Mecanismos que controlan la entrada de calcio extracelular que se asocian a la respuesta de hiperpermeabilidad venular

Las células endoteliales constituyen una barrera de permeabilidad entre la sangre y el intersticio. Normalmente en las células endoteliales de los capilares ocurre el intercambio de gases y pequeñas moléculas, sin embargo, en la inflamación ocurre una hiperpermeabilidad a macromoléculas principalmente a nivel de células endoteliales de vénulas postcapilares. Agentes inflamatorios como Histamina o PAF producen la hiperpermeabilidad mediante el incremento en la concentración de calcio intracelular [Ca2+]i. El aumento de calcio (Ca2+) se produce por su liberación desde los reservorios intracelulares del retículo a través del aumento de IP3, pero esto no explica la mantención de la señal en el tiempo lo que sugiere que la entrada de Ca2+ desde el medio extracelular también participa activamente en este proceso. Dentro de los mecanismos propuestos están los hemicanales formados por conexina y canales de panexina, que podrían participar en la entrada directa de Ca2+ o de manera indirecta a través de la liberación de ATP y activación de receptores purinérgicos. Otro componente importante es la producción de óxido nítrico (NO), por la activación de la isoforma endotelial de la enzima óxido nítrico sintasa (eNOS). En ese contexto, se ha estudiado que el incremento de la hiperpermeabilidad por NO, ocurre a partir de la activación de la eNOS, y su subsecuente traslocación al citosol que conduce a la S-nitrosilación de proteínas componentes de las uniones adherentes. Por otro lado, también un mecanismo dependiente de voltaje podría participar en el aumento de Ca2+ asociado a la hiperpermeabilidad. Estudios en la red vascular de mejilla de hámster demostraron la participación de canales de calcio dependientes de voltaje (Cav) en el aumento de la hiperpermeabilidad. Si bien el trabajo no explica la apertura de estos canales Cav, podría ser a través de la participación de canales de sodio dependientes de voltaje (Nav), sin embargo, sólo se han descrito estos canales en vena safena mediante estudios electrofisiológicos, por lo tanto, se desconoce la participación de los canales Nav en hiperpermeabilidad. Hasta la fecha aún no se han integrado todos los componentes mencionados en un mecanismo que explique la hiperpermeabilidad en vénulas postcapilares, es así que la hipótesis de esta tesis propone que “el aumento de Ca2+ inducido por PAF es mediado por la activación de canales de Nav y una posterior activación de la eNOS. Esto incrementa la producción de NO, que a través de la snitrosilación de hemicanales formados por conexina y/o canales formados por panexina induce su apertura, permitiendo la entrada directa de Ca2+ o de manera indirecta a través de la liberación de ATP, lo cual permite la mantención de la respuesta a lo largo del tiempo.” Los objetivos generales son: 1) Evaluar si los hemicanales formados por conexinas y los canales de panexinas participan en el aumento de Ca2+ asociado a la hiperpermeabilidad inducida por PAF; 2) Evaluar si la producción de NO contribuye al aumento de Ca2+ inducido por PAF a través de la apertura de hemicanales de conexinas y canales de panexinas; 3) Evaluar si los canales de Na+ dependientes de voltaje (Nav) están involucrados en el aumento de Ca2+ inducido por PAF; 4) Evaluar la participación de hemicanales de conexina, canales de panexina y canales Nav en la respuesta de hiperpermeabilidad inducida por PAF. La estrategia experimental involucró la realización de cultivo selectivo de células endoteliales provenientes de vénulas postcapilares en mesenterio de rata donde se realizó medición de calcio intracelular, captación de colorante etidio en presencia y ausencia de inhibidores de conexinas, panexina 1, eNOS y canales Nav. También se midió la liberación de ATP, variación de potencial por electrofisiología en presencia y ausencia de inhibidores de canales Nav y la formación de poros en monocapa de este cultivo con Microscopía de Fuerza Atómica. También se realizó preparación de la red vascular intacta de mesenterio de rata y se realizó medición de captación de colorante etidio en presencia y ausencia de inhibidores de conexinas y panexina 1. Los resultados mostraron que PAF induce un incremento en la captación de etidio en vénulas intactas y en cultivos de células endoteliales de vénulas postcapilares, lo cual se asocia a un rápido incremento de la [Ca2+]i y a la formación de poros. Tanto la captación de etidio como el aumento de la [Ca 2+ ]i estimulado por PAF, se bloqueó al tratar con los péptidos inhibidores de conexinas 37,43Gap27 o 43Gap26 y el péptido inhibidor de panexina 1, 10Panx, sin embargo, el tratamiento con PPADS sólo atenuó parte del incremento de la [Ca2+]i y no afectó la captación de etidio, sugiriendo que es un evento posterior a la apertura de hemicanales formados por conexina o canales formados por panexina. PAF también produjo un incremento en la liberación de ATP, que fue inhibido al tratar con 43Gap26 o 10Panx y produjo la S-nitrosilación mediada por NO de conexina 43. Consistente con esto, el bloqueo de la producción de NO con LNA produjo una inhibición en la captación de etidio y en el aumento de la [Ca2+]i. Además, se observó que PAF produce la generación de espigas despolarizantes en el potencial de membrana de células endoteliales de vénulas postcapilares y que el tratamiento con TTX bloquea las señales despolarizantes y el aumento de la [Ca2+] i . Consistente con lo anterior, el tratamiento con Lamotrigina, un inhibidor de los canales Nav1.2, prácticamente abolió la respuesta de Ca2+ inducida por PAF. Finalmente, el tratamiento con 37,43Gap27 o TTX, bloqueó la formación de poros inducida por PAF. Los resultados de esta tesis sugieren que la estimulación de las células endoteliales de vénulas postcapilares con PAF aumenta la [Ca2+]i a través de la apertura de canales Nav1.2, activación de la enzima eNOS y producción de NO que lleva a la S-nitrosilación de la Cx43 y la apertura de hemicanales formados por esta conexina, y por otro mecanismo, la apertura de canales formados por Panx1, donde ambos componentes, permitirían la entrada directa de Ca2+ y de manera indirecta mediante la liberación de ATP con la subsecuente activación de receptores purinérgicos, este mecanismo permitiría la mantención de la respuesta de hiperpermeabilidad en el tiempo.