Bioprocess engineering and metabolic modeling as a roadmap for enhanced recombinant protein production in Pichia pastoris

Pichia pastoris es reconocida como un workhorse biotecnológico para la expresión de proteínas recombinantes. Basándose en sus logros pasados y novedosos desarrollos, la biotecnología de sistemas de P. pastoris ha progresado significativamente en las últimas dos décadas. En esta tesis doctoral, el análisis sistemático de las condiciones operativas en conjunto con el desarrollo de herramientas computacionales y la selección de configuraciones mecánicas óptimas de bioreactores se llevaron a cabo como una hoja de ruta para mejorar la producción de proteínas recombinantes a través de la ingeniería de bioprocesos y el modelamiento metabólico. A pesar de que nosotros utilizamos una cepa de P. pastoris que expresaba constitutivamente la proteína endulzante taumatina, como caso de estudio, los desarrollos logrados también son aplicables para la expresión de otras proteínas recombinantes de interés. Primero, presentamos un marco integrado para revelar los efectos metabólicos de dos parámetros operacionales – la tasa específica de crecimiento y la concentración de oxígeno disuelto - en cultivos continuos limitados en glucosa. Más específicamente, empleamos un diseño experimental racional para calcular los efectos estadísticos significativos de los datos de múltiples quimiostatos, que luego fueron contextualizados utilizando un modelo metabólico a escala del genoma manualmente curado. Nuestros resultados revelaron un efecto negativo de la oxigenación en la tasa especifica de producción del producto y un efecto positivo en el rendimiento de la biomasa. En particular, identificamos un efecto sinérgico de ambos parámetros en la tasa específica de producción del producto. Finalmente, las predicciones del modelo indicaron una relación opuesta entre el nivel de oxigenación y el requerimiento de ATP asociado al crecimiento, sugiriendo un mayor gasto metabólico de crecimiento a bajo nivel de oxigenación. En segundo lugar, construimos un modelo metabólico a escala genómica dinámico para cultivos aeróbicos de Pichia pastoris limitados en glucosa. El modelo se empleó para analizar la distribución del flujo metabólicos de un cultivo alimentado por lotes y para diseñar estrategias genéticas y de ingeniería de procesos para mejorar la producción de albúmina sérica humana recombinante. Simulaciones de knock-outs individuales indicaron que la desviación del carbono hacia la formación de cisteína y triptófano podría mejorar en 63 veces la producción de HSA. Además, el modelo sugirió que la implementación de una tasa de crecimiento específica decreciente durante la fase de alimentación de un cultivo alimentado por lotes produce un aumento del 25% de la productividad volumétrica de la proteína. Finalmente, se llevó a cabo una optimización de la tasa de transferencia de oxígeno en reactores de 1 L. Para este propósito, primero discutimos la formulación de un algoritmo automático para la estimación de kLa bajo diferentes condiciones hidrodinámicas. Luego, presentamos una hoja de ruta para optimizar la tasa de transferencia de oxígeno en bioreactor de 1-L, utilizando diferentes configuraciones de aspas-difusor. La importancia relativa de la aireación y agitación bajo las diferentes configuraciones y condiciones hidrodinámicas fueron llevadas a cabo. Finalmente, propusimos un árbol de decisión para la selección de la mejor configuración con el fin de mejorar la transferencia de oxígeno en bioreactores según el rango de los parámetros operacionales y la viscosidad. En general, esta tesis es un intento exitoso de analizar y comprender los efectos metabólicos utilizando un diseño racional de experimentos y modelos metabólicos. Además, este análisis sistemático en cooperación con una optimización de la transferencia de oxígeno en bioreactores permitirá mejorar la producción de proteínas recombinantes en Pichia pastoris.