Identification and characterization of the biosynthesis, perception and signaling pathway of Brassinosteroids during the development of Vitis Vinifera L.

La vid (Vitis vinifera L.) es una de las especies de plantas más cultivadas en el mundo. Dentro de las prácticas agronómicas para su cultivo y mejoramiento se encuentran la poda y el uso de portainjertos y de reguladores del crecimiento. En los últimos años ha surgido el interés por el estudio de los brasinoesteroides (BRs) en esta especie. Estos son una familia de hormonas vegetales derivadas de esteroles que regulan procesos fisiológicos tales como respuestas a estrés biótico y abiótico, desarrollo de estomas, control de la senescencia, entre otros. El mayor efecto biológico es la promoción del crecimiento mediante división y expansión celular. En el caso de las vides, se ha analizado uno de los genes de biosíntesis denominado VvBR6OX1 mediante complementación funcional en plantas de tomate. Además, se ha reportado la acumulación de los BRs biológicamente activos castasterona y 6-deoxocastasterona en bayas de vid. Hasta el momento, genes asociados a la ruta de percepción o señalización de BRs no han sido caracterizados en vides. En análisis bioinformáticos del genoma de referencia de Vitis vinifera L. fueron encontrados modelos génicos con homología a genes descritos en Arabidopsis para las rutas de biosíntesis, percepción y señalización. Esto sugiere que estas serían vías al menos parcialmente conservadas entre estas dos especies. En esta tesis, se utilizaron distintos tejidos de plantas de vides para cuantificar los niveles endógenos de BRs. Se cuantificó diez distintos compuestos con un patrón de acumulación tejido específica. Además, se obtuvo el perfil de expresión de los genes de la ruta de biosíntesis de BRs. No existe una correlación directa entre la acumulación de transcritos y metabolitos, lo que podría dar cuenta de la complejidad de la ruta de biosíntesis y su regulación. Por otra parte, se realizaron tratamientos de bayas en el campo con 24-epibrasinólido y B2000 (análogo de BRs). Se determinó que ambos compuestos generan incremento en el tamaño de las bayas durante la etapa temprana (Fase I de crecimiento). Estos cambios implican incremento en el tamaño de las células como pudo observarse en los estudios histológicos. Considerando que para la regulación de diversos procesos fisiológicos se ha descrito interacción entre distintas hormonas vegetales, en este trabajo se cuantificaron citoquininas en las bayas tratadas en el campo con BRs. Se determinó que algunos de los tratamientos promueven el metabolismo de citoquininas, ya sea de compuestos bioactivos, intermediarios ribósidos o inactivos glucosilados, generando cambios en el contenido y composición de estos. Para entender de mejor forma los cambios generados por BRs en las bayas tratadas, se analizó la expresión de genes de las rutas de biosíntesis, percepción y señalización encontrando claros patrones de inducción general de la expresión en fases tempranas y de represión en fases tardías post-tratamiento. Además, BRs reprimieron la expresión de genes del ciclo celular codificantes para ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas, mientras que promovieron la expresión de un gen que codifica para expansinas. Estos resultados en conjunto muestran una compleja regulación del crecimiento en fases tempranas de crecimiento de bayas tratadas con brasinoesteroides los que alterarían el metabolismo hormonal y la acumulación de transcritos. Finalmente, para caracterizar las rutas de percepción y señalización se obtuvo el perfil de expresión de los genes encontrados en los análisis bioinformáticos. Con estos datos y considerando que la quinasa BIN2 es un regulador clave en señalización de BRs así como una conexión con distintas rutas como las de auxinas, ácido abscísico, desarrollo de raíces laterales y estomas, es que se decidió continuar la caracterización de este gen. Para ello VvBIN2.1 fue amplificado y clonado en un vector de clonación obteniéndose una secuencia consenso. Se realizó un análisis de dominios presentes en la proteína que sería generada, así como un estudio de filogenia, determinando que dos de los modelos génicos que codificarían para BIN2 de vides agrupan en el mismo clado que la proteína homóloga de Arabidopsis. Luego de esto, se realizó la construcción que permitió transformar plantas de Arabidopsis con VvBIN2.1 para realizar estudios funcionales. Los resultados obtenidos sugieren fuertemente un rol en el crecimiento para este gen de vides. El desarrollo de esta tesis doctoral generó un aporte al conocimiento sobre las funciones de los brasinoesteroides en vides, mediante la caracterización de genes pertenecientes a la vía de biosíntesis, percepción y señalización de esta hormona, y la cuantificación de distintos metabolitos pertenecientes a esta familia de fitohormonas.