Regulación de la dinámica mitocondrial del cardiomiocito por igf-1 y norepinefrina

La hipertrofia cardíaca es una respuesta adaptativa desencadenada por una mayor demanda de trabajo contráctil por parte del cardiomiocito, su desarrollo es el resultado de múltiples factores, existiendo una hipertrofia cardíaca de tipo fisiológica, reversible, sin signos histológicos de fibrosis, generada por factores de crecimiento como el factor de crecimiento análogo a insulina tipo 1 (IGF-1) y otra de tipo patológico, irreversible, cuya progresión genera insuficiencia cardíaca y cardiomiopatía dilatada, asociada a la acción de agonistas de receptores acoplados a proteína G como norepinefrina (NE), entre otros. Un aspecto importante a considerar es el metabolismo energético del corazón y su participación en el proceso hipertrófico, puesto que es uno de los órganos con mayor tasa de consumo de ATP y una disminución en la disponibilidad energética se traduce en alteraciones de la actividad contráctil y en el desarrollo de distintas patologías cardíacas. La mitocondria es el organelo responsable de la generación de energía en la célula, en el cardiomiocito se encuentran ubicadas entre las miofibrillas y ocupan sobre el 50% del volumen citoplasmático en el músculo cardíaco. Actualmente se reconoce la existencia de un retículo mitocondrial, donde estos organelos forman verdaderos “cables energéticos” cuya morfología y función dependen del equilibrio entre los procesos de fisión y fusión mitocondrial. Diversas proteínas, entre ellas OPA-1 y Mfn1/2 se relacionan con fusión mitocondrial mientras que Drp-1 y Fis-1 se asocian al proceso inverso. Tomando en cuenta la relación entre metabolismo e hipertrofia cardíaca, resulta evidente la importancia que adquieren los procesos de dinámica mitocondrial al regular la función de este organelo. Hasta la fecha se desconoce qué tipo de proceso de dinámica mitocondrial predomina en hipertrofia cardíaca, ni en qué forma la fusión/fisión de la mitocondria afecta el desarrollo del proceso hipertrófico en el cardiomiocito. Por esta razón, el objetivo principal del presente trabajo consistió en determinar si los estímulos prohipertróficos IGF-1 o NE, alteran la morfología y actividad mitocondrial. Para este fin, cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se trataron con IGF-1 (10 nM) o NE (10 M) entre 0 - 48 h. La red mitocondrial se visualizó mediante microscopía confocal y tinción con mitotracker Green. Los resultados muestran que desde las 24 h, NE produjo fisión de la red mitocondrial, identificada por un incremento en el porcentaje de células con fragmentación mitocondrial (+26 %, p<0,05 y +39 %, p<0,001), en el número relativo de mitocondrias por célula (+42 %, p<0,005 y +65 %, p<0,001) y disminución en el volumen mitocondrial promedio (-24 %, p<0,005 y -47 %, p<0,001, para las 24 y 48 h, respectivamente. Además, luego de los cambios morfológicos se observó una disminución del potencial de membrana mitocondrial (-23 %, p<0,05), del contenido intracelular de ATP (-27 %, p<0,05) y de la velocidad de consumo de oxígeno (-24 %, p<0,05), después de 48 h de exposición a NE. No se observaron cambios morfológicos ni metabólicos en la red mitocondrial de cardiomiocitos tratados con IGF-1. Igualmente se observó que la fisión mitocondrial inducida por NE se asoció con un incremento en la migración de Drp-1 a mitocondria, evaluado a través de un incremento en los niveles de Drp-1 en fracción mitocondrial y aumento en la colocalización entre Drp-1 y Fis-1. Calcineurina es una de las proteínas transduccionales de mayor relevancia en la respuesta hipertrófica inducida por NE, describiéndose que participa en la modulación de la dinámica mitocondrial mediante desfosforilación de Drp-1, incrementando su actividad. Para evaluar su participación, cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se transducieron con un adenovirus que expresa la subunidad catalítica de calcineurina constitutivamente activa (AdCN) o con uno que codifica un péptido inhibitorio para calcineurina (CAIN), observándose que su inhibición redujo significativamente los cambios morfológicos en la red mitocondrial inducidos por NE y que su sobreexpresión es suficiente para producir fisión mitocondrial. Además, el uso de herramientas adenovirales, también permitió determinar que una disminución en los niveles de Mfn2 produce fisión mitocondrial e induce la respuesta hipertrófica en el cardiomiocito, determinada como un incremento en el área celular, la sarcomerización y la reexpresión de biomarcadores asociados al proceso, mientras que la disminución en la actividad de Drp-1 fusiona la red mitocondrial y previene la hipertrofia cardíaca en los cardiomiocitos tratados con ambos estímulos. En base a estos resultados, se puede concluir que durante el desarrollo del proceso hipertrófico patológico del cardiomiocito se produce fragmentación de la red mitocondrial, a través de un mecanismo que involucra el incremento en la migración de Drp-1 amembrana mitocondrial y la participación de la fosfatasa calcineurina, todo esto asociado a una disminución en diversos parámetros metabólicos. Por otro lado, la modulación en los niveles o actividad de proteínas asociadas a los procesos de fusión y fisión mitocondrial, modificó significativamente el desarrollo del proceso hipertrófico, por lo que colectivamente, estos resultados revelan la importancia de los procesos de dinámica mitocondrial en el desarrollo de hipertrofia cardíaca.
 Cardiac hypertrophy is an adaptive response induced by an increased contractile work. Physiological cardiac hypertrophy is reversible, without histological signs of fibrosis, generated by growth factors such as insulin like growth factor 1 (IGF-1). In contrast, pathological cardiac hypertrophy is irreversible, progress to heart failure and dilated cardiomyopathy and it has been associated with the action of G protein-coupled receptors agonists such as norepinephrine. An important aspect to consider is the heart’s energy metabolism and its role in the hypertrophic process, since myocardial tissue is one of the organs with the highest rate of ATP consumption. A decrease in energy availability results in detrimental changes in contractile activity and the development of distinct cardiac diseases. Mitochondria have a key role in energy generation in the cardiomyocyte are located between the myofibrils and occupy over 50% of cytoplasmic volume. The existence of a mitochondrial reticulum is recognized now and these organelles are true "power-transmitting cables" whose morphology and function depend on the balance between mitochondrial fission and fusion. Several proteins like OPA-1 and Mfn1/2 have been linked to mitochondrial fusion while Drp-1 and Fis-1 are associated with mitochondrial fission. Taking into account the relationship between metabolism and cardiac hypertrophy, the role of mitochondrial dynamics in the developrment of hypertrophyc growth must be relevant. However, the mitochondrial morphology in the hypertrophic cardiomyocyte, or how the mitochondrial fusion/fission events affect the development of the cardiomyocyte hypertrophic process is unknown. For this reason, our main objective was to investigate whether IGF-1 or NE stimulation produces changes in morphology and mitochondrial activity. For this goal, primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes were treated with IGF-1 (10 nM) or NE (10 M) for 0 - 48 h. The mitochondrial network was visualized by confocal microscopy and Mitotracker Green staining. The results show that NE triggered mitochondrial fission after 24 hours of exposure, identified by an increase in the percentage of cells with mitochondrial fragmentation (+26 %, p <0.05 and +39 %, p <0.001), increase in the relative number of mitochondria per cell (+42 %, p <0.005 and +65 %, p <0.001) and decrease in the average mitochondrial volume (-24 %, p <0.005 and -47 %, p < 0.001, for the 24 and 48 h respectively). In addition to these, morphological changes, decreases in mitochondrial membrane potential (-23 %, p <0.05), intracellular ATP content (-27 %, p <0.05) and oxygen consumption rate (-24 %, p <0.05) were also observed after 48 h of exposure to NE. No morphological or metabolic changes in the mitochondrial network were detected in cardiomyocytes treated with IGF-1. NEinduced mitochondrial fission was associated with an increase in the migration of Drp-1 to mitochondria, evaluated by increase in levels of Drp-1 in mitochondrial fraction and by Drp-1 and Fis-1 colocalization. Calcineurin is one of the most important signaling molecules in the hypertrophic response induced by NE. This phosphatase is also involved in the modulation of mitochondrial dynamics by dephosphorylation of Drp-1, increasing its activity. To evaluate its role, culture neonatal rat cardiomyocytes were transduced with an adenovirus expressesing the calcineurin catalytic subunit constitutively active (AdCN) an inhibitory peptide (CAIN). Inhibition of calcineurin significantly decreased morphological changes in the mitochondrial network triggered by NE and AdCN overexpression being sufficient to cause mitochondrial fission. Using other adenoviral tools, we show that a decrease in Mfn2 levels causes mitochondrial fission, and induces the cardiomyocyte hypertrophic response, determined by increases in cell area, sarcomerización and biomarkers associated with hypertrophic response. The decrease in Drp-1 activity, stimulated mitochondrial fusion and prevented cardiac hypertrophy induced by NE and IGF-1. Collectively our results suggest, that mitochondrial network is fragmented during the development of pathological cardiomyocyte hypertrophy, through a mechanism involving the migration of Drp1 to the mitochondria and the phosphatase calcineurin activation, associated with decreases in several metabolic parameters. In addition, the modulation in the activity of proteins associated with mitochondrial fusion/fission, produced significant changes in the development of hypertrophy. Collectively these results demonstrate the importance of mitochondrial dynamics in the development of cardiac hypertrophy.