Nitrate-mediated shoot growth is modulated by cell expansion and endoreplication in Arabidopsis thaliana.

Cómo los organismos saben cuándo sus tejidos han alcanzado su tamaño final es una pregunta fundamental y aún sin resolver en biología del desarrollo. En organismos multicelulares, señales ambientales e internas son integradas para modular el crecimiento de órganos y tejidos. Está muy bien reportado que el ambiente nutricional en el que crecen los organismos modula el crecimiento y tamaño de los órganos. En plantas, sin embargo, los mecanismos moleculares que explican la interconectividad y coordinación entre señales ambientales y crecimiento siguen sin ser comprendidas. Nitrato es una fuente nutricional clave limitante del crecimiento y productividad de las plantas tanto en ambientes naturales como en sistemas agrícolas. Además de su rol como nutriente, nitrato puede actuar como una señal molecular que desencadena cambios a nivel de expresión génica, metabolismo, fisiológicos y de desarrollo. Aunque muchos procesos son modulados por nitrato, una conectividad entre la dinámica celular, el tamaño de los órganos y el nitrato nunca ha sido reportada. En el presente trabajo nos centramos en el tejido vegetativo como modelo de estudio de los procesos de desarrollo modulados por la disponibilidad del nitrato. Para entender cómo nitrato regula el tejido vegetativo, se realizó un experimento en el cual se crecieron plantas en distintas concentraciones de nitrato y se cuantificó el área del tejido aéreo desde 3 a 7 días post-imbibición. Curiosamente, observamos que el área del tejido vegetativo empieza a divergir entre las 3 condiciones nutricionales al día 5 aproximadamente. Al final del curso temporal observamos que las plantas son totalmente distintas con una respuesta dependiente de la concentración de nitrato. Para entender cómo nitrato aumenta el tamaño del tejido vegetativo durante el curso temporal previamente mencionado, se realizó un análisis de “cotyledon live-imaging” a través de microscopía confocal en las células epidermales del tejido vegetativo. Por medio de líneas reporteras transgénicas logramos seguir la dinámica celular y nuclear del mismo grupo de células a través del curso temporal de cinco días en condiciones contrastantes de nitrato (0 y 5 mM). El análisis de “live-imaging” nos permitió determinar que el crecimiento del tejido vegetativo observado se debe exclusivamente a una expansión celular, descartando la división celular como un proceso relevante durante el crecimiento mediado por nitrato durante esta etapa del desarrollo. En plantas, se ha correlacionado la expansión celular con el proceso de endoreplicación, el que consiste en un ciclo celular modificado en el cual las células pasan por continuas rondas de replicación de su material genético, sin pasar por la etapa mitótica. A través de análisis de citometría de flujo, determinamos que efectivamente un aumento del nitrato incrementa los niveles de ploidía, explicando el aumento en el tamaño celular observado previamente. Posteriormente, para identificar el mecanismo por el cual nitrato aumenta los niveles de ploidía y área celular, se realizó un análisis transcripcional por RNA-seq en plantas con y sin nitrato al inicio del curso temporal. Al analizar si la expresión de genes del ciclo celular estaba siendo modificada por la presencia de nitrato, encontramos que el gen LGO (Loss of Giant cells from Organs) estaba diferencialmente expresado en respuesta a nitrato. Se ha reportado previamente que LGO es gen esencial para el proceso de expansión celular y endoreplicación en sépalos. LGO, sin embargo, no ha sido asociado a nitrato ni a la etapa de desarrollo en la que se ha realizado el presente trabajo. Análisis de citometría de flujo en las mutantes lgo-2 confirmaron que LGO es un gen esencial para los procesos de expansión celular y endoreplicación en respuesta a nitrato. Curiosamente, a pesar de que la mutante lgo-2 tiene menores niveles de ploidía y células considerablemente más pequeñas que en plantas silvestre, el tamaño del tejido vegetativo es igual entre ambos genotipos acorde a las concentraciones de nitrato. Con el fin de entender mejor la dinámica celular que ocurre en la mutante lgo-2 se realizó la misma aproximación de “live-imaging” pero ahora utilizando la mutante lgo-2 transformada con los reporteros para el seguimiento de la dinámica celular y nuclear. Observamos que en la mutante lgo-2 ocurre una compensación a través de proliferación celular para alcanzar el tamaño del tejido vegetativo acorde a la concentración de nitrato. En consecuencia, el tejido vegetativo alcanza un tamaño dependiendo del nitrato disponible, ya sea por expansión celular o por división celular como se observó en plantas silvestres y mutante respectivamente. El presente trabajo proporciona un punto de entrada hacia el mejor entendimiento del rol de nitrato en el control del tamaño del tejido aéreo, relación que no ha sido explorada hasta el momento. Entender como el tejido vegetativo responde a la disponibilidad nutricional de nitrato es de vital importancia para la producción agrícola y futuras aplicaciones biotecnológicas.