Mecanismos antiangiogénicos de calreticulina de Trypanosoma cruzi

La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes. La utilización de agentes capaces de inhibir este proceso podría ofrecer opciones terapéuticas para patologías dependientes del abastecimiento de nutrientes a través de la sangre, como el cáncer, obesidad, o desórdenes inflamatorios. Calreticulina (CRT) es una proteína multifuncional, altamente conservada, expresada en todas las células nucleadas. Se ha reportado que calreticulina humana (HuCRT) y su dominio N-terminal, vasostatina, interfieren con la angiogénesis inhibiendo la proliferación de células endoteliales y la interacción de éstas con laminina, una proteína de la membrana basal. Previamente, hemos descrito que CRT de T. cruzi (TcCRT), es antiangiogénica en el ensayo in vivo de membrana corioalantoídea de pollo. Este efecto se correlaciona con propiedades antineoplásicas reportadas para la infección tripanosómica con varias cepas del parásito. El objetivo de la presente Tesis fue contribuir al conocimiento de los mecanismos celulares que median el efecto antitumoral de la infección chagásica, centrándose en el posible papel de TcCRT, en virtud de posibles efectos antiangiogénicos expresados en modelos in vitro y ex vivo. Para ello se propusieron tres Hipótesis: 1. TcCRT manifiesta efectos antiangiogénicos in vitro y ex vivo en modelos de vertebrados, 2. El efecto antiangiogénico de TcCRT se explica, al menos en parte, por su interacción directa con células endoteliales, inhibiendo su proliferación, y 3. La actividad antiangiogénica de TcCRT se localiza en su dominio N-terminal (N-TcCRT), y su unión a laminina inhibe la adhesividad de células endoteliales a ésta. Los objetivos específicos propuestos para dar cuenta de estas hipótesis fueron: 1. Determinar si TcCRT y su dominio N-terminal inhiben la angiogénesis en ensayos in vitro y ex vivo, a partir de células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVECs) y de anillos de aorta de rata, 2. Determinar si TcCRT se une a células endoteliales, 3. Estudiar el efecto comparativo equimolar de HuCRT, TcCRT y N-TcCRT sobre la proliferación de HUVECs, 4. Estudiar el efecto de TcCRT sobre la quimiotaxis de células endoteliales, 5. Determinar si TcCRT se une a laminina 6. Determinar si la interacción TcCRT/laminina inhibe la adhesión de HUVECs a esta última proteína y 7. Determinar el efecto de TcCRT sobre la expresión de genes reguladores del proceso angiogénico en HUVECs. Los ensayos ex vivo mostraron que TcCRT inhibe el crecimiento capilar en anillos aórticos de rata en forma dosis-dependiente. N-TcCRT (aa 20-191) también inhibió completamente el crecimiento capilar. TcCRT tuvo un efecto inhibitorio dosis-respuesta en experimentos de morfogénesis capilar in vitro, utilizando HUVECs. Comparaciones equimolares de TcCRT con su contraparte humana, mostraron que la molécula parasitaria y el dominio N-terminal, tienen un efecto inhibitorio claramente superior. Los dominios R (R-TcCRT) y S (S-TcCRT) de la proteína parasitaria (aa 136-281 y 159-281 respectivamente) no afectaron la morfogénesis capilar de HUVECs. Mediante experimentos de fluorescencia, demostramos que TcCRT se une y es internalizada por HUVECs y células de la línea endotelial EAhy926. La internalización es inhibida por fucoidina. TcCRT inhibió la proliferación de HUVECs en forma dosis y tiempo-dependiente. Este efecto es independiente de apoptosis. Cuando comparamos la acción de la molécula parasitaria y de su dominio N-terminal con la de la humana, sobre la proliferación de HUVECs, no encontramos diferencias significativas en condiciones equimolares. R-TcCRT no tuvo efecto en la proliferación de HUVECs. Mediante experimentos de migración, determinamos que TcCRT inhibe la migración de HUVECs y células EAhy926 en forma dosis-dependiente. En ELISA TcCRT, R-TcCRT y S-TcCRT, se unen a laminina en forma dosis-dependiente, pero en contraste con los resultados obtenidos con la molécula humana, esta interacción no afecta la adhesión de las células endoteliales a esta proteína. Finalmente, mediante experimentos de RT-PCR en tiempo real, determinamos que la incubación de HUVECs con TcCRT por 24 h, no activa la expresión de genes antiangiogénicos. En síntesis, en este trabajo demostramos un efecto antiangiogénico de TcCRT y su dominio Nterminal en células endoteliales arteriales y venosas de dos especies, Rattus rattus y Homo sapiens, en ensayos ex vivo e in vitro. Este efecto se correlaciona con la inhibición de la morfogénesis capilar, proliferación y migración de las células endoteliales, y también con la internalización de TcCRT en células endoteliales. Estas propiedades de TcCRT podrían explicar, al menos en parte, la resistencia relativa a ciertas agresiones por tumores sólidos inducida por infecciones tripanosómicas
 Angiogenesis is the growth of new blood vessels from the pre-existing ones. The use of agents capable of inhibit this process would offer therapeutic options for pathologies dependent on blood supplied nutrients, such as cancer, obesity and inflammatory disorders. Calreticulin (CRT) is a multifunctional, highly conserved protein, expressed in every nucleated cell. It has been reported that human calreticulin (HuCRT), and its N-terminal domain, vasostatin, interferes with angiogenesis by inhibiting endothelial cell proliferation and their attachment to laminin, a basement membrane protein, by binding to it. Previously, we have described that T. cruzi calreticulin (TcCRT) is antiangiogenic in the in vivo chorioalantoid membrane chicken assay, which correlates with the reported anti-neoplasic properties for trypanosomic infection with several strains of the parasite. The aim of the present Thesis was to contribute furthermore to the knowledge of the cellular mechanisms that mediate the antitumoral effect of chagasic infection, focusing on the possible role of TcCRT, expressed in in vitro and ex vivo models. We proposed three Hypotheses: 1. TcCRT shows antiangiogenic effects in in vitro and ex vivo vertebrate models, 2. The TcCRT antiangiogenic effect is explained, at least partly, by its direct interaction with endothelial cells, inhibiting their proliferation, and 3. the antiangiogenic TcCRT activity is located on its N-terminal domain (NTcCRT), and its binding to laminin inhibits endothelial cell attachment. The proposed specific objectives were: 1. To determine if TcCRT and its N-terminal domain inhibits angiogenesis in in vitro and ex vivo assays, on human vein endothelial cells (HUVECs) and rat aortic rings, 2. To determine if TcCRT binds to endothelial cells, 3. To study the equimolar comparative effect of HuCRT, TcCRT and N-TcCRT on HUVECs proliferation, 4. To study the TcCRT effect on endothelial cell chemotaxis, 5. To determine if TcCRT binds to laminin, 6. To determine if TcCRT/laminin interaction inhibits endothelial cell attachment to laminin and 7. To determine the TcCRT effect on the expression of angiogenic genes in HUVECs. The ex vivo assays showed that TcCRT inhibits capillary growth on rat aortic rings, in a dosedependent manner. Complete capillary growth abrogation was also observed with N-TcCRT (aa 20- 191) incubation. TcCRT had a dose-response inhibitory effect in in vitro capillary morphogenesis experiments on HUVECs. When TcCRT and N-TcCRT were compared at equal molarities with HuCRT, the effects of the parasite derived molecules were clearly stronger than those of the human counterpart. The R (R-TcCRT) and S (S-TcCRT) domains of the parasite protein (aa 136-281 and 159-281 respectively) did not affect capillary morphogenesis. By fluorescence experiments we demonstrated that TcCRT binds and is internalized by HUVECs and EAhy926 endothelial cell line. The internalization was competed by fucoidan. TcCRT inhibited HUVECs proliferation in a dose and time-dependent manner. This effect is apoptosis independent. Non significant differences were observed in the proliferation inhibition capacity at TcCRT, N-TcCRT and HuCRT equimolar concentrations. R-TcCRT had no significant effect on HUVECs proliferation. HUVECs and EAhy cells migration was inhibited by TcCRT in a dose-response manner. TcCRT and its R and S domains bind to laminin in ELISA assays, but in contrast to the observed effects of the human molecule, this interaction does not impedes cell attachment to this protein. Finally by carrying out real time RTPCR experiments, we determined that HUVECs incubation with TcCRT for 24 h, does not activate the antiangiogenic gene expression. In synthesis, in this work we demonstrated an antiangiogenic effect of TcCRT and N-TcCRT on arterial and venous endothelial cells from two species, Rattus rattus and Homo sapiens, in ex vivo and in vitro assays. This effect correlates to capillary morphogenesis, proliferation and migration inhibition of endothelial cells, and also with TcCRT internalization to endothelial cells. These properties could explain, at least partly, the relative resistance to certain solid tumor aggressions induced by trypanosomic infections