Effect of hypoxia in skeletal muscle fibrosis : regulation of CTGF/CCN2 expression by HIF-1α and TGF-β.

La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.La fibrosis es una condición recurrente en varias patologías asociadas al músculo esquelético entre ellas: la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD), diferentes patologías neuromusculares como la Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) o aquellas asociadas a denervación, y en daño crónico. La fibrosis muscular se caracteriza por la acumulación excesiva de proteínas de matriz extracelular (ECM), inflamación persistente, daño muscular y sobreexpresión de factores profibróticos. Entre estos últimos se encuentran; el factor de crecimiento transformante tipo β (TGF-β) y el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF/CCN2). Varios antecedentes muestran que músculos fibróticos también están asociados a un daño vascular. Resultados preliminares de nuestro laboratorio en modelos murinos que desarrollan fibrosis muestran una disminución en la cantidad de capilares que rodean las fibras musculares. En consecuencia, esto se asocia a una disminución en la perfusión sanguínea y por lo tanto a una disminución en la tensión de oxígeno en el tejido. Este fenómeno se define como hipoxia y lleva a la activación de mecanismos moleculares de respuesta que promueven la supervivencia celular y adaptación a bajas concentraciones de oxígeno. Sin embargo, la relación entre hipoxia y fibrosis no ha sido estudiada en el músculo esquelético. El factor transcripción inducible por hipoxia 1α (HIF-1α) es el regulador central de la respuesta molecular a hipoxia, mientras que CTGF/CCN2 es una proteína matricelular clave en la inducción de la fibrosis. Existe evidencia previa que vincula la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y específicamente HIF-1α, de manera opuesta en distintos tejidos. Sin embargo, no está descrito como hipoxia regula la expresión de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético. El objetivo de esta tesis es estudiar el mecanismo molecular y las vías de señalización involucradas en la regulación de la expresión de CTGF/CCN2 en respuesta a hipoxia y TGF-β en distintos tipos celulares que componen el músculo esquelético in vitro e in vivo. Para este análisis sometimos sistemáticamente fibroblastos, mioblastos y miotubos, de líneas celulares y cultivo primario, a condiciones de hipoxia en una cámara de cultivo con atmosfera controlada junto con estimulación con TGF-β. En primer lugar, encontramos que los tratamientos a distintos tiempos en atmosfera hipóxica no indujeron la expresión de CTGF/CCN2 en ninguno de los tipos celulares mencionados anteriormente. Interesantemente, encontramos que específicamente los miotubos sobreexpresan CTGF/CCN2 tras la activación conjunta de la ruta de señalización de hipoxia mediada por HIF-1α y TGF-β. Describimos que el efecto de ambas rutas sobre la expresión de CTGF/CCN2 es de tipo sinérgico, depende del factor de transcripción HIF-1α y requiere de las rutas de señalización no canónicas de TGF-β. Finalmente, probamos estos resultados in vivo utilizando 2 metodologías para activar la ruta señalización de hipoxia mediada por HIF-1α: mediante estabilizadores farmacológicos de HIF-1α y a través de isquemia por escisión de la arteria femoral. Combinamos estas metodologías con inyecciones intramusculares de TGF-β y logramos recapitular el efecto observado in vitro. Tras la activación farmacológica de HIF-1α y la inyección intramuscular de TGF-β observamos un efecto sinérgico en la expresión de CTGF/CCN2 y dicha expresión se encontró localizada en las fibras musculares in vivo. En base a esto postulamos que las fibras musculares son la principal fuente de CTGF/CCN2 en el músculo esquelético en respuesta a hipoxia y TGF-β; y contribuyen a la progresión de la patología fibrótica.