Expresión y función de EPAC-1 en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos

Las enfermedades cardiovasculares son, hoy en día, una de las principales causas de muerte. Estas enfermedades generan comúnmente cambios en la estructura del corazón que conlleva a un remodelamiento del tejido generando hipertrofia y fibrosis, lo cual altera la función cardiaca normal y que finalmente se traduce en una insuficiencia cardiaca. La fibrosis cardiaca se genera por un depósito excesivo de proteínas de la matriz extracelular (MEC) producto de la activación de fibroblastos. Estas células, que representan alrededor del 70% del total de las células del corazón humano, frente a una injuria cardiaca, responden a una variedad de citoquinas y factores de crecimiento que promueven su diferenciación a miofibroblastos. Estos a su vez, expresan la proteína α-actina del músculo liso (α-SMA) la que le confiere propiedades contráctiles y durante el proceso de reparación del tejido cardiaco, son los principales responsables de la síntesis de numerosas proteínas de la MEC, las que incluyen colágeno, fibronectina y laminina lo que finalmente se traduce en el cierre de la herida. Asimismo, los miofibroblastos están encargados de liberar citoquinas, factores de crecimiento, como angiotensina II, y en forma adicional, incrementan el número de receptores para estos mismos mediadores. Por otro lado, existen numerosos antecedentes que demuestran que la activación de la vía de transducción del 3’,5’-adenosina monofosfato cíclico (AMPc) podría estar contribuyendo a la reducción de la fibrosis cardiaca, ya que se ha visto que un incremento en los niveles de AMPc en el fibroblasto cardiaco, puede disminuir su función celular así como también inhibir la diferenciación de fibroblasto a miofibroblasto. En este sentido, durante mucho tiempo se ha establecido como regla general que los efectos mediados por el AMPc en las células eucariontes ocurría exclusivamente a través de la activación de la proteína quinasa A (PKA) y que a su vez la PKA mediaba los cambios en la expresión y función de las proteínas. Sin embargo, el descubrimiento de otra proteína llamada EPAC (del acrónimo exchange protein activated directly by cAMP), que regula la actividad de las proteínas G pequeñas Rap 1 y Rap 2, y que también es activada por el AMPc, comenzó a cambiar el campo de investigación relacionado con el estudio de la vía de transducción de este segundo mensajero. A pesar de que los fibroblastos cardiacos expresan EPAC-1, poco se conoce acerca de los mecanismos que regulan la expresión de las isoformas de EPAC en los fibroblastos y miofibroblastos, y de que factores (péptidos, citoquinas, hormonas, entre otros) son los que están involucrados en la regulación de la misma. Estudios han demostrado que los niveles de expresión de EPAC-1 se encuentran aumentados en ratones con hipertrofia cardiaca y que la vía AMPc-EPAC1-Rap1 se encuentra activa bajo estas circunstancias. Estos antecedentes estarían dando cuenta de que EPAC-1 podría estar participando de forma activa en procesos asociados al remodelamiento cardiaco. Paralelamente, se ha observado que el factor de crecimiento transformante β1 (TGF-β1), citoquina estrechamente relacionada con el proceso de fibrosis cardiaca, promueve la disminución de la expresión de EPAC-1 en el fibroblasto cardiaco de rata adulta. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual TGF-β1 regula la expresión de EPAC-1 tanto en el fibroblasto como en los miofibroblastos cardiacos. Desde el punto de vista de la funcionalidad de EPAC-1, existen algunos estudios que demuestran la participación de esta proteína en algunos procesos celulares asociados al remodelamiento cardiaco, tales como la migración de fibroblastos y secreción de colágeno, pero se desconoce totalmente su participación en los mecanismos asociados a adhesión y contracción de geles de colágeno, procesos celulares importantes en el remodelamiento del miocardio, en donde participan activamente tanto fibroblastos como miofibroblastos. Bajo este contexto, en la presente tesis, se estudió en una primera instancia cómo el TGF-β1 era capaz de regular los niveles de EPAC-1 tanto en fibroblastos como en miofibroblastos de rata neonata. Para ello se realizaron estudios mediante westernblot con el fin de determinar los niveles basales de EPAC-1 en nuestro modelo de estudio, para luego estudiar la influencia del TGF- β1 sobre estos niveles a través de la intervención de sus vías de señalización canónica (Smad2/3) y no canónica (MAPK y Akt). Los resultados obtenidos dieron cuenta de que los miofibroblastos poseían mayores niveles de EPAC-1 comparado a los fibroblastos y que en la regulación de EPAC- 1 en fibroblastos cardiacos participaron proteínas tales como Smad-2 y JNK, mientras que en el miofibroblasto ambas vías de señalización, canónica y no canónica, participaron de la regulación de los niveles de EPAC-1. Posteriormente y con el fin de dilucidar el rol que juega este factor intercambiador de nucleótidos de guanina sobre las funciones de fibroblastos y miofibroblastos, se evaluó la capacidad de EPAC-1 de fosforilar a su efector río abajo Rap-1, utilizando para ello un análogo del AMPc con capacidad de activar selectivamente a EPAC-1. Los resultados demostraron que en ambos fenotipos celulares EPAC-1 fue capaz de activar a su efector río abajo Rap-1, y más aún, que en los miofibroblastos está activación era mucho mayor en comparación a sus precursores los fibroblastos. Finalmente y con el objetivo de dilucidar la participación de EPAC-1 en procesos asociados al remodelamiento cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno; se llevaron a cabo una serie de experimentos destinados a evaluar los procesos antes mencionados en nuestro modelo de estudio. Para ello se utilizaron herramientas mediante las cuales fue posible dilucidar los efectos mediados principalmente por EPAC-1 y a la vez los efectos mediados por PKA, ya que al ser ambas proteínas efectoras del AMPc, era importante poder establecer la contribución real de cada una de ellas a los procesos antes señalados. Los resultados obtenidos sugieren que EPAC-1 participaría aumentando la adhesión de fibroblastos y miofibroblastos a fibronectina, promoviendo la migración de fibroblastos, aumentando la contracción de geles de colágeno tanto en fibroblastos como en miofibroblastos y disminuyendo los niveles de colágeno en ambos fenotipos celulares. Estos resultados se complementan con los obtenidos en relación a la PKA, en donde se logró dilucidar que esta proteína estaría participando en los procesos de contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno. PKA al parecer aumentaría la contracción de geles de colágeno en miofibroblastos y además, sería capaz de disminuir la expresión de colágeno tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. En resumen, los resultados de la presente tesis sugieren por un lado que, el TGF- β1 regularía diferencialmente los niveles de EPAC-1 en fibroblastos y miofibroblastos cardiacos y por otro lado, que EPAC-1 estaría regulando importantes funciones asociadas al remodelamiento cardiaco tales como adhesión, migración, contracción de geles de colágeno y expresión de colágeno en ambos fenotipos celulares.
 Throughout the last decades cardiovascular diseases has become one of the most important causes of death. These diseases commonly generate changes in the structure of the heart which leads to tissue remodeling and fibrosis, which alters the normal cardiac function and eventually resulting in cardiac failure. Cardiac fibrosis is generated by excessive deposition of extracellular matrix proteins (ECM) produced by the activation of fibroblasts. These cells represent about 70% of total human heart cells and following a cardiac injury, they respond to a wide range of cytokines and growth factors promoting their differentiation into myofibroblasts. These myofibroblasts express the protein α-smooth muscle actin (α-SMA) synonymous with increased contractile force. Enhanced contractility that attends this protein’s expression is believed to be important in allowing these cells to contract during the wound healing in the damaged heart. Myofibroblasts are the primary mediators responsible for synthesis of many ECM proteins, including collagen, fibronectin and laminin, among others. During transition of fibroblast into myofibroblasts they acquire the capability to be avid producers of cytokines and growth factors, and in addition, increase the receptor number for the same mediators. A growing body of literature over the last years has made evident that activation of the transduction pathway of 3', 5'-cyclic adenosine monophosphate (cAMP) may be contributing to the reduction of cardiac fibrosis. It has been demonstrated that an increase in cAMP levels in cardiac fibroblasts can reduce their cellular function as well as inhibit fibroblast differentiation into myofibroblasts. In this regard, it has become generally accepted, that the effects mediated by cAMP in eukaryotic cells occurred only by activation of protein kinase A (PKA) which once activated was able to mediate expression and protein function. However, the discovery of another protein, called EPAC (exchange protein activated directly by cAMP), which regulates the activity of small G proteins Rap 1 and 2, has begun to innovate the research field of the cAMP transduction pathway. It is known that cardiac fibroblast express EPAC-1, however little is known about the mechanism regulating the expression of this protein in fibroblast and myofibroblasts. In this regard, studies in this area have demonstrated that levels of EPAC-1 expression were increased in mice with cardiac hypertrophy and cAMP pathway EPAC1-Rap1 was very active. These results support the idea that EPAC-1 could be actively involved in processes associated with cardiac remodeling. In parallel, it has been observed that the transforming growth factor β1 (TGF-β1), cytokine closely related to the process of cardiac fibrosis, promotes the decrease of EPAC-1 expression in cardiac fibroblasts. However, the mechanism by which TGF-β1 regulates fibroblasts and myofibroblasts EPAC-1 expression still remains unclear. There are few studies demonstrating the involvement of EPAC-1 in cellular processes associated with cardiac remodeling. There are some investigations related to fibroblast migration and collagen secretion, nevertheless EPAC-1 participation in processes associated to cardiac remodeling such as cellular adhesion and those related to capability to contract collagen gels matrix are completely unknown. In this context, we studied EPAC-1 levels and the effect caused by TGF-β1 on EPAC-1 expression in both cardiac fibroblasts and myofibroblasts through the intervention of TGF-β1 canonical (Smad) and no canonical (MAPK and Akt) signaling pathways. The data obtained showed that cardiac myofibroblasts have greater amounts of EPAC-1 than cardiac fibroblasts. In the presence of chemical inhibitors the results showed that fibroblast EPAC-1 expression is regulated by JNK-MAPK and Smad2 protein, and the myofibroblast EPAC-1 expression is regulated by both signaling pathways (Smad, MAPKs and Akt). Subsequently, in order to determine the EPAC-1 capability to activate its downstream effector Rap1, we stimulated this protein using a cAMP analog able to specifically activate EPAC-1. The results showed that EPAC-1 was able to phosphorylate its downstream effector Rap-1 in both fibroblast and myofibroblasts, however myofibroblasts demonstrated to have higher levels of Rap1-GTP compared to cardiac fibroblasts. Finally and in order to elucidate the EPAC-1 involvement in cardiac remodeling, we performed a series of experiments designed to evaluate cellular adhesion, migration, collagen gel contraction and collagen expression. To evaluate these functions we used selective molecules ables to recognize specifically both EPAC-1 and PKA. The results suggest that EPA-1 increases fibroblast and myofibroblast fibronectin adhesion, promotes fibroblasts migration, enhances collagen gel contraction in both fibroblast and myofibroblast and decrease collagen levels measured by western blot. On the other hand, the results obtained using a PKA agonist suggest that this protein apparently increases myofibroblasts collagen gel contraction and reduces collagen expression measured by western blot in both fibroblast and myofibroblasts. In summary, the results obtained in this thesis suggest TGF-β1 participation in regulating differentially EPAC-1 levels in cardiac fibroblasts and myofibroblasts and EPAC-1 participation in cellular processes related to adhesion, migration, collagen gel contraction and collagen expression; all of them important cellular processes involved in cardiac remodeling in both fibroblast and myofibroblasts.