Specific isotope labeling of transthyretin for nuclear magnetic resonance and mass spectrometry studies — Marcaje isotópico específico de transtiretina para estudios en resonancia magnética nuclear y espectrometría de masas

Las proteínas son moléculas versátiles que juegan una variedad de roles en la mantención del cuerpo humano, tal como el transporte de nutrientes. La transtiretina (TTR) es una proteína homotetramérica de 55 kDa que se encuentra en el plasma humano y en el cerebro, la cual es responsable del transporte de retinol (vitamina A) y T4 (tiroxina). Sin embargo, probablemente no es necesaria para la vida, puesto que ratones knock out tienen un desarrollo fetal y longevidad normales. La transtiretina, al igual que otras 25 proteínas humanas, ha sido asociada a la deposición de agregados amiloides. Algunas investigaciones anteriores han mostrado que las mutaciones incrementan considerablemente la tendencia de la proteína a formar agregados. A pesar de esto, la proteína wild type (wt-TTR) también muestra la capacidad para agregarse. Esto genera la enfermedad llamada amiloidosis sistémica senil, la cual afecta a 20% de las personas sobre los 80 años de edad. Es sabido que la asociación entre subunidades monoméricas gatilla la enfermedad a través de la disociación del tetrámero, puesto que la estabilización de la estructura cuaternaria suprime la formación de agregados. Recientemente nuestro grupo descubrió que la wt-TTR purificada a 4°C es tan tóxica como los agregados de bajo peso molecular más tóxicos para células de neuroblastoma humanas, sin embargo no lo es cuando se purifica a temperatura ambiente (22°C; RT). Para nuestro asombro, esta actividad citotóxica era inducida por la proteína en su forma tetramérica. Estudios biofísicos revelaron un ligero reordenamiento de la estructura terciaria de la proteína. Es de especial interés si este pequeño cambio estructural puede conducir al descubrimiento de nuevos epítopes citotóxicos. En este trabajo exploramos la estructura proteica en más detalle mediante métodos biofísicos para confirmar la existencia de este cambio conformacional e intentar encontrar dónde específicamente ocurre en la estructura de la proteína. Expresamos wt-TTR recombinante en Escherichia coli y la purificamos mediante cromatografía de intercambio iónico y cromatografía por exclusión de tamaño a 4°C y a RT. Estudiamos la fluorescencia intrínseca de triptófano de la proteína tetramérica para confirmar que wt-TTR purificada y almacenada en frío tiene una menor barrera de activación para la disociación a monómeros comparado con la proteína purificada y almacenada a RT. Esto fue llevado a cabo mediante el desplegamiento de la estructura usando una alta concentración de urea (6,0 M) como agente caotrópico. También realizamos un experimento de intercambio isotópico de hidrógeno y deuterio con espectrometría de masas (HXMS) con el objetivo de estudiar el intercambio local de hidrógenos en los grupos amida del esqueleto polipeptídico, los cuales permiten medir el aumento/disminución de la protección de diferentes segmentos de la proteína en cuanto al intercambio, dependiendo de la temperatura. Por último, un experimento de resonancia magnética nuclear (NMR) llamado correlación heteronuclear de cuanto sencillo (HSQC), poniendo a prueba wt-TTR marcada con el isótopo 15N cultivada en un medio M9 con agua deuterada al ~99%, nos permitió seguir el espectro de acoplamiento-J bidimensional entre 15N-1H de la proteína. El análisis de los espectros bidimensionales obtenidos a ambas temperaturas reveló que algunos residuos experimentan un claro cambio en su desplazamiento químico, indicando que efectivamente ocurren cambios en la estructura terciaria de la proteína. En conclusión, determinamos que wt-TTR sufre un cambio conformacional cuando es purificada a 4°C, a pesar de que la localización específica de éste en la estructura proteica continúa siendo desconocida
 Proteins are versatile molecules that play a variety of roles in maintaining the human body, e.g. transport of nutrients. Transthyretin (TTR) is a 55 kDa homotetrameric protein found in human plasma and in the brain, responsible for the transport of retinol (vitamin A) and T4 (thyroxine). This protein is probably not essential for life, since TTR knockout mice have normal fetal development and lifespan. TTR, like 25 other human proteins, has been associated to the deposition of amyloid aggregates. Previous research has shown that mutations considerably increase the propensity of the protein to form aggregates. However, the wild type protein (wt-TTR) also exhibits this ability to aggregate, giving rise to the senile systemic amyloidosis disease that affects 20% people over 80 years of age. It is well accepted at the moment that self association of monomeric subunits triggers the disease through tetramer dissociation, since stabilization of the quaternary structure suppresses aggregate formation. Recently, our group discovered that wt-TTR purified at 4°C is just as toxic to human neuroblastoma cells as the most toxic small molecular weight aggregates, while when purified at room temperature (22°C; RT) it is not. Strikingly, this cytotoxicity was exhibited by the protein as a tetramer. Biophysical studies revealed a slight rearrangement of the tertiary structure of the protein. It is of high interest whether this minor structural change can lead to the discovery of new cytotoxic epitopes. Herein, we explored the protein structure in more detail by biophysical methods to confirm the existence of this conformational change and attempt to resolve where it specifically takes place in the protein structure. Recombinant wt-TTR was expressed in Escherichia coli and purified by ion exchange chromatography and size exclusion chromatography at 4°C and RT. We studied the tetramer’s intrinsic tryptophan fluorescence to confirm that cold purified and stored wt-TTR has a lower activation barrier for dissociation into monomers compared to the protein purified and stored at RT. This was performed by submitting the protein to unfolding using a high concentration of urea (6 M) as the chaotropic agent. We also carried out a hydrogen/deuterium isotope exchange mass spectrometry (HXMS) experiment in order to study the local exchange of backbone amide hydrogens, which serve as probes for increased/decreased protection of different segments of the protein towards exchange, depending on the temperature. At last, nuclear magnetic resonance spectroscopy using the heteronuclear single quantum coherence (HSQC) experiment probing a 15N isotope labeled wt-TTR grown in ~99% deuterated water M9 medium, allowed us to track the two dimensional 15N-1H J-coupling spectrum of the protein. Analysis of 2D spectra run at both temperatures revealed that some residues experience a clear change in chemical shift, indicating that changes in tertiary structure occurred. In conclusion, we determined that wt-TTR undergoes a conformational rearrangement when purified and stored at 4°C, although the exact location of this conformational change in the protein structure remains unclear