Terapia Génica por Vectores Adenovirales en Modelos Animales de Alcoholismo: Inhibición de la Expresión del Gen de la Deshidrogenasa Aldehídica Mitocondrial Mediante un Gen Antisentido

El alcoholismo es una enfermedad de etiología multifactorial que causa un número de problemas sociales, laborales, legales y médicos. El riesgo de un individuo de desarrollar alcoholismo está influenciado por varios genes. Algunos genes permiten el desarrollo del alcoholismo y otros genes protegen a sus portadores de esta condición. La deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2) metaboliza gran parte del acetaldehído generado en el metabolismo hepático del alcohol. En algunos individuos de la población asiática, una mutación en el gen que codifica la ALDH2, disminuye o elimina la actividad de esta enzima. La inactivación de esta enzima produce una exagerada acumulación del acetaldehído sanguíneo luego del consumo de bebidas alcohólicas, lo que genera efectos disfóricos que producen un rechazo al alcohol. Este fenotipo protector descrito en la población asiática puede ser producido en alcohólicos a los cuales se ha administrado el medicamento aversivo disulfiram (Antabus®). Este fármaco, eficaz en disminuir la actividad ALDH2, es sin embargo poco específico, posee una vida media corta, muestra una gran variabilidad individual y genera una serie de efectos tóxicos por unirse en forma no específica a los grupos sulfhidrilos de varias proteínas. La terapia génica se perfila como una alternativa al actual tratamiento farmacológico del alcoholismo. Un nuevo medicamento aversivo sin los efectos secundarios del disulfiram sería de gran utilidad en el campo del alcoholismo. El tipo de terapia a desarrollar pretende imitar el fenotipo asiático, disminuyendo específicamente la actividad de la ALDH2 mediante la reducción de la traducción del mRNA. La estrategia utilizada para lograr este objetivo, es inhibir la traducción mediante la generación de un RNA antisentido de la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial codificado en un vector adenoviral. En estudios en esta tesis, primeramente, el gen antisentido de la ALDH2 (cDNA de Aldh2 en posición 3’ a 5’) contenido en el vector adenoviral bajo el promotor CMV se transdujo a células de hepatoma de rata generando niveles altos de mRNA antisentido. La administración de este vector a células de hepatoma de rata disminuyó de 60 a 70% la actividad ALDH2 y aumentó 8 veces (10 μM a 80 μM) los niveles de acetaldehído acumulado cuando estas células se incubaron con etanol. En estudios in vivo, se administró el adenovirus portador del gen antisentido-Aldh2 a ratas bebedoras UChB (línea de ratas Bebedoras desarrollada en la Universidad de Chile). Las ratas que recibieron una sola dosis del vector (1012 pv/kg) por vía intravenosa, disminuyeron su consumo de alcohol en 50%, y se observó una reducción de 90% en la actividad de la ALDH2. La reducción del consumo de etanol duró 34 días, tiempo al cual el estudio se finalizó. En estudios paralelos de más corta duración (10 días), los niveles plasmáticos de acetaldehído en los animales tratados con el vector anti-Aldh2 aumentó 6 a 8 veces (8 μM a 60 μM) sobre niveles controles (6-14 μM; p<0,01) asociado a un 37,5% de inhibición de la actividad ALDH2 hepática. En conclusión, en animales que reciben el gen Aldh2-antisentido, una reducción específica en la actividad de la ALDH2 permite la elevación de los niveles de acetaldehído sistémico, que genera una aversión al etanol. Los estudios sugieren que es posible desarrollar una terapia génica específica y de larga duración para el alcoholismo
 Alcoholism is defined by the compulsive excessive use of alcohol despite of negative consequences perceived by the subject. It is not only one of major public health problems due to the morbidity caused by the alcohol abuse disorder but it is also a major social problem. The risk of developing this disease is genetically influenced, with some genes being permissive and other genes protective. Most of the elimination of ethanol occurs by oxidation to acetaldehyde and further into acetate. The reactions are sequentially catalyzed by alcohol dehydrogenase (ADH) and aldehyde dehydrogenase (ALDH). The oxidation of acetaldehyde to acetate is catalyzed primarily by ALDH2, the low Km isozyme of ALDH present in mitochondria. A mutation in the gene coding for ALDH2 present in some Asian populations, lowers or abolishes the activity of this enzyme and results in marked elevations in blood acetaldehyde upon ethanol consumption. The resulting phenotype greatly protects against alcohol abuse and alcoholism. The protective Asian phenotype can be elicited in alcoholics who are administered the aversive medication disulfiram (Antabuse®), affording these individuals the same protection from alcohol abuse. However, disulfiram is a non-specific drug that binds to sulfhydryl groups, has a short half-life, cannot be metabolized by some patients into its active metabolite, and has marked toxicity side effects, as it nonspecifically binds to sulfhydryl groups in other proteins. Gene therapy, as a new approach, opens the possibility of developing a specific aversive medication for alcoholism. This new treatment, based on the reduction of Aldh2 mRNA transduction, provides a means by which gene expression can be specifically inhibited to yield the low-ALDH2 Asian phenotype. The aim of the work presented in this thesis is to reduce Aldh2 mRNA translation in the rat by the intracellular generation of an antisense aldehyde dehydrogenase RNA coded by an antisense gene (Aldh2 cDNA in a 3´ to 5´ orientation) contained in an adenoviral vector. Rat hepatoma cells were transduced with the antisense coding gene against ALDH2 carried by the adenoviral vector, leading to the generation of high levels of antisense mRNA. The cells infected with this vector, reduced their ALDH2 activity by 60 to 70% and, in the presence of ethanol, increased 8-fold the levels of acetaldehyde (10 μM to 80 μM). In studies in vivo, the adenoviral vector coding for the antisense-Aldh2 RNA was administered to UChB rats (University of Chile alcohol dependent rats). The rats infected with a single dose of the vector (1012 vp/kg) by tail vein injection inhibited its ALDH2 activity in 90% and reduced its alcohol consumption in 50%. The reduction in alcohol consumption lasted 34 days, time at which the study was terminated. A parallel study in which rats were infected 10 days earlier with a single dose of the vector carrying the antisense gene showed a 37.5% reduction in hepatic ALDH2 activity, while acetaldehyde plasma levels following the administration of ethanol increased 6-8 fold over controls (5-10 μM to 40-60 μM) (p<0,01). Overall, rats treated with an Aldh2- antisense coding gene show significant reductions in hepatic ALDH2 activity and elevations in systemic acetaldehyde upon ethanol administration, which are accompanied by marked reductions in ethanol voluntary consumption in alcohol dependent animals. These preclinical studies suggest that a long-lasting specific gene therapy against alcoholism may be developed