Estudio de la señalización de insulina en cardiomiocitos hipertróficos

La hipertrofia cardiaca es un proceso fisiopatológico que busca compensar un incremento en la carga de trabajo del corazón. Este proceso se caracteriza por un incremento en el tamaño de los cardiomiocitos, células encargadas de la contracción del corazón, llevando a un aumento en el tamaño de este órgano. En un principio la hipertrofia busca mejorar la función cardiaca, fenómeno conocido como hipertrofia adaptativa. Si esta condición se mantiene en el tiempo se produce hipertrofia patológica, que se caracteriza por ser irreversible y predisponer al desarrollo de arritmias, insuficiencia cardiaca y muerte súbita. Al mismo tiempo, el corazón hipertrófico presenta importantes cambios en su metabolismo energético, homeostasis del Ca2+ y un estado de resistencia a la insulina. La insulina es una hormona fundamental para la regulación del metabolismo energético del organismo y es clave en el control de los niveles plasmáticos de glucosa. En el corazón, su principal función es promover la entrada de glucosa al cardiomiocito y favorecer su uso como fuente energética, promoviendo la glicólisis y su posterior oxidación en la mitocondria. La resistencia a insulina en el corazón como la observada en hipertrofia, se asocia a una menor capacidad de trabajo y constituye un factor de riesgo para insuficiencia cardiaca y muerte post-isquemia, por lo que conocer con mayor profundidad sus características moleculares es de gran importancia. Recientemente se ha descrito que la salida de Ca2+ desde el retículo endoplasmático (principal reservorio intracelular de Ca2+) a través de los receptores/canales de inositol-1,4,5-trifosfato es un elemento clave para la acción metabólica de insulina, incluida la captación de glucosa. Por otro lado, se sabe que la mitocondria regula las señales mediadas por Ca2+, actuando como un amortiguador e incorporando Ca2+ luego de un incremento de sus niveles en el citoplasma. A su vez, este Ca2+ es un importante regulador del metabolismo mitocondrial. A pesar de su capacidad para generar una liberación de Ca2+ al citoplasma, se desconoce si insulina regula el metabolismo mitocondrial mediante un incremento en los niveles de Ca2+ en la mitocondria. Por otro lado, se desconoce si la resistencia a insulina generada por hipertrofia ocurre a consecuencia de una menor liberación de Ca2+ en respuesta a esta hormona. A fin de responder estas interrogantes, el principal objetivo de esta tesis consistió en evaluar si los cardiomiocitos hipertróficos presentan una menor señal de Ca2+ citoplasmático y/o mitocondrial en respuesta a insulina comparado con cardiomiocitos controles. Para evaluar esta posibilidad, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata se estimularon con noradrenalina, un estímulo clásico para generar hipertrofia patológica, por 24 h y luego se midió la señal de Ca2+ en respuesta a insulina. Para comprobar que estos cardiomiocitos presentaban una menor respuesta a insulina se evaluaron la fosforilación de Akt, un marcador de los efectos metabólicos de esta hormona, y el consumo de oxígeno, un marcador de la actividad metabólica mitocondrial. Se observó una reducción de ambos parámetros en cardiomiocitos hipertróficos en respuesta a insulina. La señal de Ca2+ en respuesta a insulina se midió mediante microscopía confocal y sondas fluorescentes sensibles al Ca2+ destinadas específicamente al citoplasma y la mitocondria. Los cardiomiocitos hipertróficos mostraron una marcada reducción en el incremento del Ca2+ mitocondrial en respuesta a insulina, mientras que el incremento en el Ca2+ citoplasmático no se modificó. Mediante un estudio de colocalización usando microscopia confocal y sondas fluorescentes organelo-especificas, se determinó que la menor entrada de Ca2+ a la mitocondria se podría deber a un alejamiento entre el retículo endoplasmático y la mitocondria. Luego, mediante el uso de rojo rutenio, un inhibidor de la entrada de Ca2+ a la mitocondria, se determinó que este evento es necesario para la fosforilación de Akt y para el incremento en el consumo de oxígeno en respuesta a insulina. De esta forma, el incremento en el Ca2+ mitocondrial surge como un importante intermediario en la respuesta a insulina que regula la respuesta metabólica inducida por esta hormona, mientras que el bloqueo en el traspaso de Ca2+ a la mitocondria podría ser un importante mecanismo patológico que reduce la respuesta a insulina
 Cardiac hypertrophy is a pathophysiological process that aims to compensate an increase in the working load of the heart. This process is characterized by an increase in cardiomyocyte size, the cells in charge of heart contraction, leading to an enlargement of this organ. In the beginning, hypertrophy aims to improve cardiac function, a process known as adaptative hypertrophy. If it is maintained in time it can turn into a pathological hypertrophy, which is irreversible and predisposes to arrhythmia, heart failure and sudden death. At the same time, the hypertrophic heart shows significant changes on energy metabolism, Ca2+ handling and an insulin resistant condition. Insulin is a key regulator of energy metabolism and plasma glucose levels. In the heart, its main function is to promote glucose entry to the cardiomyocytes and its use as an energy source through the activation of glycolysis and oxidation in the mitochondria. Insulin resistance observed in cardiac hypertrophy is associated with a reduced working capacity and is a risk factor for heart failure and post-ischemic cell death. That is the reason why a better understanding of its molecular characteristics is of great relevance. Recently, it has been described that Ca2+ exit from the endoplasmic reticulum (the main reserve of intracellular Ca2+) through inositol 1,4,5-triphosphate receptor/channel is a key element for insulin action, including glucose uptake. In addition, it is known that mitochondrion is very important in the regulation of Ca2+ signals, acting as a buffer and up taking Ca2+ after an increase in its cytoplasmic levels, especially following a release through this channel. At the same time, this Ca2+ is an important regulator of mitochondrial metabolism. In spite of its Ca2+-releasing capacity, it is not known if insulin regulates mitochondrial metabolism through an increase in mitochondrial Ca2+ levels. Additionally, it is also unknown if the insulin resistance generated by hypertrophy occurs in response to a reduced Ca2+ release in response to this hormone. In order to answer these queries, the main objective of this thesis consisted in evaluating if hypertrophic cardiomyocytes show a reduced mitochondrial and/or cytoplasmic Ca2+ signal after insulin stimulation compared to normal cardiomyocytes. To evaluate this possibility, neonatal rat cardiomyocytes where stimulated with norepinephrine, a classic stimulus to generate pathologic hypertrophy, for 24 h and then the Ca2+ signal in response to insulin was measured. In order to confirm the reduced insulin response of these cardiomyocytes, Akt phosphorilation, a marker of the metabolic action of insulin, and oxygen consumption, a measure of mitochondrial metabolic activity, were evaluated after insulin stimulation. Both parameters showed a reduction in hypertrophic cardiomyocytes in response to insulin. Insulin Ca2+-signal was measured by confocal microscopy and cytoplasm and mitochondrion-selective Ca2+- sensitive fluorescent probes. Hypertrophic cardiomyocytes showed a reduction in mitochondrial Ca2+ increase after insulin stimulation, whereas cytoplasmic Ca2+ increase was unaffected. By a colocalization analysis using confocal microscopy and organelle-specific fluorescent probes, it was determined that a reduction in contacts between both organelles could explain the reduction in Ca2+ transfer in hypertrophic cardiomyocytes. Finally, pharmacological blocking of Ca2+ entry to the mitochondria through the use of ruthenium red showed that this process was necessary to the increase of Akt phosphorilation and oxygen consumption after insulin stimulation. In this way, mitochondrial Ca2+ uptake comes as a novel and significant mediator in the regulation of insulin response, while the blockade of Ca2+ transfer to the mitochondria could by an important pathological mechanism that leads to insulin resistance