el extremo carboxilo terminal, previno la inhibición de la actividad de los canales formados por panexina 1 inducida por Db-cAMP. Es más, la mutación fosfomimética de estos residuos aminoacídicos a aspartato favoreció un estado cerrado de los canales formados por panexina 1, haciéndolos insensibles al estrés mecánico y siendo esto consistente con la noción que propone que PKA fosforila a panexina 1 y de esta manera inhibe a los canales formados por panexina 1. En base a los resultados de esta tesis, se propone que los canales formados por panexina 1 no son directamente sensibles al estrés mecánico y requieren de un flujo de Ca2+ a través de canales mecanosensibles como Piezo 1. Este flujo permite un aumento citoplasmático de la concentración de Ca2+ libre que se uniría a calmodulina y el complejo Ca2+ - calmodulina activaría a CaMKII para posteriormente activar a los canales formados por panexina 1 probablemente por fosforilación en la serina 394. Además, se propone que un aumento de AMP cíclico induce la fosforilación de panexina 1 en la treonina 302 y/o serina 328 dependiente de PKA, lo cual inhibe la actividad de los canales formados por panexina 1. Esto sugiere que la comunicación paracrina a través de canales formados por panexina 1 podría ser modulada por distintos receptores acoplados a proteína G, asociados a la subunidad αs, por ejemplo, receptores de algunos neurotransmisores como el receptor D1 de dopamina y los receptores β adrenérgicos y de hormonas, como el receptor de glucagón.