Mechanisms of long-distance control of dendritic growth by Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) in central neurons.

El factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) se expresa ampliamente en muchos circuitos del sistema nervioso central (SNC) y se une a sus receptores TrkB y p75 para desencadenar diferentes vías de señalización, tales como las quinasas ERK1/2, PI3K-mTOR y la vía de la PLCg-Ca+2. De esta manera favorece el crecimiento dendrítico y la plasticidad sináptica. Una vez que BDNF une a sus receptores de membrana TrkB y p75, estos se endocitan formando endosomas de señalización. En el sistema nervioso periférico (SNP) está descrito que las neurotrofinas unen a sus receptores en el axón y transmiten señales al cuerpo celular mediante el transporte axonal de endosomas de señalización favoreciendo la sobrevida neuronal. Sin embargo, el rol funcional de los endosomas de señalización BDNF/TrkB en las neuronas centrales, se desconoce. El propósito general de esta tesis fue estudiar el papel de la ruta endosomal en la señalización a larga distancia de BDNF/TrkB en las neuronas corticales y su regulación por las vías clásicas de regulación como PI3K y PLCg. El primer objetivo de nuestro trabajo fue estudiar si BDNF aumenta la actividad de la GTPasa Rab5 de manera temporal y espacial y si esto se traduce en una modificación de la dinámica de estos endosomas en dendritas y cuerpos celulares. Las proteínas Rabs son GTPasas monoméricas que actúan como interruptores moleculares para regular el tráfico de membranas al unirse a una amplia gama de efectores. Entre las Rab GTPasas, Rab5 es la GTPasa clave que regula los endosomas tempranos y es el primer organelo en la ruta endocítica de receptores de membrana. Para estudiar el rol de Rab5 sobre la señalización neuronal de BDNF, nosotros hicimos experimentos de microscopía de fluorescencia en células fijadas y células vivas, además evaluamos, mediante el uso de adenovirus que sobreexpresan un dominante negativo de Rab5, si la actividad de la GTPasa era requerida para la arborización inducida por BDNF. Nuestros estudios mostraron que tiempos breves de tratamiento con BDNF aumentó la colocalización de TrkB con Rab5 en dendritas, aumentando el número y la movilidad de los endosomas positivos para Rab5. Estos hallazgos se complementan con estudios que mostraron que la actividad de Rab5 es requerida para la ramificación dendrítica inducida por BDNF. Estos datos muestran que BDNF regula la dinámica de los endosomas tempranos mediante el aumento de la actividad y número de endosomas Rab5 y sugieren que estos procesos son requeridos para la ramificación dendrítica inducida por BDNF. Posteriormente, nos preguntamos por el rol funcional de la señalización axonal de BDNF en las neuronas corticales y el posible papel de los endosomas de señalización. Para esto utilizamos cultivos de neuronas corticales sembradas en cámaras de microfluidos, modelo que nos permitió aislar el componente axonal del somatodendrítico y así estudiar mediante microscopía de fluorescencia el efecto de la estimulación axonal de BDNF sobre la ruta de señalización de TrkB en los cuerpos celulares y axones. Nosotros encontramos que la incubación con BDNF en axones aumenta la ramificación dendrítica en los cuerpos celulares. Usando distintos modelos de animales transgénicos, encontramos que este proceso es mayormente mediado por los receptores TrkB y no p75. Además, encontramos que la arborización dependía de la activación del factor de transcripción CREB en el núcleo y la vía PI3K-mTOR en los cuerpos celulares aumentando la síntesis de proteínas somatodendríticas. Por otra parte, la actividad de PI3K en axones no fue necesaria para el transporte de BDNF, ni para el efecto en la arborización en el cuerpo celular. Mediante el uso de neuronas corticales derivadas de ratones knock-in TrkBF616A y el uso de cultivos compartimentalizados, pudimos mostrar que se requiere de la actividad del receptor TrkB activo en el cuerpo celular inducido por BDNF en el axón, para los efectos dendríticos observados en el cuerpo celular. Por otro lado, las actividades de Rab5 y dineína fueron requeridas para estos efectos. Todos estos resultados en su conjunto sugieren la generación y transporte de endosomas de señalización para la señalización a larga distancia de BDNF. A continuación, debido a la poca información disponible sobre cómo las rutas rio abajo de TrkB regulan la señalización de larga distancia, estudiamos el papel de la señalización de la PLCg en la señalización axonal mediada por BDNF. Utilizando cultivos compartimentalizados, demostramos que la actividad axonal de PLCg es necesaria para la arborización dendrítica y la fosforilación de CREB. Estos resultados se correlacionaron con el aumento de los niveles axonales de Ca+2 inducido por BDNF en los axones de una manera dependiente del PLCg. Adicionalmente, encontramos que la ruta PLCg/Ca+2 es necesaria para la endocitosis de TrkB en el axón. En resumen, estos resultados sugieren que la señalización axonal a larga distancia de BDNF posee un rol funcional en neuronas corticales, regulando la activación de proteínas claves para la traducción de proteínas y la arborización dendrítica.