Papel de CoREST durante el desarrollo de la corteza cerebral in vivo

En la neocorteza de mamíferos, la transición de progenitores neurales a neuronas de proyección y la mantención de la identidad neuronal recaen en la combinación de programas genéticos y epigenéticos que modulan eventos celulares como salida del ciclo celular, migración y diferenciación en neuronas funcionales. Estudios in vitro e in silico han mostrado que CoREST (REST Corepressor-1) es un factor importante en la coordinación de cambios de la estructura de la cromatina y actividad de genes durante la neurogénesis. CoREST es un componente fundamental de complejos de represión transcripcional y contribuye al ensamblaje de la maquinaria de remodelamiento de la cromatina en genes asociados con la identidad celular de progenitores neuronales y con la adquisición del fenotipo celular apropiado. CoREST puede formar complejos con diferentes proteínas como REST/NRSF, Nurr1, Tlx, Hsf1 y Znf198 (entre otras). Ejerce su función a través de enzimas que introducen modificaciones post traduccionales en las histonas, tales como la demetilasa de histonas específica de lisinas, LSD1 y las histonas desacetilasas, HDAC 1/2. Sin embargo, no existían estudios asociados al papel de CoREST sobre la neurogénesis durante el desarrollo. En esta tesis, se realiza un análisis de la función in vivo de CoREST. Estudios de inmunofluorescencia revelaron que CoREST está ampliamente expresado en la corteza cerebral durante el desarrollo y en etapas postnatales. Se utilizó la estrategia de electroporación in utero para introducir plasmidios que codifican horquillas cortas de RNA (shRNA) contra CoREST y así disminuir su expresión en progenitores neuronales localizados en la zona ventricular telencefálica. Esta aproximación reveló que la disminución de CoREST produce una alteración en la migración radial neuronal y a la vez cambios en la morfología. La inmunodetección de proteínas asociadas con distintos estadios de diferenciación celular no evidenció alteraciones en la adquisición del fenotipo neuronal (neuronas Tuj1+ y Vglut+), ni cambios significativos sobre la proliferación o sobrevida celular. En contraste, se observó un aumento en la proporción de progenitores neuronales Sox2+ y Tbr2+. Para profundizar en estos hallazgos, se realizaron experimentos de rescate utilizando variantes truncadas de CoREST para explorar cual dominio era relevante para recuperar la posición normal de las neuronas en la corteza. En estos experimentos el shRNA contra CoREST fue co-electroporado con el vector que codifica cada versión truncada de CoREST. La pérdida de función de CoREST fue revertida por una construcción desprovista del dominio de interacción con REST/NRSF (región N-terminal). Al mismo tiempo, la disminución en la expresión de REST/NRSF no generó perturbaciones significativas del desarrollo de las neuronas de projección. Por otra parte, la variante de CoREST carente del dominio de interacción con LSD1 (región C-terminal) no rescató el defecto en el posicionamiento neuronal causado por la disminución de CoREST. En estas condiciones experimentales, los datos presentados muestran que la función de CoREST en asociación con LSD1, pero no con REST/NRSF es requerida durante la ejecución del programa de desarrollo de las neuronas de projección.
 In the developing mammalian neocortex, the transition from proliferating neural progenitors to projection neurons and the maintenance of neuronal identity relies on genetic and epigenetic programs that combine to establish the cell cycle exit, migration and differentiation into mature neurons. The in vitro evidence and biochemical data show that a key factor in the coordination of changes of chromatin structure and gene activity during neurogenesis is REST Corepressor-1 (CoREST). CoREST is a component of transcriptional repression complexes, contributing to the assembly of chromatin remodeling machinery at genes related with neural progenitors identity and cell fate decisions. CoREST can form complexes with different partners as REST/NRSF, Nurr1, Tlx, HSF1 and Znf198, and exerts its function through chromatin modifying enzymes, such as HDAC1/2 and LSD1. However, to date, no data had reported an effect of CoREST on neurogenesis during embryonic development. Here, the first functional in-vivo study of CoREST, it was detected that CoREST is widely expressed in the cerebral cortex during development and adulthood. It was used in utero electroporation of short hairpin RNA (shRNA) constructs into neuronal progenitors located in the cortical ventricular zone to knockdown CoREST. This approach revealed that radial migration of CoREST-deficient neurons is altered as well as their morphology. The neuronal identity of CoREST-knocked-down cells was unchanged (Tuj1+, Vglut+). By contrast, it was observed an increase of Sox2+ and Tbr2+ neural progenitor proportion without noticeable effect on cell proliferation and cell survival. To extend these findings, it was performed rescue experiments to examine the ability of distinct CoREST truncated versions to recover the normal neuronal position into the cortex. In these experiments, the plasmids encoding the CoREST truncated versions were co-electroporated with the shRNA vector targeting CoREST. CoREST loss of function was rescued by a construct lacking the characterized domain of interaction with REST/NRSF (N-terminal region). In addition, the loss of expression of REST/NRSF did not associate to significant perturbations of projection neuron development. On the other hand, CoREST truncated form which lacks the LSD1 interacting domain (C-terminal region) failed to rescue the migratory defects caused by CoREST knockdown. Under this experimental approach, the data presented here show that CoREST function in association with LSD1, but not with REST/NRSF is required for the expression of the physiological developmental program of projection neurons.