Quasispecies diversity and its role in the virulence of the human influenza A virus.

El virus de influenza estacional infectan entre el 5 y el 15% de la población humana cada año, lo que resulta en ∼500,000 muertes en todo el mundo. El virus de influenza estacional está asociada con dos tipos de virus de influenza: A (IAV) y B (IBV). Los virus de influenza pertenecen a la familia de virus Orthomyxoviridae que tienen genomas de ARN de sentido negativo, monocatenarios y segmentados. La segmentación del genoma, permite que el virus intercambie segmentos enteros con otras cepas, lo que facilita los saltos zoonóticos y aumenta la evolución y diversidad viral. Además, debido su polimerasa es propensa a errores debido a su falta de capacidad de corrección, se puede generar una diversidad considerable durante la replicación viral, que genera cambios graduales de nucleótidos que pueden acumularse con el tiempo. Estas fuentes de diversidad son fundamentales para la evolución del virus de la influenza y se han relacionado con marcadores que aumentan la patogénesis. La aparición de cepas pandémicas, las epidemias anuales y las variantes resisitentes a antivirales son ejemplos de cómo la diversidad genética impacta en la virulencia del patógeno. La diversidad de IAV, su arquitectura segmentada, el tamaño de la población y las coinfecciones generan las condiciones para que puedan ocurrir interacciones entre variantes genéticas. En este contexto, la teoría de las cuasiespecies puede contribuir a nuestra comprensión de la dinámica que puede surgir durante las infecciones por IAV. Las cuasiespecies virales se definen como la colección de genomas virales relacionados, sujetos a procesos continuos de variación genética, competencia y selección de la distribución con mayor “fitness”. En el modelo propuesto, tales interacciones entre los miembros de una cuasiespecie alcanzan un estado donde coexisten en un cuasi equilibrio que, en general, beneficia a toda la población. El desarrollo y las mejoras de las tecnologías de secuenciación, generando lecturas más largas y mayor profundidad, brindan nuevas oportunidades para estudiar las cuasiespecies virales. La mayor parte de la investigación se ha centrado en la validación experimental de conceptos introducidos por la teoría de la quasiespecie (es decir, umbral de error, robustez mutacional); para el IAV no existe una descripción clara ni una definición pragmática de las cuasiespecies en el contexto de una infección natural y su posible papel en la patogénesis. En esta tesis, investigamos si la diversidad de cuasiespecies virales modulan la virulencia de IAV. En primer lugar, para comprender mejor la diferencia entre las variantes de virus desde un enfoque funcional, desarrollamos un pipeline bioinformático. El IAV es un patógeno que ha captado la atención de los investigadores durante décadas, y como resultado de eso, hay una cantidad importante y una gran variedad de información. Para la mayoría de sus proteínas se cuenta con una o más estructuras de cristalografía y hay descripciones precisas con evidencia experimental que asocian funciones a diferentes regiones de cada proteína. Nuestro pipeline utiliza esta información resaltando las diferencias de nucleótidos en comparación con una secuencia de consenso, lo que proporciona una mejor comprensión de las funciones de la proteína que podrían verse afectadas en comparación con la secuencia de consenso. En segundo lugar, utilizamos este pipeline para analizar las variantes virales observadas en las secuencias de IAV obtenidas de individuos graves. Esto nos permitió identificar un nuevo aminoácido en la NA que confiere resistencia al antiviral oseltamivir. También identificamos cambios en la HA que probablemente ayuden a evadir la inmunidad preexistente (respuestas de anticuerpos) en un sujeto en particular, lo que sugiere que se trata de una deriva antigénica intra-huésped. Además, estos cambios se detectaron como poblaciones mixtas en muestras secuenciales, lo que indica un cambio dinámico en el tiempo del genoma de IAV. Finalmente, describimos la diversidad de las cuasiespecies experimentalmente in vitro e in vivo en humanos. Usando una combinación de los métodos de secuenciación Illumina y PacBio, medimos las poblaciones virales durante el curso de la infección cuando el IAV se pasó en diferentes sustratos celulares hasta 10 veces. Nuestros análisis revelaron la presencia de un número limitado de variantes IAV, que fluctuaron a lo largo de los pasajes y las réplicas biológicas. La mayoría de las variaciones de un solo nucleótido (SNV) se encontraron a baja frecuencia y rara vez se compartieron entre las réplicas. Sin embargo, encontramos SNV que se fijaron en los ultimos pasajes y, casi siempre, conllevaron un cambio de aminoácidos. Los datos sugieren que, típicamente, había un único genotipo dominante. La diversidad genética se evaluó en individuos infectados con IAV pertenecientes a un grupo severo o a uno no severo. Nuestros análisis genómicos indican una tendencia a tener más SNV en el grupo severo que en el no severo. En el grupo severo, solo el 25% de los SNV fueron de ocurrencia única en un segmento, mientras que el 45% en los no severos, lo que sugiere una dinámica genética diferente entre los dos grupos. Al igual que lo sucedido in vitro, generalmente un genotipo es el dominante en cada paciente. Nuestros resultados indican que las diversidad en las cuasiespecies alcanzarón altos niveles en casos particulares, pero a modo general para cada segemento, no hubo diferencias en diversidad entre el grupo grave y el no grave. Adicionalmente, se encontraron haplotipos alternativos con alta frecuencia en experimentos in vitro e in vivo, pero según los datos obtenidos de los pasajes celulares, es muy probable que sea un estado transitorio. Por lo tanto, esta investigación contribuye a la comprensión de cómo se generan las cuasiespecies y sugiere que los factores del sustrato y / o huésped, probablemente contribuyan a la diversidad viral intrínseca y a la capacidad de replicación.