Desbalance en los niveles de colesterol y esfingolípidos y su efecto en la pérdida de caveolas, señalización insulínica y diferenciación en adipocitos Agpat2-/-.

El tejido adiposo es un regulador del balance energético y de la homeostasis glucídica y lipídica en mamíferos. La lipodistrofia congénita generalizada (LCG) es un síndrome caracterizado por reducción severa de la masa de tejido adiposo corporal total y complicaciones metabólicas. Mutaciones en el gen AGPAT2 son la causa más frecuente de LCG. AGPAT2 codifica para la enzima 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferasa 2, que cataliza la síntesis de ácido fosfatídico a partir de ácido lisofosfatídico en la vía de síntesis de los glicerolípidos. Los mecanismos que determinan la LCG dependiente de mutaciones en AGPAT2 no están dilucidados. Los ratones deficientes en AGPAT2 (Agpat2-/- ) nacen con tejido adiposo blanco y pardo, pero este degenera durante la primera semana de vida postnatal, como resultado de muerte selectiva de adipocitos e infiltración inflamatoria del tejido adiposo. Por otro lado, fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) y preadipocitos aislados a partir del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- presentan adipogénesis deteriorada in vitro, caracterizada por menor abundancia de gotas lipídicas y menor expresión génica de reguladores de la adipogénesis. El análisis ultraestructural de adipocitos del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- y MEFs Agpat2-/- diferenciados adipogénicamente in vitro mostró una cantidad significativamente disminuida de caveolas. Las caveolas son microdominios de la membrana plasmática de 50 a 100 nm de diámetro, muy abundantes en adipocitos y células endoteliales. Están involucradas en funciones importantes del adipocito: unión, transporte intracelular y almacenamiento de ácidos grasos y colesterol, activación de vías de señalización adipogénicas y protección contra los efectos lipotóxicos de niveles elevados de ácidos grasos. La formación de caveolas requiere la presencia de las proteínas caveolina-1 y cavina-1, y una adecuada composición lipídica de la membrana plasmática (MP), caracterizada por enriquecimiento de colesterol y esfingolípidos. El objetivo general de esta tesis fue determinar el mecanismo por el cual adipocitos Agpat2- /- presentan un bajo número de caveolas y el rol potencial de las caveolas en la patogenia de la lipodistrofia en ratones Agpat2-/- . Para esto, combinamos experimentación in vitro usando un modelo de diferenciación adipogénica a partir de preadipocitos obtenidos de la fracción estromalvascular del tejido adiposo pardo interescapular de estos animales, e in vivo, analizando el tejido adiposo de ratones Agpat2-/- durante sus primeros días de vida postnatal, en etapas anteriores a su degeneración inflamatoria. Primero, confirmamos que tanto el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2- /- como adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro presentan un bajo número de caveolas en comparación con animales y adipocitos en cultivo Agpat2+/+ (wild type). Sin embargo, y contrario a lo esperado, la vía de insulina, que ha sido reportada como dependiente de caveolas, se encuentra preservada en adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro, y su nivel de activación no se modifica a lo largo de todos los días de diferenciación evaluados. No encontramos diferencias en la abundancia de proteínas caveolina-1 y cavina-1 pero sí en su localización subcelular a día 5 y 10 de diferenciación. Así, mientras en adipocitos wild type ambas proteínas presentan localización en la periferia de las células, compatible con una destinación en la MP, en adipocitos Agpat2-/- presentan una localización intracelular, con formación de agregados o acúmulos de tamaño heterogéneo. El análisis de composición lipídica celular total mostró que en el día 0 de diferenciación adipogénica no hay diferencias en los niveles de las diferentes especies de lípidos evaluados entre preadipocitos de ambos genotipos. Por el contrario, en el día 10 de diferenciación, los adipocitos Agpat2-/- presentaron agregaciones o acúmulos de colesterol intracelular, junto con mayores niveles de 7-dehidrodesmoterol y esfingomielina, y menores niveles de fosfatidiletanolamina y lisofosfatidiletanolamina. Los acúmulos de colesterol intracelular también fueron detectados en el tejido adiposo blanco subcutáneo (día postnatal P0.5 y P2.5) y en el tejido adiposo pardo interescapular (día postnatal P4.5) de ratones Agpat2-/- pero no wild type. Además, el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2-/- posee mayor abundancia de ceramidas en combinación con menores niveles de los fosfolípidos fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, lisofosfatidilcolina y lisofosfatidiletanolamina en el día postnatal P4.5. Para evaluar posibles mecanismos involucrados en los desbalances lipídicos de los adipocitos Agpat2-/- , cuantificamos los niveles de mRNA de algunos genes clave del metabolismo de colesterol y esfingolípidos en tres tiempos de diferenciación adipogénica in vitro. No observamos diferencias entre genotipos en el perfil de expresión génica en los días 0 y 5 de diferenciación, sin embargo, en el día 10, los adipocitos Agpat2-/- presentan niveles aumentados tanto de los genes Abca1, Ldlr, Lrp, Srbi, Srebp2 y Hmg-CoAR, implicados en la homeostasis del colesterol así como de Sptlc2, Asah1, GlcT y Smpd1, los que están involucrados en la síntesis de esfingolípidos. Para estudiar de forma directa la participación de lípidos de la MP en la deficiencia de caveolas en lo adipocitos deficientes en AGPAT2, determinamos la composición lipídica de preparaciones purificadas de MP de adipocitos diferenciados adipogénicamente in vitro y del tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos. No encontramos diferencias en los niveles de colesterol, esteroles y esfingolípidos entre células Agpat2-/- y wild type en el día 0 de diferenciación (cuando las células corresponden a preadipocitos), pero sí mayores niveles de fosfatidilglicerol en preadipocitos Agpat2-/- . En el día 10 de diferenciación, la MP de los adipocitos Agpat2-/- presentó mayor abundancia de fosfatidilserina y 8(9)-dehidrocolesterol. En la MP del tejido adiposo pardo interescapular de ratones recién nacidos, no encontramos diferencias en los niveles de colesterol entre genotipos, pero sí mayores niveles de zimosterol y FFMAS en ratones Agpat2-/- . Por lo tanto, con nuestros resultados podemos concluir que el número reducido de caveolas en adipocitos Agpat2-/- se asocia a niveles elevados de fosfatidilglicerol en el estado de preadipocito (día 0 post inducción adipogénica) y niveles elevados de fosfatidilserina en el estado de adipocito (día 10 post inducción adipogénica). Además, es posible que alteraciones en la distribución celular de caveolina-1 y cavina-1 contribuyan al déficit en el número de caveolas. Estas alteraciones podrían conducir a un tráfico anormal de colesterol, que determina la presencia de acúmulos intracelulares de este lípido y mayor actividad biosintética de colesterol, producto de su retención en compartimentos que previenen su destinación normal a la membrana del RE. Por otro lado, la deficiencia de caveolas podría promover o facilitar la muerte celular lipotóxica de los adipocitos Agpat2-/- , producto de su mayor sensibilidad a ácidos grasos y también por la acumulación excesiva de depósitos intracelulares de colesterol.El tejido adiposo es un regulador del balance energético y de la homeostasis glucídica y lipídica en mamíferos. La lipodistrofia congénita generalizada (LCG) es un síndrome caracterizado por reducción severa de la masa de tejido adiposo corporal total y complicaciones metabólicas. Mutaciones en el gen AGPAT2 son la causa más frecuente de LCG. AGPAT2 codifica para la enzima 1-acilglicerol-3-fosfato aciltransferasa 2, que cataliza la síntesis de ácido fosfatídico a partir de ácido lisofosfatídico en la vía de síntesis de los glicerolípidos. Los mecanismos que determinan la LCG dependiente de mutaciones en AGPAT2 no están dilucidados. Los ratones deficientes en AGPAT2 (Agpat2-/- ) nacen con tejido adiposo blanco y pardo, pero este degenera durante la primera semana de vida postnatal, como resultado de muerte selectiva de adipocitos e infiltración inflamatoria del tejido adiposo. Por otro lado, fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) y preadipocitos aislados a partir del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- presentan adipogénesis deteriorada in vitro, caracterizada por menor abundancia de gotas lipídicas y menor expresión génica de reguladores de la adipogénesis. El análisis ultraestructural de adipocitos del tejido adiposo de ratones Agpat2-/- y MEFs Agpat2-/- diferenciados adipogénicamente in vitro mostró una cantidad significativamente disminuida de caveolas. Las caveolas son microdominios de la membrana plasmática de 50 a 100 nm de diámetro, muy abundantes en adipocitos y células endoteliales. Están involucradas en funciones importantes del adipocito: unión, transporte intracelular y almacenamiento de ácidos grasos y colesterol, activación de vías de señalización adipogénicas y protección contra los efectos lipotóxicos de niveles elevados de ácidos grasos. La formación de caveolas requiere la presencia de las proteínas caveolina-1 y cavina-1, y una adecuada composición lipídica de la membrana plasmática (MP), caracterizada por enriquecimiento de colesterol y esfingolípidos. El objetivo general de esta tesis fue determinar el mecanismo por el cual adipocitos Agpat2- /- presentan un bajo número de caveolas y el rol potencial de las caveolas en la patogenia de la lipodistrofia en ratones Agpat2-/- . Para esto, combinamos experimentación in vitro usando un modelo de diferenciación adipogénica a partir de preadipocitos obtenidos de la fracción estromalvascular del tejido adiposo pardo interescapular de estos animales, e in vivo, analizando el tejido adiposo de ratones Agpat2-/- durante sus primeros días de vida postnatal, en etapas anteriores a su degeneración inflamatoria. Primero, confirmamos que tanto el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2- /- como adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro presentan un bajo número de caveolas en comparación con animales y adipocitos en cultivo Agpat2+/+ (wild type). Sin embargo, y contrario a lo esperado, la vía de insulina, que ha sido reportada como dependiente de caveolas, se encuentra preservada en adipocitos Agpat2-/- diferenciados in vitro, y su nivel de activación no se modifica a lo largo de todos los días de diferenciación evaluados. No encontramos diferencias en la abundancia de proteínas caveolina-1 y cavina-1 pero sí en su localización subcelular a día 5 y 10 de diferenciación. Así, mientras en adipocitos wild type ambas proteínas presentan localización en la periferia de las células, compatible con una destinación en la MP, en adipocitos Agpat2-/- presentan una localización intracelular, con formación de agregados o acúmulos de tamaño heterogéneo. El análisis de composición lipídica celular total mostró que en el día 0 de diferenciación adipogénica no hay diferencias en los niveles de las diferentes especies de lípidos evaluados entre preadipocitos de ambos genotipos. Por el contrario, en el día 10 de diferenciación, los adipocitos Agpat2-/- presentaron agregaciones o acúmulos de colesterol intracelular, junto con mayores niveles de 7-dehidrodesmoterol y esfingomielina, y menores niveles de fosfatidiletanolamina y lisofosfatidiletanolamina. Los acúmulos de colesterol intracelular también fueron detectados en el tejido adiposo blanco subcutáneo (día postnatal P0.5 y P2.5) y en el tejido adiposo pardo interescapular (día postnatal P4.5) de ratones Agpat2-/- pero no wild type. Además, el tejido adiposo pardo interescapular de ratones Agpat2-/- posee mayor abundancia de ceramidas en combinación con menores niveles de los fosfolípidos fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, ácido fosfatídico, lisofosfatidilcolina y lisofosfatidiletanolamina en el día postnatal P4.5. Para evaluar posibles mecanismos involucrados en los desbalances lipídicos de los adipocitos Agpat2-/- , cuantificamos los niveles de mRNA de algunos genes clave del metabolismo de colesterol y esfingolípidos en tres tiempos de diferenciación adipogénica in vitro. No observamos diferencias entre genotipos en el perfil de expresión génica en los días 0 y 5 de diferenciación, sin embargo, en el día 10, los adipocitos Agpat2-/- presentan niveles aumentados tanto de los genes Abca1, Ldlr, Lrp, Srbi, Srebp2 y Hmg-CoAR, implicados en la homeostasis del colesterol así como de Sptlc2, Asah1, GlcT y Smpd1, los que están involucrados en la síntesis de esfingolípidos. Para estudiar de forma directa la participación de lípidos de la MP en la deficiencia de caveolas en lo adipocitos deficientes en AGPAT2, determinamos la composición lipídica de preparaciones purificadas de MP de adipocitos diferenciados adipogénicamente in vitro y del tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos. No encontramos diferencias en los niveles de colesterol, esteroles y esfingolípidos entre células Agpat2-/- y wild type en el día 0 de diferenciación (cuando las células corresponden a preadipocitos), pero sí mayores niveles de fosfatidilglicerol en preadipocitos Agpat2-/- . En el día 10 de diferenciación, la MP de los adipocitos Agpat2-/- presentó mayor abundancia de fosfatidilserina y 8(9)-dehidrocolesterol. En la MP del tejido adiposo pardo interescapular de ratones recién nacidos, no encontramos diferencias en los niveles de colesterol entre genotipos, pero sí mayores niveles de zimosterol y FFMAS en ratones Agpat2-/- . Por lo tanto, con nuestros resultados podemos concluir que el número reducido de caveolas en adipocitos Agpat2-/- se asocia a niveles elevados de fosfatidilglicerol en el estado de preadipocito (día 0 post inducción adipogénica) y niveles elevados de fosfatidilserina en el estado de adipocito (día 10 post inducción adipogénica). Además, es posible que alteraciones en la distribución celular de caveolina-1 y cavina-1 contribuyan al déficit en el número de caveolas. Estas alteraciones podrían conducir a un tráfico anormal de colesterol, que determina la presencia de acúmulos intracelulares de este lípido y mayor actividad biosintética de colesterol, producto de su retención en compartimentos que previenen su destinación normal a la membrana del RE. Por otro lado, la deficiencia de caveolas podría promover o facilitar la muerte celular lipotóxica de los adipocitos Agpat2-/- , producto de su mayor sensibilidad a ácidos grasos y también por la acumulación excesiva de depósitos intracelulares de colesterol.