Regulación de la liberación de calcio en vesículas de retículo sarcoplasmático de músculo esquelético de conejo. Participación de Mg2+, estado redox y calsecuestrina

El canal de calcio/receptor de ryanodina permite que el calcio contenido en el retículo sarcoplasmático (RS) sea liberado hacia el mioplasma. Múltiples componentes celulares regulan la actividad de este canal de calcio, entre los que se distinguen: Ca 2+ , Mg 2+ , H + , ATP 2- , calcio luminal, agentes que reaccionan con grupos SH, entre otros. Por otra parte, existen evidencias que sugieren que calsecuestrina, una proteína del lumen del RS, estaría regulando la cinética de liberación de calcio. Originalmente, a esta proteína se le atribuyó un papel de tampón de calcio, lo que permite acumular grandes cantidades de este ion al interior del RS. Es importante establecer la cinética de disociación del calcio desde la calsecuestrina para investigar si es una etapa limitante de la liberación de calcio. En esta tesis se caracterizó la participación de Mg 2+ , de calsecuestrina y del estado redox de proteínas, en la cinética de liberación de calcio inducida por cafeína. Se utilizó una preparación de vesículas aisladas de RS de músculo esquelético de conejo y se midió la liberación de calcio siguiendo la señal de indicadores fluorescentes de calcio. Cafeína indujo liberación transitoria y parcial de calcio en el intervalo de [Mg 2+ ] libre 0,05 - 2,5 mM. En vesículas nativas, en [Mg 2+ ] 0,1 - 0,5 mM este primer evento de liberación fue seguido por oscilaciones de calcio. En ausencia de cafeína se observaron oscilaciones espontáneas de calcio. La magnitud y la duración del primer evento de liberación inducido por cafeína disminuyeron con el aumento de [Mg 2+ ]. Al oxidar las vesículas, aumentó la duración del primer evento de liberación en todas las concentraciones de Mg 2+ probadas. Lo inverso ocurrió al reducir las vesículas. El patrón oscilatorio también se modificó al tratar las vesículas con los reactivos redox. Se sabe que estos reactivos modifican la afinidad del sitio inhibitorio para Mg 2+ . Estos resultados indican que las vesículas de RS poseen todos los elementos requeridos para la generación de oscilaciones de calcio, que previamente habían sido observadas sólo en células y en fibras musculares. Además, los resultados indican que la liberación de calcio inducida por cafeína está directamente regulada por [Mg 2+ ] libre y que al modificar el(los) sitio(s) inhibitorio(s) para Mg 2+ , cambia marcadamente la respuesta a cafeína. En vesículas sin calsecuestrina disminuyó la cantidad de calcio acumulada tanto en forma pasiva como en forma activa. El calcio acumulado fue liberable por agonistas del canal de ryanodina. La liberación de calcio presentó una constante de velocidad de liberación menor que en vesículas control. También se redujo la duración de la liberación neta de calcio. No se observaron oscilaciones de calcio en vesículas sin calsecuestrina. Esta proteína fue fundamental no sólo para que las vesículas acumularan grandes cantidades de calcio sino que también para su posterior liberación con una cinética rápida acorde con las exigencias del músculo esquelético. Estudios cinéticos de la disociación del calcio unido a calsecuestrina indican que la disociación del calcio desde calsecuestrina en solución o asociada a membranas fue más rápida que los cambios de fluorescencia intrínseca asociados. Se utilizó una preparación de membranas de la zona de unión del RS al túbulo transversal. Estas membranas son denominadas JFM, del inglés j unctional f ace m embranes . En las JFM, la disociación de calcio y el cambio de fluorescencia intrínseca fueron más rápidos que en calsecuestrina en solución. El t 1/2 de la disociación de calcio en JFM fue de 6,5 mseg a 25 #C. Es probable que a 37 #C, la disociación de calcio sea aun más rápida. Estos resultados sugieren que la disociación de calcio desde calsecuestrina in vivo no es limitante de la velocidad de liberación de calcio desde el RS.