Polimorfismo intracromosómico de los genes del rRNA 16S y presencia de genes relacionados con patogenicidad en aislados ambientales del género vibrio en la costa chilena

El género Vibrio incluye un alto número de especies indígenas de agua de mar, algunas de las cuales pueden causar importantes enfermedades en humanos aún en ausencia de contaminación antropogénica (V. cholerae, V. vulnificus y V. parahemolyticus). Aunque la infección por estos vibrios se ha observado en Chile con baja frecuencia, el surgimiento de brotes es una amenaza constante a la salud humana y a la producción y explotación acuícola. En esta tesis se estudió el polimorfismo intra-cromosómico de los genes repetidos del rRNA 16S de bacterias del género Vibrio, y se exploró la presencia de genes relacionados con patogenicidad en aislados ambientales de estas bacterias. En este proyecto el análisis de los rDNAs 16S obtenidos de una sola colonia de cepas tipo o cepas ambientales del género Vibrio reveló la presencia de polimorfismo en cada una de las cepas analizadas. El polimorfismo se detectó por la visualización de heterodupletes que se generan después de la amplificación por PCR del rDNA 16S, un procedimiento que permite examinar un gran número de aislados. El amplificado del rDNA 16S obtenido tanto de V. parahaemolyticus como de una cepa ambiental fueron clonados. Las secuencias nucleotídicas revelaron diferencias de hasta un 2% entre genes repetidos del rDNA 16S de una misma cepa. Los sitios polimorfos se encontraron concentrados en una región del gen rRNA 16S bacteriano que forma un lazo y una horquilla. En algunas cepas esta región concentraba hasta un 83% del total de sitios polimorfos. La acumulación de muchos cambios compensatorios en la región de lazo y horquilla implican que la divergencia de las diferentes versiones de este lazo y horquilla es relativamente muy antigua. Esta divergencia podría ser el resultado de un proceso de selección o transferencia lateral de genes o regiones de genes que evolucionaron independientemente en otras bacterias. El polimorfismo también se observó en el rRNA después de ser amplificado por RTPCR, indicando que algunos de los genes diferentes eran expresados. La exploración por genes relacionados con la patogenicidad de diferentes especies de Vibrio en aislados ambientales mostró sólo un gen relacionado con un aislado. Se exploró la presencia de tdh, trh y gyrB relacionados con la patogenicidad en V. parahaemolyticus; vvhA relacionado a V. vulnificus; y ctxA, tcpA y el espaciador de los genes rRNA 16 y 23S relacionados con V. cholerae. Este aislado, llamado C1, contiene el gen gyrB, relacionado al V. parahaemolyticus. La caracterización detallada mostró corresponder a un V. parahaemolyticus, pero con algunas características de V. alginolyticus. Este aislado no contiene todo el conjunto de genes considerados necesarios en una especie realmente patógena. Sin embargo, este aislado alberga un fago de amplio espectro de huésped que puede infectar tanto V. alginolyticus como V. parahaemolyticus. Aunque es posible aislar bacterias con genes asociados a vibrios patógenos en las aguas costeras chilenas, éstas no parecen ser cepas realmente virulentas.
 The genus Vibrio includes a number of bacterial species that in spite of being indigenous of the sea (V. parahaemolyticus and V. vulnificus) with the exception of V. cholerae, which is terrestrial, may infect humans with serious consequences. In this work we explore the commonness polymorphism and the extent of sequence dissimilarity among repeated 16S rRNA genes, in type strains of genus Vibrio and environmental isolates. Analysis of the 16S rDNAs obtained from cultures of single colonies of either type collection strains or environmental strains of the genus Vibrio revealed the presence of polymorphism in almost every one of the strains examined. Polymorphism was detected by visualization of heteroduplexes produced after 16S rDNA PCR amplification, a procedure that allows for the screening of a large number of isolates. Amplified 16S rDNAs obtained from both V. parahaemolyticus and an environmental strain were cloned. Their nucleotide sequences revealed differences of up to 2% among 16S rDNAs from the same strain. Polymorphic sites were concentrated in a recognized variable stem loop of bacterial 16S rRNA that contained in some cases up to 83% of the total mismatches observed. Most of the substitutions present in the stem loop region showed compensating base covariation. The accumulation of so many compensating changes in the stem loop region implies that the divergence of the different versions of this stem loop is relatively ancient. This divergence could be the result of either a selection process or a lateral transference of independently evolved genes. Polymorphism was also observable in the rRNA when this was amplified by RT-PCR, indicating the expression of at least some of the different genes. In this work we also explored the presence of putative pathogenic vibrio strains, carrying amplicons related to pathogenic species of this genus, isolated in coastal waters of the Southern Pacific Ocean (Chile). A search for bacteria of this genus containing genes related with virulence was conducted and isolates of the genus Vibrio were grouped according to the size pattern of their 16-23S rDNA spacer regions. One isolate from each of 20 different groups was then tested by PCR amplification for the presence of the following genes, related with pathogenicity: tdh , trh, and the girB related to pathogenic V. parahaemolyticus; vvhA related to V. vulnificus; and ctxA, tcpA and the 16-23S rDNA spacer region related to V. cholerae. Only a single Vibrio isolate carrying a pathogenicity associated gene was detected. Further characterization of this isolate suggested, however, that it lacked additional properties to be virulent. The results indicated that this strain belong to the species V. parahaemolyticus but contains many properties more closely related to V. alginolyticus. This strain can host a phage present in the Chilean coastal waters.