Disfunción mitocondrial en la enfermedad de Niemann-Pick tipo C : contribución del aumento de colesterol mitocondrial mediado por MLN64.

La enfermedad de Niemann-Pick tipo C (NPC) se caracteriza por la acumulación lisosomal de colesterol, presencia de estrés oxidativo y muerte celular. Los tejidos más afectados son el cerebro y el hígado. Hasta la fecha, no se ha determinado el o los mecanismos que producen la muerte celular en estos tejidos. Para tratar de entender estos mecanismos y dado que se ha demostrado la contribución del daño mitocondrial en otras enfermedades neurodegenerativas y con daño hepático nosotros proponemos estudiar el funcionamiento y la dinámica mitocondrial en modelos NPC y evaluar la contribución de la disfunción mitocondrial en el daño celular observado en la enfermedad. Las mitocondrias son esenciales para la integridad celular, por lo que su dinámica está estrechamente regulada. La dinámica mitocondrial abarca procesos de fusión, fisión, biogénesis y autofagia. En las células NPC se ha observado que existe un mayor contenido de colesterol en la membrana mitocondrial y que procesos importantes de la mitocondria están alterados, como la síntesis de ATP y la entrada de GSH a la mitocondria. Se ha descrito además alteraciones en la morfología mitocondrial en tejidos NPC. Nuestra hipótesis es que el aumento de colesterol en la membrana mitocondrial produce disfunción mitocondrial en las células NPC. Además proponemos que la proteína MLN64 mediaría el transporte de colesterol a las mitocondrias en células NPC. En conjunto estas alteraciones convergerían en una reducción en la producción de energía, aumento en la producción de ROS y en la demanda de energía de las células NPC.El objetivo principal de este trabajo es evaluar si el aumento de colesterol, mediado por la proteína MLN64, contribuye a la disfunción mitocondrial y su relevancia en la patogenia de la enfermedad NPC. Para evaluar esto en diferentes modelos modulamos los niveles de expresión de MLN64 y evaluamos la función mitocondrial en diferentes modelos celulares y en tejidos del ratón Npc1-/-. Para mejorar la función mitocondrial en células NPC y ratones Npc1-/- usamos GSH-EE como antioxidante y Piracetam, una droga que estimula la producción de ATP. Nuestros resultados muestran, en diferentes modelos celulares NPC, disminución en el potencial de membrana, aumento de la producción de superóxido mitocondrial, disminución de GSH y alteraciones en la morfología mitocondrial en comparación con las células control. Las alteraciones en la morfología se relacionaron con disminución y aumento en los niveles de la proteína de fusión MFN2 y a de la proteína de fisión FIS1, respectivamente. En el hígado de ratones Npc1-/- encontramos disminución en la actividad de la ATPasa lo que se relacionó con un aumento significativo en el contenido de colesterol mitocondrial.El tratamiento con Piracetam previno la pérdida del PMM y el aumento de producción de superóxido mitocondrial en células tratadas con U18, pero en ratones Npc1-/- no tuvo efectos positivos. El tratamiento con GSH-EE previno la pérdida de peso en ratones Npc1-/- hasta las 8 semanas. Sin embargo, no tuvo efectos positivos en el comportamiento locomotor y en la sobrevida. Las células NPC y el hígado del ratón Npc1-/- presentaron aumento de la expresión de MLN64. Al disminuir los niveles de MLN64 en células NPC se previno la pérdida del potencial de membrana y disminuyeron los niveles de ROS mitocondrial. En el hígado de los ratones Npc1-/- la disminución de MLN64 provocó disminución del contenido de colesterol libre total y sorprendentemente un aumento en el contenido de colesterol mitocondrial. Por otra parte, en las células que sobreexpresan MLN64 encontramos alteraciones en la función mitocondrial y cambios en la morfología mitocondrial, estos últimos, asociados a disminución en la expresión de MFN2. La sobreexpresión de MLN64 en hígado de ratones produjo un aumento significativo en los niveles de colesterol mitocondrial, disminución en la actividad de la ATPasa, alteraciones en el consumo de oxígeno, disminución en el contenido de GSH mitocondrial y disminución de MFN2.Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que existen alteraciones en la función mitocondrial en la enfermedad NPC y sugieren que MLN64 estaría involucrado en estas alteraciones, ya que la sobreexpresión de MLN64, produce alteraciones en la función y dinámica mitocondrial similares a las observadas en modelos NPC. En este trabajo por primera vez se demostró que la expresión de MLN64 está aumentada en modelos NPC, lo que podría constituir un mecanismo patogénico en la enfermedad NPC. Los resultados obtenidos y antecedentes de la bibliografía sugieren que MLN64 participaría en la homeostasis celular del colesterol y favorecería la acumulación de colesterol en la mitocondria en la enfermedad NPC. La función de la proteína MLN64 no ha sido completamente dilucidada y no se puede descartar que MLN64 regule la función de otras proteínas transportadoras de colesterol que pueden favorecer el transporte de colesterol a la mitocondria. Las conclusiones de este trabajo es que en modelos NPC existen alteraciones en la función y en la morfología mitocondrial. Estas alteraciones estarían relacionadas a un aumento del contenido de colesterol mitocondrial mediado por MLN64 y a cambios en la expresión de proteínas reguladoras de los procesos de fusión y fisión mitocondrial. La importancia de este trabajo es que se demuestra que existe disfunción mitocondrial en la enfermedad de NPC y que esta disfunción podría estar relacionada al aumento de colesterol mitocondrial y al aumento de expresión de MLN64.