Participación de kisspeptina en la función ovárica y sus cambios durante la activación del sistema nervioso simpático inducida por el estrés por frío en la rata

Kisspeptina es un péptido de 145 aa. el cual juega un rol clave en la secreción de GnRH, participando en conjunto con las catecolaminas en la regulación de la ovulación a nivel hipotalámico. La mayoría de las neuronas kisspeptinérgicas en el núcleo paraventricular del hipotálamo coexpresan mRNA para tirosina hidroxilasa (TH), lo que sugiere una estrecha relación catecolaminérgica-kisspeptinérgica. El hecho que kisspeptina se exprese en el bulbo raquídeo y en las astas dorsales de la medula espinal, sugiere la existencia de un mecanismo de comunicación hacia y desde los órganos periféricos en el cual participe la kisspeptina. A nivel periférico, se ha descrito que kisspeptina y su receptor es sintetizado en células del ovario (siendo las células de la teca una de las que la expresa) y que aumenta su expresión antes de la ovulación, sin establecer aún la función de kisspeptina intraovárica. Estos antecedentes, siguieren que podría existir un control kisspeptinérgico neuronal que llega al ovario a través del sistema simpático (kisspeptina extraovárica) y por otra parte la kisspeptina intraovárica podría estar bajo control simpático, la cual podría ser importante en la regulación de la función ovárica. Con estos antecedentes, se postuló la hipótesis que: “Kisspeptina se expresa en el eje ganglio celíaco-ovario y es activado por el sistema simpático. En el ovario kisspeptina activa la esteroidogénesis y regula la función ovárica tanto en la pubertad como durante la etapa adulta”. Para responder esta hipótesis: se caracterizó la expresión de kisspeptina y su receptor en ganglio celíaco y ovario. Se estudiaron los cambios durante el desarrollo puberal, sobre la apertura vaginal, la ciclicidad estral y la secreción hormonal. Se determinaron los efectos de la estimulación adrenérgica sobre la expresión de kisspeptina en el ovario in vitro y por el estrés por frío crónico de 4 y 8 semanas de duración in vivo. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que: 1.- Kisspeptina se sintetiza en ganglio celíaco y en el ovario, el cual fue determinado por PCR en tiempo real y EIA. Además, se colocaliza con neuronas TH positivas como muestran las inmunohistofluorescencia. Más importante aún es que kisspeptina aumenta en el eje ganglio celiaco-ovario al inicio de la pubertad, participando en la regulación del desarrollo folicular y la ciclicidad estral en ratas adultas. Esto fue confirmado al bloquear la acción de kisspeptina (antagonista p234), en el cual se retrasó la apertura vaginal, sugiriendo que kisspeptina podría jugar un rol protector de la ovulación. 2.- Kisspeptina se expresa tanto en células de la granulosa y de la teca en ovarios de rata. La inmunodetección mostró reactividad positiva desde folículos primarios hasta preovulatorios. 3.- Kisspeptina es regulado por el sistema simpático ya que la activación in vitro de receptores β-adrenérgica aumenta la expresión de la kisspeptina ovárica. Es así como una sobre activación del sistema simpático (eje hipotálamo-ganglio-ovario) mediante un estrés agudo (64 horas a 4°C) o crónico (3 hrs/día a 4°C durante 5 días a la semana por 4 and 8 semanas) altera el sistema kisspeptinérgico periférico (eje GC-O). 4.- Con respecto a la función ovárica, la administración in-vivo de kisspeptina (bomba miniosmótica Alzet) mostró que posee un efecto esteroidogénico, aumentando la concentración plasmática de testosterona y progesterona. Además, favorece la mantención de los cuerpos lúteos, posiblemente inhibiendo la luteólisis. Esto determinado al administrar directamente en el ovario kisspeptina a través de un minibomba osmótica. Por otro lado el bloqueo de la acción de kisspeptina por el antagonista p234 no mostró efectos significativos en la función reproductiva. En conclusión, los resultados presentados en esta tesis han mostrado que kisspeptina es sintetizada en ganglio celíaco (kisspeptina extraovárica), siendo parte de una vía neuronal (eje H-GC-O) que podría contribuir en la regulación de la función ovárica. Por otra parte, la kisspeptina intraovárica presente en todos los folículos en desarrollo estaría participando en el proceso ovulatorio. Los resultados siguieren que participa en el proceso de ovulación, teniendo una función esteroidogénica y protectora de este proceso.
 Kisspeptin, is a peptide of 145 aa that has been described as key components in the GnRH secretion playing a complementary role with catecholamines. Studies have shown that most of the kisspeptin neurons in the paraventricular nucleus coexpress the mRNA for tyrosine hydroxylase (TH), suggesting a close kisspeptin-catecholamine relationship. Moreover, kisspeptin is present in other regions in the central nervous system, as the medulla oblongata and the dorsal horn in the bone marrow, suggesting that kisspeptin could be involved in both afferent and efferent pathway. At peripheral level, it has been described that kisspeptin and its receptor GPR54 is expressed in the ovary (especially at the theca cells of the ovarian follicle), and its expression increase before the ovulation without known function in the ovulatory process. Available data suggest that it could exist a neuronal kisspeptinergic network that arrive to the ovary through the sympathetic nervous system (extraovarian kisspeptin) and on the other hand, an intraovarian kisspeptin system without known if they could be controlled by the sympathetic nervous system, and if this control could be important for the ovarian function. Thus, we postulated that: “Kisspeptin is expressed in the celiac ganglion-ovary axis and it is activated by the sympathetic system. In the ovary, kisspeptin activate the steroidogenesis and regulates the ovary function, both during the pubertal and the adult age”. To answer this hypothesis the kisspeptin and GPR54 expression was characterized in the celiac ganglion and the ovary. The changes through the pubertal development, vaginal opening and hormonal secretion, were studied, and the adrenergic stimulation effects over the kisspeptin expression in the ovary in-vitro and the 4 and 8 week of chronic cold stress in-vivo was determined. The results presented in this thesis were the following: 1.- RT-PCR and EIA determinations showed that kisspeptin is synthetized in the celiac ganglion and the ovary. Furthermore, dual labeled immunofluorescence showed that kisspeptin is probably co-expressed within TH neurons. More important the kisspeptin along the celiac ganglion-ovary axis, increased with the puberty start, and thus, it could participate in the regulation of the follicular development and estrous ciclycity in adults rats. This suggestion was confirmed by blocking the in vivo kisspeptin action with the kisspeptin antagonist, p234, resulting in a delay in the vaginal opening, suggesting that kisspeptin could play a protector role in the ovulation process. 2.- Kisspeptin is expressed in both granulosa and theca cells. The immunodetection shows that kisspeptin is present through primary to preovulatory follicles. 3.- Kisspeptin is regulated by the sympathetic system because the in-vitro incubation of the ovaries with isoproterenol, a β-adrenergic agonist, increased the kisspeptin expression and the presence of the B-blocker propranolol eliminated the action of isoproterenol. Therefore, if this neuronal pathway is activated in the presence of a sympathetic stressor like acute (64 hour at 4°C) or chronic stress (3 hrs/day at 4°C during 5 days a week for 4 and 8 weeks) alter the peripheral kisspeptinergic system. 4.- Respect to ovarian function, in-vivo model (Alzet miniosmotic pumps to deliver Kisspeptin), show the capacity of kisspeptin to stimulate the steroidogenesis, increasing the testosterone and progesterone plasma concentration. The increased levels of plasma progesterone could favor the corpus luteum maintenance, possibly due to the decrease in the luteolysis process. Moreover, the kisspeptin antagonist administration (p234) don´t show significant effects in the reproductive function. In conclusion, in this thesis, the results have shown the existence of an extraovarian (neuronal) pathway (H-GC-O axis) that could contribute to the ovarian function regulation, and a intraovarian kisspeptin system (present in all follicles in development), that could participates in the ovulatory process, stimulating the steroidogenesis and hence regulating the ovulation.