Análisis estructural, evolutivo y funcional de la piridoxal quinasa humana (hPLK)

La enzima piridoxal quinasa (PLK) pertenece a la familia de quinasas sin dominio menor de la superfamilia de la riboquinasa y cataliza la formación de piridoxal-5’-fosfato (PLP) a partir de piridoxal (PL) y de un complejo metal divalente–ATP (Me+2-ATP), siendo fundamental en la vía de salvataje de PLP en diversos organismos. PLP es la forma activa de la vitamina B-6 y es el segundo cofactor más usado en la naturaleza, luego del ATP, principalmente relacionado con el metabolismo de los compuestos aminos, como los aminoácidos. A partir de análisis filogenéticos se infirió que existen cuatro clados de PLK bien diferenciados, tres de los cuales corresponden al dominio de las bacterias y uno al dominio de los eucariontes, estando ausente el dominio de las arqueas, las que sólo poseen una vía de biosíntesis de novo de PLP. En el caso de las bacterias, uno de los clados corresponde a las proteínas que son homólogos cercanos del gen pdxK y los otros dos clados son homólogos cercanos del gen pdxY, donde en uno se encuentran las PLK de firmicutes, bacteroidetes, espiroquetas, fusobacterias y termotogales, mientras que en el otro se encuentran las PLK de proteobacterias, actinobacterias y deinococos-thermus. Además, se distinguieron tres motivos de secuencia conservados, los cuales corresponden a DPV, NXXE y GXGD, asociados a la unión de sustratos, unión de Mg+2 y la catálisis. La estructura de PLK de origen humano (hPLK) posee una alta similitud estructural con PLKs de otras fuentes, como de Ovis aries y Escherichia coli, salvo en algunos loops de la estrucura. hPLK, que fue expresada en E. coli, se purificó y caracterizó cinéticamente. En cuanto al uso de diferentes metales divalentes (Me+2), se observó que la mayor velocidad inicial se obtiene a bajas concentraciones de Zn+2 libre. En relación a los parámetros cinéticos, la Vmax fue de 4789 U/mg y la kcat de 3,2 s-1, en tanto, la Km para PL fue de 490 μM, mientras que para ZnATP-2 fue de 20 μM. El pH óptimo de hPLK fue de 6,4 en las condiciones usadas. Respecto a la regulación de la actividad enzimática, se determinó que hPLK es inhibida por PL, ZnATP-2 y Zn+2 libre, mientras que las especies ATP-4 y HATP-3 no generan cambios en la actividad de la enzima. La inhibición por Zn+2 libre posee un IC50 de 37 μM, en tanto que la Kd para Zn+2, determinada por fluorescencia intrínseca, es de 266 nM. El Zn2+ libre presenta un patrón de inhibición complejo: cuando se varía el sustrato ZnATP-2 los datos se ajustan a un modelo de inhibición denominado sistema C1 de tipo mixto lineal, mientras que cuando se varía el sustrato PL, los datos se ajustan a dos modelos, debido a que se observa un perfil de inhibición dual dependiendo de la concentración de Zn+2 libre. El primer modelo, que explica el comportamiento inhibitorio hasta una concentración de Zn+2 libre de 50 μM, es lo que se denomina sistema C5 de inhibición de tipo mixto hiperbólico, en tanto que el segundo modelo, que explica el comportamiento inhibitorio desde 50 μM a concentraciones mayores, corresponde a un modelo de inhibición incompetitiva modificado, en el cual se incluye la unión de un Zn+2 adicional a la enzima libre