Regulación del metabolismo energético cardiaco por insulina y su relación con la fusión y fisión mitocondrial

Las mitocondrias corresponden a una red organelar altamente dinámica e interconectada, mantenida por eventos frecuentes de fisión y fusión. A través de estos procesos, las mitocondrias adoptan diferentes formas en respuesta a señales internas y externas, así como también presentan diferencias de distribución y forma en los diferentes tejidos de los seres pluricelulares. En las células mamíferas, las principales reguladoras del proceso de fusión mitocondrial, corresponden a la GTPasa Mitofusina (Mfn) y la proteína de la atrofia óptica-1 (Opa-1). Aunque la disrupción de la expresión de cualquiera de ellas, disminuye la función mitocondrial, aún no está claro si la regulación fisiológica del metabolismo involucra directamente cambios en la dinámica de este organelo. Los cardiomiocitos corresponden a la unidad funcional básica del corazón, los cuales para funcionar adecuadamente necesitan del aporte continuo y elevado de sustratos metabólicos en la forma de ácidos grasos libres (AGL), glucosa y oxígeno. En el corazón, la insulina regula el ingreso de glucosa al compartimento intracelular, la velocidad de la glicólisis, la síntesis del glicógeno, así como el crecimiento, contractibilidad y sobrevida de los cardiomiocitos. Sus acciones metabólicas son mediadas por la activación del receptor de insulina (RI) y una serie de otras proteínas de señalización río abajo, entre las que se incluyen a la familia de las proteínas sustrato del receptor de insulina (IRS-1 e IRS-2), la proteína fosfatidilinositol 3-kinasa (PI3-K) y la proteína serina/treonina kinasa Akt. Dado el papel crítico de insulina en el control metabólico y energético del corazón, el principal objetivo de este trabajo consistió en investigar si insulina modifica el metabolismo mitocondrial a través de la regulación de la dinámica. Trabajos recientes han mostrado alteraciones de la maquinaria proteica reguladora de estos procesos en pacientes obesos e insulino-resistentes, haciendo relevante el estudio de la señalización de insulina y su implicancia en la regulación de la morfología mitocondrial. Para probar esta hipótesis, cultivos primarios de cardiomiocitos de rata neonata se trataron con insulina 10 nM por 0 – 24 h y se incubaron con la sonda Mitotracker Green en los últimos 30 min de exposición a la hormona. Posteriormente, las células se visualizaron en un microcopio confocal, la red mitocondrial se reconstruyó tridimensionalmente a partir de las imágenes obtenidas, determinándose el número y volumen promedio de las mitoncondrias. Los resultados muestran que insulina indujo fusión de la red mitocondrial a las 3 h de tratamiento, lo cual se evidenció por un aumento del volumen mitocondrial promedio (+156%; p<0,001) y una disminución del número de mitocondrias por célula (-60%; p<0,001). Al mismo tiempo, estos cambios, se asociaron a un aumento en los niveles de la proteína Opa-1 (+3,7±1,5; p<0,05) y su colocalización efectiva con Mfn2. Por medio de microscopía electrónica también se observó la aparición de mitocondrias de gran tamaño en el mismo tiempo descrito anteriormente. Sin embargo, bajo estas mismas condiciones experimentales, tanto los niveles de Mfn2 y de la proteína constitutiva mitocondrial mtHsp70 no se modificaron en relación a los controles. Con respecto a la regulación del metabolismo energético, insulina aumentó el potencial de la membrana mitocondrial (+21%; p<0,05), los niveles intracelulares de ATP (+28%; p<0,001) y la respiración celular (+19%; p<0,01). Paralelamente, la transducción de los cardiomiocitos con un adenovirus que codifica para un antisentido contra Mfn2 o un micro RNA dirigido a Opa-1 previno todos los incrementos metabólicos y morfológicos inducidos por insulina antes descritos. Para confirmar si estos resultados también ocurrían en un modelo in vivo, ratones silvestres C57BL6 se sometieron a un clamp euglicémico - hiperinsulinémico por 2 h, extrayéndose los corazones al término del experimento. Insulina aumentó los niveles totales de Opa-1 en el tejido cardiaco (1,8 veces; p<0,001) respecto a los controles así como la respiración (+38; p<0,05) y síntesis de ATP (+50%; p<0,05) en fibras cardiacas aisladas. Finalmente, el tratamiento previo de cardiomiocitos con inhibidores generales de la vía transduccional RI/PI3-K/Akt y del inhibidor específico del complejo mTORc1, rapamicina, previno la fusión mitocondrial inducida por insulina, Este último inhibidor también previno los incrementos en el metabolismo energético y en los niveles de Opa-1, sugiriendo un papel clave del complejo mTORc1 en la señalización río abajo activada insulina, en el control de la dinámica mitocondrial. En conclusión, estos antecedentes colectivamente indican que insulina regula el metabolismo energético en el cardiomiocito a través de un mecanismo dependiente de la fusión mitocondrial y de la vía transduccional Akt/mTORc1.
 Mitochondria exist as a dynamic network of interconnected organelles that undergo frequent fission and fusion events. Through these processes mitochondria may adopt different shapes in response to internal and external signals and also display particular morphologies and distributions in the many different cell types of higher eukaryotes. In mammalian cells, the main regulators of mitochondrial fusion are the dynamin-related GTPase mitofusin (Mfn) and optic atrophy protein 1 (Opa- 1). Although a disruption in the expression of these proteins impairs mitochondrial function, it is not clear if the physiological regulation of mitochondrial metabolism directly involves changes in mitochondrial dynamics. Cardiomyocytes are the basic functional unit of the heart and in order to function properly, they require a constantly high supply of metabolic substrates in the form of free fatty acids (FFA), glucose and oxygen. In the heart, insulin regulates glucose transport inside the cell, glycolysis rate, glycogen synthesis, growth, cardiomyocyte contractility and survival. The metabolic actions of insulin are mediated through the activation of the insulin receptor (IR) and a series of downstream associated proteins, including the insulin receptor substrate family proteins (IRS-1 and IRS-2), the phosphoinositide 3-kinase (PI3-K) and the serine/threonine kinase Akt. Given the critical role of insulin in the metabolic and energetic control of heart, the goal of this study was to determine if insulin regulates mitochondrial metabolism affecting mitochondrial dynamics. Previous work from other groups had shown that obese and insulin-resistant patients have alterations in the protein machinery of mitochondrial dynamics, further implying insulin signaling in the control of mitochondrial morphology. To prove our hypothesis, cultured rat neonatal ventricular cardiomyocytes were treated with 10 nM of insulin for 0 - 24 h and three-dimensional images of cells were obtained using the mitochondrial dye Mitotracker Green and confocal microscopy. Three hours of insulin treatment promoted mitochondrial fusion as evidenced by an increase in the mean mitochondrial volume (+156%; p<0.001) and a reduction in the mitochondrial number (-60%; p<0.001). These changes were associated with both an increase in the levels of Opa-1 protein (+3.7±1.5; p<0.05) and in its effective colocalization with the protein Mfn2. By means of electronic microscopy we also observed the apparition of giant mitochondria at 3 hours of treatment. However, at these same conditions, we did not find any change in the total levels of Mfn2 or in the constitutive mitochondrial protein, mtHsp70, ruling out mitochondrial biogenesis or degradative processes. Regarding the control of metabolism, the treatment with insulin increased mitochondrial membrane potential (+21%; p<0.05), intracellular levels of ATP (+28%; p<0.001) and oxygen consumption rate (+19%; p<0.01). Transduction of cardiomyocytes with an adenovirus harboring an antisense Mfn2 oligonucleotide or a micro RNA against Opa-1 prevented all the insulin-induced changes in mitochondrial morphology and function. To confirm that these changes also occur in an in vivo model, C57BL6 mice were subjected to hyperinsulinemic-euglycemic clamps for 2 h, at the end of which, hearts were harvested. Relative to controls, insulin increased the total levels of Opa-1 protein by 1.8±0.1- fold; (p<0.001), the ADP-stimulated respiration rate (+38; p<0.05) and ATP synthesis (+50%; p<0.05) evaluated in saponin-permeabilized fibers. Finally, the pre-treatment of cardiomyocytes with general inhibitors of the insulin transduction pathway RI/PI3- K/Akt avoided the insulin induced fusion, while rapamycin, a specific inhibitor of the mTORc1 protein, inhibited fusion and also also prevented the metabolic boost and the Opa-1 protein increase observed after insulin treatment, suggesting an active role for mTORc1, downstream the canonical insulin route in the control of mitochondrial dynamics. These data indicate for first time that insulin acutely regulates mitochondrial metabolism through a mechanism that is dependent upon increased mitochondrial fusion.