Estudio del Efecto de la Adición de Extremos Hidrofóbicos en la Expresión y Purificación por HIC de Xilanasas Recombinantes

En la producción de proteínas una de las etapas más importantes es la de purificación, por lo que muchos estudios se enfocan en modificar esta etapa de manera de mejorar la pureza de la proteína de interés. El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar el efecto de la adición de un extremo polipeptídico hidrofóbico corto (tag) a una xilanasa, en su producción, recuperación y purificación por Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para el estudio se escogieron 4 combinaciones de los aminoácidos tirosina (Y), triptófano (W) y prolina (P) para formar la secuencia del extremo, y se realizaron mutaciones en la proteína para adicionar esta secuencia en el extremo C terminal de la misma por medio de la técnica de Polymerase Chain Reaction (PCR). Se obtuvieron exitosamente las mutantes Xilanasa-(WP)2, Xilanasa-(YP)2Y, Xilanasa-Y3 y Xilanasa-(YP)3. Las cepas de la proteína modificada con estos extremos se crecieron e indujeron bajo condiciones definidas, y se les extrajo de la fracción periplasmática de la célula, se midió actividad enzimática y proteína total, y actividad específica. Para la cepa nativa y las mutantes, se observó una baja producción de proteína, como se indica en los resultados de proteína y actividad total. Debido a esto se sugiere hacer un estudio de las condiciones óptimas de crecimiento e inducción tanto para la proteína nativa como para las modificadas. En el caso de la xilanasa mutada con la secuencia (YP)3, se observó que en la fracción periplasmática obtuvo la menor cantidad de proteína total, pero la mayor actividad xilanolítica total, mientras que para el resto de las mutantes, se obtuvo una mayor actividad total en la fracción extracelular. Por esto, se recomienda hacer un estudio para analizar las causas de esta forma de expresión de la xilanasa en estudio. Las fracción periplasmática de la cepa nativa y las 4 cepas mutadas se analizó por HIC utilizando como matriz hidrofóbica Butil Sefarosa y se calculó gráficamente los tiempos de retención adimensional (DRT) de a cuerdo a la fracción en que eluyó la proteína en cada caso. Para la xilanasa nativa y las 4 mutadas se observó una tendencia similar en los cromatogramas, y los DRT presentaron un aumento porcentual promedio respecto de la xilanasa nativa de 46,17 % y 31,82 % para las mutantes Xilanasa-(WP)2 y Xilanasa-(YP)2Y respectivamente, mientras que para la Xilanasa-Y3 se observó una disminución de la hidrofobicidad en un 16,6 %. El aumento de los DRT coincide con la presencia de prolinas en el extremo adicionado, mientras que la disminución del mismo se observa en ausencia de este aminoácido. La Xilanasa-(YP)3 se excluyó del estudio de los DRT, debido a que no presentó actividad en medio sólido en las fracciones de la cromatografía, por lo que no se pudo determinar en qué fracción eluyó dicha proteína. Esto se debe probablemente a la baja cantidad de proteína presente en el periplasma de esta cepa. Se calculó la hidrofobicidad superficial de la xilanasa nativa, y el aporte de cada cola a ella. Sin embargo, para esto se utilizó un modelo de xilanasa cuya secuencia posee aproximadamente un 38% de parecido, por lo que no es confiable, y se recomienda buscar un modelo que tenga un mayo porcentaje de similitud con la proteína de trabajo o modelar la misma. Es posible concluir que el aumento de hidrofobicidad superficial de la proteína xilanasa debida a la adición de una secuencia corta de aminoácidos hidrofóbicos, permite un aumento del DRT de las proteínas para el caso de las extremos que contienen prolina como la (WP)2 e (YP)2Y. En el caso del extremo que no tiene prolina (Y3), se observa una disminución de los tiempos de retención adimensional, por lo que se recomienda continuar el estudio de extremos hidrofóbicas sin prolinas, para confirmar la importancia de la presencia de este aminoácido en la secuencia de estos extremos.