Genome-scale reconstruction of the metabolic network in Oenococcus oeni and its functional analysis in malolactic fermentation

Oenococcus oeni es el agente principal de la fermentación maloláctica en vinos, responsable de la descarboxilación del ácido L-málico a ácido L-láctico. Es un proceso clave en la vinificación, reduciendo la acidez y aportando complejidad aromática y estabilidad microbiológica, pero es errático e impredecible Pese a su rol crucial, el proceso no es aún entendido del todo. Para mejorar la comprensión de la bacteria y el proceso, se construyó y curó el primer modelo metabólico a escala genómica de O. oeni cepa PSU-1 (iSM454). Luego, se estudió su crecimiento bajo distintas condiciones de etanol, determinando la redistribución de los flujos metabólicos intracelulares, y, por último, se generó un modelo por homología de la enzima maloláctica. Los experimentos in silico revelaron que el modelo iSM454 predice los requerimientos nutricionales con una exactitud del 93%. Luego, éste se aplicó para determinar la energía de mantención no asociada a crecimiento. Los resultados mostraron que el O. oeni cultivado al 12% de concentración de etanol gastaba treinta veces más ATP para mantenerse vivo que en su ausencia. La mayor parte de este ATP era empleado en la extrusión de protones fuera de la célula. Los experimentos in vitro se llevaron a cabo en MaxOeno, un medio de cultivo definido y similar al vino, desarrollado y optimizado para el estudio. La integración de los datos experimentales con el modelo permitió determinar la redistribución de los flujos metabólicos intracelulares bajo diferentes condiciones de etanol (0 a 12% v/v). Se identificaron claramente cuatro fases de crecimiento durante el cultivo por lote de la cepa PSU-1 del O. Oeni, según el consumo de los ácidos málico y cítrico, la absorción de azúcares y aminoácidos, y las tasas de biosíntesis de productos metabólicos – biomasa, eritritol, manitol y ácido acético, entre otros. Se halló que, bajo condiciones de etanol crecientes, el O. oeni favorece reacciones anabólicas relacionadas con el mantenimiento celular, mientras los requerimientos de NAD(P)+ y ATP aumentan. Finalmente, se usó un modelo por homología de la enzima maloláctica y la técnica de quantum polarized ligand docking para describir el sitio de unión y ubicación del ácido L-málico (MAL) y sus estados desprotonados MAL- y MAL2-. MAL2- tuvo el más bajo ΔGbinding, seguido por MAL- y MAL, con valores de −23.8, −19.6 y −14.6 kJ/mol, respectivamente, consistente con los valores obtenidos en los ensayos de titulación de calorimetría isotérmica (ITC). Los resultados de dinámica molecular y de MM/GBSA sugieren que sólo el MAL2- exhibe una conformación abierta extendida en el sitio de unión, que cumple los requerimientos geométricos para la coordinación con Mn2+, componente crítico de la actividad de la enzima maloláctica. Se espera que iSM454 y el modelo de homología para la enzima maloláctica descritos aquí, provean herramientas únicas para comprender y predecir la compleción de la fermentación maloláctica en el vino por O. Oeni, así como los inconvenientes que el proceso puede eventualmente afrontar en cualquier condición físico-química particular.