Estudio de la secreción de Tax, su interacción con Calreticulina y sSEMA-4D en linfocitos infectados con HTLV-I y su efecto sobre las actividades quinásicas y fosfatásicas en células PC12 durante su diferenciación a tipo neuronal

El HTLV-I (Virus Linfotrópico humano Tipo I) puede causar dos enfermedades, la Mielopatía asociada al HTLV-I/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP), una axonopatía neurodegenerativa central donde existe falla en el transporte axonal y la Leucemia de células T del adulto (ATL), una neoplasia agresiva. El HTLV-I infecta principalmente linfocitos T CD4+. No se ha detectado infección por HTLV-I en neuronas, desconociéndose el mecanismo por medio del cual se produce la neurodegeneración en HAM/TSP. Algunos productos virales secretados por linfocitos infectados infiltrados en el sistema nervioso central podrían afectar vías intracelulares relacionadas con el citoesqueleto axonal, produciendo el daño evidenciado en pacientes HAM/TSP. Los productos secretados por células MT2 (linfocitos infectados con HTLV-I) disminuyen la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12 durante su diferenciación a tipo neuronal. Entre las proteínas virales secretadas se encuentra Tax, que se ha asociado fuertemente al desarrollo de HAM/TSP. La disminución de la velocidad de crecimiento neurítico en células PC12 podría estar mediada por Tax, o bien por otras proteínas secretadas por estos linfocitos como sSEMA-4D (Semaforina 4D soluble) la cual participa como guía axonal negativo pudiendo producir detención del crecimiento neurítico. Esta proteína soluble es generada por medio de proteólisis de SEMA-4D unida a la membrana plasmática por metaloproteinasas de matriz (MMPs). En linfocitos infectados con HTLV-I existe un desbalance entre las actividades de MMPs y sus inhibidores tisulares lo que podría provocar mayor cantidad de sSEMA-4D, causando así detención del crecimiento axonal. Además, Tax interacciona intracelularmente con la chaperona de retículo endoplásmico Calreticulina (CRT) en linfocitos infectados, pero se desconoce si esta interacción se mantiene una vez que Tax es secretada. En esta tesis se propuso que “La proteína Tax secretada desde linfocitos infectados con HTLV-I, complejada con Calreticulina y/o SEMA-4D soluble, produce disminución del largo neurítico durante la diferenciación a tipo neuronal de células PC12 asociado al aumento de la actividad quinásica (CDK5 y GSK3ß) y disminución de la fosfatásica (PP2A)”. Los objetivos planteados incluyeron estudiar: a) el mecanismo de secreción de Tax y CRT; b) si había interacción extracelular entre Tax, CRT y sSEMA-4D; c) el efecto de Tax, CRT y sSEMA-4D sobre el proceso de diferenciación neuronal de la línea PC12 y d) si en células PC12 se producían cambios en las actividades quinásicas de GSK3ß y CDK5, y fosfatásica de PP2A por acción de productos secretados por linfocitos infectados con HTLV-I. Los resultados mostraron que en células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de pacientes HAM/TSP existe una correlación positiva entre las cantidades de Tax y CRT secretadas determinadas por Western-blot, siendo esta secreción dependiente de la vía retículo endoplásmico-aparato de Golgi. Por otra parte, efectivamente se identificó la interacción de Tax tanto con sSEMA-4D como con CRT en medios de cultivo de PBMCs de pacientes HAM/TSP. Mediante el bloqueo de Tax, sSEMA-4D y CRT con anticuerpos se demostró la participación extracelular de Tax y sSEMA-4D, probablemente actuando como un complejo, pero no de CRT en la disminución del largo neurítico en células PC12 cultivadas con medios condicionados de linfocitos infectados con HTLV-I (medio condicionado de células MT2). Respecto a las actividades quinásicas y fosfatásicas, se encontró que en células PC12 cultivadas con medios condicionados de células MT2 la actividad de GSK3ß no se altera, en cambio la de CDK5 disminuye, observándose también una menor proporción de PP2A fosforilada en Y307 (fosforilación inactivante), lo que sugiere una mayor actividad fosfatásica. Esto concuerda con la menor fosforilación en el residuo T181 de Tau, sustrato tanto de CDK5 como de PP2A. Aunque los resultados encontrados no apoyan la hipótesis planteada, la disminución de la actividad de CDK5 y la probable mayor actividad fosfatásica PP2A también pueden estar asociadas con la disminución en el largo neurítico en células PC12 producido por productos secretados por linfocitos infectados con HTLV-I. Este efecto podría ser mediado por sSEMA-4D y Tax que interaccionan, abriendo la posibilidad de que estén actuando como complejo sobre los receptores Plexinas (receptores de semaforinas) que están directamente relacionados con colapso del cono de crecimiento axonal, dando luces sobre cómo el HTLV-I podría producir paraparesia en pacientes infectados.
 The HTLV-I (Human T-cell Lymphotropic Virus Type-I) may cause two diseases, the HTLV-I Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP), a neurodegenerative central axonopathy with axonal transport failure, and the Adult T-cell Leukemia (ATL), an aggressive neoplasia. HTLV-I infects mainly CD4+ T lymphocytes. No evidence of neuron infection with HTLV-I has been detected, therefore the molecular mechanisms associated with the neurodegeneration in HAM/TSP remain unclear. Viral products secreted from infected lymphocytes infiltrated in the central nervous system may affect intracellular pathways related with axonal cytoskeleton producing damage in HAM/TSP patients. Secreted products from MT2 cells (lymphocytes infected with HTLV-I) decrease the rate of neurite growth of PC12 cells at the third day of differentiation to neuronal type. The viral protein Tax is strongly associated with HAM/TSP progression. The decrease in neuritic length of PC12 cells could be mediated either by Tax or by other proteins secreted from these lymphocytes, for example sSEMA-4D (soluble Semaphorin 4D) that serves as negative axonal guide being capable of producing detention of the axonal outgrowth. This soluble protein is generated by the proteolytic release of the membrane-bound SEMA-4D by Matrix Metaloproteinases (MMPs). In HTLV-I infected lymphocytes there is an imbalance in the activities of MMPs and their tissular inhibitors that could produce a large extent of sSEMA-4D, causing detention of the axonal outgrowth. Also, Tax interacts with the endoplasmic reticulum chaperone Calreticulin (CRT) in infected lymphocytes, although it is unknown if this interaction is maintained once Tax is secreted. In this Thesis we proposed that “Secreted Tax protein from HTLV-I infected lymphocytes, complexed with Calreticulin and/or soluble SEMA-4D, reduces the neuritic length during PC12 differentiation to neuronal type, associated with an increase of kinase activities (CDK5, GSK3β) and a decrease in phosphatase activity (PP2A)”. The objectives include to study: a) the mechanism of Tax and CRT secretion; b) the existence of extracellular interaction between Tax, CRT and sSEMA-4D; c) the effect of Tax, CRT and sSEMA-4D on the neuronal differentiation process of PC12 cell line, and d) whether extracellular Tax produces in PC12 cells changes in activities of the kinases CDK5 and GSK3β, and the phosphatase PP2A. The results showed a positive correlation between secreted Tax and CRT amounts determined by Western-blot in Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) of HAM/TSP patients. This secretion was dependent of the Endoplasmic Reticulum–Golgi Apparatus pathway. We identified interaction of Tax with both sSEMA-4D and CRT in the culture medium of PBMCs from HAM/TSP patients. Antibody-mediated blocking demonstrated the participation of both Tax and sSEMA-4D in neurite length decrease of PC12 cells cultured with conditioned media of HTLV-I infected lymphocytes (MT2 cells conditioned media). Respect to kinase and phosphatase activity participation, we determined that in PC12 cells cultured with MT2 conditioned media, GSK3ß activity was not altered, while that of CDK5 was diminished, finding also a lower ratio of phosphorylated PP2A at Y307 (inactivating phosphorylation) that suggests an increase in its phosphatase activity. These results agree with the lower phosphorylation at T181 of Tau, substrate of both CDK5 and PP2A. Although these results do not support the proposed hypothesis, the reduction on CDK5 activity and higher phosphatase activity also may be involved with the reduction of PC12 neuritic length in response to products secreted by HTLV-I infected lymphocytes. This effect could be mediated by the participation of sSEMA-4D and Tax. In consideration of the identified interaction between them, the results open the possibility that they are acting together as a complex on Plexin receptors (Semaphorin receptors) giving us new insights about the mechanism by which the HTLV-I produces HAM/TSP in infected patients.