Mechanisms involved in the loss of brown adipose tissue in the AGPAT2 deficient mouse.

1-acilglicerol-3-fosfato O-aciltransferasa-2 (AGPAT2) es una enzima que participa en la síntesis de triacilgliceroles y glicerofosfolípidos. En la diferenciación de adipocitos (adipogénesis) el almacenamiento de lípidos en gotas lipídicas de los adipocitos tiene un rol fundamental. Mutaciones en el gen codificante para esta enzima generan lipodistrofia congénita generalizada, enfermedad caracterizada por la reducción severa de tejido adiposo blanco y pardo, así como también severas complicaciones metabólicas. Los ratones deficientes para AGPAT2 (Agpat2-/-) nacen con tejido adiposo pardo de morfología y abundancia similar al de ratones normales, sin embargo, este tejido degenera completamente durante los primeros 6 días después de nacer. Las causas de este fenómeno son actualmente desconocidas. La hipótesis de esta tesis es que adipocitos pardos de ratones Agpat2-/- tienen anormalidades transcripcionales que determinan adipogénesis defectuosa y mayor susceptibilidad a muerte celular lipotóxica. Para evaluar esta hipótesis, preadipocitos pardos del tejido adiposo interescapular de ratones Agpat2-/- y tipo silvestre fueron diferenciados adipogénicamente en cultivo celular y comparados en diversos parámetros morfológicos y moleculares. Los cultivos de preadipocitos diferenciados Agpat2-/- presentaron una menor proporción de células cargadas con gotas lipídicas a lo largo de la diferenciación y una expresión disminuida de los reguladores transcripcionales pro-adipogénicos PPARy, PPARα, C/EBPα y PGC1α. Importantemente, los factores de transcripción PRDM16 y C/EBPβ, previamente identificados como mediadores de la diferenciación adipogénica parda, tuvieron niveles normales en los adipocitos pardos Agpat2- /- diferenciados in vitro. Concordantemente, la proteína UCP1, un marcador específico de adipocito pardo maduro, permaneció indetectable en los adipocitos Agpat2-/- diferenciados. Por el contrario, sus niveles fueron fuertemente inducidos en los adipocitos pardos tipo silvestre diferenciados in vitro. El análisis ultraestructural de los adipocitos diferenciados mostró que las mitocondrias de los adipocitos Agpat2-/- diferenciados pardos tienen morfología notoriamente alterada, con crestas de geometría irregular, y una menor asociación física con gotas lipídicas, a diferencia de lo que ocurre en los adipocitos pardos normales diferenciados, que tienen mitocondrias con crestas plegadas en disposición paralela y que están íntimamente asociadas a gotas lipídicas con alta frecuencia. El análisis global del transcriptoma de los adipocitos diferenciados in vitro mostró divergencia significativa en la abundancia del mRNA codificado por varios grupos de genes. Entre estas destacaron, menor expresión de genes relacionados a la acumulación de lípidos y estructura y función mitocondrial, y mayor expresión de genes estimulados por interferón. Estos resultados fueron verificados independientemente por análisis de qRT-PCR. Adicionalmente, los cultivos de adipocitos Agpat2-/- diferenciados presentan menores niveles de Elovl3 y mitoNEET, ambos previamente identificados como reguladores de la diferenciación y función adiposa. Importantemente, la sobreexpresión de estas proteínas por medio de vectores adenovirales, no normalizó la acumulación de gotas lipídicas en adipocitos Agpat2-/- diferenciados, indicando que la diferenciación adipogénica defectuosa dependiente de la carencia de AGPAT2 no es revertida por estos productos génicos. Finalmente, para evaluar la mayor susceptibilidad a muerte celular por lipotoxicidad en adipocitos pardos Agpat2-/-, primero se cuantificó la concentración y composición de ácidos grasos en el plasma de ratones Agpat2-/- recién nacidos en comparación con ratones tipo silvestre de la misma edad, mostrando una elevación marcada de todas las clases de ácidos grasos, en particular saturados y monoinsaturados, a partir del segundo día postnatal. Entre los primeros destacó el ácido palmítico, cuya concentración fue ~5 veces mayor en los ratones Agpat2-/- recién nacidos en comparación con el tipo silvestre. La incubación de preadipocitos no diferenciados Agpat2-/- y tipo silvestre con ácido palmítico, mostró similares niveles de muerte celular causada por lipotoxicidad. Sin embargo, cuando adipocitos pardos diferenciados in vitro fueron expuestos a ácido palmítico, los cultivos Agpat2-/- presentaron niveles de muerte celular significativamente mayores, cuantificada por cuatro técnicas distintas y complementarias, en comparación con el tipo silvestre, indicado que la carencia de AGPAT2 determina mayor susceptibilidad de los adipocitos a muerte por lipotoxicidad. Tomados en su conjunto, los resultados de esta tesis indican que AGPAT2 es esencial para la diferenciación adiposa parda, determinando perfiles transcripcionales anormales y que los adipocitos diferenciados carentes de esta enzima son más sensibles a altos niveles de ácidos grasos saturados presentes en los ratones Agpat2-/- después de nacer.