Evaluación de la actividad estrogénica de un extracto de planta medicinal endémica en útero de rata pre-púber y de su toxicidad oral aguda en ratas adultas

La administración de 17-β estradiol (E2) vía subcutánea desencadena una serie de conocidas respuestas estrogénicas a nivel uterino, clasificadas como tempranas y tardías. Estas respuestas también han sido observadas tras la administración de ciertos compuestos polifenólicos, conocidos como fitoestrógenos (FE), los cuales pueden actuar como agonistas, antagonistas o moduladores selectivos de receptores estrogénicos. Los FE se encuentran en grandes cantidades en especies vegetales como Glicine max (poroto de soja) y trébol rojo. Por otra parte, muchas especies vegetales de nuestro país han sido usadas durante siglos por los pueblos originarios de Chile con propósitos medicinales. Por lo anterior, el análisis de estas plantas y de sus componentes, es una estrategia atractiva en la búsqueda de nuevos principios activos. Una planta del sur de nuestro país fue seleccionada debido a los antecedentes de su uso folklórico en la interrupción del embarazo o como reguladora del ciclo menstrual (emenagogo), siendo ambos efectos estrogénicos alcanzados a diferentes dosis. Se obtuvo un extracto etanólico de esta planta y cuatro fracciones utilizando solventes de distintas polaridades. Una de esas fracciones fue escogida debido a su gran actividad en estudios preliminares y se designó como la fracción polar 185a4. La fracción 185a4 fue usada para llevar a cabo varios estudios in vivo en útero de rata pre-púber, en los cuales se evaluaron respuestas estrogénicas tempranas, tales como edema y eosinofilia. Se dispuso cuatro grupos de ratas (n=20) de 21 días de edad, que recibieron uno de los siguientes tratamientos vía sc.: 1.- vehículo (control negativo); 2.- estradiol 300 g/k de peso (control positivo); 3.- fracción 185a4; 4.- fracción 185a4 seguido una hora más tarde de E2; Se analizaron las respuestas a 6 y 24 horas post tratamiento. A 24 horas de administrada la fracción, se observó la presencia de edema y eosinofilia en el tejido uterino. Además, se observó un efecto antagonista en ambas respuestas a las 6 h. y sinergia en la respuesta edematosa a las 24 h. post administración del tratamiento combinado. También se evaluaron respuestas estrogénicas tardías, tales como mitosis e hipertrofia celular. No se observó hipertrofia como efecto de la fracción, pero se evidenció un significativo aumento de las mitosis en ambos tiempos, siendo la respuesta mitótica a 24 h. significativamente menor a la inducida por E2. No se observaron efectosantagónicos sobre ambas respuestas a 6 ni a 24 h tras la administración del tratamiento combinado. Adicionalmente se realizó la caracterización química del extracto 185a. De acuerdo con nuestros resultados, la presencia de FE incluyendo genisteína, daidzeína, biochanina A y formononetina fue descartada; Por el contrario, la presencia de kaempferol y apigenina fue confirmada. Finalmente, se realizó un test toxicológico en ratas adultas usando una dosis oral aguda de 5g/kg de peso corporal de rata. Durante el período de observación (14 días) posterior a la administración del extracto no se identificaron signos de toxicidad como pérdida de peso corporal, diarrea, irritación de las mucosas o hemorragias. Los análisis histopatológicos de hígado, riñón y cerebro confirmaron que el extracto de la planta no presenta efectos tóxicos a las dosis ensayadas. Dado lo anterior, podemos inferir que el extracto 185a4 posee actividad estrogénica, la que se expresa a través de las respuestas antes descritas para E2 y que su dosis tóxica en ratas es superior a 5g/kg de peso corporal
 The administration of 17-β estradiol (E2) subcutaneously triggers a series of well known estrogenic responses both early and late in the uterus. Such responses have also been observed after administration of certain polyphenolic compounds known as phytoestrogens (PE), which can act as agonists, antagonists or as selective estrogen receptor modulators (SERMS). PE are founded in large quantities in plant products such as Glycine max (soybean) and red clover. Due to the above, the analysis of plant species from our country, many of which have been used for centuries for medicinal purposes by native people of Chile, is an attractive strategy to search new drugs. A plant from the south of our country was selected because of the history of its folk use to induce abortion or as menstrual cycle regulator (emmenagogue), being both effects attributed to estrogen at different doses. An ethanolic plant extract was obtained and furthermore, four fractions with different solvent polarities were obtained. One of these fractions was chosen because of its greater activity in preliminary studies and was labeled as the polar fraction 185a4. Fraction 185a4 was used to perform several in vivo studies in pre-puberal rat uterus, where early estrogenic responses, like eosinophilia and edema were evaluated: Twenty rats 21 years old were randomly assigned to one of the four treatment groups: 1.- Vehicle (negative control); 2.-E2 (300 g/k) positive control); 3.- 185a4 fraction; 4.- 185a4 fraction and one hour after, E2; All treatments were administered sc. Responses were evaluated at 6 and 24 hours after treatment administration. A significant eosinophilia and edema were observed only at 24 hours after fraction administration. An antagonic effect in both responses at 6 hours and a synergic response only for edema at 24 hours were detected after combined treatment administration. Late estrogenic responses were also evaluated, like uterine mitosis and cell hypertrophy. No effect of the fraction over cell hypertrophy but a significant mitotic effect were observed at both times, being the mitotic response at 24 hours lower than E2 induced. No antagonic effects over both responses were observed at 6 or 24 hours after combined treatment administration. Further, a chemical characterization of the 185a extract was performed. According to our results, the presence of PE including genistein, daidzein, biochanin A and formononetine was discarded; by contrary, the presence of kaempferol and apigenin was confirmed. Finally, a toxicity test in adult rats was carried out using a 5g/kg of body weight as acute oral dose. No toxicity signs such as loose of body weight, diarrhea, mucose irritation or bleeding were detected during the observation period (14 days) after extract administration. Histopathological analysis of liver, kidney and brain confirmed that plant extract has no toxic effect at the assayed dose. We concluded that fraction 185a4 exert estrogenic activity in pre-puberal rat uterus such as eosinophilia, edema and induces uterine mitose, all responses atributed to E2 and the extract is not toxic at dose of 5 g/kg body weight of rats