Rol del tráfico endocítico en la señalización apoptótica del receptor de neurotrofinas p75 en un modelo de neuronas del sistema nervioso periférico

Las neurotrofinas son factores tróficos solubles secretados tanto por las neuronas como por los tejidos que son inervados por ellas para el correcto establecimiento del SN. Estos factores ejercen sus funciones uniéndose a dos clases de receptores transmembrana: los receptores de alta afinidad tirosina quinasa Trks (A, B y C), los cuales poseen actividad autocatalítica en su dominio citoplasmático y unen de manera diferencial las neurotrofinas dependiendo de su afinidad; y el receptor p75, el cual se une a todas las neurotrofinas con similar afinidad, pero depende la asociación de proteínas adaptadoras que se unen a su dominio citoplasmático para poder llevar a cabo su señalización. Durante el desarrollo del sistema nervioso simpático, p75 tiene un rol dual: promueve sobrevida junto a TrkA en respuesta a NGF, pero además induce apoptosis tras unir BDNF. En este periodo los factores positivos como NGF, son secretados en cantidades limitantes, por lo tanto existe una competencia por la obtención de los factores que aseguren la sobrevida y el crecimiento axonal. Aquellas neuronas que no logran obtener el suficiente NGF y así activar a TrkA, mueren tras unir BDNF; proceso mediado por p75. Por lo tanto, el balance de ambas señales regula el número de neuronas simpáticas y la correcta inervación del tejido y la apropiada conectividad del sistema. Las neuronas al ser células polarizadas, durante el desarrollo una vez que alcanzan el blanco a inervar, tienen el desafío de poder comunicar desde los axones distales señales progresivas o positivas, o señales regresivas o negativas hacia el cuerpo celular, y viceversa, con el fin de asegurar su mantención y la conectividad del SN . Existen diversas evidencias que sugieren que el complejo NGF/TrkA una vez internalizado utiliza un endosoma de señalización retrógrado por el axón para señalizar sobrevida y crecimiento, e influenciar eventos tanto en el cuerpo celular como en las dendritas. Sin embargo, se desconoce si el complejo p75/BDNF y su señalización apoptótica utiliza una estrategia similar. La señalización apoptótica a través de p75 tiene como requisito la activación de la quinasa de estrés, JNK, y el procesamiento proteolítico del receptor. En respuesta a ligandos pro-apoptóticos, JNK aumenta la proteólisis del receptor al aumentar la expresión de ADAM17, enzima a cargo del primer corte proteolítico y liberar el fragmento extracelular de p75. Consecutivamente se realiza un segundo corte que libera el fragmento intracelular o ICD-p75 Este fragmento facilita la ubiquitinación de la proteína de unión al ADN, NRIF, por la ubiquitinligasa TRAF6, lo que resulta en la translocación nuclear de NRIF. Además, esto conduce a una segunda ola de activación de JNK. Todo esto es necesario para una señalización apoptótica a largo plazo de p75. Un aspecto clave en la regulación de la señalización neurotrófica es el tráfico intracelular de sus receptores. Y para esto son las proteínas Rabs GTPasas los reguladores maestros del tráfico e identidad de membrana. Recientemente, hemos mostrado en neuronas simpáticas y células PC12, que p75 tras su internalización evade la ruta endo-lisosomal, acumulándose en dos poblaciones endosomales diferentes: endosomas Rab11+ y MVBs CD63+. Estos MVBs CD63 y p75 positivos constituyen una población de MVBs que son liberados como exosomas. En su tránsito hacia ambas rutas, p75 trafica por endosomas tempranos Rab5+ desde los cuales es destinado rápidamente a una de estas rutas endosomales. Sin embargo, esta interacción pareciera depender de la actividad de Rab5, ya que la expresión de una versión constitutivamente activa de Rab5 atrapa a p75 en endosomas tempranos, lo que aumenta la translocación nuclear de NRIF en respuesta a BDNF. Tenemos datos preliminares que indican que p75 requiere internalización para la señalización, sugiriendo la importancia de tu tráfico y su paso por éstos endosomas. Además, hay evidencias en la literatura que muestran que p75 interactúa en endosomas con adaptadores intracelulares que regulan su señalización. Estos datos sugieren un rol clave de la internalización, tráfico post-endocítico y la participación de Rab5 en la señalización mediada por este receptor. Sin embargo hasta la fecha no hay estudios que muestren la relevancia del tráfico endócito en la señalización apoptótica mediada por p75 tanto en el cuerpo celular como desde el terminal axonal. Por esto, mi tesis tuvo como objetivo evaluar el rol del tráfico endocítico en la respuesta apoptótica de p75 en un modelo de neuronas simpáticas, específicamente la participación de la GTPasa Rab5. Proponiendo como hipótesis que existe una regulación funcional entre p75 y Rab5. Evaluamos el impacto de la disrupción del tráfico de p75 en su señalización apoptótica tras unir BDNF en SCGs, utilizando un mutante dominante negativo de Rab5. Nuestros resultados demostraron que p75 mantiene una interacción con Rab5 la cuál es dependiente de la activación del receptor por BDNF, pero que además el receptor modula la actividad de Rab5 en repuesta a BDNF, aumentando la presencia de Rab5 activa. Adicionalmente evaluamos que p75 se une de manera preferencial a la forma activa de Rab5. En esta dirección, la modulación de la actividad de Rab5 sería de vital importancia, ya que la actividad de Rab5 es requerida para desencadenar los eventos río debajo de la señalización apoptótica del receptor, tras unir BDNF, ya que en presencia de un mutante dominante negativo de Rab5, se inhiben tanto las translocación nuclear de NRIF, así como el clivaje de la caspasa- 3. Ambos requisitos para desencadenar apoptosis por p75. Sin embargo, la actividad de Rab5 no sería un requerimiento para la internalización del receptor. Adicionalmente nuestros resultados también muestran que existe una participación relevante de JNK en el tráfico post-endocítico del receptor mostrando por primera vez datos que sugieren que la activación de JNK en SCGs es mayoritariamente axonal. De esa manera JNK tendría un rol dual en la señalización del p75, permitiendo la internalización y posterior transporte de p75 y luego participar en el reclutamiento de distintos adaptadores como TRAF6 o la activación de caspasas para llevar a cabo la respuesta apoptótica en respuesta a BDNF. Por lo tanto, los datos de esta tesis contribuyeron a dilucidar el rol de la GTPasa monomérica Rab5 en la señalización apoptótica del receptor p75, indicando que ambas proteínas tienen una relación funcional, y que p75 interactúa con Rab5 regulando su actividad de una manera dependiente de ligando lo cual es necesario para la señalización apoptótica en SCGs.