El efecto de 3-hidroxibakuchiol y sus derivados sobre el sistema de fosforilación oxidativa : ¿potenciales agentes antineoplásicos?

Los cambios en la síntesis de ATP mitocondrial pueden afectar el desempeño de células tumorales, debido a que el primer paso de la glicólisis es dependiente del ATP mitocondrial que proviene de la fosforilación oxidativa. En células normales, la cadena transportadora de electrones es responsable del 90% de la síntesis de ATP, y en células tumorales, a pesar de estar disminuida, es responsable de al menos el 50% de los niveles totales de ATP, incluyendo los cánceres más glicolíticos; por lo tanto, la inhibición de la cadena transportadora de electrones mitocondrial se presenta como un importante blanco terapéutico para el cáncer. Bakuchiol (bk) es el componente mayoritario del extracto metanólico de Psoralea glandulosa y de Psoralea corylifolia. Es un meroterpeno liposoluble con propiedades antidiabéticas, bactericidas, hepatoprotectoras y antitumorales, entre otras. De Psoralea glandulosa o Culén (nombre común), se aisló también un derivado catecólico, 3-hidroxibakuchiol (3-OHbk). Hasta el momento, este último ha sido encontrado solamente en Psoralea glandulosa, planta nativa chilena. Este hecho y sus características estructurales lo convierten en un interesante candidato capaz de interferir con el flujo de electrones mitocondrial. 3-OHbk se encuentra descrita solo en Psoralea glandulosa, lo que explicaría la ausencia de trabajos con este compuesto. El objetivo de esta tesis fue evaluar la citotoxicidad in vitro de 3-OHbk en dos modelos de células tumorales, adenocarcinoma mamario de ratón (TA3) y leucemia linfoblástica aguda humana (CCRF-CEM), y además, relacionar el efecto citotóxico con la efecto inhibitorio de esta molécula sobre la cadena transportadora de electrones mitocondrial de células cancerosas. Para ello se evaluó la actividad citotóxica de 3-OHbk, bk y un derivado acetilado de 3-OHbk (3-OHbk-DA). Se determinó el efecto de estas tres moléculas sobre la proliferación de cuatro líneas celulares cancerosas: la línea TA3, su derivada multirresistente a fármacos antineoplásicos (TA3-MTX-R) células CCRF-CEM y su línea derivada resistente a camptotecina y derivados (CEM/C2). De las 3 moléculas evaluadas, 3-OHbk y 3-OHbk-DA presentaron la mayor actividad antiproliferativa en las cuatro líneas tumorales. Para determinar si este efecto antiproliferativo estaba relacionado con algún efecto sobre la cadena transportadora de electrones mitocondrial, se determinó el efecto de las dos moléculas seleccionadas sobre el consumo de oxígeno de células TA3. Solo 3-OHbk fue capaz de inhibir el consumo de oxígeno, mientras que su derivado di-acetilado no presentó actividad en este sistema. Se determinó el sitio de la cadena transportadora de electrones sobre el cual 3-OHbk ejerció su acción inhibitoria, y el efecto de esta molécula sobre la función mitocondrial de células TA3. 3-OHbk actúa en el complejo I de la cadena transportadora de electrones, disminuyendo la velocidad de oxidación de NADH, provocando una disminución del potencial de transmembrana mitocondrial, la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (MPTP) y una disminución de la concentración de ATP intracelular total. Además indujo muerte celular, induciendo la activación de caspasa 3 y la fragmentación del DNA nuclear, fenómenos característicos de una muerte celular del tipo apoptótico. La inhibición de la proliferación y la muerte celular se observó sólo en las células cancerosas humanas y de ratón, y fue significativamente menoren dos modelos celulares considerados normales (la línea celular murina MM3MG y las células mononucleares de sangre periférica humana PBMC) Es sabido que diversos inhibidores del complejo I de la cadena transportadora de electrones inducen la muerte celular debido a la generación de ROS, por este motivo, debido a que es capaz de inhibir el complejo I, se estudió la capacidad de 3-OHbk para generar especies reactivas del oxígeno a través de la medición de la oxidación de DCFDA. Sin embargo, no se observó este fenómeno. Cuando se utilizó un sustrato sintético que revierte la inhibición del consumo de oxígeno, entregando electrones directamente al complejo III de la cadena transportadora de electrones, la muerte celular de las células TA3 fue casi completamente prevenida. Este resultado sugiere que la muerte celular está provocada directamente por la disminución del consumo de oxígeno por la inhibición del complejo I de la cadena transportadora de electrones mitocondrial, que es un sistema deficiente pero esencial en células tumorales, y no por la generación de ROS, lo cual podría presentar una serie de ventajas para el tratamiento de esta enfermedad.
 Changes in mitochondrial ATP synthesis can affect the performance of tumor cells due to the dependence of the first step of glycolysis on mitochondrial ATP. The mitochondrial electron transport chain (ETC) is responsible for the synthesis of approximately 90% of ATP in normal cells and up to 50% in most glycolytic cancers; therefore, the inhibition of ETC emerges as an interesting therapeutic target. Here, we studied the effect of a lipophilic isoprenylated catechol, 3-hydroxybakuchiol (3-OHbk) and bakuchiol (bk) isolated from Psoralea glandulosa, and an di-acetylated 3-OHbk (3-OHbk-DA) on several tumor cell mitochondrial functions. We expect 3-OHbk and its analogues to kill tumor cells by inhibiting the electron transport chain and decreasing the intracellular concentration of ATP. The effect of these three molecules on the proliferation of four cell lines: mouse mammary adenocarcinoma cell line TA3 and its derivative multi-drug resistant cell line TA3-MTX-R, and human acute lymphoblastic leukemia cell line CCRF-CEM and camptothecin-resistant derivative and derivatives CEM/C2 was evaluated. 3-OHbk and 3-OHbk-DA showed the highest antiproliferative activity on all four cell lines, and were selected as potential inhibitors of mitochondrial electron transport chain in TA3 cells. However, 3-OHbk showed inhibitory activity of the electron transport chain, while its di-acetylated derivative showed no activity in this system, therefore, the site of the electron transport chain which 3-OHbk on exerts its inhibitory action was determined, with other mitochondrial metabolism and cell death parameters. We found that this molecule acts on complex I of the electron transport chain, decreasing the mitochondrial transmembrane potential, opening the mitochondrial permeability transition pore (MPTP), decreasing the intracellular ATP concentration and cell death, inducing the activation of caspase 3 and nuclear DNA fragmentation, a characteristic phenomenon of apoptotic cell death. In addition, the capability of 3-OHbk to generate reactive oxygen species was assessed by measuring the oxidation of DCFDA. This, however, was not observed. When a synthetic substrate, which reverses inhibition of oxygen consumption delivering electrons directly to complex III of the electron transport chain, was added to TA3 cells, cell death was almost completely prevented. This might indicate that cell death is caused directly by the decrease in oxygen consumption by the inhibition of complex I of mitochondrial electron transport chain, an essential system in tumor cells, suggesting a new mechanism to attack cancer cells.