Transcitosis apical-basolateral inducible del receptor de opioides tipo delta en células MDCK

Las células epiteliales cumplen funciones vectoriales de absorción y secreción en base a su fenotipo con polaridad apical-basolateral. Este fenotipo se caracteriza por una membrana plasmática dividida por las uniones estrechas en dos dominios con estructura, composición y funciones distintas: el dominio apical se orienta hacia el lumen de una cavidad mientras que el dominio basolateral está en contacto con las células vecinas y con la membrana basal. La composición proteíca de cada dominio se mantiene por el tráfico vesicular en la ruta exocítica y endocítica que destina proteínas cargo al dominio correspondiente según las señales apicales o basolaterales codificadas en su estructura. Las proteínas de transmembrana basolateral alojan señales específicas en su región citosólica, en su mayoría basadas en residuos de tirosina en el contexto NPxxY, YxxΦ y dileucinas en los contextos DxxLL o [D/E]xxxL[L/I]. Las señales apicales son más diversas y pueden estar en la secuencia de la proteína o bien ser modificaciones post-traduccionales como glicosilaciones. Estas señales son decodificadas por la célula a través de una maquinaria de adaptadores citosólicos. El adaptador AP1B que se localiza principalmente en el endosoma de reciclaje común (CRE) se ha involucrado en la destinación basolateral, mientras que la maquinaria de destinación apical es menos conocida. Una vez insertas en la membrana plasmática ciertas proteínas se endocitan y pueden ser destinadas a degradación en lisosomas o recicladas a su polo de origen o al polo opuesto por transcitosis.Gran parte del conocimiento sobre la transcitosis proviene de estudios sobre la ruta de transcitosis apical-basolateral del receptor de poliinmunoglobulinas (pIgR), caracterizándose sus señales de destinación, los compartimentos endocíticos involucrados y el requerimiento del citoesqueleto. La ruta inversa desde el polo apical al basolateral se ha estudiado principalmente para proteínas solubles (albúmina e inmunoglobulinas) y sólo para una proteína de transmembrana, el receptor neonatal Fc (FcRn). FcRn transita de manera constitutiva desde el polo apical al basolateral y vice-versa, incluyendo un paso por el CRE y su dependencia del citoesqueleto es distinta según el sentido del tráfico. Datos de nuestro laboratorio indican que los receptores de opioides al ser expresados en células epiteliales (MDCK) se destinan inicialmente a la superficie apical, pero al ser activados por agonista se redistribuyen a la región basolateral. Sin embargo, está pendiente definir si esto correspondería realmente a transcitosis apical-basolateral porque no se ha logrado detectar si los receptores opioides se insertan realmente en la membrana plasmática basolateral. En esta tesis nos concentramos en estudiar el tráfico del receptor opioide δ (DOR) planteándonos la siguiente hipótesis: “El tráfico del DOR en células MDCK involucra señales apicales y basolaterales y una ruta de transcitosis apical-basolateral regulada que incluye al CRE y a la función del citoesqueleto”. Y los objetivos específicos: 1) Definir si el DOR estimulado por agonista desde el polo apical se transporta vía vesículas y se inserta en la membrana plasmática basolateral; 2) Definir las señales apicales y basolaterales que determinan la ruta de transcitosis apical-basolateral del DOR; 3) Evaluar si la ruta apical-basolateral del DOR incluye el tránsito por el CRE y si depende del complejo adaptador AP1B;4) Evaluar la contribución del citoesqueleto de microtúbulos y actina en esta ruta. Primero implementamos nuevas estrategias para la detección y cuantificación de la aparición del DOR en la superficie basolateral, ya que las técnicas de biotinilación dominio-selectiva fueron infructuosas. Nuestros resultados mostraron que el DOR activado se endocita desde la superficie apical y luego de su transporte en vesículas se inserta en la membrana del polo basolateral. Demostramos así que entra en una ruta de transcitosis apical-basolateral regulada por estímulo externo. Análisis por inmunofluorescencia utilizando marcadores endosomales mostró que el DOR endocitado desde el polo apical pasa por el CRE. Sin embargo, en células MDCK silenciadas para el complejo AP1B, que reside en este compartimento, mostramos que el transporte del DOR al polo basolateral no se altera, indicando que es independiente de este adaptador.Abordamos la búsqueda de posibles señales de destinación apical y basolateral mediante mutaciones sitio dirigida de residuos dentro las secuencias análogas a las descritas. Mutando los motivos de N-glicosilación demostramos que la distribución apical del DOR es independiente de N-glicosilación. Mutaciones en dos supuestos motivos basolaterales basados en tirosinas interrumpieron la salida del DOR desde el retículo endoplásmico, impidiéndonos evaluar la contribución de estos motivos en la destinación basolateral post-transcitosis. Mutaciones que reemplazaron dos leucinas presentes en la tercera asa intracelular de DOR no afectaron su transcitosis hacia el polo basolateral. También demostramos que la endocitosis del DOR es independiente de actina, mientras que su transcitosis al basolateral se inhibió con latrunculin A, un inhibidor de la polimerización de los monómeros de actina, acumulándose vesículas en la región subapical. Como no se ha descrito una función para la actina en la transcitosis apical-basolateral, esto sugiere la existencia de una nueva ruta de transcitosis, que no sólo sería inducible sino también dependiente de microfilamentos de actina.