Rondetafelgesprek

Ontwikkeling van proefdiervrije
onderzoeksmethoden
14 september 2017

vaste commissie voor economische zaken
uitsluitend bestemd voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek

Den Haag, 7 september 2017

Geachte leden,

Hierbij treft u, op volgorde van de in de convocatie genoemde genodigden, hun bijdragen aan
ten behoeve van het rondetafelgesprek over de ontwikkeling van proefdiervrije
onderzoeksmethoden op donderdag 14 september 2017 van 14.00 tot 17.00 uur.
De bijdragen vindt u ook op het tabblad agenda onder agendapunt ‘Position Papers’ in Parlis.
Van niet alle genodigden hebben wij tot op heden een bijdrage ontvangen. Indien wij deze
alsnog ontvangen, zullen deze alleen digitaal worden verspreid.

Met vriendelijke groet,

R. Konings,
Adjunct-griffier van de vaste commissie voor Economische Zaken

Deze reader is uitsluitend bestemd voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek.

Den Haag, 14 juli 2017

Voortouwcommissie:
Volgcommissie(s):

vaste commissie voor Economische Zaken

Activiteit:
Datum:
Tijd:
Openbaar/besloten:

Rondetafelgesprek
donderdag 14 september 2017
14.00 - 17.00 uur
openbaar

Onderwerp:

Ontwikkeling van proefdiervrije onderzoeksmethoden

Agendapunt:

RONDETAFELGESPREK OVER DE ONTWIKKELING VAN
PROEFDIERVRIJE ONDERZOEKSMETHODEN

Noot:

Blok 1 Wetenschap ten aanzien van de ontwikkeling van proefdiervrije
methoden (14.00 - 15.00 uur)
1. Han van de Sandt (research manager TNO)
2. Jan van der Valk (coördinator 3V-Centrum Utrecht Life Sciences)
3. Ingrid Geesink (coördinator Ziekte en Gezondheid Rathenau Instituut)
4. Peter van Meer (Universiteit Utrecht)
5. Aldert Piersma (reproductietoxicoloog RIVM en bijzonder hoogleraar IRAS
Universiteit Utrecht)
6. Wim de Leeuw (hoofd Instantie voor Dierenwelzijn Universiteit Utrecht)

vaste commissie voor Onderwijs, Cultuur en Wetenschap

Blok 2 Ngo’s (15.00 - 15.20 uur )
1. Marja Zuidgeest (directeur Proefdiervrij)
2. Elly von Jessen (dierenbescherming)
Pauze (15.20 - 15.30 uur)
Blok 3: Implementatie van proefdiervrije onderzoeksmethoden
(15.30 - 16.15 uur)
1. Han van de Sandt (research manager TNO)
2. Theo Vermeire (RIVM)
3. Herman Koëter (voorzitter Nationaal Comité advies
dierproevenbeleid)
4. Marie-Jeanne Schiffelers (senior adviseur en onderzoeker Universiteit
Utrecht)
5. Menk Prinsen (onderzoeker Triskelion)
Blok 4: Dierproeven in het kader van het beperken van
gezondheidsrisico’s (16.15 - 17.00 uur)
1. Robert Scholten (directeur Dutch Brain Council)
2. Pieter Roelfsema (directeur Nederlands Herseninsituut)
3. Han van de Sandt (research manager TNO)
4. Robert Passier (onderzoeker Leids Universitair Medisch Centrum)

Griffier:
Activiteitnummer:

D.S. Nava
2017A02149

Convocatie

Rondetafelgesprek Ontwikkeling van
proefdiervrije onderzoeksmethoden

Donderdag 14 september 2017
14.00 – 17.00 uur

Deze reader is uitsluitend voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek.

Convocatie

Rondetafelgesprek Ontwikkeling van
proefdiervrije onderzoeksmethoden
(inbreng genodigden)

Blok 1
Wetenschap ten aanzien van de
ontwikkeling van proefdiervrije
methoden (14.00 - 15.00 uur)

Donderdag 14 september 2017
14.00 – 17.00 uur

Deze reader is uitsluitend voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek.

Convocatie

Han van de Sandt

Proefdiervrije innovaties binnen biomedisch
effectiviteitsonderzoek in perspectief
Han van de Sandt - TNO
4 september 2017

Voor het beantwoorden van een aantal maatschappelijke vraagstukken is het inzetten van
dierproeven op het moment (helaas nog) onvermijdelijk. Deels is dit gevolg van eisen die
overheden stellen, deels omdat er (nog) geen proefdier-vrije methoden zijn met voldoende
betrouwbaarheid. Binnen kennisinstituten, bedrijven en universiteiten wordt gericht en
ongericht (uit wetenschappelijke nieuwsgierigheid) gewerkt aan verfijning, vermindering en
vervanging van dierproeven. Ook binnen het biomedisch onderzoek naar de werkzaamheid
(effectiviteit) van geneesmiddelen worden continu onderzoeksmodellen ontwikkeld en
toegepast. Centraal hierbij staat de voorspellende waarde voor de mens. Het klinkt eenvoudig:
het model dat de mens het best nabootst, wint de race. Of ligt het complexer?
De beste voorspeller van de mens is.... de mens
Het is belangrijk om vast te stellen dat het binnen het geneesmiddelenonderzoek draait om
bewezen effectiviteit van een nieuw medicijn in de mens. Daarom vinden er verschillende
ontwikkelingen plaats binnen het klinisch onderzoek: door vroege biomarkers te ontwikkelen
op basis van mechanistische kennis en door steeds gevoeliger meetmethoden toe te passen
worden de mogelijkheden om vroeg de effectiviteit van geneesmiddelen in de mens te
onderzoeken, steeds verder vergroot. Humaan onderzoek biedt bij uitstek de mogelijkheid om
verschillen en overeenkomsten tussen individuen te onderzoeken, waardoor meer inzicht wordt
verkregen over het nut en noodzaak van stratificatie en personalized medicine.
Echter het is om ethische en praktische redenen niet mogelijk om nieuwe potentiele medicijnen
in een vroeg stadium in de mens te testen. Daarom gaat er een uitgebreid preklinisch traject aan
vooraf, waar modellen voor de mens (eigenlijk: voor specifieke processen in de mens) worden
gebruikt.
Diermodellen: ideaal door integrale fysiologie of black box?
Diermodellen worden veel gebruikt in het preklinisch effectiviteitsonderzoek. De muis is hierbij
veruit het meest gebruikte proefdier. Belangrijke voordelen van muismodellen zijn de
genetische overeenkomst met de mens (95%), mogelijkheden tot genetische manipulatie,
snelheid (life span van 2 jaar ipv 75 jaar), induceerbare ziekteprocessen en decennialange
ervaring. Toch staan de voorspellende waarde van deze modellen en de ethische aspecten van
dit type onderzoek regelmatig ter discussie.
Voor sommige ziekteprocessen bestaan geen bruikbare diermodellen, omdat de relevante
fysiologische en/of moleculaire processen in proefdieren te verschillend zijn van die van de
mens. Het is echter helder dat diermodellen een essentiële rol spelen bij het ontwikkelen van
nieuwe medicijnen. Daar waar geen bruikbare modellen bestaan, wordt vaak hard gewerkt aan
het ontwikkelen van modellen met een hogere voorspellende waarde, door transgenese of door
gebruik van andere diersoorten dan de muis. Het aantonen van voorspellende waarde van
diermodellen is trouwens niet eenvoudig, oa door gebrek aan beschikbaarheid van goed
gedocumenteerde, mechanistische data in de mens.
In vitro modellen: ideaal humaan representerend systeem of te reductionistisch?
Voorafgaand aan diermodellen worden binnen het geneesmiddelenonderzoek vaak in vitro
methoden toegepast. Het grote verschil met diermodellen is dat in vitro modellen geen integrale
fysiologie reflecteren: slechts een beperkt en geïsoleerd deel van biologische processen kan in
vitro worden bestudeerd. Dat is natuurlijk een enorm nadeel als het doel is om voorspellend te
zijn voor de gehele humane fysiologie. Echter, in vitro modellen bieden de mogelijkheid in

Convocatie

menselijke cellen (ziekte)processen te bestuderen. En ze kunnen in detail bestudeerd worden,
wat vaak in de mens niet kan.
Klassieke 2D in vitro modellen worden dan ook vooral ingezet bij het screenen van mogelijk
nieuwe geneesmiddelen op goed begrepen, relatief simpele, biologische processen, vooral
tijdens de drug discovery fase van de geneesmiddelenontwikkeling. Om de toepassing van in
vitro modellen te verbreden tot biologisch ingewikkelder vraagstellingen zijn complexere in
vitro modellen ontwikkeld, vaak 3D en bestaande uit verschillende celtypen en soms extra
technologie toegevoegd. Een voorbeeld hiervan is de organ on a chip technologie, wat als
containerbegrip gebruikt wordt voor een breed palet aan verschillende technologieën. Er
worden door ontwikkelaars veel lonkende vergezichten geschetst, tot en met een volledig
geïntegreerde menselijke fysiologie op een chip. Deze beloften moeten nog worden
waargemaakt, maar het is duidelijk dat dit gebied snel aan kracht wint.
Eén doorbraaktechnologie?
Bij de introductie van nieuwe onderzoeksmodellen binnen de geneesmiddelen-ontwikkeling is
een aantal aspecten van belang. Allereerst moet de vernieuwing natuurlijk aantoonbaar beter
zijn dan het bestaande model (= een hogere voorspellende waarde). Daarnaast spelen kosten en
praktische implementeerbaarheid een rol, en vaak ook regulatoire acceptatie.
Het perfecte onderzoeksmodel bestaat niet. Een model dat alles moet kunnen, kan uiteindelijk
niets. De toegevoegde waarde van modellen ligt in de voorspellende waarde voor een specifieke
onderzoeksvraag. Het is zeer onwaarschijnlijk dat één technologie (humaan, dier of vitro) de
gehele geneesmiddelenontwikkeling zal gaan domineren. Veel waarschijnlijker is dat alle 3 de
technologieën van waarde blijven en hun eigen ontwikkeling hebben, afhankelijk van de fase
(drug discovery, drug development, preclinical safety) en de precieze inhoudelijke
vraagstellingen. Afhankelijk van de toegevoegde waarde aan het proces zullen de verhoudingen
tussen de technologieën veranderen; TNO onderschrijft de zeer uitdagende ambitie van de
Staatssecretaris van Economische Zaken, om in 2025 wereldleider op het gebied van
proefdiervrije innovaties te zijn. Een gevaar voor de publieke acceptatie van innovaties is dat
onderzoekers de waarde en de mogelijkheden van een specifiek model groter maken dan deze
werkelijk is. Dit gebeurt zowel bij proefdiermodellen als bij in vitro modellen. Degelijk en ethisch
verantwoord wetenschappelijk onderzoek is essentieel voordat de waarde van een nieuw model
kan worden vastgesteld en in de praktijk kan worden toegepast.
Technologie zonder toepassing is geen innovatie
Er zijn veel actoren die bepalen of een (ver)nieuw(d) model toegevoegde waarde heeft:
allereerst de toepassers (waaronder geneesmiddelenontwikkelaars), maar ook overheden
(kaders op het gebied van ethiek, kosten, regeldruk), academia (aanbieden van nieuwe
technologische mogelijkheden) en technologie aanbieders (techno start-ups, CRO’s etc).
TNO is van mening dat proefdiervrije innovaties essentieel zijn voor het biomedisch onderzoek,
zowel uit wetenschappelijk als ethisch oogpunt. Er zijn veel interessante ontwikkelingen op het
gebied van klinisch als in vitro onderzoek. De overheid kan deze ontwikkelingen stimuleren door
gerichte en duurzame investeringen, én eenduidige wetgeving op het gebied van biomedisch
onderzoek. Om de kans van slagen (=proefdiervrije methodologie die ook echt in de praktijk
wordt gebruikt) te vergroten, zou geavanceerde in vitro technologie gekoppeld moeten worden
aan mechanistisch onderzoek van menselijke ziekteprocessen. Biobanken met daarin goed
gekarakteriseerd menselijk weefsels (ziek en gezond) kunnen een belangrijke rol spelen om
ziektemechanismen te ontrafelen en hierdoor proefdiervrije modellen beter translationeerbaar
te maken. Ook bij deze lijn van onderzoek spelen belangrijke wetenschappelijke, wettelijke en
ethische aspecten, zoals kwaliteitscontrole, logistiek, beveiliging van data en weefsels en, last
but not least, privacy van donoren.
De rol van TNO is om ‘beyond the hype’ te kijken, door wetenschappelijke onderbouwing van
nieuwe onderzoek aanpakken en – door de contacten met bedrijfsleven – het aanbod van
innovaties te matchen met de industriële vraagstellingen en daarmee de implementatie in de
praktijk.

Convocatie

Jan van der Valk

Schriftelijke inbreng Rondetafelgesprek “ontwikkeling proefdiervrije onderzoeksmethoden”, vaste
commissie voor Economische Zaken, 14 september 2017.
Dr. Jan van der Valk, 3Rs-Centre Utrecht Life Sciences, Fac. Diergeneeskunde, Universiteit Utrecht.
Stellingen
1. Stel als landelijke norm vast om voorafgaande proefdiervrije methoden te vermelden in de
aanvraag voor een vergunning tot het doen van dierproeven.
2. Proefdiervrije methoden dienen vrij toegankelijk te zijn. Het patenteren van academisch
intellectueel ‘eigendom’ dat verkregen is met gemeenschapsgeld, en het patenteren van
methoden die (kunnen) leiden tot vervanging, vermindering of verfijning van dierproeven
moet worden voorkomen.
3. Wil Nederland in 2025 zich inderdaad kunnen profileren als wereldleider proefdiervrije
innovaties is een sterke centrale regie noodzakelijk.
Uitleg
Ad. 1. Huidige onderzoek met proefdiervrije modellen
In Utrecht wordt onderzoekers gevraagd om bij hun aanvragen voor een vergunning tot het doen van
dierproeven, voorafgaande proefdiervrije methoden te vermelden in de aanvraag. Op deze manier
wordt meer inzicht verkregen in de toepassing van proefdiervrije methoden en kan een betere
afweging worden gemaakt of de 3V’s zijn meegenomen in de opzet van het gehele onderzoek.
De Universiteit Utrecht heeft deze stap opgenomen omdat het gebruik van dierproefvrije methoden
niet hoeft te worden geregistreerd. Het 3Rs-Centrum ULS heeft in samenwerking met de Instantie voor
Dierenwelzijn Utrecht onderzoek gedaan naar de toepassing van deze methoden in laboratoria waar
dierproeven worden uitgevoerd. De uitkomsten laten zien dat in veel gevallen onderzoek vooraf
plaatsvindt met proefdiervrije modellen. Door deze voorafgaande studies worden veel proefdieren
bespaard. De Universiteit legt de lat hoog en wil minder gebruik van proefdieren. Daartoe dus de
specifieke vraag aan onderzoekers naar proefdiervrije onderzoeksmethoden.
Graag zien we deze ‘best practice’ uit Utrecht landelijk toegepast: Stel als landelijke norm vast om
voorafgaande proefdiervrije methoden te vermelden in de aanvraag voor een vergunning tot het doen
van dierproeven.
Context:
Hoe wordt het adagium van vervangen, verminderen en verfijnen in de praktijk geïmplementeerd? In
Utrecht wordt al veel onderzocht met proefdiervrije modellen. De Faculteit Diergeneeskunde van de
Universiteit Utrecht heeft in haar Strategisch Plan 2017-2021 o.a “kennis en inzichten rond het
duurzaam en verantwoord omgaan met dieren in de samenleving” centraal gesteld via Sustainable
Animal Stewardship (SAS). Binnen dit brede streven krijgt het welzijn van proefdieren en de 3V’s
bijzondere aandacht.
De UU waarborgt het welzijn via de Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht, dat nauw samenwerkt met
het 3Rs-Centre Utrecht Life Sciences, het “alternatieven voor dierproeven” centrum bij de Faculteit
Diergeneeskunde. Door constante afstemming worden alternatieven voor dierproeven (tegenwoordig
3V-methoden genoemd) waar mogelijk toegepast.
Ad. 2 Patenteren van academische onderzoeksresultaten
Bovenstaande is alleen goed mogelijk als de proefdiervrije methoden ook vrij toegankelijk zijn. Op dit
moment worden veel nieuwe methoden ontwikkeld die mogelijk ook het proefdiergebruik terug
kunnen dringen. Het ontwikkelen van deze methoden kost veel (gemeenschaps)geld.
Het patenteren van (wetenschappelijke) uitvindingen geeft de mogelijkheid het intellectuele eigendom
te beschermen en de ontwikkelkosten terug te verdienen. Van de andere kant werpt het een
belemmering op in het gebruik. Met name wanneer het niet direct om een eindproduct gaat, of om

Convocatie

een alternatief voor een dierproef, kan men zich afvragen of zo’n drempel wenselijk is. In veel gevallen
moeten andere wetenschappers die onderzoek doen met gemeenschapsgeld hier (ook) een prijs voor
betalen om deze methoden te gebruiken in hun onderzoek. We zien in enkele gevallen dat gebruik van
deze methoden zo duur is, dat ander onderzoek daardoor wordt belemmerd.
In het geval van modellen die (kunnen) leiden tot vermindering of zelfs vervanging van dierproeven, is
het onwenselijk dat een patent het gebruik hiervan belemmert. De Organisatie voor Economische
Ontwikkeling (OESO/OECD) schrijft hierover in haar “Test Guidelines for the Testing of Chemicals”:
“The OECD presently will not develop Test Guidelines that require the use of a unique instrument or
process owned by a patent. One reason for this is that the method should be readily available to all
potential users: another is to avoid market monopoly of an OECD test method by a private company.” i
Eén van de voorwaarden voor het toepassen van proefdiervrije modellen is dus dat deze zo
laagdrempelig mogelijk worden aangeboden.
Hoewel het patenteren van nieuwe methoden het intellectuele eigendom beschermt, kan deze dus
ook een drempel opwerpen voor de toepassing daarvan.
Proefdiervrije methoden dienen vrij toegankelijk te zijn. Het patenteren van academisch intellectueel
‘eigendom’ dat verkregen is met gemeenschapsgeld, en het patenteren van methoden die (kunnen)
leiden tot vervanging, vermindering of verfijning van dierproeven moet worden voorkomen.
Ad. 3 Agenderen en regisseren
De staatssecretaris van EZ heeft in zijn brief aan de Tweede Kamer dd. 6 juli 2017 aangegeven de regie
op zich te nemen voor de transitie Proefdiervrije innovatie. Vanuit die rol heeft hij samen met de
staatssecretaris van OCW aan het NCad, de KNAW en het RIVM de opdracht gegeven om samen met
het veld een Agenda Proefdiervrije Innovatie op te stellen.
Er zijn vele partijen betrokken, waaronder ook CCD, ZonMW, Topsectoren, IvD Platform, Nederlandse
Vereniging voor Proefdierkunde, Biotechnische vereniging, etc. Mede daardoor is het een complex
proces. Het is daarom van groot belang dat de leden van de Commissie EZ van de TK in de komende
jaren zich met regelmaat op de hoogte blijven stellen over de opzet van de agenda de voortgang in het
uitwerken van de agenda en de ontwikkelingen in het veld die van invloed kunnen zijn op de agenda.
Een bijzonder aandachtspunt is de coherentie tussen de agenda en de besteding van de beschikbare
financiële middelen. Wil Nederland in 2025 zich inderdaad kunnen profileren als wereldleider
proefdiervrije innovaties is een sterke centrale regie noodzakelijk.
i 1
( OECD (2005). Guidance Document No. 34 on the Validation and International Acceptance of New or Updated Test

Methods for Hazard Assessment (3rd Version), 25 January 2005, 96pp. Paris, France:
Organisation for Economic Cooperation and Development.
Website
http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?doclanguage=en&cote=env/jm/mono(2005)14)

Convocatie

Ingrid Geesink

MEMO
Aan:

Vaste Kamercommissie voor Economische Zaken

Van:

Dr. Ingrid Geesink, themacoördinator Ziekte en Gezondheid, Rathenau Instituut

Datum:

05/09/2017

Betreft:

Schriftelijke inbreng van het Rathenau Instituut voor het rondetafelgesprek Ontwikkeling
van proefdiervrije onderzoeksmethoden op 14 september 2017

Van aap naar beter: Een verkenning en dialoog over proeven met apen
Het kabinet ambieert om Nederland in 2025 internationaal koploper dierproefvrije innovatie te
laten zijn. Verschillende initiatieven zijn al in gang gezet om die doelstelling te halen. Het
Rathenau Instituut deed op verzoek van het ministerie van Onderwijs, Cultuur en Wetenschap
verkennend onderzoek onder stakeholders naar het gebruik van apen als proefdier. Daaruit blijkt
dat hèt alternatief voor proeven met apen niet bestaat. Belanghebbenden delen de toekomstvisie
dat niet langer gezocht moet worden naar een model dat apen één op één vervangt. Onderzoek
moet zich richten op andere manieren om de volksgezondheid te waarborgen; naar innovaties die
proefdiervrij zijn. Over de snelheid waarmee dit kan worden bereikt, verschilt men wel van
mening.
De aap is het meest omstreden van alle proefdieren vanwege de nauwe verwantschap met de mens en
de maatschappelijke en politieke wens om leed bij deze dieren te voorkomen. De Nederlandse wet maakt
daarom een extra uitzondering voor onderzoek met apen: proeven mogen alleen plaatsvinden als er geen
alternatieven zijn, en geen dieren van een andere soort kunnen worden ingezet.
Door de Tweede Kamer is eerder de wens uitsproken om geheel te stoppen met proeven met apen, mits
dit geen nadelige gevolgen heeft voor “het onderzoek dat strikt noodzakelijk is voor de bestrijding van
levensbedreigende ziekten en uitbraken van infectieziekten, die de volksgezondheid bedreigen”.
Aan het Rathenau Instituut is een verkenning gevraagd naar:
• De stand van zaken op het gebied van alternatieven met apen, nu en in de nabije toekomst,
• Hoe zo snel mogelijk gekomen kan worden tot een plan voor afbouw naar nul bij het BPRC en
andere Nederlandse onderzoekscentra, zonder dat dit gevolgen heeft voor de volksgezondheid.
Januari 2017 heeft het Rathenau Instituut de resultaten van deze verkenning gepubliceerd, die onder
meer gebaseerd zijn op een systematische stakeholderdialoog, in het rapport ‘Van aap naar beter’.
Conclusies
1. Op dit moment wordt er voor verschillende typen onderzoek en verschillende doeleinden onderzoek
aan apen gedaan. Een deel daarvan wordt gedaan in het kader van de bestrijding van
levensbedreigende ziekten en uitbraken van infectieziekten.

Convocatie

2. Uit de stakeholderdialoog blijkt dat er brede consensus is dat de sterke focus op alternatieven niet
helpt om het aantal dierproeven met apen te verminderen. Als het doen van dierproeven met apen
niet wenselijk is, moet opnieuw de vraag centraal staan: welke kennis over gezondheid is er nodig en
hoe kan deze zonder proefdieren ook worden verkregen?
3. Als het noodzakelijk is en wenselijk wordt gevonden om een faciliteit te behouden voor het doen van
onderzoek in het kader van de bestrijding van levensbedreigende ziekten en uitbraken van
infectieziektes, dan zullen de daarbij behorende financiële lasten geaccepteerd moeten worden.
Hoeveel en welk onderzoek met apen wordt er gedaan in Nederland?
In Nederland wordt op drie locaties onderzoek gedaan met apen. Naast het Biomedical Primate Research
Centre (BPRC) in Rijswijk, wordt er ook onderzoek met apen gedaan aan het Erasmus Medisch Centrum
te Rotterdam en aan het Herseninstituut te Amsterdam. De voorziening aan de Radboud Universiteit
Nijmegen is eind 2016 gesloten.
Tabel 1: Aantal ingezette apen voor proeven per instelling in 2015
Resusapen
Java-apen
BPRC Rijswijk

87

Erasmus MC Rotterdam

26

Marmoset-apen

Totaal

91

204

21

21

Herseninstituut Amsterdam

6

6

Radboud Universiteit Nijmegen

3

3

Totalen in Nederland

96

47

91

234

Bron: NVWA (2016) Zo doende 2015, BPRC (2016), Proefdierkundig jaarverslag 2015, interviews 2016
Het BPRC heeft als enige instelling een fokkolonie van circa 1500 apen waarvan elk jaar ongeveer 200
tot 250 dieren worden ingezet voor experimenten. Van de apen die in 2015 voor onderzoek werden
gebruikt, werd 59% ingezet voor translationeel onderzoek gericht op onder meer de ontwikkeling van
vaccins en infectieziektebestrijding, en daarnaast ook voor transplantatiegeneeskunde, MS, tuberculose,
reuma en andere ziektes. 41% van de apen werd ingezet voor fundamenteel wetenschappelijk
onderzoek, met name voor onderzoek naar de hersenen, het immuunsysteem en virale infecties.
Experimenten met apen voor wettelijk verplicht veiligheidsonderzoek naar nieuwe producten vinden
nauwelijks plaats in Nederland. Het gebruik van apen voor het ontwikkelen en testen van cosmetica en
recreatieve drugs of voor defensiedoeleinden is in Nederland verboden, evenals het gebruik van
mensapen voor biomedisch onderzoek.
Zijn er alternatieven voor onderzoek met apen?
Er zijn meerdere alternatieve onderzoeksmethoden en technologische ontwikkelingen die bijdragen aan
vermindering, verfijning en vervanging van onderzoek met apen. Dit heeft echter niet geleid tot volledige
afbouw van het onderzoek met apen. Uit de interviews met belanghebbenden en de stakeholderdialoog
die het Rathenau Instituut organiseerde, is gebleken dat er brede consensus is dat de huidige focus op
alternatieven niet zal leiden tot het verdwijnen van onderzoek met apen. Zolang de mogelijkheid er in
principe is, zullen apen ingezet worden voor wetenschappelijk onderzoek.

Convocatie

Is het mogelijk om volledig te stoppen met het onderzoek met apen?
Op basis van de verkenning zien wij twee mogelijkheden voor verdere vermindering van onderzoek met
apen:
• Optie 1: Alleen onderzoek met apen toestaan voor infectieziekte bestrijding met acute
gezondheidsdreiging. Dit zal naar verwachting leiden tot een reductie van een derde tot de helft van
al het onderzoek met apen in Nederland. Dit betekent waarschijnlijk dat de locaties in Amsterdam en
Rotterdam gesloten worden en dat de huidige fokkolonie van het BPRC wordt afgebouwd. Verdere
afbouw kan als we internationale afspraken maken welk onderzoek in Nederland wordt gedaan en
wat in andere landen. Het BPRC is dan niet kostendekkend.
• Optie 2: Verdere versterking van de maatschappelijke toetsing en verantwoording van het
wetenschappelijk onderzoek met apen. Sommige stakeholders benadrukken het belang van
fundamenteel wetenschappelijk onderzoek met apen, zonder acute gezondheidsdreiging. Dit vraagt
wel een verdere discussie en articulatie van wat maatschappelijk noodzakelijk en als ethisch
verantwoord wordt gezien.

Convocatie

Peter van Meer

Wetenschappelijk onderzoek nodig om tot een proefdiervrije ontwikkeling van geneesmiddelen te
komen
Geachte leden van de Tweede Kamer,
De ambitie van de staatssecretaris om een proefdiervrij onderzoeks- en geneesmiddelontwikkeling
klimaat te bewerkstelligen in 2025 is een ambitieuze maar noodzakelijke stap om helder te krijgen
welke technologie en wetenschappelijke ontwikkeling echt noodzakelijk zijn om tot een
proefdiervrije wetenschap te komen. Immers: Necessity is the mother of invention.
Daarbij moet wel rekening gehouden worden met een aantal factoren binnen het wetenschappelijk
onderzoek.
Zo heeft het financieren van de ontwikkeling van alternatieve technologieën als doel op zich vrij
weinig opgeleverd, niet alleen in Nederland maar wereldwijd. Dit heeft een aantal oorzaken die
welbekend zijn. De meest saillante argumenten zijn: er is een lange adem voor nodig en overstijgt
de tijdsduur van de subsidies, na ontwikkeling vindt er geen validatie plaats omdat dit kostbaar
en weinig innovatief werk is, dat wetenschappers niet aanspreekt, er is geen duidelijke afnemer
van deze technologie, of de nieuwe technologie is te beperkt in reikwijdte ten opzichte van de
dierproef. Hierdoor is er een woud van in de kiem gesmoorde alternatieven die met
gemeenschapsgeld zijn ontwikkeld maar niet verder gebruikt worden.
Tegelijkertijd levert wetenschappelijk onderzoek wel degelijk veel mogelijkheden voor
alternatieven. Een treffend voorbeeld hiervan is miniaturisatie van humane organen en weefsels in
‘organ on a chip’ systemen of organoiden om bijwerkingen van nieuwe geneesmiddelen in de
mens kunnen voorspellen. Ze zijn niet à priori ontwikkeld om een dierproef te vervangen, maar
komen voort uit fundamenteel onderzoek.
De alternatieven maken gebruik van menselijk weefsel en hebben daarom niet de beperking van
proeven in dieren die vaak anders reageren dan mensen. Daarom levert het waarschijnlijk veel
meer om vooral projecten te subsidiëren die proefdiervrije technologie ontwikkelen om
fundamentele vraagstukken te beantwoorden.
Ontwikkelingen in proefdiervrije methoden floreren wanneer deze gedaan om fundamenteel
onderzoek in menselijk weefsel te doen, en stagneren wanneer deze een doel op zich worden.

Maar ook als deze route voor de ontwikkeling van alternatieven gevolgd wordt, blijft de transitie
naar een proefdiervrije onderzoekswereld een langzaam en moeilijk proces. Tot die tijd blijven
dierproeven veelgebruikt in onderzoek en geneesmiddelontwikkeling, zonder dat in de meeste
gevallen duidelijk is wat waarde is van dit onderzoek is. En welke diermodellen beter in staat zijn
om bepaalde vraagstukken te beantwoorden dan andere.
Daarom is onderzoek naar het gebruik van proefdieren in het verleden zeer belangrijk, omdat de
ervaring leert, dat dat in relatief korte tijd tot een vermindering van dierproeven kan leiden. Bij dit
soort onderzoek worden eerdere resultaten van dierproeven bestudeerd en de meerwaarde
vastgesteld en of de resultaten relevant zijn voor de mens.
Vaak kiest men voor dierproeven op basis van wetenschappelijk nooit bewezen aannames of
traditie. Door aan te tonen dat die aannames niet kloppen kan een substantiële reductie van
proefdier gebruik leiden. Zo heeft ons eigen retrospectief onderzoek bijgedragen aan een revisie
van de manier waarop kopieën van biotechnologische geneesmiddelen (biosimilars) worden
onderzocht op veiligheid, en het inzicht dat veiligheidsstudies in biotechnologische geneesmiddelen
maar een beperkte meerwaarde hebben.
Binnen de wetenschap wordt veel gebruik gemaakt van ziektemodellen in dieren om
ziekteprocessen in de mens beter te begrijpen of om de werkzaamheid van een experimenteel
geneesmiddel te testen. Ook deze diermodellen worden veelvuldig gebruikt zonder dat de
voorspellende waarde voor ziekte bij de mens bekend is. Wanneer de echte waarde van deze
modellen objectief kan worden vastgesteld, kan veel overbodig proefdierwerk worden vermeden.
Op dit moment is onze groep bezig met deze validatie met de bedoeling een register op te stellen
van diermodellen van ziekte die zin hebben.
Dit register kan ook een goede basis geven voor het ontwikkelen van alternatieve technologieën
omdat men de alternatieven kan toetsen aan een gevalideerd diermodel. Naast snelle resultaten
en directe gevolgen in het proefdierbeleid is een bijkomstig voordeel ons onderzoek dat het relatief

Convocatie

goedkoop is omdat gebruik gemaakt wordt van bestaande data. Bovendien kan het
dierexperimentele commissies van onderzoeksinstituten helpen om goed gebruik van dierproeven
te bevorderen.
Om te weten waar kansen liggen voor nieuwe alternatieve methodes, is het noodzakelijk
diermodellen door te lichten en te bepalen welke diermodellen voorspellende waarde hebben .
Met vriendelijke groet,
dr. ing. P.J.K. van Meer

Convocatie

Aldert Piersma

Schriftelijke Inbreng Rondetafelgesprek implementatie Proefdiervrije Onderzoeksmethoden
Vaste kamer-commissie Economische Zaken
Tweede Kamer, 14 september 2017
Prof. Dr. Aldert H. Piersma
Reproductietoxicoloog
RIVM-Bilthoven, IRAS-Universiteit Utrecht
Innovatie van veiligheidsevaluatie van stoffen en welzijn van proefdieren gaan hand in hand.
De huidige methoden voor veiligheidsevaluatie van stoffen zijn gebaseerd op standaard dierproeven
die in de 80er jaren zijn afgestemd. De wetenschap is nu zoveel verder dat we op een aantal
terreinen serieus proefdiervrije methoden kunnen gaan toepassen. Die nieuwe methoden zijn beter
toegesneden op risico’s bij de mens en gebruiken niet de omweg van de dierproef voor humane
risicoschatting.
De huidige kennis van biologie, chemie en toxicologie maakt een innovatieve benadering mogelijk.
Vanuit de integratie van moderne kennis in meerdere vakgebieden worden computermodellen
ontwikkeld voor fysiologische processen in de mens en voor hun verstoring door blootstelling aan
chemische stoffen. Proefdiervrije methoden leveren data voor de voorspelling van schadelijkheid van
stoffen in deze modellen. Op deelgebieden werkt dit al, de uitdaging ligt in de uitbreiding daarvan
naar alle gebieden van de gevaar- en risicoschatting van stoffen op weg naar 100% vervanging van
dierproeven.
De transitie naar implementatie van proefdiervrije methoden vergt top-down regie en investering.
• Het klassieke uitgangspunt van 1 op 1 vervanging van dierproeven door alternatieve
methoden is achterhaald, en vertraagt de vernieuwing.
• De klassieke validatie van alternatieve methoden, gebaseerd op voorspelling van effecten in
het proefdier, is achterhaald en vertraagt de vernieuwing.
• Transitie betekent onder meer het denken in combinaties van proefdiervrije methoden die
samen een integrale dekking geven van de mechanismen van humane toxiciteit.
• Transitie is weerbarstig, actoren in het vigerende systeem (toepassing, beleid en regelgeving)
zijn veelal conservatief en beducht voor verandering.
• Top-down regie houdt in dat innovaties gericht worden op welke methoden vanuit de kennis
van de biologie, chemie en toxicologie nodig zijn voor een goede risico-evaluatie (in plaats
van de bottom-up ontwikkeling en promotie van individuele alternatieve methoden)
• Deze innovatie is technisch mogelijk, maar het tijdpad wordt in hoge mate bepaald door de
investering die eraan gekoppeld wordt. Het gaat hierbij om honderden miljoenen euro’s.
• De acceptatie en implementatie van innovaties in het internationale systeem voor de
veiligheidsevaluatie van stoffen zijn in hoge mate afhankelijk van een stevige regie en
coördinatie tussen alle betrokken partijen in wetenschap, politiek en beleid.
De transitie naar proefdiervrije risico-evaluatie is uiteindelijk een kwestie van vertrouwen in
innovatieve methoden.
• De huidige proefdiermethoden geven een werkbaar maar toch beperkt beeld van gevaar en
risico van stoffen (zie figuur).
• Er is onzekerheid over wat we missen in het huidige systeem van het meten van schadelijke
effecten in dierstudies.
• De dierstudie was in de vorige eeuw de best denkbare en dus logische keuze, maar is in
wezen een omweg die evenveel problemen oproept als ze oplost.

Convocatie

•
•
•
•

Een innovatieve benadering richt zich op de mens en op moleculaire mechanismen
waarlangs stoffen schade kunnen toebrengen, is directer, relevanter en daarom
fundamenteel beter.
Evenals elke bestaande methode heeft ook elke innovatieve benadering een onzekerheid in
zich over wat we niet weten (zie figuur).
De samenleving is zeer veiligheidsbewust, laat geen onzekerheid toe, en dat vergt een
maatschappelijke discussie over relaties tussen innovatie, dierenwelzijn, veiligheid en
acceptatie van onzekerheden.
Het innovatieve proefdiervrije systeem zal bewezen, evident, principieel beter moeten zijn,
zodat de noodzaak tot transitie voor alle betrokkenen vanzelfsprekend wordt.

Schematische vergelijking van 1. Idealiter gewenste informatie voor veiligheidsevaluatie; 2. De
huidige beperkte kennisomvang uit dierstudies; 3. Een proefdiervrije benadering direct gericht op de
mens, met informatie- en kwaliteitswinst maar mogelijk met andere beperkingen; 4. De winst- en
verliesrekening; waarbij elke benadering een onbepaalde rest-onzekerheid in zich heeft.

1

[Type a quote
or the
summary
Allesfrom
wat the
we document
zouden willen
weten
voor humane risicoschatting
of an interesting point. You can position the text

Wat we nu uit dierstudies leren

2

3

4

Verlies ?

Verlies ?

Wat we nu niet weten

Wat we uit humaan-mechanistische studies leren

Kwaliteitswinst !

Winst !

Onzeker ?

Onzeker ?

Convocatie

Wim de Leeuw

Position paper Rondetafelgesprek ontwikkeling proefdiervrije onderzoeksmethoden

Vaste commissie Economische Zaken Tweede Kamer, 14 september 2017
Wim de Leeuw, Hoofd Instantie voor dierenwelzijn Utrecht

Aanbevelingen
1. Zorg voor een wettelijke regeling die het onderhouden en aanscherpen van kennis en
bekwaamheden van betrokkenen bij dierproeven en vervangingsalternatieven garandeert.
2. Subsidieverstrekkers, ook de overheid, moeten als voorwaarde stellen dat de rapportages van
het onderzoek dat door hen gefinancierd wordt voldoen aan de ARRIVE richtlijnen en dat ook
negatieve en neutrale resultaten algemeen beschikbaar gemaakt worden.
3. Zorg dat een vast deel van het budget dat beschikbaar is voor de ontwikkeling en validatie van
dierproefvrije methoden beschikbaar is voor het instellen en onderhouden van informatie
bronnen en een kennisinfrastructuur, die een laagdrempelige beschikbaarheid van informatie
over 3V methoden garandeert.
4. Zorg er voor dat er verder onderzoek gedaan wordt naar die ethische implicaties en er met
betrokken partijen afspraken gemaakt worden die het makkelijker maken om nieuwe
behandelingen eerder in mensen te testen.
5. Zorg er voor dat bestaande barrières die toegang tot (geanonimiseerde/gecodeerde) gegevens
uit patiënten- en/of bevolkingsonderzoeken voor onderzoekers bemoeilijken in beeld gebracht
worden en dat onderzocht wordt hoe deze geslecht kunnen worden.
Toelichting
Ad. 1. Een leven lang leren.
Hoe vreemd het misschien ook klinkt voor een beroepsgroep die per definitie bezig is met het
vergaren van kennis, ook voor onderzoekers geldt dat blijvende bijscholing noodzakelijk is, vooral op
het gebied van de methodologie en de mogelijkheden om 3V methoden toe te passen. Onder 3V
methoden verstaan we, dierproefvrije modellen, methoden om het aantal proefdieren te
verminderen en methoden verdere verfijning toe te passen. De Wet op de dierproeven (Wod)
bepaalt dat personen die de opzet van dierproeven bepalen en/of betrokken zijn bij de uitvoering
van dierproeven bevoegd en bekwaam moeten zijn. Daarnaast bepaalt de Wod dat een dierproef
niet verricht mag worden als er een vervangingsalternatief voor is en dat het aantal dieren voor een
project tot het minimum moet worden beperkt zonder dat de doelstellingen van het project in het
gedrang komen. Er zijn vooralsnog geen wettelijke eisen gesteld voor het op peil houden en
uitbreiden van kennis en bekwaamheden.
De Wod bepaalt eveneens dat de IvD’s het personeel van een instelling adviseert over de 3V’s. In
verband hiermee zijn echter geen specifieke voorwaarden gesteld voor de samenstelling van de IvD
en de wijze waarop de expertise op dit gebied wordt onderhouden.
Het is wenselijk dat, evenals dat voor diverse andere beroepen het geval is, er een verplichting tot
nascholing is. Deze nascholing moet praktische handvatten bieden voor het toepassen van 3V
innovaties, met ruime aandacht voor proefdiervrije methoden. De nascholing moet aansluiten bij de
eigen onderzoekspraktijk, moet uitdagend en mag hier en daar ongemakkelijk zijn. Ook andere dan
de biomedische deskundigheden zouden hierbij betrokken moeten worden. Dit alles scherpt
onderzoekers en biedt ze meer aandacht voor andere benaderingen.
Ad. 2. Kwaliteit
Publiceren volgens de hoogste standaarden is een essentieel onderdeel van verantwoord en integer
wetenschap bedrijven. Uit een publicatie moet volledig duidelijk worden waarom het onderzoek is

Convocatie

uitgevoerd, hoe het is opgezet, hoe het is verlopen en hoe de resultaten zijn geanalyseerd. Dit maakt
een goede beoordeling en analyse van de resultaten mogelijk en verhoogt de dupliceerbaarheid en
kwaliteit van onderzoek. Herhaaldelijk blijkt echter uit inventariserend onderzoek dat de kwaliteit
van de publicaties in dit opzicht te kort schiet. Met het doel om de kwaliteit van publicaties te
verbeteren en daarmee het onnodig gebruik van dieren te voorkomen zijn in 2010 zijn de ARRIVE
guidelines 1 opgesteld. Ze zijn bedoeld voor onderzoekers en beoordelaars van publicaties. De ARRIVE
guidelines zijn breed geaccepteerd, maar de implementatie door onderzoekers en wetenschappelijke
tijdschriften is onvoldoende. VSNU, NFU en SGF hebben aangegeven via hun leden de navolging van
de guidelines te stimuleren.
Ook negatieve en neutrale resultaten moeten, met in-achtneming van dezelfde kwaliteitscriteria,
beschikbaar komen. Het aantal laagdrempelige mogelijkheden hiervoor neemt toe. Alleen op basis
van rapportages die voldoen aan de gestelde kwaliteitscriteria kunnen onderzoekers verantwoorde
beslissingen nemen om wel of geen proefdieren te gebruiken en als dierproeven onontkoombaar
blijken, welk model dan het meest geschikte is met het oog op transleerbaarheid.
Ad. 3. Kennisinfrastructuur
Onderzoekers hebben vaak onvoldoende zicht op wat er al beschikbaar is op het gebied van
(dierproef-vervangende) 3V methoden. Dit blijkt uit de dagelijkse praktijk van de Instantie voor
Dierenwelzijn, maar ook uit een recente inventarisatie 2. Dit ligt niet zo zeer aan de onderzoekers als
wel aan het feit dat die kennis grotendeels versnipperd is en niet altijd goed doorzoekbaar is.
Bovendien is op dit moment een deel van die kennis niet algemeen beschikbaar. Onderzoekers, IvD’s
en beoordelaars moeten snel en eenvoudig toegang kunnen hebben tot goed doorzoekbare
informatie over 3V methoden. Het door het NCad geadviseerde gegevenspakhuis 3 kan hier een
aanzienlijke bijdrage aan leveren. Daarnaast zijn er ook andere informatiebronnen nodig.
Daarom is het nodig dat er niet alleen geïnvesteerd wordt in het ontwikkelen en valideren van
dierproefvrije methoden en verminderings- en verfijningsmethoden, maar ook in de opzet en
continuering van een kennisinfrastructuur waarmee de beschikbare informatie over 3V methoden
laagdrempelig beschikbaar is en waar informatie uitgewisseld kan worden. Die kennis en informatie
vormt immer de basis een bredere toepassing en verdergaande ontwikkeling van ontwikkelde
innovatieve methoden.
Ad. 4 en 5. Dichter bij onszelf blijven
Een toename in de toepassing van dierproefvrije onderzoeksmethoden moet langs meerdere lijnen
bereikt worden. Meer en eerder gebruik maken van de mens of het doeldier is er één van. Dit kan
bijvoorbeeld door voor onderzoek t.b.v de mens meer gebruik te maken van humaan materiaal
(cellen, weefsels en andersoortige monsters) via weefselbanken en het inrichten van een supply
chain voor vers en vitaal humaan materiaal. Daarnaast bieden de verdere ontwikkeling en
toepassing van organoids en organs-on-a –chip veelbelovende mogelijkheden.
Ook zijn er goede voorbeelden van onderzoekers die er in slagen om met minder dierproeven dan
voorheen het geval was de stap naar de kliniek te maken. Dit vergt een gedegen vooronderzoek, een
goede onderbouwing en een goed overleg met de beoordelende instanties, zoals de Centrale
Commissie Mensgebonden Onderzoek (CCMO). Afhankelijk van de aard en opzet van het onderzoek
kan deze benadering ook nieuwe ethische vraagstukken met zich meebrengen 4.
Tot slot is het van belang dat onderzoekers onder voorwaarden makkelijker toegang kunnen krijgen
tot (geanonimiseerde/gecodeerde) gegevens uit patiënten- en/of bevolkingsonderzoeken.
1

https://www.nc3rs.org.uk/arrive-guidelines
Van Luijk, J. The next steps towards responsible animal-based Research. Evaluation of strategies to improve scientific quolity and
responsible animal use in research. Thesis. 2017. ISBN: 978-94-6295-610-0
3
https://www.ncadierproevenbeleid.nl/adviezen-ncad/documenten/rapport/2015/11/1/ncad-advies-dataopslag en
https://www.ncadierproevenbeleid.nl/adviezen-ncad/documenten/rapport/2016/5/17/ncad-advies-data-deel-2
4
Niemansburg, S.L.The ethics of bringing Regenerative Medicine to patients: the example of orthopedics. PhD thesis. 2015. ISBN: 978-946295-139-6
2

Convocatie

Rondetafelgesprek Ontwikkeling van
proefdiervrije onderzoeksmethoden
(inbreng genodigden)

Blok 2
non-gouvernementele
organisaties (NGO’s)
(15.00 - 15.20 uur)

Donderdag 14 september 2017
14.00 – 17.00 uur

Deze reader is uitsluitend voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek.

Convocatie

Marja Zuidgeest

Position paper Proefdiervrij
Schriftelijke Inbreng Rondetafelgesprek ontwikkeling Proefdiervrije Onderzoeksmethoden
Vaste kamer-commissie Economische Zaken Tweede Kamer, 14 september 2017
Marja Zuidgeest, directeur Proefdiervrij
Proefdiervrij
Proefdiervrij zet zich in voor een toekomst zonder proefdieren. Dat doen wij met hart en ziel; in de
wetenschap dat er steeds meer proefdiervrij onderzoek bijkomt dat dierproeven onnodig maakt. Wat
wij zien is dat de wetenschap zich razendsnel ontwikkelt en in staat is om onderzoek te doen zonder
proefdieren. In een wereld waarin al zoveel mogelijk is kunnen wij maar moeilijk bevatten dat er nog
steeds proefdieren gebruikt worden. Kortom, proefdiervrij onderzoek is een onmisbare bouwsteen
voor een betere wereld voor mens en dier.
Strategie Proefdiervrij
Om haar doel te bereiken zet Proefdiervrij in op samenwerking met wetenschappers en technologen
om samen kansen te benutten waar onderzoeksmodellen op basis van humane biologie mogelijk zijn.
Denktank Aanvullende financiering alternatieven voor dierproeven
De denktank heeft in zijn advies onder meer aangegeven dat de valorisatie van proefdiervrije
innovaties belemmerd wordt door de zogeheten `valley of death`. Resultaten uit publiek gefinancierd
onderzoek worden onvoldoende opgepakt door private investeerders.
Staatssecretaris Van Dam heeft Proefdiervrij opdracht gegeven hiervoor een fonds op te zetten.
Proefdiervrij heeft deze opdracht van harte geaccepteerd omdat wij merken dat daar inderdaad een
bottleneck zit.
Fund Humane4animals
Samen met de Triodos Foundation en Privium Fund Management heeft Proefdiervrij een model
uitgewerkt voor dit fonds, genaamd Fund Humane4animals. Hieronder de beoogde structuur:

Convocatie

Elly von Jessen

DE 3 V'S VAN DE
DIERENBESCHERMING
Input RTG 14/9/2017 - afbouw dierproeven
Datum
16-8-2017
Versie
1.0
OP WEG NAAR ONDERZOEK ZONDER DIEREN: DE 3 V’S VAN DE DIERENBESCHERMING

De Dierenbescherming denkt dat het er bij proeven met dieren niet om gaat voor of tegen te zijn. De
opdracht aan de samenleving is ervoor te zorgen dat ze er straks niet meer zijn. Dat vraagt allereerst om
de politieke wil tot omdenken, om het oude los te laten en voor nieuwe richtingen te kiezen. Om de
uitgesproken transitiedoelen te kunnen halen zijn nieuwe V’s nodig.

Verruiming van denken en doen:
► Houd de focus ruim, duw dieren niet in het hokje wel of niet dichtbij de mens. Het is erg belangrijk
dat het gebruik van apen stopt, maar vergeet niet dat het om nog heel veel andere dieren gaat. Het
lijdend voorwerp is altijd een dier;
► Realiseer in laboratoria, onderwijsinstellingen en kweekstations positief dierenwelzijn, zorg dat
dieren het ook leuk kunnen hebben. In vergelijking met de veehouderij bijvoorbeeld, is de
proefdierhouderij hier veel te weinig mee bezig. Waarom kan een gezond schaap waarin een nieuwe
hartklep wordt getest niet gewoon in de wei staan?

Versnelling van denken en doen:
► Besteed nu vooral tijd en geld aan innoveren zonder dieren en benut de kansen die andere
wetenschapsterreinen en het bedrijfsleven bieden om sneller af te bouwen;
► Leid jonge onderzoekers nu op in dierproefvrij werken en zorg dat ze makkelijk aan eerdere
onderzoeksresultaten kunnen komen om onnodig herhalen te voorkomen;
► Maak dat consumenten bewust kunnen nadenken over hun (schijn)veiligheid. Wees open over het
feit dat een aap, of een rat, geen mens is en dat onderzoek zonder dieren juist daardoor vaak
meer betrouwbaar is.

Verantwoording voor denken en doen:
► Zorg dat de Rijksoverheid een sterke regie neemt op de transitie naar een Nederland zonder
dierproeven. Dit is nodig in dit complexe veld waarin belangen van de burger, de wetenschap en
industrie – misschien meer nog dan in de veehouderij - zo nauw verbonden zijn aan het gebruik van
dieren;
► Zorg dat wetenschappelijk publiceren niet langer een doel op zichzelf is en laat ook negatieve
uitkomsten waardevolle data zijn. Geef altijd voorrang aan onderzoek waarvoor geen dieren nodig
zijn;
► Zorg voor verheldering. De wet spreekt niet voor zich en daar heeft de praktijk last van. Vervanging
van dierproeven moet niet in één adem met verfijning/vermindering worden genoemd. Geef DEC’s
meer handvatten om objectief vast te stellen of een onderzoek echt niet zonder dieren kan;
► Zorg voor toegankelijk taalgebruik om de samenleving meer te betrekken. Spreek niet over
diermodellen, maar over muizen, zebravinken, of apen. ‘Ongerief’ is geen spreektaal, heb het over
hoeveel pijn of stress dieren concreet zullen hebben.

Convocatie

Rondetafelgesprek Ontwikkeling van
proefdiervrije onderzoeksmethoden
(inbreng genodigden)

Blok 3
Blok 3: Implementatie van
proefdiervrije onderzoeksmethoden (15.30 - 16.15 uur)

Donderdag 14 september 2017
14.00 – 17.00 uur

Deze reader is uitsluitend voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek.

Convocatie

Theo Vermeire

De vaste commissie voor Economische Zaken van de Tweede Kamer
Rondetafelgesprek over de ontwikkeling van proefdiervrije
onderzoeksmethoden op 14-09-2017

Standpunten implementatie van proefdiervrije
onderzoeksmethoden

A. van Leeuwenhoeklaan 9
3721 MA Bilthoven
Postbus 1
3720 BA Bilthoven
www.rivm.nl
KvK Utrecht 30276683
T 030 274 91 11
F 030 274 29 71
info@rivm.nl

Theo Vermeire, senior wetenschappelijk medewerker RIVM, toxicoloog,
voorzitter SCHEER (Scientific Committee on Health, Environmental and
Emerging Risks)

Voor een succesvolle implementatie van proefdiervrije onderzoeksmethoden moet de aandacht gericht zijn op dierenwelzijn, veiligheid, en
innovatie van methoden.
De verwachting is dat wetenschappelijke innovaties geleidelijk aan
standaard onderzoeksmethoden opleveren die proefdiervrij en efficiënter
zijn zonder dat de veiligheid van stoffen en producten voor mens en milieu
in het geding komt. Wetenschappelijk zijn al een aantal flinke stappen
gezet: resultaten van proefdiervrije methoden leveren data voor bepaalde
aspecten en inzicht in schadelijke eigenschappen van stoffen. Op
eenvoudige deelgebieden van de toxicologie werkt dit al, bijvoorbeeld voor
irritatie en overgevoeligheid, de uitdaging ligt in de uitbreiding daarvan
naar alle gebieden van de gevaarsbeoordeling en risicoschatting van
stoffen.
Er liggen grote uitdagingen in de implementatie van proefdiervrije
methoden.
1. Wetenschappelijke uitdagingen
Wetenschappelijke uitdagingen liggen er in de ontwikkeling van nieuwe
teststrategieën gebaseerd op systemische biologie, toxiciteitsmechanismen
en chemische structuurinformatie. Uitgangspunt hier dient te zijn: welke
innovatieve proefdiervrije methoden hebben we of kunnen we op korte
termijn ontwikkelen om de veiligheid van stoffen en producten te testen.
Een dierproef wordt vervangen door een aantal proefdiervrije methoden
die samen een beeld moeten geven van de schadelijkheid van een stof. De
nieuwe methoden moeten voldoende gestandaardiseerd zijn en liefst beter
dan de klassieke benadering. Met de nieuwe teststrategieën zullen ook
effecten onderzocht moeten worden die tot nu toe minder goed in beeld
kwamen in dierexperimenteel onderzoek zoals bepaalde typen
hormoonverstoring en effecten op de ontwikkeling van het zenuwstelsel en
het immuunsysteem. De onzekerheden door extrapolatie van proefdier
naar mens vervallen. Daarvoor komt in de plaats onzekerheid in de
vertaling van in-vitro-systemen naar de mens. De validatie van innovaties
zal anders en sneller moeten dan tot nu toe gebruikelijk. Er zal veel
aandacht nodig zijn voor de reproduceerbaarheid van teststrategieën.

GEWIJZIGD: 4-9-2017

3.2 VERMEIRE

Pagina 1 van 2

Convocatie

Standpunten implementatie van proefdiervrije
onderzoeksmethoden

2. Wettelijke-juridische uitdagingen
Implementatie vereist ook acceptatie van methoden en uitkomsten door
alle belanghebbende partijen op internationaal (bijvoorbeeld EU, OESO)
niveau en een zoveel mogelijk geharmoniseerde doorvoering in wet- en
regelgeving. Acceptatie van nieuwe methoden betekent ook acceptatie van
maatregelen over het gebruik van stoffen op grond van zowel positieve als
negatieve uitkomsten van deze nieuwe methoden.
Er zijn positieve en negatieve consequenties te verwachten voor
marktpartijen bijvoorbeeld wanneer meer eindpunten onderzocht kunnen
worden dan nu het geval is of wanneer nieuwe criteria moeten worden
geformuleerd voor indeling van stoffen. De juridische basis van de nieuwe
beslissingscriteria en daarmee de impact op veiligheid en markt moet
helder zijn en zoveel mogelijk internationaal geharmoniseerd.
3. Socio-economische uitdagingen
De maatschappelijke acceptatie van proefdiervrije onderzoeksmethoden is
op het eerste gezicht groot. Toch vergt dit een brede maatschappelijke
discussie over het evenwicht tussen dierenwelzijn, veiligheid en innovatie.
De nieuwe methoden van gevaar- en risicoschatting moeten niet alleen
voldoende informatie leveren over de veiligheid voor de mens. Die
veiligheid moet ook zo ervaren moet worden door de maatschappij. In die
discussie moet een goed beeld worden verkregen van de onzekerheden in
de traditionele aanpak en die in de innovatieve benaderingen en dus van
de baten (verhoogd dierenwelzijn, onderzoek met humane cellen) versus
de kosten (investeringen in ontwikkeling en implementatie, winst van
implementatie versus onzekerheden in de innovatieve aanpak).
Bij de betrokken partijen, bijvoorbeeld wetenschappers en beleidsmakers,
kunnen weerstanden tegen verandering aanwezig zijn, onder andere
vanwege gevestigde belangen.
Gezien de uitdagingen kunnen een aantal aanbevelingen voor succesvolle
implementatie van proefdiervrije methoden gegeven worden.
- Nodig is een stevige nationale en internationale regie en coördinatie op
alle betrokken partijen in wetenschap, politiek en beleid op
methodiekontwikkeling, validatie, implementatie gebaseerd op up-todate kennis van de biologie, chemie en toxicologie en relevant voor
een goede risico-evaluatie en classificatie van stoffen en producten.
- Nodig is internationale acceptatie van de nieuwe teststrategieën en
van de verkregen uitkomsten op basis van snellere
validatiemechanismen gebaseerd op afspraken over interpretatie en
bewijskracht van gegevens en prestatie-eisen voor nieuwe methoden.
- Het tijdpad van wettelijke verankering moet zoveel mogelijke
synchroon lopen met de beschikbaarheid van internationaal
geaccepteerde methoden.
- Een dialoog met belanghebbenden om de nieuwe aanpak en dus ook
de uitkomsten, bijvoorbeeld t.a.v. maatregelen van gebruik, te
accepteren en niet alsnog over te gaan tot dierproeven bijvoorbeeld
wanneer beperkingen t.a.v. gebruik worden voorgesteld.
Een maatschappelijke discussie over de nieuwe aanpak en haar vooren nadelen is essentieel om acceptatie hiervan mogelijk te maken, het
vertrouwen te winnen en de ervaren veiligheid van het gebruik van
stoffen te vergroten.
GEWIJZIGD: 4-9-2017

3.2 VERMEIRE

Pagina 2 van 2

Convocatie

Herman Koëter

> Retouradres Postbus 20401 2500 EK Den Haag

Postbus 20401
2500 EK Den Haag
www.ncadierproevenbeleid.nl
Contactpersoon

T0900 2800028
NCad@minez.nl

Datum: 5 september 2017
Onderwerp: schriftelijke bijdrage NCad voor rondetafelgesprek over de
ontwikkeling van proefdiervrije onderzoeksmethoden

Onze referentie
NCad-2017-171

Geachte leden van de vaste commissie voor Economische Zaken,
Ter voorbereiding en verdieping en van het rondetafelgesprek over proefdiervrije
onderzoeksmethoden , ontvangt u hierbij een bijdrage van het Nationaal Comité
advies dierproevenbeleid (NCad)i.
In antwoord op zijn verzoek om een ‘afbouwschema voor dierproeven’ heeft het
NCad eind 2016 het advies ‘Transitie naar proefdiervrij onderzoek’ii aangeboden
aan de staatssecretaris van EZ en samengevat in een toegankelijke whiteboard
animatieiii. Dit advies en de activiteiten die naar aanleiding daarvan tot nu toe
hebben plaatsgevonden leiden tot een aantal actiepunten die naar de mening van
het NCad essentieel zijn voor de ontwikkeling van proefdiervrije innovaties;
1.
Voorlopers in innovatieve gezondheid, levenswetenschappen en 3V’s
behouden en stimuleren;
2.
Vanuit een gezamenlijke ambitie streven naar proefdiervrije, innovatieve,
excellente wetenschap;
3.
Samenwerking van alle betrokken partijen in binnen- en buitenland;
4.
Daadkrachtige regie op de transitie.
1. Voorlopers in innovatieve gezondheid, levenswetenschappen en 3V’s
behouden en stimuleren
‘In 2025 Wereldleider proefdiervrije innovaties’, dat is de ambitie die
Staatssecretaris Van Dam voor ons land uitsprak. In haar advies heeft het NCad
aangegeven dat het op het vlak van regulatoir veiligheidsonderzoek, dat wil
zeggen het wettelijk voorgeschreven onderzoek voor de toelating van stoffen en
geneesmiddelen, mogelijk moet zijn in 2025 afscheid te nemen van dierproeven,
zoals voor cosmetica nu reeds het geval is. In overige domeinen van
fundamenteel, toegepast en toepassingsgericht onderzoek kunnen ook zeker
stappen gemaakt worden, maar die verschillen sterk per domein. Daarom heeft
het NCad geadviseerd per domein streefbeelden voor dierproefvrije innovaties op
te stellen. Dit advies heeft in de publieke beeldvorming echter aan nuance
verloren en is daardoor te vaak ten onrechte opgevat als een totaalverbod op alle
dierproeven per 2025.
De weerstand tegen dierproeven -op grond van wetenschappelijke, ethische of
economische argumenten- staat veelal op gespannen voet met de behoefte aan
kennis en aan de ontwikkeling van nieuwe, veiligere en betere geneesmiddelen,
behandelmethoden en producten, zeker ook met betrekking tot ingrijpende of
chronische aandoeningen. In ons land vindt dergelijk onderzoek en ontwikkeling

Pagina 1 van 4

Convocatie

plaats in een kwalitatief hoogstaand wetenschappelijk onderzoeksysteem waarin
proefdieren nog altijd een belangrijke rol hebben en dat sterk gereguleerd is door
wet- en regelgeving die de intrinsieke waarde van het dier en het 3V-principe
centraal stelt. Bij het vormgeven van beleid dient het risico in acht genomen te
worden dat kwalitatief goed onderzoek verplaatst wordt naar het verre buitenland,
waar proefdierenwelzijn veelal minder goed beschermd wordt.

Datum
5 september 2017
Onze referentie
NCad-2017-171

Daarom is het gewenst om het Nederlandse beleid vooral te richten op het behoud
van en verder stimuleren van de internationale voorbeeldpositie en de voorlopers
op het gebied van de 3V’s. Het NCad en het RIVM benaderen instellingen en
onderzoekers in het buitenland die zich graag verbinden aan het Nederlandse
initiatief. Zodoende is een start gemaakt met het uitbreiden van een netwerk van
innovatieve wetenschappers.

2. Vanuit een gezamenlijke ambitie streven naar proefdiervrije,
innovatieve, excellente wetenschap
Het NCad pleit ervoor dat afscheid wordt genomen van bestaande denkwijzen en
praktijken, met name in het regulatoire veiligheidsonderzoek. Ook in
wetenschappelijke kringen dringt het besef steeds meer door dat met dierproeven
kennis wordt vergaard over toxiciteit en veiligheid, die suboptimaal is als het gaat
over de bescherming van de mens. Resultaten uit de traditionele dierproeven
worden onterecht als 100% vertaalbaar naar de mens beschouwd en data uit
alternatieve of innovatieve proefdiervrije methoden als risicovol. Om verbetering
van de gezondheidszorg en de wetenschappelijke kwaliteit te kunnen realiseren
zijn robuuste, betrouwbare, en voor de mens meer voorspellende innovatieve
onderzoeksmodellen dan dierproeven, noodzakelijk.
Om de politieke ambities waar te maken en –nationaal en internationaal- de
beweging richting proefdiervrij onderzoek te versnellen is in het regulatoire
risicobeoordelingsveld één-op-één vervanging van afzonderlijke dierproeven door
3V-methoden geen realistische optie.
Het NCad spreekt in haar advies ’Transitie naar proefdiervrij onderzoek’ over een
systeem in verandering waarbij dierproeven niet langer gezien worden als de
gouden standaard. Deze verandering vergt een grote inspanning van alle
betrokken actoren: wetenschap, industrie, samenleving én overheid om tot een
andere risicobenadering te komen, die uiteindelijk mens en dier dient. Openheid
en transparantie over de risico’s en beperkingen van onderzoeksmodellen draagt
bij aan een minder polariserend en meer constructief maatschappelijk debat over
dierproeven en de mogelijkheden voor afbouw daarvan. Ook eerlijke
communicatie over risico’s, verwachtingen en de mogelijkheid van succes én falen
van kansrijke innovaties dient daarin een plek te krijgen.
In een aantal velden van het fundamentele en toegepaste onderzoek zijn nieuwe
wetenschappelijke ontwikkelingen en behandelmethoden nu nog afhankelijk van
dierproeven. Ook in deze velden is een kritische houding ten aanzien van het
voortgaan op eerder ingeslagen wegen noodzakelijk. Ook hier geldt dat voor de
mens meer voorspellende innovatieve onderzoeksmodellen ingezet zouden
moeten worden. In deze velden adviseert het NCad om per onderzoeksdomein
streefbeelden voor proefdiervrije innovatie op te stellen om de mogelijkheden van
en trends in proefdiervrije innovaties in kaart te brengen en optimaal te benutten.
In de context van kennisdeling en het beschikbaar maken van bruikbare
gegevens, dienen bovendien open data en het publiceren van negatieve en
onverwachte onderzoeksresultaten gestimuleerd te worden.

Pagina 2 van 4

Convocatie

3. Samenwerking van alle betrokken partijen in binnen- en buitenland
Het NCad geeft in haar advies de complexiteit van het speelveld aan, waarbij veel
(internationale) partijen betrokken zijn. De stakeholders hebben elk verschillende
belangen bij dierproeven, maar delen ook waarden, zoals ‘goede
gezondheidszorg’, ‘bescherming van mens, dier en milieu’, ‘goede wetenschap’ en
‘vermindering dierenleed’. Al deze waarden zijn gebaat bij een focus op
proefdiervrije innovaties. Om die innovaties te stimuleren is het van belang dat
optimaal gebruik wordt gemaakt van kennis, door intensieve multidisciplinaire en
cross-sectorale samenwerking.

Datum
5 september 2017
Onze referentie
NCad-2017-171

Ondanks de inzet van ZonMw, zijn dierproefvrije innovaties nog onvoldoende
verankerd in het innovatiebeleid. Het zijn nog teveel afzonderlijke bewegingen in
gescheiden werelden. Daardoor wordt de potentie van technische innovaties, die
met een heel ander doel en binnen een heel andere onderzoeksdiscipline zijn
ontwikkeld, voor proefdiervrij onderzoek binnen het biomedisch onderzoek vaak
niet onderkend. Hier valt dus winst te behalen.
Een van de punten die uit de evaluatie van het topsectorenbeleid naar voren
kwam, was de noodzaak verbinding te zoeken met maatschappelijke vraagstukken
en –ontwikkelingen. Het NCad adviseert de transitie naar proefdiervrij onderzoek
integraal onderdeel te maken van het topsectorenbeleid en om dit als herkenbaar
onderwerp op te nemen in de Nationale Wetenschapsagenda. Ook de koppeling
naar de Europese onderzoeksagenda’s, zoals Horizon2020, is daarbij van groot
belang.
Dit brengt ook de noodzaak met zich mee dat het onderwerp proefdiervrije
innovaties meer wordt gezien als een interdepartementale gezamenlijke opgave,
waarbij het mes aan meerdere kanten snijdt;
Betere wetenschap ten behoeve van de maatschappij;
Vervanging, Vermindering en Verfijning van proefdiergebruik;
Versterking van de kenniseconomie.
4. Daadkrachtige regie voeren op de transitie
Om succesvol stappen te zetten is het naar de overtuiging van het NCad
noodzakelijk dat er een stevige regie gevoerd wordt op de implementatie van haar
advies. Het gebruik van proefdieren raakt immers de verantwoordelijkheid van
niet alleen de departementen van EZ en VWS, maar ook die van IM en DEF en
OCW voor wat betreft toelatingskaders, gebruik, en kennis en innovatiebeleid.
Ook in de EU raakt dit onderwerp aan de verantwoordelijkheid van vele
directoraten-generaal. Mondiaal is eveneens sprake van een zeer breed veld. Om
tot snellere ontwikkeling, acceptatie en implementatie te komen van proefdiervrije
innovaties zal een interdepartementaal gebundelde inspanning nodig zijn, die ook
structureel van aard is. Het NCad bepleit dat EZ daarop de regie voert.
Het proefdiergebruik kan in ons land niet in isolement worden gereduceerd of
afgebouwd, omdat de regelgeving rondom dierproeven op interdepartementaal,
Europees en mondiaal niveau tot stand komt. Bovendien opereren zowel
kennisinstellingen als het bedrijfsleven in internationale consortia en
afzetmarkten. Dit vereist een stevige en gecoördineerde lobby en coalitievorming
op Europees en zelfs mondiaal niveau. Politiek, departementen en
vertegenwoordigers van de wetenschap, patiëntenorganisaties en
dierenbeschermingsorganisaties moeten een actieve rol spelen in het uitdragen
van de mogelijkheden.
In haar advies bepleit het NCad daarbij langs de volgende lijnen tot een
uitwerking te komen.

Pagina 3 van 4

Convocatie

Volgens het NCad kunnen in het wettelijk voorgeschreven (veiligheids-)onderzoek
dierproeven binnen afzienbare tijd worden uitgefaseerd. Het RIVM werkt
momenteel aan een plan van aanpak voor de gecoördineerde en
interdepartementale inzet die nodig is om de benodigde aanpassing van nationale,
Europese en mondiale wettelijke kaders te realiseren.
In veel fundamenteel wetenschappelijke en toegepaste onderzoeksdomeinen lijkt
afbouw van het proefdiergebruik lastiger en verschillen de mogelijkheden per
onderzoeksdomein. Om ook in deze domeinen een beweging in te zetten richting
proefdiervrije innovaties, zullen de komende maanden, onder coördinatie van de
KNAW en het NCad, de eerste streefbeelden voor proefdiervrije innovatie worden
opgesteld, te beginnen met een pilot voor het fundamenteel wetenschappelijke
domein van het hersenonderzoek. Ook voor het toegepaste onderzoek en voor het
domein van dierproeven voor onderwijs en training stelt het NCad voor met pilots
aan de gang te gaan die daarna een breder vervolg kunnen krijgen.
Bij de dierproeven die desondanks voorlopig noodzakelijk blijven, verdient het
principe van de 3V’s –en met name de V’s van vermindering en verfijningonverminderd aandacht, om een optimaal proefdierenwelzijn te waarborgen.
Elk streefbeeld wordt opgesteld door experts vanuit het betreffende domein, in
samenwerking met creatieve ‘anders-denkers’ en blijft eigendom en
verantwoordelijkheid van het werkveld binnen dat domein. Streefbeelden geven
richting aan de innovatie, maar zijn voldoende flexibel om experimenteren
mogelijk te maken. Een systeem in transitie is immers geen lineair proces, het is
een langdurig proces van richting geven, experimenteren, evalueren en bijsturen,
vallen en opstaan.

Datum
5 september 2017
Onze referentie
NCad-2017-171

Hoogachtend,
Herman Koëter,
Voorzitter Nationaal Comité advies dierproevenbeleid (NCad)

i

Het NCad is in december2014 door de staatssecretaris van EZ ingesteld als onafhankelijk
adviesorgaan en heeft sindsdien negen beleids-adviesrapporten uitgebracht en twee technische Codes
of Practice (beste praktijken) ten behoeve van het dierexperimentele werkveld. In haar werk benadert
het NCad de onderwerpen van de haar gestelde adviesvragen vanuit meerdere invalshoeken:
technisch wetenschappelijk, ethisch en maatschappelijk, waarbij zoveel mogelijk kennis en ervaring uit
binnen- en buitenland wordt gebruikt. Ook worden experts uit binnen- en buitenland geconsulteerd,
evenals maatschappelijke groeperingen. De intrinsieke waarde van het dier en het 3V-principe van de
Vervanging, Vermindering en Verfijning van dierproeven staan centraal.
ii
https://www.ncadierproevenbeleid.nl/adviezen-ncad/documenten/rapport/2016/12/15/ncadadvies-transitie-naar-proefdiervrij-onderzoek
iii
https://www.ncadierproevenbeleid.nl/actueel/nieuws/16/12/15/white-board-animatie-transitieproefdiervrij-onderzoek

Pagina 4 van 4

Convocatie

Marie-Jeanne Schiffelers

Conservatisme leidt tot moeizame acceptatie proefdiervrije innovaties
Er worden meer proefdieren gebruikt dan nodig. Goede alternatieven zijn steeds meer
voorhanden, maar acceptatie en toepassing gaat moeizaam. Waarom? Risicoaversie en
conservatisme, zo concludeert Marie-Jeanne Schiffelers. 1
Jaarlijks worden in Europa zo’n 11,5 miljoen proefdieren gebruikt voor biomedische doeleinden.
Vanuit de stakeholdergroepen wetenschappers, beleidsmakers en de industrie rijzen steeds meer
vragen over het nut van proefdierengebruik. Zo blijken resultaten behaald met
proefdierenonderzoek lang niet altijd te vertalen naar mensen. Het is daarom van belang de transitie
richting 3V modellen (verfijnings-, verminderings- en vervangings- modellen) te stimuleren. Het
aantal beschikbare zogenaamde 3V-modellen neemt toe. Zo kunnen steeds meer experimenten
gedaan worden op bijvoorbeeld celkweken of aan de hand van computersimulaties. Dat leidt ertoe
dat er soms geen dieren meer nodig zijn (vervangen). In andere gevallen worden minder proefdieren
gebruikt (verminderen) en als er alsnog proefdieren worden gebruikt kan het lijden van de
proefdieren verlicht worden (verfijnen).
Er zijn in veel gevallen goede alternatieven voor dierproeven beschikbaar maar de acceptatie ervan
verloopt moeizaam. In juni 2016 promoveerde Marie-Jeanne Schiffelers (senior adviseur en
onderzoeker bij het departement Bestuurs-en Organisatiewetenschappen van de Universiteit
Utrecht) op de vraag waarom deze acceptatie zo moeizaam verloopt en hoe dit proces eventueel
versneld zou kunnen worden. Hierbij lag de focus op het proefdiergebruik voor de beoordeling van
stoffen, producten en medicijnen op veiligheid en werkzaamheid. Dit is goed voor ongeveer een
kwart van het totale proefdierengebruik.2
Conservatisme
De moeizame acceptatie wordt veroorzaakt door factoren op drie verschillende niveaus (macro,
meso en micro). Zo is in onze samenleving (macroniveau) steeds meer sprake van risicoaversie.
Vanuit de maatschappij en daarmee vanuit de politiek klinkt een luide roep om veiligheid. Wetten en
regels die mens en milieu moeten beschermen zijn dientengevolge streng en worden steeds verder
aangescherpt (mesoniveau). Hierbij is vaak onvoldoende oog voor de effecten van deze
aanscherpingen op bijvoorbeeld de inzet van proefdieren. Ook leidt het tot angst om oude
werkwijzen te veranderen. Producenten en beoordelaars van producten zijn daardoor vaak
terughoudend in het toepassen van 3V-modellen en innovaties blijven daardoor onnodig lang hangen
in de kraamkamers waar ze ontwikkeld en getest zijn (microniveau).
Kortom door de risicoaversie verloopt de transitie naar alternatieven erg moeizaam. De angst voor
eventuele gevolgen als er iets misgaat door invoering van alternatieven voor proefdieren voert de
boventoon. Zelfs als de alternatieven wetenschappelijk gezien de voorkeur verdienen, bijvoorbeeld
omdat ze een betere voorspellende waarde hebben. Een beleidsmaker vanuit de Europese
Commissie die Schiffelers in het kader van haar promotieonderzoek interviewde verwoorde het
treffend als volgt: “het is beter om tien keer niet te veranderen dan negen keer een verbetering door
te voeren en één keer een verslechtering.’’ Dit conservatisme trof Schiffelers aan bij wetenschappers,
de overheid, de controlerende autoriteiten en de tijdschriften die studies publiceren.

1

Zie ook: http://www.nporadio1.nl/wetenschap-techniek/191-waarom-we-toekunnen-met-minderproefdieren-veel-minder-proefdieren
https://www.ntr.nl/De-Kennis-van-Nu-Radio/139/detail/De-Kennis-van-Nu-/RBX_NTR_618523
2
Zie: https://dspace.library.uu.nl/handle/1874/334103

Convocatie

Schijnzekerheid
Proefdiergebruik en veiligheid worden nu nog te vaak aan elkaar gekoppeld. Dit is onterecht en
creëert een ‘schijnzekerheid’. In veel gevallen blijkt het proefdiermodel een black box te zijn waarvan
de precieze werking veel te raden overlaat. Ook het vertalen van de effecten bij het proefdier naar
de mens is door talloze onzekerheden omgeven. Innovatieve testmethoden ondervangen een deel
van deze problemen doordat ze beter reproduceerbaar zijn dan het diermodel en/of een grotere
voorspellende waarde hebben.
Oplossingsrichtingen
De centrale vraag is dan ook hoe de moeizame acceptatie van deze innovatieve testmodellen op
gang geholpen kan worden. Hiervoor is het transitie denken, dat Schiffelers in haar
promotieonderzoek gehanteerd heeft en dat inmiddels ook een prominente plek heeft gekregen in
het Nederlandse beleid rondom proefdiergebruik en proefdiervrij innovaties, erg behulpzaam. Dit
transitie denken maakt onderscheid tussen het eerder genoemde macro-, meso- en micro niveau
waarin niet alleen factoren te vinden zijn die de moeizame acceptatie veroorzaken maar waarin ook
de mogelijke oplossingsrichtingen liggen.
Zo is het bijvoorbeeld op het microniveau van groot belang dat toekomstige gebruikers nauw
betrokken zijn bij de ontwikkeling van de innovatieve testmodellen en bij de discussies over de inzet
ervan. Verder is bewustwording van en een open discussie over de betrekkelijke waarde van
dierproeven en de potentiële waarde van alternatieven belangrijk. Op het mesoniveau is het onder
meer belangrijk dat er duidelijk (Europees) beleid komt. Het ontbreekt op dit moment aan een
heldere Europese ambitie voor de invoer van alternatieven of een tijdspad daarvoor zoals dat voor
Nederland eind 2016 wel is geformuleerd voor Nederland in opdracht van ex-staatsecretaris Van
Dam.
Op het macroniveau is het van belang de discussie te voeren over ogenschijnlijk botsende waarden
en belangen op het vlak van veiligheid enerzijds en innovatie anderzijds. Door dit gesprek te blijven
voeren kan duidelijk worden dat veel van deze belangen congruent in plaats van conflicterend zijn.
Tot slot vraagt de transitie naar proefdiervrij innovaties commitment van en samenwerking
(coöperatie) en communicatie tussen de betrokken stakeholders en een goede coördinatie van het
proces. De zogeheten 4C’s.

Dr. M.J.W.A (Marie-Jeanne) Schiffelers | Senior Consultant | USBO Advies| Universiteit Utrecht | Faculteit
Recht, Economie, Bestuur en Organisatie | Departement Bestuurs- en Organisatiewetenschap (USBO) |
Bijlhouwerstraat 6, 3511 ZC Utrecht |

030-2539178/8101|

[m.j.w.a.schiffelers@uu.nl]|

Convocatie

Menk Prinsen

Blok 3: Implementatie van proefdiervrije onderzoeksmethoden
Menk Prinsen, Toxicoloog, Triskelion BV
Sinds 1982 werkzaam op het gebied van in vitro oogirritatie ter vervanging van
de Draize test met konijnen. (Mede)ontwikkelaar van de in vitro test met
geïsoleerde ogen afkomstig van slachtkippen (OECD testrichtlijn 438).

Introductie
Met de sterke opkomst van de chemische industrie in de 20ste eeuw werd
duidelijk dat de omstandigheden op de werkplek nadelige effecten op veiligheid
en gezondheid van de mens kon hebben. Een van de vele risico’s bij het omgaan
met (gevaarlijke) stoffen is het in de ogen krijgen van het product. Al in 1944
publiceerde de Amerikaan John Draize een artikel met daarin een beschrijving
van onderzoeksmethoden voor het vaststellen van toxiciteit en irritatie van
stoffen die op huid en slijmvliezen worden toegediend, waaronder de oogirritatie
test bij konijnen en de LD50 (Lethale Dosis) test.
In 1961 schreef de Amerikaanse toelatingsautoriteit de “Food and Drug
Administration” (FDA) deze test met konijnen (de zogenaamde Draize test) voor
om stoffen te testen op hun oogirriterende eigenschappen. Internationaal
adopteerde de OESO (Organisatie voor Economische Samenwerking en
Ontwikkeling) de Draize test in 1981, gevolgd door de Europese Unie in 1984.
Sindsdien zijn de OECD/EC richtlijnen verschillende keren aangepast, maar de
praktische uitvoering van de test bleef onveranderd tot pas in 2012 lokale en
systemische pijnverlichting voor de konijnen werd geïntroduceerd.

Vervanging Draize konijnen oogirritatietest
Begin 80-er jaren van de vorige eeuw is men al begonnen met het onderzoek ter
vervanging van de Draize test, toen algemeen beschouwd als één van de meest
pijnlijke veiligheidstesten. Deze toxiciteitstest werd als een redelijk simpele test
beschouwd, want met een éénmalige toediening en het meten van “slechts”
lokale effecten. De verwachting was dat de vervanging door een proefdiervrij
alternatief 5-7 jaar zou duren. Pas in 2009 werden twee alternatieve methoden
officieel erkend, maar alleen voor de identificatie van de categorie “ernstig
oogirriterende” stoffen, en later in 2013 voor de identificatie van de categorie
“niet-irriterende” stoffen. De overige categorie “irriterende” stoffen dient nog
steeds met de Draize konijnen test geïdentificeerd te worden. Gedeeltelijke
implementatie van proefdiervrije onderzoeksmethoden voor deze Draize test
heeft dus nu al meer dan 30 jaar geduurd.

Convocatie

Oorzaken
Er zijn diverse redenen voor dit langdurige proces van validatie, acceptatie en
implementatie van de proefdiervrije alternatieven. Voor het grootste gedeelte
heeft dit te maken met de aard van deze specifieke test met konijnen.
De blootstelling en behandeling van de konijnen is zeer onrealistisch t.o.v. de
mogelijke blootstelling bij de mens. De betrouwbaarheid van de in vivo
(konijnen) data voor validatie van de alternatieven, met name in de categorie
irriterende stoffen, is bijna nihil. Dit feit is altijd terzijde geschoven door de
instanties die betrokken zijn bij de beoordeling van deze proefdiervrije
alternatieven. Voor nadere details adviseer ik om de navolgende publicaties te
lezen (zie bijlagen).
1.
2.

M.K. Prinsen. The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology In Vitro 20 (2006) 78-81.
M.K. Prinsen, C.F.M. Hendriksen, C.A.M. Krul, R.A. Woutersen (2017). The Isolated Chicken Eye test to replace the Draize
test in rabbits. Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132-149.

Noemenswaardig is het feit dat de Household en Personal Care industrie (Procter
& Gamble, Unilever, Henkel etc.) al jaren deze alternatieven voor oogirritatie
gebruikt voor het testen van hun producten. Deze producten vallen over het
algemeen in de categorie “irriterend”, juist die categorie waarvoor de
alternatieven niet zijn toegelaten.

Stellingname
Bij de implementatie van proefdiervrije alternatieven (daaronder versta ik het
complete proces van introductie, validatie en acceptatie) zou ik de volgende
stellingen willen deponeren:

1. Dier experimentele data moeten niet langer als de “gouden Standaard”
worden beschouwd.
2. De tekortkomingen van het dierexperiment dienen in kaart gebracht te
worden en de implicaties daarvan voor de implementatie van
proefdiervrije alternatieven.
3. Vooraf moet met alle belanghebbende partijen een inventaris gemaakt
worden van de factoren die een (regulatoire) acceptatie beïnvloeden.
4. De selectie van kandidaat proefdiervrije methode dient kritischer te
worden gemaakt dan in het verleden. De methode moet een directe
relatie hebben met de humane situatie en niet per se met de diertest.
5. Een 100% risicovrije (toxvrije) samenleving is “wishful thinking”.

Convocatie

Toxicology in Vitro 20 (2006) 78–81
www.elsevier.com/locate/toxinvit

Discussion

The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage?
M.K. Prinsen *
TNO Quality of Life, Toxicology and Applied Pharmacology, P.O. Box 360, 3700 AJ, Zeist, Utrechtseweg 48, 3704 HE, The Netherlands
Received 20 June 2005; accepted 20 June 2005
Available online 1 August 2005

Keywords: Draize Eye Test; Validation; In vitro assay

1. Variability of the Draize Test

2. Exposure conditions in the Draize Test

No other animal test like the Draize Eye Irritation
Test has been as controversial to replacement by
in vitro methods, while initially it was believed to be
one of the ÔsimplestÕ animal tests to be replaced. Since
the early 1980s numerous alternatives have been
developed, with some being submitted to validation,
but without ﬁnding a single test or set of tests for replacing the animal test. Why is this? For many of the alternatives, it soon became clear that the chosen test system
had not enough relevance with respect to eye irritation
as was hoped for. For instance, a test system measuring
decreased sperm mobility/motility provides some
information on cytotoxicity in general, but not speciﬁcally on toxicity to corneal or conjunctival tissue. The
fact that the toxicity measured by the test system has
to be translated to speciﬁc (rabbit) ocular toxicity is
the basis for most of the problems encountered. Furthermore, the variability of the Draize Eye Test, especially in the middle range of irritancy adds to this
problem. The factors contributing to this variability
are meanwhile well-known and recognized by the
scientiﬁc world. The variability is mainly caused by the
subjective scoring by diﬀerent observers and interlaboratory variability.

What is not highlighted in the discussions so far,
however, is surprisingly enough the conduct and course
of the test itself, although several investigators have discussed the unrealistic exposure conditions of the Draize
Eye Test, i.e., instillation in the conjunctival cul-de-sac
of the rabbits eye, compared to potential human exposure (Freeberg et al., 1986; Roggeband et al., 2000).
For most routine acute and repeat toxicity tests, standard exposure times and/or delivery of dosage (orally,
intravenously, etc.) are well-deﬁned. In the dermal irritation test, for example, the entire dosage is held by a
patch onto the skin for an exact period of time. In the
eye irritation test, however, neither of these well-deﬁned
conditions exists. For liquids, pastes and solids, it is
impossible to estimate how much and for how long
the test substance stays in contact with the eye. For
aqueous, non-viscous formulations the standard instillation of 0.1 ml in the conjunctival cul-de-sac of the rabbit
and the holding of the eye-lids for 1 s, results in a rapid
removal of the material within seconds/minutes through
blinking with the nictitating membrane (third eye-lid)
and grooming by the rabbit.
This contrasts with the situation for sticky pastes for
example, which cannot be removed that easily. The most
dramatic variation in contact time and dosage occurs
with solids. Even if applied as a 0.1 ml equivalent (the
content of the cul-de-sac), the actual amount of a powder/solid that stays in contact with the eye is unpredictable. More importantly, the contact time may vary from
a couple of minutes to 24 h, because rinsing the eye is

*

Tel.: +31 30 69 44 558; fax: +31 30 69 60 264.
E-mail address: prinsen@voeding.tno.nl

0887-2333/$ - see front matter Ó 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.tiv.2005.06.030

Convocatie
M.K. Prinsen / Toxicology in Vitro 20 (2006) 78–81

not allowed before the 24-h reading (only recently changed to 1 h for solids in the 2002 update of OECD guideline no. 405).

3. Testing of solids and variability
From ethical and scientiﬁc points of view, it is unbelievable that this situation still exists. Having carried
out the test since 1981, it became increasingly diﬃcult
for me to adhere to this non-rinsing practice. Unintentionally, I discovered that the problem could be solved
by manipulation of the eye-lids of the rabbit at the 1 h
observation time point in such a way that any remnants
of the test material present could be removed without
rinsing. This process was always recorded in our reports,
but never resulted in any comment on this deviation from
the guideline. It is striking how few reports on eye irritation even mention the presence of remnants of powders/
solids in the eye at the 1-h and/or 24-h observation time
points, whereas it should be a common ﬁnding. The
enclosure of solid materials up to 24 h in the conjunctival
cul-de-sac, sometimes in combination with mechanical
damage, can have a devastating eﬀect on the eye. In the
case of poorly water-soluble solids with distinct cytotoxic
properties, the entrapped solid can rapidly cause a considerable and increasing degree of swelling of the conjunctivae, making it even more diﬃcult for the animal
to remove the material. If, at the 1-h observation, the
lower eye-lid is not pulled away far enough by the observer, it can stay unnoticed that a bulk of test material lays
deeply hidden in the conjunctival cul-de-sac.
Often, this forced continuous exposure for the next
24 h results in a complete closure of the eye-lids by the
abundant production of colloidal discharge which often
forms a sealing crust. Upon opening these sealed eyelids, purulent discharge, and other inﬂammatory debris
are released. The degree of swelling of the conjunctivae
can be suﬃciently severe such that removal of any remains of the test substance is hardly possible anymore.
In the majority of these cases, the eye is permanently
damaged or can only be saved by applying special care,
such as regular daily cleaning and rinsing of the eye and
eye-lids, often including cutting oﬀ the eye-lashes to prevent further sealing. In general, keeping the eye-lids
open is essential for the recovery process, otherwise
the enclosed inﬂammatory exudate will further damage
the cornea. If no further extensive remedial treatment
is given to the animal, the described exposure conditions
can easily cause an initial opacity score of 1 or 2 to develop into a score of 3 or 4. Also, the eye can become
vulnerable to microbiological infection (the so-called
secondary inﬂammatory process), causing initial mild
to moderate eﬀects during the ﬁrst days after exposure
developing into more severe and prolonged eﬀects during the 21 day observation period.

79

Without doubt such events will have occurred in
other laboratories in the past, and probably will continue to occur, even with application of the present 1-h
rinsing protocol for solids now in place. The events described here are of course not typical for all solids.
Many of the solids are inert and form an unharmful
bulk which can easily be removed by the animal or the
observer, or they are well water-soluble and have already disappeared at the 1-h observation time point.
However, the overall problem makes the Draize Eye
Test highly variable, even before the actual scoring of
eﬀects takes place. Therefore, even if the scoring could
be made more objective and less variable, the scores recorded will still represent a large variation. To my
knowledge, this important source of variability has
never been discussed, while its implication for any validation of alternative in vitro methods is very important.

4. Draize Test results and validation
Does this mean that we cannot use the data from the
Draize Eye Test for validation purposes at all? It seems
logical to assume that non-irritating or severely irritating hydrophilic liquids and non-irritating solids produce
reliable reactions in the Draize Eye Test. Extremely
variable results, however, will be obtained with sticky
pastes and solids in the moderate to severe range of irritancy and with hydrophobic solutions. Such data will be
unsuitable for the use as benchmarking data in the validation of in vitro methods. Apart from that, the kind of
entrapment of solids in the rabbit eye has little relevance, because it is highly unlikely to occur in humans,
accidentally or intentionally. For that reason, the lowvolume eye test (LVET) has been developed by the Procter and Gamble company (Griﬃth et al., 1980). In this
test, one-tenth of the original volume of 0.1 ml is administered directly onto the cornea of the rabbit and this is
believed to mimic human exposure more realistically.
From a safety standpoint, it is understandable that
the Draize Eye Test is still required by regulatory agencies, mostly because of the perceived higher sensitivity of
the rabbit eye compared to the human eye. However,
this perception has more to do with these exaggerated
exposure conditions rather than with speciﬁc ocular tissue sensitivity. In that light, it is praiseworthy that, several years ago, European regulatory agencies took the
initiative to accept in vitro screening of severe eye irritants by using isolated eyes or corneas, or the HenÕsegg chorioallantoic membrane (HET-CAM assay).
Recently, the Interagency Coordinating Committee
on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM)
and the National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological
Methods (NICEATM) of the United States of America
initiated a programme to oﬃcially adopt these alternatives

Convocatie
80

M.K. Prinsen / Toxicology in Vitro 20 (2006) 78–81

into the US-guidelines for the screening of severe eye
irritants. In this programme, the methods and the data
available are evaluated by a panel composed of national
and international experts. Although there was a general
awareness amongst the panel members concerning the
variability of the Draize Eye Test, the general attitude
was still to attempt to ﬁt in the in vitro methods with
the Draize Eye Test, rather than to address the validity
of the latter test. All emphasis is again on the statistical
evaluation of the in vivo and in vitro data. It is true that
the nature and quality of the in vivo and in vitro data
was examined in more detail, but mostly with the
intention of modifying/optimizing the in vitro assays,
rather than questioning the relevance of the in vivo
data. To some extent the ﬂaws of the rabbit test were
acknowledged, but this did not lead to any real changes
to the conduct of the test itself, whereas in vitro methods
are still judged against this ‘‘Gold Standard’’ and
repeatedly forced to have their methodologies adapted
to the rather unrealistic conditions of the Draize Eye
Test.
To give an example, ICCVAM evaluated the data of
the EC/HO validation study (Balls et al., 1995) in which
four candidates (Isolated Chicken Eye test, Isolated
Rabbit Eye test, HET-CAM assay, and Bovine Corneal
Opacity and Permeability test) selected by ICCVAM
participated. Twenty-two out of the 59 substances examined in this study were severe irritants and, for the purpose of selecting in vitro methods for screening severe
irritants, the data of these compounds (tested by four
labs per method) were useful. For the Isolated Chicken
Eye test (ICE), the ICCVAM panel concluded that it
could identify severe irritants but with a high false-negative rate, especially for solids. Of the 22 compounds,
the ICE identiﬁed 13 as severely irritating, 4 as irritating
and 5 as non, or borderline, irritating. The latter ﬁve
compounds were all solids. Remarkably, most of the
in vitro methods participating in the EC/HO study also
did not identify these compounds as severe irritants. Instead of questioning the in vivo exposure conditions of
solids, ICCVAM considered this to be a deﬁciency of
the in vitro method. Therefore, ICCVAM recommended
that the test method needed to be optimized with respect
to the exposure conditions for solids. Considering the
fact that we have to deal with in vivo exposures to solids
ranging from a couple of minutes up to 24 h, then standardization of the Draize Eye Test would be an appropriate recommendation.

5. How to proceed?
All suggestions for optimization/modiﬁcation—how
ever well intended they may seem to be—are driven by
the thought that they are needed because there is not
suﬃcient correlation with the in vivo ‘‘Gold Standard’’

test. The fact that these are totally uncontrolled and
non-standardized conditions in the in vivo test, which
cannot be modeled accurately by any of the in vitro
tests, seems to be ignored or of no concern to regulatory
bodies or to validation bodies like ICCVAM and ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods). Until the problems with the Draize
Test discussed in this paper are solved and taken account of, all eﬀorts to validate in vitro tests as complete
replacements for the in vivo test will be doomed to fail.
Since the ﬁrst international (pilot) validation (Commission of the European Communities, 1991) of alternatives for eye irritation was started in 1988, numerous
validations using optimized/modiﬁed/standardized
in vitro protocols have been carried out without any substantial success. We seem to be caught in a vicious circle
and, by now, after almost 18 years of validation, I think
it is time to conclude that further attempts will be futile,
if we keep on using ‘‘old’’ in vivo data or new data
generated by the current protocol for comparison. In
fact, since the very ﬁrst validation, most of the in vitro
tests have been used in practice for decision making by
many companies and have been accepted in Europe for
screening of severe irritants. Having carried out the
Draize Eye Test since 1981 and applied an in vitro/
ex vivo screen prior to any in vivo testing since 1992,
my recommendation would be a multi-way approach,
as follows:
(a) Immediate implementation in the guidelines (legislation) of the most current in vitro methods in the
testing strategy for screening of severe irritants, following current EC practice (CA, 2002). Many contract or company laboratories already have
extensive experience with the existing in vitro alternatives. Moreover, severe irritancy is not based on
the in vitro screen alone but often conﬁrmed
by other tests, such as skin irritation/corrosion
(in vivo and in vitro) and acute dermal toxicity.
Also indications of the possible (severe) irritating
properties of a compound are often known by the
manufacturer. Furthermore, most new substances
will be tested in a battery of acute toxicity tests,
covering skin and eye irritation, oral, dermal and
inhalatory toxicity and skin sensitization, which
require a tiered decision-making process by the
investigator with respect to dose and test concentration selection. For that purpose, it is always useful to know as early as possible if one is dealing
with an irritating (reactive) compound or not.
(b) Internationally, the Draize Eye Test should be reevaluated taking a more realistic procedure like the
LVET into consideration. The exposure conditions should be standardized for liquids and solids,
i.e., a ﬁxed exposure time, amount and mode of
instillation (directly onto the cornea instead of in

Convocatie
M.K. Prinsen / Toxicology in Vitro 20 (2006) 78–81

the conjunctival cul-de-sac). In the EC guidelines
there is the provision that substances causing eye
irritation may also be examined for the eﬀect of
rinsing after a ﬁxed exposure time, but in practice
this possibility seems not to be followed. For
exceptional circumstances, like ocular therapeutics
or pesticides, the non-rinsing protocol could be
maintained because in daily practice rinsing the
eyes after (accidental) exposure to pesticides by
the user may not always be possible.
(c) Together with the immediate implementation of
in vitro methods and standardization of the Draize
Eye Test, the possibilities for a more mechanistically-based development and optimization of
in vitro methods should be an ongoing process.
The parallel testing mentioned under point (a)
would also oﬀer the unique possibility to further
validate the in vitro methods for the non-severe
irritating category of compounds, and to test any
new (mechanistically-based) modiﬁcation both
in vitro and in vivo.

81

References
Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H., Spielmann, H., 1995. The EC/
HO international validation study on alternatives to the draize eye
irritation test. Toxicology in Vitro 9 (6), 871–929.
Commission of the European Communities, 1991. Collaborative study
on the evaluation of alternative methods to the eye irritation test.
EC Document XI/632/91, V/E/1/131/91.
CA, 2002. Competent Authority meeting of the European Communities. Agreement on the use of positive results obtained in non
validated in vitro eye irritation tests.
Freeberg, F.E., Nixon, G.A., Reer, P.J., Weaver, J.E., Bruce, R.D.,
Griﬃth, J.F., Sanders, L.W., 1986. Human and rabbit eye
responses to chemical insult. Fundamental and Applied Toxicology
7, 626–634.
Griﬃth, J.F., Nixon, G.A., Bruce, R.D., Reer, P.J., Bannan, E.A.,
1980. Dose–response studies with chemical irritants in the albino
rabbit eye as a basis for selecting optimum testing conditions for
predicting hazard to the human eye. Toxicology and Applied
Pharmacology 55, 501–513.
Roggeband, R., York, M., Pericoi, M., Braun, W., 2000. Eye irritation
responses in rabbit and man after single applications of equal
volumes of undiluted model liquid detergent products. Food and
Chemical Toxicology 38 (8), 727–734.

Convocatie
Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

Contents lists available at ScienceDirect

Regulatory Toxicology and Pharmacology
journal homepage: www.elsevier.com/locate/yrtph

The Isolated Chicken Eye test to replace the Draize test in rabbits
Menk K. Prinsen a, *, Coenraad F.M. Hendriksen b, Cyrille A.M. Krul c, d ,
Ruud A. Woutersen d, e
a

Triskelion B.V., P.O. Box 844, 3700 AJ Zeist, The Netherlands
Utrecht University/Institute for Translational Vaccinology, P.O. Box 450, 3720 AL Bilthoven, The Netherlands
c
University of Applied Sciences Utrecht, Institute for Life Sciences & Chemistry, P.O. Box 12011, 2501 AA Utrecht, The Netherlands
d
TNO Innovation for Life, P.O. Box 360, 3700 AJ Zeist, The Netherlands
e
Wageningen University Research Centre, Department Toxicology, Wageningen, The Netherlands
b

a r t i c l e i n f o

a b s t r a c t

Article history:
Received 14 October 2016
Accepted 27 January 2017
Available online 10 February 2017

In 1944, Draize et al., published a paper entitled “Methods for the study of irritation and toxicity of
substances applied topically to the skin and mucous membranes”. The Organization for Economic Cooperation and Development published their ﬁrst guideline on eye irritation in 1981, using rabbits. In
the early eighties the development of alternative non-animal tests to replace the Draize eye test started.
The ﬁrst attempts to validate alternative tests for eye irritation were considered to be relatively simple by
comparing in vitro and in vivo irritation index scores. In the early nineteen-eighties, we introduced the
use of isolated eyes as an alternative test for the Draize eye irritation test. What was expected to be a
process of several years, however, turned out to be a decades spanning process still not fully completed.
For a large part, this can be attributed to the nature of the in vivo test in rabbits, which is more
complicated and compromised than originally believed. This paper describes, most chronologically, the
development, performance, validation and application of the Isolated Eye Test and, in broader
perspective, the international validation and acceptance of this alternative test by regulatory authorities
and agencies.
© 2017 The Authors. Published by Elsevier Inc. This is an open access article under the CC BY-NC-ND
license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Keywords:
Isolated Chicken Eye test
ICE
Chicken Enucleated Eye test
CEET
Alternative testing method
Eye irritation in vitro
Draize test

1. Introduction
Before industrialization, eye defects were mainly caused by
physical trauma or by diseases caused by malnutrition, bacterial
infection or parasites. In the twentieth century, when (chemical)
industrialization strongly developed, it became apparent that
conditions at the workplace could have distinct adverse effects on
health and safety of employees. Acute and long-term exposure to a
variety of industrial chemicals were responsible for a range of
diseases, varying from relatively mild, non-life threatening phenomena, such as dermatitis, to incurable, lethal conditions such as
cancer. After World War II, the chemical industry rapidly increased
and workers became organized and more concerned with the potential risks they could encounter in the workplace. Consequently,

* Corresponding author. Triskelion B.V., P.O. Box 844, 3700 AJ Zeist, The
Netherlands.
E-mail addresses: menk.prinsen@triskelion.nl (M.K. Prinsen), coenraad.
hendriksen@intravacc.nl (C.F.M. Hendriksen), cyrille.krul@tno.nl (C.A.M. Krul),
ruud.woutersen@tno.nl (R.A. Woutersen).

the need for identifying health hazards and worker's protection
became an important issue in most industrial countries. Moreover,
people could afford more luxury products and the household and
personal care industry became more and more innovative using
new technologies and (chemical) ingredients. Therefore, an even
larger population of people needed to be safeguarded from potential hazardous substances.
To establish the potential risk of exposure of the eyes to compounds, the Food and Drug Administration of the United States (USFDA) adopted the Draize eye irritation test using rabbits already in
1961.
At ﬁrst sight, this test is simple and straightforward and provides a useful tool for regulators. However, the controversial character of this type of animal testing became known to the general
public e on 15 April 1980, Henry Spira, a Belgian-American advocate, member and founder of the Animal Rights International group
bought a full-page advertisement in the New York Times, with the
header: “How many rabbits does Revlon blind for beauty's sake?” e
and the need to develop alternative non-animal tests became
apparent. Within a year after Spira's advertisement, Revlon had

http://dx.doi.org/10.1016/j.yrtph.2017.01.009
0273-2300/© 2017 The Authors. Published by Elsevier Inc. This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

List of abbreviations
Azocarmine & aniline
Bovine Corneal Opacity and (ﬂuorescein) Penetration
test
CEET
Chicken Enucleated Eye test
CRO
Contract Research Organization
EC
European community
ECVAM European Centre for the Validation of Alternative
Methods
EU
European Union
EVG
Elastic Van Gieson
FDA
Food and Drug Administration
H&E
Haematoxylin & eosin
HET-CAM Hen's Test - Chorioallantois Membrane
HO
British Home Ofﬁce

AZAN
BCOP

donated $750,000 to a fund to investigate alternatives to animal
testing, followed by substantial donations from Avon, Bristol
e Lauder, Max Factor, Chanel, and Mary Kay Cosmetics.
Meyers, Este
These donations led to the creation of the Centre for Alternatives to
Animal Testing (http://caat.jhsph.edu).
The attempts to validate alternative tests for eye irritation in the
early nineteen-eighties were considered to be relatively simple by
comparing in vitro and in vivo irritation index scores. What was
expected to be a process of several years, however, turned out to be
a decades spanning process still not fully completed.
For a large part, this can be attributed to the nature of the in vivo
test in rabbits, which is more complicated and compromised than
originally believed.
This paper describes, most chronologically, the development,
performance, validation and application of the Isolated Eye Test
and, in broader perspective, the international validation and
acceptance of this alternative test by regulatory authorities and
agencies.
A considerable part of the paper deals with the in vivo Draize
rabbit eye test itself, because its performance and the use of its
results as the golden standard to compare the in vitro test, are
considered to be the main obstacle for replacing one of the most
controversial experimental animal tests within safety testing today.
Since the introduction of the alternative test with isolated eyes,
two different isolated eye models exist for the same test, each
having two different abbreviations, namely the Rabbit Enucleated
Eye Test or the Isolated Rabbit Eye test (REET or IRE) and the
Chicken Enucleated Eye Test or the Isolated Chicken Eye test (CEET
or ICE).

2. The Draize eye irritation test
On 2 November 1944 a manuscript, entitled “Methods for the
study of irritation and toxicity of substances applied topically to the
skin and mucous membranes” was received for publication by the
Journal of Pharmacology and Experimental Therapy. The authors of
this article were John H. Draize, Geoffrey Woodard and Herbert O.
Calvery from the Division of Pharmacology, Food and Drug
Administration, Federal Security Agency, Washington, D.C., USA. It
is more than likely that the authors never expected the kind of
impact this publication would have on animal experimentation
worldwide. Almost seventy years later the name Draize is still
inextricably attached to two of the three most disputed toxicity

133

ICCVAM Interagency Coordinating Committee on the Validation
of Alternative Methods
ICE
Isolated Chicken Eye test
IRAG
Interagency Regulatory Alternatives Group of the
United States
IRE
Isolated Rabbit Eye test
MMAS Modiﬁed Maximum Average Score
NEI
National Eye Institute, USA
OECD
Organisation for Economic Co-operation and
Development
PAS
Periodic acid-Schiff
PM
Prediction Model
REET
Rabbit Enucleated Eye test
TG
Test Guideline
TNO-CIVO Toegepast Natuurwetenschappelijk Onderzoek e
Centraal Instituut voor Voedingsonderzoek
UN-GHS United Nations - Globally Harmonized System

tests commonly used to determine acute toxicity, i.e. the Draize eye
irritation test, the Draize skin irritation test and the LD50 (lethal
dose) test. The latter two tests fortunately have already been
replaced by in vitro tests (skin irritation) or by test methods using
much less animals and causing less discomfort (LD50).
The Draize eye irritation test was ﬁrst adopted by the US-FDA as
part of the safety evaluation of foods, drugs and cosmetics (USFederal Register, 1961). At that time already, it was recognized
that the subjective grading of ocular reactions posed a considerable
problem. In order to standardize the scoring and to provide guidance to the observers, an illustrated guide was issued (FDA, 1964).
Internationally, the OECD published their ﬁrst guideline on eye
irritation in 1981, which was subsequently adopted by the European Union (EC, 1984).
Since then several revisions of the guideline have followed,
mostly not affecting the actual exposure procedure, but providing
guidance for reﬁnement and reduction of animal use and discomfort (Table 1). Examples are the exemption of testing skin corrosives
and substances with pH lower than 2.0 or higher than 11.5, the use
of well-validated alternatives as a screen for severe irritancy, and a
tiered approach of testing (i.e. starting with one animal and
continue only if non-severe irritancy is observed).
The design of the eye irritation test is actually quite simple and
straightforward: a rabbit is placed on a worktable and restrained
either manually or in a ﬁxation-box. Next, the lower eye-lid is
pulled out and the test substance is instilled in the conjunctival culde-sac formed; the upper and lower eye lids are then closed and
subsequently held together for at least one second before releasing
the animal. The other eye remains untreated and serves as a
control.
The animal is returned to its cage and is free to remove the
material. The control and test eyes are examined (without optical
aid) at approximately one hour, and at approximately 24, 48, and
72 h after treatment. Ocular reactions of the test eye are judged
using a scoring scale (Table 2). Residual eye effects are recorded at
regular intervals, if necessary up to about 3 weeks after treatment,
in order to allow the evaluation of the reversibility or irreversibility
of the effects elicited. Liquids are tested in a volume of 0.1 mL and
solids (ground to a ﬁne powder) in an amount of 0.1 g or a volume
of 0.1 mL. In general, 0.1 mL is the amount the conjunctival cul-desac can hold when the lower eye-lid is pulled out.
Despite the existence of many national guidelines on eye irritation, the exposure procedure and the scoring system for ocular

Convocatie
134

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

Table 1
OECD test guideline no. 405 and its revisions (procedures, interpretation results, ethics and 3 R's).
OECD TG 405

Procedure

Guidance on interpretation of results

Ethical considerations

Three R's

1981

- 0.1 mL or 0.1 g
substance;
- wash out only
after 24 h

Local anaesthetics
proposed

- Three instead of six rabbits
No testing of:
- Strongly acidic or alkaline substances
- Corrosive or severe skin irritants

1987

- 0.1 mL or 0.1 g
substance;
- wash out only
after 24 h

- Extrapolation of the
results of eye irritation
studies in animals to
man is valid only to a
limited degree. The
albino rabbit is more
sensitive than man to
ocular irritants or
corrosives in most
cases.
- Similar results in
tests on other animal
species can give more
weight to extrapolation
from animal studies
to man.
- Care should be taken
in the interpretation
of data to exclude
irritation resulting
from secondary
infection.
Identical to 1981
Guidance

Addition of:
- severe eye irritants identiﬁed in well-validated
alternative studies

2002

- 0.1 mL or 0.1 g
substance;
- wash out after 1 h
(solids)

Similar to 1981 and
1987 Guidance

Addition of:
- Animals showing
severe and
enduring signs
of distress and
pain may need to
be humanely killed.
Addition of:
- End points for
humane sacriﬁce
- Tiered testing

2012

- 0.1 mL or 0.1 g
substance;
- wash out after 1 h
(solids)

Similar to 1981,
1987 and 2002
Guidance

lesions are basically identical. However, the classiﬁcation systems
differ considerably (Tables 3 and 4). In general, four classiﬁcations
are assigned on the basis of the ocular lesions, viz. not irritating (not
classiﬁed), mildly irritating, irritating and severely irritating. The

Addition of:
- Extensive directions
for the use of topical
anaesthetics and
systemic analgesics

Addition of:
- Weight-of-the-evidence analysis on the
existing relevant data
- Conduct of validated and accepted in
vitro tests;
- One rabbit ﬁrst
Addition of:
- ICE test (OECD 438)
- BCOP test (OECD 437)

EU recognizes three classiﬁcations, i.e. not classiﬁed, irritating and
severely irritating (risk of serious damage to the eye). The existence
of these different classiﬁcation and labelling systems is not
favourable for the validation of alternative test methods. Therefore,

Table 2
Draize scheme for grading of ocular lesions in the rabbit.
Tissue

Lesion

Score

Cornea Opacity-degree
of density (area most
dense taken for reading)

No opacity
Scattered or diffuse areas, details of iris clearly visible
Easily discernible translucent area, details of iris slightly obscured
Opalescent areas, no details of iris visible, size of pupil barely discernible
Opaque, iris invisible
Normal
Folds above normal, congestion, swelling, circumcorneal injection (any or
all of these or combination of any thereof); iris still reacting to light (sluggish
reaction is positive)
No reaction to light, haemorrhage, gross destruction (any or all of these)
Vessels normal
Vessels deﬁnitely injected above normal
More diffuse, deeper crimson red, individual vessels not easily discernible
Diffuse beefy red
No swelling
Any swelling above normal (including nictitating membrane)
Swelling with lids about half closed
Swelling with lids about half closed to completely closed

0
1a
2
3
4
0
1a

Iris

Conjunctivae - Redness

Conjunctivae - Swelling

a

Lowest score considered positive according to US-EPA.

2
0
1
2a
3
0
1
2a
3

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

135

Table 3
European Union (1993a) classiﬁcation system for eye irritation/corrosion.
Eye effects

Corneal opacity
Iris lesion
Conjuntiva redness
Conjunctiva chemosis

R41 (Risk of serious damage to eyes)d

R36 (Irritating to eyes)
3 animalsb

6 animalsc

3 animalsa

6 animalsb

2.0, but <3.0
1.0, but <2.0
2.5
2.0

2.0, but <3.0
1.0, but 1.5
2.5
2.0

3.0
2.0

3.0
>1.5

a

Ofﬁcial Journal of the European Communities, L 110 A, Volume 36, 4 May 1993.
The classiﬁcation is assigned if the mean tissue effect (averaged over the 24 h, 48 h and 72 h time points) exceeds the threshold value in at least two of the three animals.
c
The classiﬁcation is assigned if the mean tissue effect (averaged over the three time points and over the six animals) exceeds the threshold value.
d
R41 is also assigned if, in at least one animal, one of the eye effects has not reversed at the end of the observation period.
b

Table 4
US-EPA (1998a) classiﬁcation system for eye irritation.
Toxicity categories

Category I

Category II

Category III

Category IV

Eye effects

Corrosive (irreversible
destruction of
ocular tissue) or
corneal involvement
or irritation persisting
for more than 21 days

Corneal involvement
or irritation clearing
in 8e21 days

Corneal involvement
or irritation clearing
in 7 days or less

Minimal effects
clearing in less
than 24 h

a

Health Effects Test Guideline OPPTS870.1000, EPA 712-C-98-189, August 1998.

the implementation of the classiﬁcation system of the United Nations Globally Harmonized System (UN-GHS; Table 5) in 2007 is
considered to be an improvement, although there is still a difference with the system the EU applies. The UN-GHS system subdivides the irritating category (Category 2) into mild irritant
(Category 2B) and irritant (Category 2A), whereas the EU only uses
the category irritant (Category 2).

Because the cornea is such a highly relevant target tissue in eye
irritation, it was taken as the basic principle for the development of
a relevant and practical in vitro alternative to the animal test that
had been in use as the sole test for the screening of eye irritation
worldwide since the early forties of the twentieth century.

2.1. Awareness of alternatives for animal testing

In 1981, Burton published a method using isolated rabbit eyes
for the in vitro assessment of severe eye irritants. Previously, he had
discovered that the measurement of corneal thickness (swelling) by
slit-lamp examination provided an objective assessment of eye
irritation in the in vivo rabbit eye irritation test (Burton, 1972). He
had examined 100 different cosmetic formulations in 600 rabbits
and found not only a close relationship between the total corneal
Draize score and the recorded corneal swelling, but also a relationship between corneal swelling and the conjunctival effects
scored subjectively. Around that time another article on the usefulness of slit-lamp examination in the rabbit eye irritation test,
including corneal thickness, was published (McDonald et al., 1973).
Between 1972 and 1981, Burton did not publish further on this
subject, but it is assumed that he played with the idea of replacing
the live rabbit by isolated rabbit eyes only. In his 1981 publication
no further considerations for using isolated eyes were given, but a
possible clue may be found in the literature reference he used for
the design of the superfusion apparatus (used for maintaining the

The publication of Russell and Burch in 1959 entitled: “The
Principles of Humane Experimental Technique” stood at the basis of
most initiatives relating to the use and development of alternatives
for animal experiments. In their publication they postulated the
famous and often cited three R's: Reduction, Reﬁnement and
Replacement of animal experiments. Nowadays, the 3Rs have
become a mantra for scientists and regulators in research areas
involving animal experimentation. The initiatives concerning the
Draize eye test mainly involved reduction of the number of animals
from six to three per test and replacement by the implementation
of non-animal alternatives. Certain aspects of the Draize eye test
causing considerable pain and discomfort to the animal were dealt
with only at a much later stage, i.e. reduction of the time for a washout of the test substance from 24 h to 1 h after instillation in 2002,
and the use of systemic pain relief and topical sedation in 2012
updates of the OECD guideline 405 (Table 1).
In the early nineteen-eighties, the Netherlands Society of Toxicology (NVT) started a working group named Critical Evaluation of
Toxicity Testing and in Europe, the European Research Group for
Alternatives in Toxicity Testing (ERGATT) was founded to stimulate
innovative toxicological research and to act as a counterpart to the
John Hopkins Centre of Alternatives to Animal Testing in the USA
which was founded in 1981.
For eye irritation, the policy was to select one of the most
promising existing alternative methods and to focus on further
development, standardization and validation in order to develop a
method that would be acceptable for regulatory purposes. In
addition, recommendations for a tiered approach to eye irritation
testing were made, viz. testing skin irritation ﬁrst, and starting the
eye irritation test with one rabbit.

2.2. Isolated eye test method (rabbit)

Table 5
GHS (2007a) classiﬁcation system for eye irritation/corrosion.
Eye effects

Category 2Ab

Category 1c

Corneal opacity
Iris lesion
Conjunctiva redness
Conjunctiva chemosis

1.0
1.0
2.0
2.0

3.0
>1.5

a
Globally Harmonised System of Classiﬁcation and Labelling of Chemicals (UNGHS) UN, New York and Geneva, 2007.
b
All effects have to be reversible within 21 days of treatment. Subcategory of 2B:
mildly irritating to the eyes, i.e. eye effects reversible within 7 days of treatment.
c
Category 1 is also applicable if, in at least one animal, an eye effect has not
reversed, or is not expected to reverse, within 21 days of treatment.

Convocatie
136

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

isolated eyes in good condition), which he had modiﬁed from the
one described by Mishima and Kudo in 1967. Remarkably, Burton
had already referred to publications by Mishima in his 1972 article,
and surely have thought about the possibility of using isolated
rabbit eyes in a superfusion apparatus at that time. It remains unclear why he did not pursue the use of isolated rabbit eyes sooner.
The idea of using isolated rabbit eyes was very appealing from a
scientiﬁc point of view. After all one uses an ex vivo eye for an eye
in vivo and, moreover, the parameters measured (corneal swelling,
corneal opacity and epithelial cytoxicity by ﬂuorescein dye) are
directly comparable to the parameters measured in vivo (both in
€ter and Prinsen proposed to
rabbit and in human). Therefore, Koe
introduce an in vitro eye irritation test (with isolated rabbit eyes) as
a possible contribution to the reduction of experimental animal use
€ter and Prinsen, 1985). The test method was evaluated by
(Koe
investigating the effects of several substances from the publication
of Burton et al. (1981). The test method was further validated with
34 substances that had been investigated in the in vivo eye irritation
€ter and
test in rabbits as part of the standard toxicity testing (Koe
Prinsen, 1985).
During the same period, several other investigators explored the
use of isolated rabbit eyes as an alternative for the in vivo test (York
et al., 1982; Price and Andrews, 1985; Jacobs and Martens, 1988,
1990).
The research and publications on isolated rabbit eyes resulted in
the inclusion of this test method in the ﬁrst EC Collaborative Study
on the Evaluation of Alternative Methods to the Eye Irritation Test
(EC, 1991). In this study, ﬁve in vitro cell toxicity tests, the Rabbit
Enucleated Eye Test (REET) and the Hen's Egg Test Chorioallantoic
Membrane (HET-CAM) were selected to undergo validation by
testing 21 chemicals of different classes in at least 3 different laboratories. It was concluded that: i) The Isolated Rabbit Eye test did
not misclassify many non-irritants and also had the capability to
discriminate between moderate and severe effects, although irritating (R36) chemicals were underrepresented. ii) The REET produced results which were consistent across all three laboratories
and generally correctly predicted the in vivo grade. The protocol
and the method for calculating ﬁnal irritancy grades (in validation
studies later on called “Prediction Model”) needed harmonization
before a wider interlaboratory study could be conducted. iii) The
REET is nearest to the human situation and has the advantage that
all types of chemicals can be investigated without the need for
testing dilutions, therefore the study showed that the REET is easier
to interpret than the other assays in the trial.
The REET results showed an overall correlation of 82% with the
in vivo results, using a general classiﬁcation scheme for the grading
of in vivo and in vitro eye irritation (i.e. not, slight, moderate or
severe irritant). Four compounds, overpredicted (slight or moderate instead of non-irritant) by the REET, were all moderate to severe
irritants in the in vivo skin irritation test. A common physicochemical characteristic of these compounds was their hydrophobicity. A general observation in the in vivo rabbit eye test was that
hydrophobic compounds stayed in contact with the cornea (eye) for
a relatively short period of time, because they mixed poorly with
the tear ﬁlm on the cornea and because the nictitating membrane
(third eye-lid) acted as a wiper, and rapidly removed the compound
from the eye. This was in distinct contrast to the skin irritation test
where the compound was kept in contact with the skin with the aid
of a patch and ﬁxative tapes for at least 4 h. The presence of a third
eye-lid is an example of a condition very speciﬁc to the in vivo
rabbit eye test inﬂuencing the exposure and cause a problem with
respect to the validation of alternative methods. alternative
methods are not able to mimic the presence of a third eye-lid,
which is also an irrelevant condition with respect to humans. On
the basis of the results with the 34 compounds, the REET was

considered to be a sensitive and useful test system for the identiﬁcation of eye irritants. Negative in vitro results should be
conﬁrmed only in case of expected regular eye contact and in a
maximum of three rabbits. At that time six rabbits was the usual
number in the Draize eye test in order to comply with the US
guidelines, although the ﬁrst OECD guideline on eye irritation
(OECD, 1981) recommended the use of 3 rabbits, which could mean
a considerable reduction in the use of rabbits for eye irritation
testing.
The rapporteurs, however, considered the trial to be too limited
to make ﬁrm conclusions and it was recommended to perform
further interlaboratory trials with a larger number of laboratories
and chemicals and according to the principles of GLP. An important
remark in the EC report was the fact that toxicological proﬁles of
the chemicals investigated were prepared by collecting and critically evaluating the literature data available, because it was not
possible to repeat in vivo eye determinations for animal protection
considerations. The limited availability, evaluation and appraisal of
in vivo eye irritation data and the test method itself constitute the
main cause of the exceptionally long, and not yet completed,
acceptance of alternative methods to the Draize eye test. Until
recently, the in vivo data were taken as the “Golden Standard”,
which in practice meant that the in vitro data had to almost exactly
match the variable in vivo result.
2.3. The use of slaughterhouse animals
Although rabbits are available as eye-donor for the isolated eye
test in contract research organisations (CROs) executing routine
eye- and skin irritation studies, the scientiﬁc community considered this dependency on laboratory animals a serious shortcoming.
The isolated eye test would still be associated with animal experimentation and organisations not using laboratory rabbits could
have difﬁculties in obtaining rabbit eyes. Therefore, the use of
slaughterhouse animals, such as the cow, pig or chicken, as eyedonor was investigated. Firstly, the possibility to obtain eyes from
abattoirs was explored and, secondly, possible practical limitations
of the type of eye in relation to the experimental set-up were
identiﬁed. On the basis of these explorations, the cow and pig were
rejected as suitable eye-donor, although the latter was expected to
be the most suitable candidate on the basis of its physiological
resemblance with the human eye. The rejection of the cow eye was
based on the following observations: 1) the irregular supply and
variable origin of cows and, related to that, 2) the insufﬁcient
quality of the cornea in too many cases. In the case of the pig eye,
the collection of suitable eyes by the investigator at the process line
of the slaughterhouse appeared difﬁcult, but doable. The most
important feature of the pig's eye, also applying to the cow's eye,
was unfavourable for its use in the isolated eye test, namely its
corneal thickness. The pig's cornea is relatively thick (600e700 mm;
Faber et al., 2008) when compared to the cornea of the rabbit (ca
400 mm; Chan et al., 1983; Li et al., 1997), but quite comparable to
the thickness of the human cornea (ca 530 mm; Doughty and
Zaman, 2000; Fowler et al., 2004). The cow's cornea easily doubles that thickness (900e1100 mm; OECD TG 437). Although the pig
eye is better comparable to the human eye, the isolated eye test has
to produce matching results with the Draize rabbit eye test in order
to be accepted as an alternative. Hence, an eye (cornea) that
matches closest to the rabbit eye and not to that of the human eye
was needed. The chicken provided such an eye, i.e. its dimensions
and corneal thickness (ca 400 mm; Fowler et al., 2004) are similar to
the rabbit cornea. Another point of concern was the baseline
corneal thickness of the pig which was in the upper scale of the
thickness measurement device and recording of increased thickness to its full extend after treatment with moderate to severe

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

irritants appeared not possible. Other possibilities for measuring
the corneal thickness in the higher range were not available for the
Haag-Streit microscope in use. Ultrasonic pachymetry instead of
the mechanical (non-invasive) measurement device was an option
but the procedure required touching the cornea with a probe. In
case of irritating substances, touching the cornea could result in
additional damage and was therefore considered unsuitable.
The epithelium of the cornea is the ﬁrst barrier against (chemical) insult and as such its thickness (number of layers of epithelial
cells) is of importance. One of the most used alternative tests for
eye irritation is the BCOP, which uses excised and isolated corneas
of the cow. Because of its corneal thickness (not used as a parameter
in the BCOP), the exposure time needed to elicit an irritation
response is 10 min (for liquids) or 4 h (for solids) in the BCOP. In the
ICE and REET test, only a 10-second contact period is needed to
elicit a relevant irritation response. A relevant response in this case
means a response comparable to that observed in the in vivo rabbit
test. Apart from a comparable thickness to the rabbit cornea and, to
a certain extent to the human cornea, the chicken cornea has
another feature, which might be an advantage to predict (human)
eye irritation, i.e. a well-developed Bowman's membrane (Fowler
et al., 2004). This membrane, which is in between the epithelium
and stroma, is also well developed in the human cornea, but poorly
developed in the rabbit cornea.
With respect to the availability of eyes, attaining chicken eyes
appeared relatively easy by simply collecting heads just after the
sedation of the animals at the process line, transporting them to the
laboratory and enucleating them from the heads within 2 h after
sacriﬁce. This time period is sufﬁcient to guarantee corneas
meeting the acceptance criteria for testing, i.e. no or very slight
opacity, no or very slight ﬂuorescein staining, and a corneal thickness in the normal range. The daily processing of thousands of
chickens at the slaughterhouse guaranteed a constant supply of
suitable eyes (corneas). Since 1981 we have visited the same
slaughterhouse (Nijkerkerveen, The Netherlands) for our supply
and only during a period of about 6 months in 2003 could eyes not
be obtained because of an Avian ﬂu break-out (H7N7 variant) in a
large part of the Netherlands. Even then, eyes could be obtained
from another slaughterhouse outside the affected region.
The use of chicken eyes was evaluated by testing the 21 reference chemicals previously tested in the ﬁrst (pilot) EC validation
study of the REET (EC, 1991) which were selected to be representative of currently used industrial chemicals of different chemical
classes and ranging from non-irritant to severe irritant. Describing
the criteria and scoring system of the in vitro corneal effects
together with a Prediction Model (PM) for matching the EC scheme
for classiﬁcation and labelling of compounds (Table 3) was an
important step forward. The development of the prediction scheme
was primarily a theoretical exercise based on the range of physiological responses observed in the ICE (corneal swelling, opacity and
ﬂuorescein retention of damage epithelial cells). Because the
corneal effects determined in the ICE have a direct relationship
with the in vivo response (e.g. in vitro opacity for prediction of
in vivo opacity), a PM could be established based on the magnitude/
range of the effects and not by using an empirically-derived
mathematical algorithm to translate an in vitro effect to an in vivo
effect. For instance, in the HET-CAM assay lysis of blood vessels of
the chorioallantois membrane is measured as time (seconds) of ﬁrst
occurrence (Luepke, 1985). The number of seconds recorded cannot
be translated directly to an in vivo effect, which is considered a
serious limitation of the method. A PM could be designed only after
computer calculations of data obtained for a relevant number of
compounds by using the in vivo MMAS (Modiﬁed Maximum
Average Score) as the sole parameter for the in vivo test. The
computer calculation was based on a mathematical formula or

137

conversion algorithm resulting in a single in vitro irritation index
score comparable to the in vivo MMAS. Computer calculations were
also needed with the BCOP assay, using a cornea, because the
opacity is measured as a reduced light transmission value and the
epithelial damage as the amount of ﬂuorescein penetrated through
the cornea, leading to an In Vitro Irritation Score (IVIS ¼ mean
opacity value þ (15  mean permeability OD490 value)).
The ICE followed a theoretical approach not using in vitro data to
be compared to the in vivo MMAS. By knowing the ranges of the
in vitro ICE responses (swelling, opacity and ﬂuorescein retention),
cut-off values were chosen to identify different categories of effect,
viz. a non (Category I), slight (Category II), moderate (Category III)
or severe (Category IV) effect. Thus after testing a compound, three
categories were established, i.e. one for swelling, one for opacity
and one for ﬂuorescein retention.
The assignment of the ﬁnal irritation classiﬁcation to a nonirritant, (slight or moderate) irritant or severe irritant was obtained by the combination of these three categories. Again, a
theoretical and weighted division of the different combinations
possible was made for each ﬁnal classiﬁcation. For instance, at the
low end of the ICE classiﬁcation system the combination of I/I/I is a
non-irritant and at the high end the combination of IV/IV/IV is a
severe irritant. The combinations possible and respective irritation
classiﬁcations are shown in Table 6.
Often the PM of other alternatives had to be revised after more
compounds had been tested by the in vitro test or additional PM's
were especially designed for certain categories of compounds. With
the ICE, the criteria system for scoring the effects was never
changed, while the classiﬁcation system has been modiﬁed twice,
i.e. once to accommodate the introduction of the UN-GHS classiﬁcation system and secondly after adoption as an OECD guideline for
non-irritants (OECD, 2013a).
The use of the in vivo MMAS in establishing the PM proved to be
less ideal than thought. The EC and UN-GHS systems do not use the
MMAS for determination of the irritation classiﬁcation of a compound. Instead, the individual in vivo tissue scores are used. Evaluation of the use of the MMAS in the validation study of the
European Commission and the British Home Ofﬁce (EC/HO study)
showed a poor correlation with these classiﬁcation systems
(Prinsen, 1999).
On the basis of the ICE study with 21 reference materials
€ter, 1993) the conclusions were that: 1) although
(Prinsen and Koe
the ICE does not assess conjunctival damage, its sensitivity to
predict ocular damage is not reduced, 2) the ICE correctly predicted
the EC classiﬁcations of the 21 chemicals and 3) the ICE ﬁtted in the
previously updated EC B.5 and OECD 405 guidelines regarding
acute eye irritation/corrosion now including recommendations to
use alternatives for the prescreening or positive identiﬁcation of
strong eye irritants.
2.4. Isolated eye test method (chicken)
The use and suitability of eyes of slaughterhouse animals was
ﬁrst established by testing the same reference chemicals (Prinsen
€ter, 1993) that had been tested in the EU Collaborative
and Koe
Study on the Evaluation of Alternative Methods to the Eye Irritation
Test (EC, 1991). Although the in vivo data were obtained from
literature this study was considered quite valuable because the
in vitro data obtained with the slaughter eyes could be directly
compared with the in vitro data obtained in the REET. Ideally, the
in vitro test should be performed in parallel with the in vivo test,
hence enabling a more direct comparison of the data.
Prinsen (1996) published the results of such a parallel testing of
44 compounds, which were considered to be a relevant crosssection of compounds (raw chemicals, ﬁnished products and

Convocatie
138

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

Table 6
ICE in vitro classiﬁcation system.
General classiﬁcation

UN-GHS classiﬁcationa

Combinations of categories

Not irritating

Not classiﬁed

Slightly irritating

2B: Mild irritant/causes eye irritation

Moderately irritating

2A: Irritant/causes eye irritation

Severely irritating

1: Irreversible effects on the eye/serious damage to the eye

3I
2  I, 1  II
2  II, 1  I
3  II
2  II, 1  III
1  I, 1  II, 1  III
2  III, 1  I
2  III, 1  II
3  III
1  IV, 2  I
1  IV, 2  II
x IV, 2  III
1  IV, 1  III, 1  II
2  IV,1  I
2  IV,1  II
3  IV

a

Globally harmonised system of classiﬁcation and labelling of chemicals (UN-GHS). UN, New York and Geneva, 2007.

formulations) routinely produced by the (chemical) industry.
Instead of only comparing single in vivo and in vitro irritation index
scores, as was the common practice in validation, the individual
components used for calculation of the index score were also
analysed. This was a recommendation of the United States Interagency Regulatory Alternatives Group (IRAG) made during a
workshop on eye irritation testing in Washington DC, in 1993 (Scala
and Springer, 1997). Fourteen different in vivo scores were derived
from each of the 44 in vivo tests, covering time scores (1-hr, 24 h,
1e72 h, days to recovery), index scores (MAS and total eye score),
and individual tissue scores (cornea, area of cornea involved, iris,
cornea and iris combined, conjunctival redness, conjunctival
swelling, conjunctival discharge, conjunctival scores combined).
The in vivo critical scores were compared to the critical scores of the
ICE test, namely the scores for corneal swelling, corneal opacity,
ﬂuorescein retention of damaged corneal epithelium and an index
score (combination of the three parameters). The overall correlations found for the in vivo scores with the ICE in vitro scores were
0.90 (index score), 0.91 (corneal swelling), 0.86 (corneal opacity)
and 0.82 (ﬂuorescein retention). The correlation between the
in vivo conjunctival scores and the ICE scores were 0.92 (index
score), 0.92 (corneal swelling), 0.93 (corneal opacity) and 0.86
(ﬂuorescein retention). These correlations substantiated the
conclusion made by Burton (1972) that a relationship exists between the in vivo conjunctival damage and the corneal scores of the
isolated eye test. Moreover, in ophthalmology the term “ocular
surface” was introduced to emphasize the potential interdependence of the epithelium of the cornea and the epithelium of the
conjunctivae (Thoft and Friend, 1977; Wagoner, 1997). “Subsequent
clinical and research insights provided compelling evidence of the
functional relationships between these two adjacent cell populations” (Thoft and Friend, 1977). Furthermore, the proven relationship and high correlation between the critical scores of the ICE
test and the Draize eye test demonstrated that the test is a relevant
alternative to eye irritation, and that applying regulatory irritation
classiﬁcation systems is “just” a matter of choosing the appropriate
threshold limits belonging to the different irritation classes. This
was supported by the in vivo and in vitro EC classiﬁcations obtained
for the 44 compounds. Overall, it was concluded that the ICE provided a practical prescreen for the Draize rabbit eye test and that
only mild to moderate irritants in the ICE, generally showing the
highest sensitivity to inter- and intra-laboratory variability, should
be conﬁrmed in the rabbit eye test. Eighteen years later, the OECD
adopted this conclusion. Furthermore, the “parallel” testing
showed the ICE test to be robust in the sense that the practical

aspects are not complicated and relatively easy to control, i.e. a
saline drip is sufﬁcient to maintain the eyes in good condition, and
all compounds, regardless the physico-chemical properties, can be
assayed.
The in-house repeatability of the ICE was assessed to be
adequate during the Reference Standard Validation of in vitro tests
sponsored by ECVAM (Brantom et al., 2000). Two reference compounds for the group of siloxanes (decamethylcyclopentasiloxane
and cyclohexylamino-functional PDMS) and two for the group of
surfactants (Triton X-500 5% and cetylpyridium bromide 6%), representing non-irritants, Category 2B and 2A, and Category 1 compounds, were tested ﬁve times each on different occasions.
The publication of the results for the ﬁrst 44 compounds did not
result in termination of the “parallel” testing program. The main
reason for continuing the “parallel” testing was that it was
considered unethical to perform any toxicity test on live animals
without prior information on the reactivity of the test compound
using a “relevant” biological structure such as the cornea. In those
days, it was common practice to start different acute toxicity tests
with a new compound almost simultaneously and, if different study
directors were involved, often without consulting each other about
the speciﬁc results of their studies, whereas the result of an acute
irritation test would have inﬂuenced or helped their decision
concerning the study design to be followed. It became apparent
that the ICE ﬁtted well in a tiered approach for acute toxicity
testing. The results of the ICE provided not only information on eye
irritation, but also gave information that could help to optimally
design the other acute toxicity tests. If the ICE test showed severe
irritancy, the in vivo eye irritation test was waived and the skin
irritation test was initiated with one rabbit only. Important decisions for the conduct of the acute oral and dermal toxicity tests in
rats could also be made on the basis of the outcome of the ICE. In
most cases, these studies were started as a limit study with the
highest dose level of 2000 mg/kg body weight. In case of severely
irritating or corrosive compounds, the local effects on the stomach
or skin could lead to severe suffering or even mortality of the animals. When the ICE test showed severe effects, dosing of high
levels or high concentrations of corrosive compounds could be
avoided. When the ICE showed no or negligible signs of irritation
(cytotoxicity), the decision to perform the acute oral and dermal
tests with the highest dose level or a high test concentration could
be better justiﬁed.
It was not until 2001 that the OECD adopted the use of results of
any other in vitro toxicity test on a compound in order to determine
start levels to be used for the in vivo acute oral toxicity test in rats

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

(OECD, 2001).
For skin sensitization tests, this approach reduced the number of
animals necessary for testing. At that time, the standard test for
skin sensitization was the Guinea Pig Maximization test (GPMT),
requiring up to 40 animals for the main test and 6e9 animals for
the preliminary skin irritation test. The preliminary skin irritation
test was needed to establish the appropriate (maximum tolerable)
concentrations for the various phases of the study (i.e. the intradermal and topical induction and the topical challenge). Normally
ranges covering concentrations from 1% up to 100% had to be
investigated. When the ICE showed no or negligible irritancy, the
range to be examined could be limited to only 100% and one lower
concentration, which in practice meant that only 3 and not 6e9
animals were needed. At present, the GPMT is replaced by the Local
Lymph Node Assay (LLNA; OECD, 2010a,b), and this guideline also
mentions the use of results of any other in vitro toxicity test on a
substance as an aid in dose selection.
In retrospect it can be concluded that the testing strategy was
successful for the majority of compounds submitted for testing, i)
identiﬁcation of severe eye irritants without further in vivo testing.
ii) tiered testing of skin irritants/corrosives, iii) determination of
acceptable (non-severe) dose levels of corrosive compounds in
acute oral and dermal toxicity testing, and iv) reduction of the
number of animals used in the preliminary irritation experiment of
sensitization studies.
“Parallel” in vivo and in vitro eye irritation testing was continued
with another 50 compounds, meaning that each compound was
ﬁrst tested in the ICE and, in case of non-severe irritancy, directly
followed by an in vivo rabbit test, both in full compliance with the
OECD principles of Good Laboratory Practice (GLP). These results
were submitted to organizations dedicated to the validation of
alternative non-animal tests, such as ECVAM and ICCVAM. Because
the performance of the ICE was considered sufﬁciently established
after the “parallel” testing of 94 compounds, another approach was
introduced to make optimal use of the ICE at low extra costs. First a
non-GLP ICE test with only one eye was carried out and depending
on the outcome either a full GLP ICE test (in case of severe irritancy)
or an in vivo rabbit eye test (in case of non-severe irritancy) was
carried out. This procedure was followed until the ICE OECD
guideline 438 was adopted to include the identiﬁcation of nonirritants (OECD, 2002). From then on, only compounds identiﬁed
by the ICE as irritating (Category 2) need to be tested in the in vivo
eye irritation test in rabbits.
Based on the results of their microscopic examination of the
corneas in the Low Volume Eye Test (LVET; Grifﬁth et al., 1980;
Grifﬁth, 1987). Maurer et al. (2002) recommended to include histopathology of the treated corneas sampled at the end of the
observation period. They suggested a direct correlation between
the depth of injury in the cornea and possible recovery of eye lesions. Since measurement of recovery is not possible in the ICE (and
in all other alternatives) it could be an important improvement of
the method and helpful in the argumentation for absence or
presence of microscopic lesions in the ICE that could predict (ir)
reversibility. The outcome of this study (Schutte et al., 2009) was
that, in general, the results of the ICE using the standard volume of
30 ml or mg were in line with or more conservative than the LVET in
terms of classiﬁcation. The level of overprediction found in the ICE
was expected and considered acceptable since the ICE was developed for prediction of the Draize eye test and not the LVET.
For industry, the ICE test was considered useful for several
purposes, such as 1) EU/GHS classiﬁcation and labelling of powder
and liquid household cleaning products, 2) screening of candidate
formulations, and 3) weight-of-evidence approach by determining
the proﬁle of new cleaning product formulations against benchmark products. A deﬁnite conclusion on the usefulness of

139

histopathology in the ICE could not be made, but the data showed
that assessment of the histopathological lesions in the various parts
of the cornea was possible, enabling the application of the “Depthof-Injury” theory of Maurer et al. (2002). The question remained if
this theory established on the basis of an inﬂammatory process in
the rabbit's eye (consisting of initial ocular injury and subsequent
repair over days/weeks) correlated with the irritation process or
damage in the ICE.
2.5. Optimizing histopathology in the Isolated Chicken Eye test
For the histopathological observations in the ICE, a quite basic
and routine procedure of processing the eye/cornea is used. The eye
is preserved in formalin at the end of the study, i.e. 4 h after the 10second exposure, and further processed into a parafﬁn block from
which slides of the longitudinal section of the corneal centre are
prepared. This area was considered appropriate since the application of the test compound was made at the centre of the cornea and
in general the slit-lamp observation showed conﬂuent, homogenous corneal effects. In case of non-homogenous effects, such as
focal spots with more severe opacity not present in the central area,
these parts were also examined. The choice of the staining
appeared an important issue. In ﬁrst instance, the most common
staining by Haematoxylin & Eosin (H&E) was used, which was later
replaced by the Periodic Acid-Schiff (PAS) staining, which provided
a much better discrimination of the different layers of the cornea.
The three major layers of the cornea, i.e. epithelium, stroma and
endothelium were well visible with both stainings. The other
structures, such as basement membrane and Bowman's membrane
(between epithelium and stroma) and Descemet's membrane (between stroma and endothelium), were not that visible with H&E,
whereas PAS provided much better results. The integrity of the
membranes was considered to play a role in the injury and recovery
process of the cornea, and the visibility of these membranes by
microscope was considered important for an adequate histopathological assessment by the pathologist. Therefore, other staining
methods speciﬁcally targeting collagen-rich membranes were
tested on corneas treated with compounds representing a nonirritant, two irritants and a severe irritant (corrosive). The microscopic examination focused on the basement and Bowman's
membrane and not on Descemet's membrane, because damage to
this membrane adjacent to the endothelium was considered to
result in severe, irreversible effects and not borderline effects. Of
the ﬁve stainings selected, i.e. H&E, PAS, Trichrome, Azocarmine &
Aniline (AZAN) and Elastic Van Gieson (EVG), PAS was clearly superior with respect to visibility of the membranes and the quality of
the morphology of the various corneal structures. Moreover, the
histopathological examinations provided interesting facts and insights. After severe corrosive damage to the cornea by sodium hydroxide, observed macroscopically through slit-lamp observation
as maximum swelling and very severe opacity of the cornea, the
basement and the Bowman's membranes appeared undamaged
while effects were seen in the underlying stroma. Does this mean
that the functionality of the membranes was not compromised or is
light microscopy not able to detect such damage of the membranes? This observation led to the conclusion that depth of injury
is not the only factor determining the seriousness of corneal injury.
Personal communications with an ophthalmologist of the University Medical Centre of Utrecht, specialized in the cornea, and
publications (Wagoner, 1997; Terry and Khosla-Gupta, 2002; Rama
et al., 2010) indicated that in the clinic, emphasis is put on corneal
opacity and corneal stem cell survival after (chemical) injury
(Table 7). With severe stem cell damage, recovery of the corneal
damage by re-epithelialization of migrating stem cells from the
corneal limbus is not possible. In that case, the recovery process

Convocatie
140

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

Table 7
Roper-Hall (1965) classiﬁcation of chemical burns of the human eye.
Grade

Findings

Prognosis

I
II
III
IV

Corneal epithelial damage; no limbal ischemia
Cornea hazy but iris details seen; ischemia less than 1/3 of limbus
Total loss of corneal epithelium; stromal haze blurring iris details; ischemia at 1/3 to ½ of limbus
Cornea opaque, obscuring view of iris or pupil; ischemia at more than ½ of limbus

Good
Good
Guarded
Poor

will result in complete, irreversible conjunctivalization of the
ocular surface. The stem cells are rather superﬁcially located in the
limbal region of the eye and as such involved in early contact with a
topically applied compound. Therefore, the possibility of screening
the viability of stem cells after chemical injury could be of value.
However, explorations to stain stem cells of the chicken cornea by
p63 immunostaining appeared unsuccessful.
Although the assessment of reversibility or irreversibility in the
ICE is undoubtedly of value, especially for household and personal
care companies, the EU/GHS classiﬁcation and labelling of severe
eye irritants does not make a distinction between these two categories; they are all classiﬁed as Category 1: “irreversible effects on
the eye/serious damage to the eye”. The use of additional histopathology in the ICE over the past ten years has proven that it is
mainly conﬁrmative of the results already obtained by the slit-lamp
observation and, in some instances, can be used to support decision
making in borderline cases between irritating and severely irritating compounds. In general, the histopathology results provided
no reason for altering the irritation classiﬁcation.
In literature on the cornea, an interesting observation was that
vacuolation of epithelial cells can occur in the human cornea after
chemical insult, but it does not occur in the rabbit cornea (Grant,
1986). In the ICE, especially with detergent products, vacuolation
of epithelial cells was regularly observed by the pathologist. ICE
studies commissioned by the International Association for Soaps,
Detergents and Maintenance Products (AISE) showed that vacuolation of epithelial cells, and in particular its location in the
epithelial layer (top, mid or bottom region), may be reason for an
upgrade of the classiﬁcation to Category 1 in case of borderline
severe corneal effects (Cazelle et al., 2014).
2.6. Other alternatives
In the early nineteen-nineties another alternative method using
corneas was developed, namely the bovine corneal opacity test
(BCOP; Gautheron et al., 1992). They used bovine corneas, not in
situ, but excised from the eye-ball and clamped inside a chamber. At
ﬁrst sight the method appears quite similar to the Isolated Chicken
Eye (ICE) test, i.e. using corneas and measuring opacity and ﬂuorescein penetration, but the differences are remarkable. Corneal
opacity is measured quantitatively as the amount of light transmission through the cornea. Permeability is measured quantitatively as the amount of sodium ﬂuorescein dye that passes across
the full thickness of the cornea, as detected in the medium in the
posterior chamber (OECD, 2013a). An empirically-derived formula
is used to calculate an in vitro irritancy score (IVIS ¼ mean opacity
value þ (15  mean permeability OD490 value)).
Other alternatives using reconstructed (human) corneal tissue,
the so-called 3D models, such as the SkinEthic Human Corneal
Epithelium test and the EpiOcular™ test were developed in the late
20th early 21st century and were also validated in several studies. A
drawback of these corneal models is that only the epithelial layer of
the cornea is reconstituted which might pose a problem in
discriminating irritating from moderately/severely irritating
substances.
At present, only the ICE and the BCOP tests are ofﬁcially adopted

by the OECD for Identifying.
i) Chemicals Inducing Serious Eye Damage (OECD, 2009a,b) and
ii) Chemicals Not Requiring Classiﬁcation for Eye Irritation or
Serious Eye Damage (OECD, 2013a). The Fluorescein Leakage test
has been adopted by the OECD for Identifying Ocular Corrosives
and Severe Irritants (OECD, 2012), but with speciﬁc limitations, i.e.
only applicable to water soluble chemicals and excluding strong
acids and bases, cell ﬁxatives and highly volatile chemicals.
The BCOP, the ICE test and 7 other test systems were considered
to be the most promising alternatives to be further validated and in
1992 the British Home Ofﬁce (HO) and the Directorate General XI of
the European Commission (EC) commissioned a validation study on
alternatives to the Draize eye irritation test, to be known as the EC/
HO validation study. The ﬁrst priority was given to evaluate the
possibility of identiﬁcation of substances severely irritating to the
eye, while also evaluating the methods for predicting the irritants
and non-irritants (Balls et al., 1995). The methods selected, their
principle, expression of results together with the pros and cons are
presented in Table 8.
2.7. International validation of the ICE (EC/HO study)
With the introduction of alternative methods for the Draize Eye
Test in the mid-eighties, a certain wild-growth of alternative
methods occurred and internationally (mostly) in Western Europe
clusters of speciﬁc methods could be seen. Roughly, the IRE/ICE was
developed and practiced mainly by the UK and the Netherlands, the
Bovine and Corneal Opacity and Permeability test (BCOP) by France,
the Hen's Egg Test Chorioallantoic Membrane (HET-CAM) by Germany and the Neutral Red Uptake test (NRU) by several European
countries. With the increasing interest in these methods and the
need for regulatory acceptance it became apparent that a formal
validation of the alternative methods was needed.
A ﬁrst (pilot) validation of several alternative methods,
including HET-CAM, REET and NRU was commissioned by the EU in
1987 (the Collaborative study on the evaluation of alternative
methods to the eye irritation test, 1991), which was the basis of one
of the largest validation programs held in the early nineties, known
as the EC/HO study. In this comprehensive study, organized by the
European Commission (EC) and the British Home Ofﬁce (HO), nine
methods including the ICE (Table 6) were each carried out by four
laboratories testing 60 chemicals which represented different
chemical classes and irritation potential (Balls et al., 1995).
The chemicals were selected from the ECETOC database and
were considered to have reliable in vivo eye irritation data. Basically
that meant; the tests having been performed under GLP conditions
and in compliance with OECD TG 405 (OECD, 1981). No other
assessment with respect to the quality of the individual data was
made. The outcome of the study was quite disappointing; none of
the methods were capable of identifying the eye irritation potential
of the compounds (maximum overall correlation ranged from 0.34
to 0.55). Breaking up the compounds into different categories such
as liquids, solids, surfactants, non-irritants, severe irritants etc. did
not improve the correlation signiﬁcantly, although the group of
surfactants showed the best results across all methods.
One of the reasons for this disappointing result was considered

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

141

Table 8
Alternative In vitro tests for eye irritancy considered most promising (based on EC/HO study).
Alternative

Principle

Expression of results

Pro's

Con's

Red blood cell haemolysis test Leakage of haemoglobin (H) H50 and D values
equivalent to MMASa
from red blood cells and
denaturation (D)
Neutral red uptake test

Inhibition of neutral red
uptake (NRU) into mouse
3T3 cells

Fluorescein leakage test

Fluorescein leakage (FL)
by damage to the tight
junctions of Madin-Darby
canine kidney cells

EYTEX method

Turbidity of reagent

HET-CAM method

Haemorrhage, lysis and
coagulation in the
chorioallantoic membrane
of embryonated chicken
eggs

Silicon microphysiometer test Reduction in the metabolic
acidiﬁcation rate of L929
ﬁbroblasts

Bovine corneal
opacity/permeability test

Changes in opacity and in
permeability of isolated
bovine corneas

Isolated chicken eye test
Isolated rabbit eye test

Corneal swelling, corneal
opacity and ﬂuorescein
staining of damaged
epithelial cells of the
cornea

Draize rabbit eye test

Corneal opacity, iritis
and conjunctival damage
of one eye treated in the
conjunctival sac

a

- relatively simple set-up - single index score
- relatively simple
- no direct relation with ocular tissue
performance
- no reversibility
- testing of non-soluble substances
- relatively simple set-up - single index score
NRU50 values
equivalent to MMAS
- relatively simple
- no direct relation with ocular tissue
performance
- no reversibility
- extreme PH, non-soluble substances
- relatively simple set-up - single index score
FL20 score equivalent
to MMAS
- relatively simple
- no direct relation with ocular tissue
performance
- no reversibility
- viscous materials, extreme PH,
non-soluble substances
EYTEX Draize equivalent - relatively simple set-up - single index score
(EDE) score equivalent
- relatively simple
- no direct relation with ocular tissue
to MMAS
performance
- no reversibility
- testing of solids, coloured samples,
surfactants, water-solubles
- interference/inhibition with matrix
Reaction time for
- relatively simple set-up - single index score
occurrence of
- relatively simple
- no direct relation with ocular tissue
haemorrhages, lysis
performance
- limited testing of solids and sticky
and coagulation within
materials
5 min combined into
- use of live embryo
a Q score equivalent
- subjective scoring
to MMAS
- no reversibility
- assesses functional
- single index score
MRD5) values
equivalent to MMAS
cell changes
- no direct relation with ocular tissue
- very limited testing of substances
(37e48%)
- laborious
- complex and expensive system
In vitro irritancy
- highly standardized
- single index score
score (IVIS)
- “human” parameters
- no direct observation (black box)
equivalent to MMAS
- ocular tissue
- cornea excised
- eyes relatively
- thick cornea compared to rabbit/human
easy attainable
- laborious
- objective scoring
- no reversibility
- no conjunctival damage
- testing of solids, coloured substances
Degree of severity
- eyes easy attainable
- no reversibility
(categories) for each
- relatively simple
- no conjunctival damage
endpoint separately and
set-up
- subjective scoring opacity,
combination of the three - relatively simple
ﬂuorescein retention
categories into regulatory
performance
- experienced observer
classiﬁcation
- ocular tissue
- “human” parameters
- slit-lamp
microscopical
assessment
- objective scoring
corneal swelling
- direct translation
to human ocular
damage
- all substances can
be assayed neat
Degree of severity for
- simple set-up
- unrealistic exposure area (inside eye-lid)
each endpoint separately - simple performance
- undeﬁned exposure time (seconds to 24 h)
and classiﬁcation on the
- rabbits easily
- subjective scoring
basis of the most affected
attainable
- experienced observer
tissue (degree and/or
- large eye
- animal behaviour inﬂuencing eye effects
persistency)
- in vivo response
- unrealistic assessment of recovery (no aftercare)
including recovery

MMAS ¼ Modiﬁed maximum average score.

to be the use of the MMAS as the sole parameter derived from the
in vivo data. This score, ranging from 0 to 110, is an average of the
maximum individual tissue scores of the animals recorded for a
compound. By using certain cut-off values for the MMAS, a compound is classiﬁed as a non-irritant (score 0e25), irritant (score
25e59) or severe irritant (score >59). Assessment of the entire

process of ocular inﬂammation by a single index instead of using
the in vivo data to its full potential appeared rather inadequate. For
instance, the classiﬁcation system used in the EC does not use a
single irritation index score, but is based on individual tissue scores
(i.e. for cornea, iris and conjunctivae separately) and/or the (ir)
reversibility of these effects within 21 days (Table 3). In 1998, the

Convocatie
142

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

OECD published a proposal for the harmonization of hazard classiﬁcation based on eye irritation/corrosion, which is comparable to
the EC classiﬁcation system, because it also uses the individual
tissue scores separately (Table 5). However, slightly lower thresholds were used for classiﬁcation as an irritant (Category 2) or severe
irritant (Category 1), and additionally recovery of eye effects within
7 days were used to discriminate between a mild irritant (2B) and
an irritant (2A). Because the MMAS is not used for regulatory
classiﬁcation, the impact of the EC and proposed OECD classiﬁcation criteria on the irritating potential of the compounds tested in
the EC/HO study was investigated. First of all, it was established
that applying the two classiﬁcation systems to the EC/HO compounds resulted in classiﬁcations that were comparable between
the two systems, i.e. R36 compounds were also Category 2A/2B
compounds, and R41 compounds were also Category 1 compounds.
Subsequently, it was demonstrated that the MMAS cut-offs of 25
and 59 belonging to, respectively, irritant and severe irritant, were
not appropriate for classiﬁcation according to these two regulatory
systems. Eight compounds with an MMAS lower than 59 were in
fact severe irritants (R41/Category 1) and 4 compounds with a
MMAS higher than 59 and 3 compounds with a MMAS lower than
25 were irritants (R36/Category 2). One of the reasons was that an
MMAS could be lower than 59 during the study while ocular effects
persisted until day 21 which according to the classiﬁcation system
is reason for R41/Category 1 classiﬁcation. The recommendation
was that validation of alternatives would beneﬁt from the use of
classiﬁcations based on the proposed OECD harmonized system
(later on adopted as the EU-CLP and UN/GHS classiﬁcation systems). After this publication on the role of the MMAS in 1999, it was
not until 2004 that a new initiative was undertaken to (re-)validate
four of the alternative methods which were considered the most
promising in the EC/HO study, especially for the screening of severe
irritants.
2.8. International validation of the ICE (ICCVAM study)
The validation was an initiative of ICCVAM and NICEATM (National Toxicology Program (NTP) Interagency Centre for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods) of the USA in
collaboration with ECVAM of the EC and the methods selected were
the ICE, the HETeCAM, the IRE (formerly called REET) test and the
BCOP. An independent Expert Panel was established for each
alternative method to determine the validation status of these
methods. After a public request for data on the four methods in
2004, a public meeting was held in January 2005 at the National
Institutes of Health (NIH), Bethesda, USA to assess the current
validation status of the in vitro test methods proposed for identifying compounds that may cause serious eye damage and to
develop recommendations for further validation. During that
meeting, the ICE method was presented. The attitude of the Panel
members towards the validation procedure in general was rather
disappointing. The focus was on the belief that the poor correlation
with the Draize Eye Test was due to shortcomings in the practical
performance of the in vitro methods which should be improved,
rather than critically addressing the validity and shortcomings of
the Draize eye test itself and its consequences for the validation of
in vitro alternatives. Emphasis was again put on the statistical
evaluation of the in vivo and in vitro data (Prinsen, 2005).
Another public request for in vitro data was made by ICCVAM in
February 2005. ICCVAM received data of in total174 compounds, i.e.
€ter (1993; 21 compounds).
previously tested by i) Prinsen and Koe
ii) Prinsen (1996, 2005, dataset of 94 compounds), and iii) Balls
et al. (1995; 59 compounds), which were compiled in a background
review document (ICCVAM, 2006a). This time the MMAS was no
longer used for reanalysis of the accuracy and reliability of the ICE,

but regulatory classiﬁcation criteria (UN-GHS, EC and EPA) were
applied as was recommended previously (Prinsen, 1999). ICCVAM
and its Ocular Toxicity Working Group summarized the Expert
Panel evaluation, the revised analyses, the public comments, and
the comments of the Scientiﬁc Advisory Committee on Alternative
Toxicological Methods in a ﬁnal Test Method Evaluation Report
(ICCVAM, 2006b).
The conclusion was that ”there are sufﬁcient data to substantiate
the use of the BCOP or the ICE test methods, with certain limitations, as
screening tests to identify compounds as ocular corrosives and severe
irritants in a tiered-testing strategy, using a weight-of-evidence
approach, for regulatory hazard classiﬁcation purposes”. The limitations of the ICE were the testing of alcohols based upon the false
positive rate and of solids and surfactants based upon the false
negative rates. The limitations for the BCOP were the testing of
alcohols and ketones based upon the false positive rates and of
solids based upon the false negative rate.
Although the acceptance as a screen for ocular corrosives and
severe irritants was a success for the ICE, the way the data were
used by ICCVAM for reanalyses and for adjustments in the experimental procedures of the ICE was debatable. It was acknowledged
that the in vivo rabbit eye test was subject to variability, but the
in vivo data were taken as absolutely accurate (the “Golden Standard”) in predicting the eye irritation potential of a compound.
The in vivo irritation classiﬁcations were assigned if the study
performance met the criteria set by ICCVAM. One of the criteria
(assessment of full reversibility of any eye effect) was the reason
that the database (ICCVAM, 2006a) contained many gaps compared
to the original data submitted, whereas sufﬁcient in vivo data were
available for classiﬁcation. For example, two compounds (2,2dimethyl butanoic acid and p-ﬂuoroaniline) identiﬁed in the EC/
HO validation study as severe irritants (R41) on the basis of the
individual in vivo data (ECETOC, 1998) were rejected with the
remark “study criteria not met”. The two compounds were
correctly identiﬁed as R41 by the ICE and by most other in vitro
methods participating in the validation study. The in vivo classiﬁcation was based on sound scientiﬁc judgment, but ICCVAM
decided to exclude the compounds, because a 21-day observation
period was not completed. The OECD/EC guidelines (at the time of
testing) speciﬁed that the observation period should be long
enough to evaluate the reversibility or irreversibility of the lesions.
The six rabbits treated with 2,2-dimethyl butanoic acid still showed
slight to severe corneal opacity and neovascularization of the
cornea at 14 days after treatment. It was considered evident that
these lesions would not have cleared within a 21-day observation
period. Thus, the 14-day observation period applied was in agreement with the guidelines and should not have been a reason for
discarding the results by ICCVAM. The same applied for p-ﬂuoroaniline, which caused moderate to severe corneal opacity and
iritis score 2 (highest score possible; no reaction to light, haemorrhage, gross destruction). The test was terminated on day 3, which
is also in agreement with the guidelines which state that animals
may be humanely sacriﬁced if the severity of the effects is
considered too high.
Similar cases occurred in the “parallel” data set of the 94 compounds provided by Prinsen (2005). These cases also mainly concerned in vivo eye irritation studies that were terminated earlier
than 21 days after treatment because of the severity of eye effects or
compounds lacking an in vivo eye irritation study because of proven
skin corrosivity in the in vivo rabbit skin irritation test (10 compounds), that was performed immediately after the ICE had shown
severe eye irritancy. In full agreement with the guidelines, the
in vivo eye irritation test in rabbits was waived in these ten cases.
The individual in vivo skin irritation data and the ICE data were
provided to ICCVAM, but the 10 compounds remained excluded

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

from the analyses because of “classiﬁcation assigned on the basis of
skin corrosion assay” (SC). Remarkably, ICCVAM claimed to apply
the criteria for classiﬁcation according to the EC (1993) and UN
(2007), whereas both guidelines unambiguously state “corrosive
to skin” as one of the criteria for classifying a compound as severely
eye irritating.
Another remarkable conclusion in the ICCVAM document was
the underperformance of surfactants by the ICE. This conclusion
was primarily based on the 6 surfactants examined in the EC/HO
validation study. The correlation percentages for surfactants in the
EC/HO study tested by the four participants that performed the ICE
were 72, 82, 83 and 76%, compared to an overall mean correlation
percentage of 54%. In general, the chemical class of surfactants was
best predicted by each of the nine in vitro methods participating in
the EC/HO study. The fact the ICE has been employed by P&G for
more than ten years for their product development (Schutte et al.,
2009), the majority of which contains surfactants covering the
whole spectrum of eye irritancy, is in contrast with ICCVAM's
conclusion. More recently, member companies of the International
Association for Soaps, Detergents and Maintenance Products (AISE)
increasingly use the ICE for their (surfactant-containing) products
(Cazelle et al., 2014).
With respect to the ICE study performance the ICCVAM expert
panel identiﬁed two major issues: 1) the variability in swelling
percentages obtained by the four laboratories performing the ICE,
and 2) the use of only one control eye per experiment.
2.8.1. Variability in swelling percentages (high CVs)
The variation in swelling percentage was caused by the use of
different pachymeters with different slit width settings. This was
already intensively discussed by the Management Team of the EC/
HO study, but was considered of no concern because the in vivo
MMAS was compared to the critical scores of the ICE (i.e. the max.
mean swelling%, max. mean opacity score and mean ﬂuorescein
score) and not to the regulatory irritation classiﬁcations. ICCVAM
overlooked this fact and decided to apply the TNO ICE system for
categorizing effects to the other three participating labs as well.
This was a valid approach for the opacity and the ﬂuorescein scores
because the scoring is exactly the same for the four labs, but it could
not be used integrally for the swelling %. The misconception of the
variability in corneal swelling by the ICCVAM expert panel led to
incorrect conclusions and recommendations. For example,
centering lights needed to be installed on the optical pachymeter to
improve the determination of corneal thickness by ensuring
consistent central corneal thickness measurements across laboratories. The purpose of these lights in human ophthalmology is to
guide the patient's eye to a ﬁxed point and thus perform the
reading at the centre of the cornea. This is used because the subjects often (involuntarily) move their eyes making the (central)
corneal thickness assessment difﬁcult and variable. The chicken eye
is isolated and ﬁxed, so there is no movement at all. Therefore, the
corneal thickness can be measured in a very accurate and reproducible way at the centre of the cornea without any additional aid.
2.8.2. Use of control eyes
ICCVAM decided to increase the number of negative control eyes
from the usual one per experiment to three, because three was the
accepted minimum of replicates in in vitro testing in general. The
use of only one negative control eye has been employed and
approved by all users of the isolated eye test (both with rabbit eyes
and with chicken eyes) since the introduction of the method by
Burton in 1981 and during the EC/HO study. The use of only one
negative control eye is justiﬁed since the effects of the cornea
treated with the test material are not assessed or evaluated in any
way against the effects of the control eye. This is possible because,

143

prior to testing, the quality and suitability of each cornea can be
accurately assessed and, moreover, each cornea provides its own
pre-dose baseline thickness/opacity/ﬂuorescein control values.
Furthermore, all compounds (liquids, pastes and solids) are tested
neat and, therefore, effects of solvents need not to be examined. The
purpose of the negative control eye is only to demonstrate the
appropriateness of the general conditions in the chambers of the
superfusion apparatus, i.e. the saline drip onto the cornea and
chamber temperature, necessary to maintain corneas in the proper
condition during the 6-hour test period. All ICE experiments used
for the ICCVAM BRD were performed with one negative control,
representing 354 independent test runs or replicates. These negative controls never showed any unusual effect during the 6-hour
test period and adequately demonstrated the appropriateness of
using only one negative control for the purpose of monitoring the
general conditions of the test system. Other alternatives like the
BCOP need to use three or more control corneas because pre-dose
corneal observations, to assess their suitability for testing, are not
possible. The BCOP control values at each observation time point
are needed for subtraction from the values of the test corneas.
Following a public request for comments on the draft ICCVAM
Test Method Evaluation Report: “Evaluation of the Current Validation Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants” (Federal Register, 2005a) and the
“In Vitro Ocular Toxicity Draft Background Review Document
(BRD)” on the ICE test method (Federal Register, 2005b), the discussion concentrated on the exclusion of the ICE data of skin corrosive compounds and other data gaps in the BRD. Concern was
expressed on the decision to pool the data of the various ICE
(validation) studies for analyses without analysing the individual
studies separately. In vivo and in vitro data obtained in “parallel” are
of a higher quality than ICE data compared to in vivo data obtained
from literature, because in the latter case it is obtained by different
observers, with different batches of the compound, under different
laboratory conditions and often with only summarizing data reported. Furthermore, reservations were made about the handling of
the in vivo data, i.e. that no lessons were learned from previous
validation studies, which made clear that another approach for
validation was needed. The disadvantages and shortcomings of the
in vivo rabbit eye test and their implications on the test results
should be addressed ﬁrst before starting the validation process.
3. The Draize eye test and in vitro alternatives; a left-handed
marriage?
Recognizing, understanding, and the correct appreciation of the
in vivo test conditions and their effect on the results are crucial for
the evaluation of the in vitro results obtained by the alternative test
method. The in vitro test conditions can usually be fully controlled
in contrast to the conditions of testing in the in vivo rabbit test. The
in vivo results are used as the “Golden Standard” for all comparisons
with the alternative tests. However, the shortcomings of this test
should not be ignored, especially if one is aware of the nature and
extend of these shortcomings. Up to now, in compliance of the
rabbit test with the current guidelines was the criterion used in
validation studies for the validity and acceptance of the in vivo data.
Once that was established, the in vivo results are treated as the
absolute truth without any room for interpretation or expert
judgment. This means that a compound is classiﬁed as a nonirritant, an irritant or a severe irritant based on the in vivo test
without any kind of nuance or deliberation. There is general
agreement that the in vivo test in rabbits is far from perfect, but the
implications of the inconsistencies of the in vivo test for the validation of the alternatives were never taken into account.
In fact, over the years an increasingly rigid attitude towards

Convocatie
144

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

questioning the value of the in vivo eye irritation data can be noted.
This can be considered the root of the problems encountered since
the very ﬁrst validation took place in 1989.
There is a common believe and acknowledgement that the
in vivo rabbit eye test produces variable results due to the fact that
different labs and observers are involved and data had been obtained over a very long period of time. However, this is only a small
part of the problem. There are more serious reasons to consider the
in vivo data in a critical way.
There are several important issues that play a crucial role in the
outcome of the in vivo test:
3.1. The kind of exposure
By instillation of the compound in the conjunctival cul-de-sac,
closing the eye-lids for one second and then releasing the rabbit,
the exposure is undeﬁned. It can be anything from minutes (liquids) to 24 h (solids). No washing out of remnants from the
conjunctival sac was allowed before 24 h after treatment. Only after
modiﬁcation of the OECD guideline in 2002 was a wash-out
allowed after one hour. Especially with poorly soluble/dissolving
powders the results can be devastating if the powder is present for
one hour, let alone for up to 24 h. It should be noted that the ICCVAM validation was mainly with in vivo data obtained before 2002.
Remarkably, Draize only mentions the testing of liquids, solutions
and ointments and not the testing of solids. In fact, in his 14-page
publication (Draize et al., 1944), only one sentence is dedicated to
the actual test procedure for eye irritation testing. Overall, eye
irritation was dealt with in a rather limited way when compared to
his discussion on dermal toxicology and skin sensitization. One
wonders what would have happened if Draize had extended his eye
irritation investigations to the testing of solids.
These undeﬁned exposure conditions are in contrast to the basic
principles of toxicity testing. Moreover, this kind of exposure condition by placing such a large amount of compound in a retracted
eye-lid will hardly occur in humans.
A well-deﬁned and standardized exposure in toxicity testing is
one of the pillars of hazard and risk assessment. For instance, in the
acute skin irritation in rabbits, a semi-occlusive exposure of
0.5 mLe6.25 cm2 of skin is applied for 4 h under a patch and ﬁxative
tape. These are standardized conditions and remarkably the skin
irritation test in rabbits has been fully replaced by alternatives since
2010 (OECD, 2004; OECD, 2010a,b).
3.2. Behaviour of the animals
The behaviour of rabbits after treatment may also differ
considerably. After treatment the animal is immediately released
and is placed in its home cage where it can move freely. Usually,
they start grooming and/or scratching. One rabbit out of a group of
3 treated may do this excessively, while on the other end of the
behavioural spectrum another animal may freeze and not react at
all. Again these variations in behaviour add considerably to the
variability of the results.
3.3. Treatment of the eye post-exposure
When signiﬁcant irritation occurs in an early stage, the treatment of the eye post-exposure highly determines the outcome for
classiﬁcation. The observation times after treatment are essentially
the only moments that the animals are handled outside the cage. In
case of a moderate eye irritant those time points are normally 1 h,
24 h, 48 h, 72 h, 7 days, 14 days and 21 days. In between, the animals
are not handled except for a cage-side observation once a day. The
enclosure of solid materials up to 24 h in the conjunctival cul-de-

sac, sometimes in combination with mechanical damage, can
have a devastating effect on the eye. In the case of poorly watersoluble solids with distinct cytotoxic properties, the entrapped
solid can rapidly cause a considerable and increasing swelling of
the conjunctivae, making it very difﬁcult for the animal to remove
the material. If, at the 1-hour observation, the lower eye-lid is not
pulled away far enough by the observer, a bulk of test material
deeply hidden in the conjunctival cul-de-sac may remain unnoticed. In most cases this continuous exposure for the next 24 h
results in a complete closure of the eye-lids by the abundant production of colloidal discharge which often forms a sealing crust.
Upon opening the sealed eyelids, purulent discharge, and other
inﬂammatory debris are released. If the animal (treated eye) is not
receiving special care of the eye an otherwise irritating compound
can easily become a severe one.
The swelling of the conjunctivae can be such that removal of the
remains of the test compound is hardly possible. In the majority of
these cases, the eye is permanently damaged or can only be saved
by applying special care, such as regular daily cleaning and rinsing
of the eye and eye-lids, often including cutting off the eye-lashes to
prevent further sealing. This special care is not common practise in
the Draize eye test nor is it mentioned in the guidelines, whereas it
can certainly relieve the discomfort and pain experienced by the
rabbit considerably. In general, keeping the eye-lids open is
essential for the recovery process, otherwise the enclosed inﬂammatory exudate will further damage the cornea. If no further
extensive remedial treatment is given to the animal, the exposure
conditions described can lead to an opacity score of 3 or 4 instead of
the initial score of 1 or 2. In these cases, recovery from these injuries has little or no relevance for man. As with the exposure
conditions, these kind of circumstances are not representative for
the human situation. After accidental exposure, one will seek
“immediate” care in case of ocular damage, and the victim will
usually receive medical treatment, if required. The unrealistic
exposure conditions in the Draize eye test impelled P&G to develop
the in vivo rabbit Low Volume Eye Test (LVET) for their products
(Grifﬁth, 1987). For instance, the testing of a dish wash detergent
tab would result in dramatic ocular effects in the standard in vivo
Draize eye test, because the tab is ground to a ﬁne powder and
instilled as a bulk in the conjunctival cul-de-sac of the rabbit and
remains there for at least one hour (before 2002 up to 24 h). Nobody would consider this as real exposure circumstances, nor will it
occur in real life. In the ICE, the exaggerated test conditions can be
mimicked by leaving the powder on the cornea for up to 60 s
instead of the standard 10 s, but what relevance does it have? The
LVET was designed to mimic the possible human exposure, by
exposure to a tenth of the usual amount directly onto the rabbit's
cornea in the Draize eye test, and was extensively used for household care products. Now P&G uses the ICE for their purposes
because the test also mimics the possible human exposure more
closely. In general, it was astonishing that both ECVAM and ICCVAM
urged that the ICE method needed to be modiﬁed in order to mimic
the extreme exposure conditions of the in vivo Draize eye test,
rather than modifying the exposure (to solids) in the in vivo Draize
eye test.
Another phenomenon that occasionally occurred in the Draize
eye test is the development of a secondary infection following the
eye effects caused by the compound (initial infection). In the past,
the hygiene standards in the laboratories were not as high as
currently, and the treated eye could be infected by the scratching/
grooming of the animal with its paws. In addition to the inﬂammation caused by a compound, the eye is more vulnerable to
microbiological infection, causing initial mild to moderate effects
during the ﬁrst days after exposure developing into more severe
and prolonged effects during the 21 days observation period. An

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

interesting example of such an event can be found in one of the
compounds tested in the EC/HO study, which was also used in the
ICCVAM validation of the ICE.
1-Napthaleneacetic acid was tested in six rabbits of which one
rabbit showed very unusual persisting and increasing effects after
day 7, compared to the eye effects observed in the other ﬁve rabbits
(ECETOC, 1998). The effects of the ﬁve rabbits followed a pattern
which is normally expected for the initially slight to moderate eye
effects, i.e. gradually decreasing in severity after day 3 followed by a
complete recovery on day 14 or day 21. In the sixth rabbit, a similar
pattern was observed until day 7, but thereafter the slight opacity
observed increased to a moderate opacity on day 10 and ﬁnally a
very severe opacity on days 14 and 21. This difference in the pattern
of the eye effects is remarkable and most probably caused by a
secondary infection in the eye of the animal. Based on the result in
this rabbit, the compound was classiﬁed as Category 1, whereas the
initial effects (24e72 h) in the 6 rabbits would lead to a Category
2(A) classiﬁcation. The ICE test also classiﬁed the compound as
Category 2.
It is remarkable that the OECD guideline 405 of 1981 already
stated that “Care should be taken in the interpretation of data to
exclude irritation resulting from secondary infection”. However,
this issue was neither addressed in the EC/HO validation nor in the
ICCVAM validation.
3.4. Observation/grading of eye effects
In the early days of validation of alternatives for eye irritation it
was recognized that the variability could be high in the Draize eye
test, and this was considered to be caused by subjective scoring by
different observers and by interlaboratory variability (Weil and
Scala, 1971; Lordo et al., 1999; Ohno et al., 1999). Unfortunately,
the publications by Lordo and Ohno did not include the individual
in vivo rabbit eye data which might have provided more insight in
the underlying causes of the variation. Subjective scoring is indeed
part of the problem but a large part of the variation presently
ascribed to subjective scoring might in fact be caused by differences
in animal behaviour, differences in exposure times, and absence (or
presence) of post-treatment care. For instance in the study of Weil
and Scala, in one laboratory ethanol 95% caused a combined score
(all tissues combined) of 2, 9, 22, 15, 38 and 110 in the 6 rabbits at
the 72-hour observation time point. A score of 110 is the maximum
score possible. Amongst the 24 laboratories the median score for
ethanol 95% ranged from 0 to 42. This cannot be explained by
subjective scoring only. The subjective nature of the observation
deﬁnitely plays a role with compounds causing effects near the
thresholds for classiﬁcation (not classiﬁed/irritant and irritant/severe irritant).
First of all there is the grading/scoring of the effects itself. The
Atlas of eye effects of the FDA (1964) already gave rise to debate. For
example the redness of the conjunctivae of the eye no. 6 of Plate 1
(Fig. 1) is stated to be score 2 (moderate redness: more diffuse,
deeper crimson red, individual vessels not easily discernible; see
also Table 2 of the Introduction). Based on the grading of eye effects
of all compounds tested at TNO since 1981, it should be the
maximum score of 3 (severe redness: diffuse beefy red), because a
more intense redness cannot be observed. Eye no. 3 of Plate 1 is
presented as a case of redness score 1 (slight redness: vessels
deﬁnitely injected above normal), whereas this would be a good
example of score 2 for redness. Eye no. 2 of Plate 1 is more representative of a redness score 1 than of a normal eye (redness: vessels
normal). The other plates of the Atlas contain more examples of
grading that are considered questionable and subject to debate.
Another issue concerning the subjective scoring is the decision
the observer has to make in certain cases where the score of one

145

animal at one time point can make the difference between, for
instance, not classiﬁed and irritant (Category 2). For EU-CLP and
UN-GHS classiﬁcation, the individual tissue scores of each animal is
ﬁrst averaged over the 24e72 h time points and next the average
score of the two rabbits showing the highest score for a speciﬁc
tissue determines classiﬁcation or not. The threshold score for
redness or for swelling of the conjunctivae is an overall average of
2.0 for classifying as a Category 2 compound. Table 9 shows a
theoretical case where one of the 6 scores can make the difference
between classifying or not. The score of 1.0 in Table 9 is assigned to
animal 2 at the 72 h time point, but can theoretically be at any of
the 6 different places.
3.5. Appreciation of the in vivo data
With the knowledge of the factors inﬂuencing the in vivo results
the “black or white” approach applied by ICCVAM can hardly be
defended. Weil and Scala (1971) even concluded that the eye irritation test in rabbits as published by the Federal agencies of the US
should not be recommended as standard procedure in any new
regulations. However, the Draize eye test has been used practically
unchanged until now.
Balls and Fentem (1993), concluded: “It is very rare for any
allowance to be made for the variability of the animal data, which are
thus given a status which they do not deserve. They wrongly become
the “true” values which the non-animal tests must struggle to reproduce. Also, insufﬁcient allowance is made for the doubt which must be
placed on values which fall within the barrier zones on both sides of
category cut-off points. This is particular worrying when Cooper twoby-two way plots are used as a basis for establishing the sensitivity,
speciﬁcity, predictivity and concordance of in vitro test data”. Bruner
et al. (1996), concluded after computer simulations that even if
the alternative methods were perfectly reproducibly (if their coefﬁcients of variation were 0), the variability in the Draize scores
alone would restrict the Pearson's correlation coefﬁcients to the
range 0.65e0.80 when the Draize scores are between 0 and 40,
which are typical for (mild) irritants.
4. ICE OECD test guideline 438
One of the conclusions in the ICCVAM test method evaluation
report (ICCVAM, 2006b) was: “There are sufﬁcient data to support the
use of the ICE test method, in appropriate circumstances and with
certain limitations, as a screening test to identify compounds as ocular
corrosives and severe irritants (i.e., EPA Category I, UN GHS Category 1,
EU R41) in a tiered-testing strategy, as part of a weight-of-evidence
approach. The identiﬁed limitations for this method are based on the
false negative and false positive rates that are observed for certain
chemical and physical classes. Based on the available database, the
false negative rates for alcohols, surfactants and solids range from 33%
(1/3) to 50% (1/2), 44% (4/9) to 57% (4/7), and 46% (6/13) to 70% (7/10),
depending on the hazard classiﬁcation system (EC, UN-GHS or EPA)
used. Additionally, the false positive rates for alcohols range from 27%
(3/11) to 50% (5/10)”. Two of the alcohols in the data base were
ethanol and butanol. Both caused severe irritancy in the ICE (and
BCOP) but were Category 2 according to the in vivo data of ECETOC
(1998). As discussed previously the in vivo data of Weil and Scala for
ethanol (and also for butanol) showed very high inter- and intralaboratory variations, making the ICCVAM conclusion on performance of the ICE with respect to alcohols questionable. Also the
surfactant examined in the study of Weil and Scala showed high
inter- and intralaboratory variations.
In 2009, on the basis of the ICCVAM evaluation report the ICE
and BCOP were adopted as an OECD Test Guideline (TG 438 and TG
437, respectively) for the screening of severe eye irritants. The false

Convocatie
146

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

Fig. 1. FDA guidance on scoring of ocular lesions; Plate 1 (FDA, 1964).

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149
Table 9
Examples of conjunctival scores (redness or
swelling); Category 2 (ﬁrst table) versus not
classiﬁed (second table).
Time point 24 Hours
Animal 1
Animal 2

2.0
2.0

Time point 48 Hours
Animal 1
Animal 2

2.0
2.0

Time point 72 Hours
Animal 1
Animal 2

2.0
2.0

Time point 4 Hours
Animal 1
Animal 2

2.0
2.0

Time point 48 Hours
Animal 1
Animal 2

2.0
2.0

Time point 72 Hours
Animal 1
Animal 2

2.0
1.0

negative rates for identifying severe irritants, i.e. compounds
identiﬁed by the ICE as not severely irritating, were not considered
critical since these compounds are still to be tested in the in vivo
rabbit eye test. In the OECD test guideline, the limitations with
respect to the screening of surfactants, alcohols and solids were
also mentioned. Speciﬁcally it was mentioned that: “The current
validation database did not allow for an adequate evaluation of some
chemical or product classes (e.g. formulations). However, investigators
could consider using this test method for testing all types of compounds (including formulations), whereby a positive result could be
accepted as indicative of an ocular corrosive or severe irritant
response. However, positive results obtained with alcohols should be
interpreted cautiously due to risk of over-prediction”. The speciﬁc
mentioning of formulations is remarkable because the ICE is used
more frequently for formulations than for pure compounds.
Moreover, the Draize eye test also does not make any distinction
between the testing of pure compounds and formulations. In
general, one should realize that at that time the eye irritation potential of almost all, if not all, compounds had been determined for
regulatory purposes in one single type of eye (test), i.e. the rabbit
eye (test).
A follow-up evaluation of the usefulness and limitations of alternatives for identifying mild/moderate and non-irritant chemicals was made by NICEATM/ICCVAM, in collaboration with ECVAM
and JaCVAM. In early 2011, a proposal for updating the BCOP TG 437
for the identiﬁcation of chemicals not requiring a classiﬁcation for
eye irritation was submitted to the OECD by means of a Standard
Project Submission Form (SPSF). The BCOP database comprised 196
compounds of which 89 were non-irritants, and these data were
used to draft a Streamlined Summary Document (SSD). The BCOP
was considered appropriate because the percentage of false negatives for non-irritants was 0%. However, the percentage of false
positives was 69%. The ICE test was not proposed for such an update, because the review panel maintained the original recommendation to use the ICE only for classiﬁcation of ocular corrosives
and severe irritants. Speciﬁc objections against the use of the ICE
for chemicals not requiring a classiﬁcation was the fact that two
compounds of the “parallel” dataset (coded TNO-28 and TNO-94)
identiﬁed as non-irritants by the ICE turned out to be severe

147

irritants in the in vivo rabbit eye test. It was argued that the review
panel had not studied the nature of the effects of these two false
negative substances in detail. TNO-94 was an anti-fouling paint for
the shipping industry, a speciﬁc type of product, which produced
reversible irritating eye effects in two out of three rabbits. In the
third rabbit an unusual effect occurred, i.e. adherence of the paint to
the cornea which was reason to humanely sacriﬁce the animal on
day 1. Anti-fouling paints are designed to be very durable which
may explain the ﬁndings in this rabbit. Whether or not this peculiar
effect is relevant for humans, excluding (anti-fouling) paints from
ICE testing would have no major consequences for the applicability
of the method for screening of non-irritants in general. TNO-28
caused no corneal or iris effects; only conjunctival effects were
observed. The conjunctival effects observed with this compound
were below the threshold for classiﬁcation as an eye irritant. Eye
effects had cleared completely in one rabbit after 72 h and in
another rabbit after 7 days. The third rabbit showed increased
conjunctival effects at 48 h after treatment and on day 14 moderate
redness and slight swelling of the conjunctivae were still observed.
Importantly, a white ocular discharge was also observed which was
a sign of secondary infection. The fact that the same effects were
observed at 21 days after treatment supported this assumption.
One week later, the eye effects in this rabbit had cleared completely.
Overall, the ICE “parallel” data set provided by TNO showed a
false negative rate for non-irritants of 6% and a false positive rate of
1%. Therefore, the OECD was asked to reconsider the applicability of
the ICE for the purpose of identifying non-irritants. During an OECD
expert meeting (6e7 December 2012, Paris), the limitations of the
in vivo Draize rabbit eye irritation test and their implications for
validation purposes were recognized and summarized in the
document (OECD, 2013b) as follows:
1. “The in vivo rabbit eye irritation/corrosion test has no standardized
exposure regimen. Therefore, the duration of exposure of the test
substance with the rabbit eyes remains unknown and can vary
from a few minutes to several hours. In addition, for solids and
sticky chemicals it is unclear how much of the compound (solid,
paste or liquid) stays in contact with the eye;
2. The limited reproducibility of the Draize rabbit eye test method;
3. The subjectivity in the allocation of the rabbit ocular tissue scores;
4. The type of exposure which does not reﬂect a potential human
accidental exposure;
5. The differences in physiology and sensitivity to tested chemicals
between rabbit and human eyes”.
The re-evaluation of the ICE ICCVAM dataset showed that individual in vitro and in vivo classiﬁcations of a number of compounds need further considerations. Discrepancies were found in
the ﬁnal in vivo and in vitro classiﬁcations for a number of compounds that had an impact on the ﬁnal number of false negative
compounds. After re-evaluation, the ICE test method had an overall
accuracy of 82%, a false positive rate of 33%, and a false negative rate
of 1% (instead of 6%) for non-irritants, when compared to the in vivo
data classiﬁed according to the UN-GHS. If anti-fouling organic
solvent containing paints were excluded from the database, the
accuracy of the ICE test method was 83%, the false positive rate 33%
and the false negative rate 0%.
In September 2013, the OECD TG 438 for the ICE was ofﬁcially
adopted including the identiﬁcation of non-irritants (in general
about 80% of the chemicals tested are non-irritants). This was a
huge success for the ICE and for the 3Rs in general, but it still meant
that compounds not identiﬁed by the ICE as non-irritant or severe
irritant have to be tested in the in vivo rabbit eye test.

Convocatie
148

M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149

5. Lessons learned and considerations

online at http://dx.doi.org/10.1016/j.yrtph.2017.01.009.

 For eye irritation with a lack of human data, the combined
in vitro/in vivo (parallel) testing instead of using in vivo rabbit eye
irritation data from literature only provided an more relevant
setting for i) developing and validating the alternative method,
ii) introducing the method to industry and regulatory authorities, iii) getting insight in, and critically address the pros and
cons of both the in vitro and in vivo test system.
 A meaningful validation of an in vitro alternative model in the
middle range of irritancy (Category 2 classiﬁcation) cannot be
reached with the current in vivo rabbit eye irritation data set due
to the large variability.
 The procedure to select or to accept models suitable as an
in vitro alternative to eye irritation should be more critical than
in the past. Alternatives should have a direct relation to (human)
ocular irritancy and be developed on the basis of the mechanistic principles of (human) ocular inﬂammation, instead of
matching Draize eye test results only.
 It should be realized that the existing in vivo rabbit eye irritation
data does not reﬂect the inﬂammatory and recovery processes
in humans. Therefore, the data of the Draize eye test are not
suitable for the development of in vitro models for eye irritation
focusing on discrimination between severe, but reversible or
severe, but irreversible eye effects.
 The in vivo eye irritation test in rabbits should no longer be
allowed, and should be completely replaced by alternative
methods, for instance the ICE.
 The household and personal care industry that share their
strategy to fulﬁl regulatory demands without the use of the
in vivo animal test with other (chemical) industries and regulatory authorities, should be rewarded, e.g. by providing a ‘safe
harbour’ to evaluate data derived from alternative methods
(Schiffelers et al., 2014).

References

6. Conclusions
Alternatives to the Draize eye irritation test should preferably
make use of ex vivo eyes, eye tissue, or eye tissue equivalents in
order to measure, both qualitatively and quantitatively parameters
similar or identical to those in the clinic. The appropriateness of the
presently available alternatives, based on the above mentioned
criteria and in order of suitability, is as follows:
1. Models using intact isolated eyes with slit-lamp microscope
observations and histopathology, e.g. the ICE or IRE.
2. Models using excised corneas with light transmission and
ﬂuorescein measurements and histopathology, e.g. the BCOP
(Bovine) or PCOP (Porcine).
3. 2D or 3D human corneal epithelium reconstruction models,
which have as major disadvantage the lack of the different
membranes of the cornea, corneal stroma and corneal
endothelium.

Conﬂict of interest statement
The authors declare that the research was conducted in the
absence of any commercial or ﬁnancial relationships that could be
construed as a potential conﬂict of interest.
Transparency document
Transparency document related to this article can be found

Balls, M., Fentem, J.H., 1993. On Recognizing and Overcoming Barriers to the
Acceptance of Alternative Methods. Alternative Methods in Toxicology and the
Life Sciences 11, Part 11 a. Mary Ann Liebert, Inc., publishers, New York.
Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H., Spielmann, H., 1995. The EC/HO international
validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. Vitro 9,
871e929.
Brantom, P.G., Cassidy, S., Eigler, D., Esdaile, D., Fentem, J.H., Liebsch, M.,
McPherson, J., Pfannenbecker, U., Prinsen, M.K., 2000. TNO BIBRA Report No. 2/
3387/00. Preliminary Evaluation of the Application of Reference Standards in
the Prevalidation and Validation of in Vitro Tests for Eye Irritation, vol. 2.
December 2000.
Bruner, L.H., Carr, G.J., Chamberlain, M., Curren, R.D., 1996. Validation of alternative
methods for toxicity testing. Toxicol. Vitro 10 (4), 479e501.
Burton, A.B.G., 1972. A method for the objective assessment of eye irritation. Fd.
Cosm. Toxicol. 10, 209e217.
Burton, A.B.G., York, M., Lawrence, R.S., 1981. The in vitro assessment of severe eye
irritants. Fd. Cosm. Toxicol. 19, 471e480.
Cazelle, E., Eskes, C., Hermann, M., Jones, P., McNamee, P., Prinsen, M., Taylor, H.,
Wijnands, M.V.W., 2014. Suitability of histopathology as an additional endpoint
to the isolated chicken eye test for classiﬁcation of non-extreme pH detergent
and cleaning products. Toxicol. Vitro 28, 657e666.
Chan, T., Payor, S., Holden, B.A., 1983. Corneal thickness proﬁles in rabbits using an
ultrasonic pachometer. Investigative Ophthalmol. Vis. Sci. 24 (10), 1408e1410.
Doughty, M.J., Zaman, M.L., 2000. Human corneal thickness and its impact on
intraocular pressure measures: a review and meta-analysis approach. Surv.
Ophthal 44 (5), 367e408.
Draize, J.H., Woodard, G., Calvery, H.O., 1944. Methods for study of irritation and
toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes.
J. Pharmacol. Exp. Ther. 82, 377e390.
EC, 1984. Directive 67/548 (6th adaptation); Annex V Part B: methods for the
determination of toxicity B.5. Acute toxicity, eye irritation. Ofﬁcial J. Eur.
Community 27 (L251), 109.
EC, 1991. Collaborative Study on the Evaluation of Alternative Methods to the Eye
Irritation Test. Document XI/632/91-V/E/1/131/91, part I and part II. European
Commission, Brussels.
EC, 1993. Commission directive 93/21/EEC of 27 April 1993 adapting to technical
progress for the 18th time council directive 67/548/EEC on the approximation
of laws, regulations and administrative provisions relating to the classiﬁcation,
packaging and labelling of dangerous substances. Ofﬁcial J. Eur. Communities
(L110A), 1e86.
ECETOC, 1998. Eye Irritation e Reference Chemicals Data Bank. Technical Report No.
48(2). European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Brussels.
Faber, C., Scherﬁg, E., Prause, J.U., Sørensen, K.E., 2008. Corneal thickness in pigs
measured by ultrasound pachymetry in vivo. Scand. J. Lab. Anim. Sci. 35, 39e43.
FDA, 1964. Illustrated Guide for Grading Eye Irritation by Hazardous Substances.
Washington, D.C. 20204, USA.
Volume 70, No. 53, Monday, March 21 Federal Register notice 13513, 2005a. National Toxicology Program; National Toxicology Program (NTP) Interagency
Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM);
Availability of Expert Panel Report on the Evaluation of the Current Validation
Status of in Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe
Irritants.
Volume 70, No. 142, Tuesday, July 26 Federal Register notice 43149, 2005b. National
Toxicology Program (NTP); NTP Interagency Center for the Evaluation of
Alternative Toxicological Methods (NICEATM); Availability of Revised Analyses
and Proposed Reference Substances for in Vitro Test Methods for Identifying
Ocular Corrosives and Severe Irritants.
Fowler, W.C., Chang, D.H., Roberts, B.C., Zarovnaya, E.L., Proia, A.D., 2004. A new
paradigm for corneal wound healing research: the white leghorn chicken
(Gallus gallus domesticus). Curr. Eye Res. 28 (No. 4), 241e250.
Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D., Sina, J.F., 1992. Bovine corneal opacity and
permeability test: an in vitro assay of ocular irritancy. Fund. Appl. Toxicol 18,
442e449.
Grant, W.M., 1986. Corneal Epithelial Vacuoles. Toxicology of the Eye, third ed., vol.
1. Charles C. Thomas Publishers, Springﬁeld, Illinois, USA, p. 9.
Grifﬁth, J.F., 1987. The low volume eye irritation test. Soap Cosm. Chem. Spec. 63 (4),
32e63.
Grifﬁth, J.F., Nixon, G.A., Bruce, R.D., Reer, P.J., Bannan, E.A., 1980. Dose-response
studies with chemical irritants in the albino rabbit eye as a basis for selecting
optimum testing conditions for predicting hazard to the human eye. Toxicol.
Appl. Pharmacol. 55, 501e513.
ICCVAM, 2006a. Current Status of in Vitro Test Methods for Identifying Ocular
Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH. Publication No: 06e4513.
ICCVAM, 2006b. In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Severe Irritants and Corrosives. NIH. Publication No: 07e4517.
Jacobs, G., Martens, M., 1988. The enucleated eye test: a comparison of the use of
ultrasonicand optic pachometers. Toxicol. Vitro 2 (4), 253e256.
Jacobs, G., Martens, M., 1990. Quantiﬁcation of eye irritation based upon in vitro
changes of corneal thickness. ATLA 17, 255e262.

Convocatie
M.K. Prinsen et al. / Regulatory Toxicology and Pharmacology 85 (2017) 132e149
€ter, H.B.W.M., Prinsen, M.K., 1985. Comparison of in Vivo and in Vitro Eye IrriKoe
tation Test Systems: a Study with 34 Substances. Alternative Methods in Toxicology 3, Chapter A9. Mary Ann Liebert, Inc., publishers, New York.
Li, H.F., Petroll, W.M., Møller-Pedersen, T., Maurer, J.K., Cavanagh, H.D., Jester, J.V.,
1997. Epithelial and corneal thickness measurements by in vivo confocal microscopy through focusing (CMTF). Curr. Eye Res. 16 (3), 214e221.
Lordo, R.A., Feder, P.I., Gettings, S.D., 1999. Comparing and evaluating alternative
(in vitro) tests on their ability to predict the Draize maximum average score.
Toxicol. Vitro 13 (1), 45e72.
Luepke, N., 1985. Hen's egg chorioallantoic membrane test for irritation potential.
Fd. Chem. Toxicol. 23, 287e291.
Maurer, J.K., Parker, R.D., Jester, J.V., 2002. Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key ﬁndings and recommendations for the
development of alternative assays. Regul. Toxic. Pharmacol. 36, 106e117.
McDonald, T.O., Baldwin, H.A., Beasley, C.H., 1973. Slit-lamp examination of experimental animal eyes. J. Soc. Cosmet. Chem. 24, 163e180.
Mishima, S., Kudo, T., 1967. In vitro incubation of rabbit cornea. Investig. Ophthalmol. 6 (4), 329e339.
OECD, 1981. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 405: Acute Eye Irritation/
corrosion, Adopted 12 May 1981. Organisation for Economic Co-operation and
Development, Paris.
OECD, 2001. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 423: Acute Oral
Toxicity (Acute Toxic Class method, Paris, France).
OECD, 2002. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 405: Acute Eye Irritation/
corrosion, Adopted 24 April 2002. Organisation for Economic Co-operation and
Development, Paris.
OECD, 2004. OECD guideline for testing of chemicals No. 431. In: In Vitro Skin
Corrosion: Human Skin Model Test, Adopted 13 April 2004. Organisation for
Economic Co-operation and Development, Paris.
OECD, 2009a. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 437: Bovine Corneal
Opacity and Permeability Test Method for Identifying Ocular Corrosives and
Severe Irritants, Adopted 7 September 2009. Organisation for Economic Cooperation and Development, Paris.
OECD, 2009b. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 438: Isolated Chicken
Eye Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants, Adopted
7 September 2009. Organisation for Economic Co-operation and Development,
Paris.
OECD, 2010a. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 429: Skin Sensitisation; Local Lymph Node Assay, Paris, France.
OECD, 2010b. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 439: in Vitro Skin Irritation - Reconstructed Human Epidermis Test Method, Adopted 22 July 2010.
Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
OECD, 2012. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 460: Fluorescein Leakage
Test Method for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants, Adopted 2
October 2012. Organisation for Economic Co-operation and Development, Paris.
OECD, 2013a. OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 438: Isolated Chicken
Eye Test Method for Identifying I) Chemicals Inducing Serious Eye Damage and
Ii) Chemicals Not Requiring Classiﬁcation for Eye Irritation or Serious Eye
Damage, Adopted 26 July 2013. Organisation for Economic Co-operation and
Development, Paris.
OECD, 2013b. Draft Streamlined Summary Document (SSD) for the Isolated Chicken
Eye (ICE) Test Method. ENV/JM/TG/RD(2013)19.
Ohno, Y., Kaneko, T., Inoue, T., Morikawa, Y., Yoshida, T., Fuji, A., Masuda, M.,
Ohno, T., Hayashi, M., Momma, J., Uchiyama, T., Chiba, K., Ikeda, N., Imanashi, Y.,

149

Itakagaki, H., 1999. Interlaboratory validation of the in vitro eye irritation tests
for cosmetic ingredients. (1) Overview of the validation study and draize scores
for the evaluation of the tests. Toxicol. Vitro 13 (1), 73e98.
Price, J.B., Andrews, I.J., 1985. The in vitro assessment of eye irritation using isolated
eyes. Fd. Cosm. Toxicol. 23 (2), 313e315.
Prinsen, M.K., 1996. The chicken enucleated eye test (CEET): a practical (pre)screen
for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Fd.
Chem. Toxicol. 34 (3), 291e296.
Prinsen, M.K., 1999. An evaluation of the OECD proposal for the harmonised classiﬁcation of eye irritants and corrosives. Report of ECVAM workshop 34, eye
irritation testing: the way forward, appendix 1. ATLA 27, 72e77.
Prinsen, M.K., 2005. In Vitro and in Vivo Data for 94 Substances Tested in the Isolated Chicken Eye Test. Unpublished Data provided Directly to NICEATM by M.K.
Prinsen. TNO Nutrition and Food Research Institute.
€ter, H.B.W.M., 1993. Justiﬁcation of the Enucleated Eye Test with
Prinsen, M.K., Koe
eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test
with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31 (1), 69e76.
Rama, P., Matuska, S., Paganoni, G., Spinelli, A., De Luca, M., Pellegrini, G., 2010.
Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration. New Eng. J. Med.
363, 147e155.
Roper-Hall, M.J., 1965. Thermal and chemical burns of the eye. TransOphthalmol.
Soc. U.K. 85, 631e646.
Russell, W.M.S., Burch, R.L., 1959. The Principles of Humane Experimental Technique. South Mimms, Potters Bar, Herts: Universities Federation for Animal
Welfare.
Scala, R.A., Springer, J., 1997. lRAG working group 6; guidelines for the evaluation of
eye irritation alternative tests: criteria for data submission. Fd. Chem. Toxicol.
35, 13e22.
€ter, H.B., Krul, C.,
Schiffelers, M.J., Blaauboer, B.J., Bakker, W.E., Hendriksen, C.F., Koe
2014. Regulatory acceptance and use of 3R models for pharmaceuticals and
chemicals: expert opinions on the state of affairs and the way forward. Regul.
Toxicol. Pharmacol. 69, 41e48.
Schutte, K., Prinsen, M.K., McNamee, P.M., Roggeband, R., 2009. The isolated chicken
eye test as a suitable in vitro method for determining the eye irritation potential
of household cleaning products. Regul. Toxicol. Pharmacol. 54 (3), 272e281.
Terry, K.T., Khosla-Gupta, B.A., 2002. Chemical and Thermal Injuries to the Ocular
Surface. Ocular Surface Disease Medical and Surgical Management, Part III.
Springer-Verlag New York, Inc, pp. 100e112.
Thoft, R.A., Friend, J., 1977. Biochemical transformation of regenerating ocular surface epithelium. Investigative Ophthalmol. Vis. Sci. 16, 14e20.
United Nations-Economic Commission for Europe (UN/ECE), 2007. Globally
Harmonised System of Classiﬁcation and Labelling of Chemicals (GHS). UN, New
York and Geneva. Available at: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/
ghs_rev02/02ﬁles_e.html.
US-Federal Register, 1961. Title 21 Food and Drugs, Part 191 Hazardous Substances, x
191.12 Test for Eye Irritants.
Wagoner, M.D., 1997. Chemical injuries of the eye: current concepts pathophysiology and therapy. Surv. Ophthal 41 (4), 367e408.
Weil, C.S., Scala, R.A., 1971. Study of intra- and interlaboratory variability in the
results of rabbit eye and skin irritation tests. Toxicol. Appl. Pharmacol. 19,
276e360.
York, M., Lawrence, R.S., Gibson, G.B., 1982. An in vitro test for the assessment of eye
irritancy in consumer products e preliminary ﬁndings. Int. J. Cosmet. Sci. 4,
223e234.

Convocatie

Rondetafelgesprek Ontwikkeling van
proefdiervrije onderzoeksmethoden
(inbreng genodigden)

Blok 4
Dierproeven in het kader van
het beperken van gezondheidsrisico’s (16.15 - 17.00 uur)

Donderdag 14 september 2017
14.00 – 17.00 uur

Deze reader is uitsluitend voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek.

Convocatie

Robert Scholten

Geachte leden van de Tweede Kamer, dames en heren,
Een groot aantal Nederlandse patiëntenorganisaties – waaronder de Dutch Brain Council
hebben in 2016 en 2017 zich tot de relevante beleidsministeries en de Tweede Kamer gewend
om hun ernstige verontrusting kenbaar te maken over beleidsvoornemens vanuit overheid en
politiek om te komen tot een ‘afbouwschema dierproeven in 2025’, in het bijzonder daar waar
dit het onderzoek met non humane primaten betreft. De Dutch Brain Council is een platform
van 25 hersengerelateerde patiëntenorganisaties die een spreekbuis wil zijn voor minimaal 4
miljoen mensen met een Hersenaandoening.
Naar aanleiding van deze brieven hebben nadere gesprekken plaatsgevonden met zowel het
het ministerie van EZ als het ministerie van OC&W.
De genoemde patiëntenorganisaties hebben met waardering kennis genomen van zowel het
NCad advies als het SCHEER rapport. Beide rapporten houden nadrukkelijk rekening met het
nog noodzakelijke medische onderzoek naar ziektebeelden zowel op fundamenteel en
toegepast niveau, die tot nu toe niet of onvoldoende behandeld kunnen worden. Waardoor –
helaas – nog steeds onderzoek met proefdieren – inclusief non humane primaten –
noodzakelijk zal blijven en waarschijnlijk ook tot na 2025.
Bijzonder positief aan het SCHEER rapport is dat het laat zien welke vooruitgang er de
afgelopen 10 jaar is geboekt zowel rond het medisch onderzoek met non humane primaten,
als op het terrein van het onderzoek naar proefdiervrije innovaties. Hiermee geeft dit rapport
in aanvulling op het NCad advies ook de wegen aan waarlangs het onderzoek zich ook in de
komende jaren kan en zou moeten ontwikkelen, daarbij ondersteund door een bijbehorend
traject van validatie van alternatieven en wet- en regelgeving.
De genoemde patiëntenorganisaties constateren echter dat zo’n benadering ontbreekt in het
rapport van het Rathenau Instituut ‘Van aap naar beter’. De conclusies van dit rapport staan
haaks op het eerdere rapport van de KNAW ‘Gebruik van niet-humane primaten (NHP) als
proefdier. Nut en noodzaak?’ uit 2014. Omdat beide rapporten afkomstig zijn van een
KNAW instituut, verbazen wij ons over deze verschillen.
Daarbij komt dat onderstaande patiëntenorganisaties in onze brief aan de overheid van 16
september 2016 en in de mondelinge toelichting daarop bij het Rathenau Instituut, hebben
aangegeven dat een afbouw van onderzoek met non humane primaten in Nederland
vooralsnog ongewenst is . Deze brief staat weliswaar in de geraadpleegde bronnen op blz. 48,
maar de conclusie in het voorwoord van het rapport op blz. 3 dat ”eigenlijk iedereen achter de
stelling stond dat het zo langzamerhand niet meer verantwoord is om apen te gebruiken voor
onderzoek”, lijkt meer een standpunt op persoonlijke titel en wordt daarom zeker niet door
ons gedeeld.
Vanzelfsprekend hebben wij begrip voor dat deel van de samenleving in Nederland en Europa
dat problemen heeft met onderzoek met proefdieren en in het bijzonder met non humane
primaten. Tegelijkertijd echter vertegenwoordigen wij als patiëntenorganisaties – circa 6
miljoen patiënten - ook een zeer groot deel van de burgers in Nederland en Europa die
vooralsnog reikhalzend uitkijken naar een behandeling voor tot nu toe niet of nauwelijks te
behandelen medische problematiek. In het bijzonder geldt dat voor de miljoenen burgers met

Convocatie

ernstige, nu nog niet te behandelen neurologische aandoeningen. Dit neemt overigens niet
weg, dat wij ieder initiatief om het dierenwelzijn te verbeteren ondersteunen.
Vanzelfsprekend zijn wij ook niet voor het ondoordacht of onnodig gebruik van proefdieren
in het medisch-wetenschappelijk onderzoek. Als daarvoor een even goed of beter alternatief
beschikbaar zou komen, zijn wij de eersten die dat toe zouden juichen. Helaas moeten wij op
dit moment constateren – daarbij gesteund door het NCad advies, het eerste KNAW rapport
en het SCHEER rapport - dat hiervan op dit moment nog geen sprake is. Tot die tijd steunen
wij het gebruik van de meest ‘state of the art’ werkwijzen in het proefdieronderzoek en de
continue ontwikkeling en ondersteuning (met name in financiële zin) van de ontwikkeling van
effectieve proefdiervrije innovaties.
Om nogmaals te benadrukken dat grote delen van de bevolking de roep om onderzoek naar tot
nu toe niet of niet goed behandelbare ziekten ondersteunen, noemen wij de op grote schaal
door de Nederlandse bevolking gedragen initiatieven, zoals het fietsen naar kanker voor Alpe
d’H’zes, fietsen voor ALS naar de Mont Ventoux, de ALS Swim in Amsterdam, de
ROPARUN, de zwemactiviteiten van Maarten van der Weijden, Spieren voor Spieren, enz.
Kortom, een lange lijst van activiteiten waar Nederlandse burgers voor medischwetenschappelijk onderzoek op de been komen en aantonen onderzoek belangrijk te vinden.
Hen en ons kunt u niet teleurstellen, met dank voor uw aandacht.
De VSOP en de DBC zijn de penvoerders namens onderstaande organisaties.
namens onderstaande organisaties

C. Oosterwijk
Directeur VSOP

R. Scholten
Directeur Dutch Brain Council

Convocatie

Convocatie

Convocatie

Pieter Roelfsema

Het	  nut	  van	  proefdieren	  in	  het	  hersenonderzoek	  
Pieter	  Roelfsema	  
Directeur	  Nederlands	  Herseninstituut	  (KNAW)	  
In	  1981	  verloor	  Jens	  Naumann	  een	  oog	  door	  een	  ongeluk	  met	  een	  metaalsplinter.	  Een	  paar	  jaar	  later	  
gebeurde	  een	  tweede	  ongeluk	  waarbij	  hij	  zijn	  andere	  oog	  verloor.	  Hij	  werd	  van	  de	  ene	  op	  de	  andere	  
dag	  volledig	  blind.	  In	  2002	  liet	  hij	  zich	  opereren	  in	  Lissabon.	  Een	  neurochirurg	  plaatste	  elektroden	  op	  
zijn	  hersenschors	  met	  als	  doel	  een	  camera	  aan	  te	  sluiten	  op	  de	  hersencellen,	  zodat	  Naumann	  weer	  
iets	  zou	  kunnen	  zien.	  Naumann	  nam	  een	  paar	  weken	  eenvoudige	  patronen	  waar	  via	  de	  camera	  en	  
was	  erg	  enthousiast.	  Maar	  daarna	  kwamen	  er	  complicaties.	  Eerst	  kreeg	  hij	  epileptische	  aanvallen,	  
daarna	  bleek	  de	  aansluiting	  van	  de	  camera	  op	  zijn	  hersenen	  niet	  meer	  te	  werken	  en	  later	  kwam	  er	  
ook	  nog	  een	  ontsteking	  rond	  het	  implantaat	  bij,	  waardoor	  het	  deels	  moest	  worden	  verwijderd1.	  De	  
prothese	  was	  vooraf	  niet	  getest	  in	  proefdieren	  en	  geen	  van	  de	  circa	  zestien	  in	  Lissabon	  geopereerde	  
patiënten	  heeft	  baat	  gehad	  bij	  de	  prothese.	  De	  onderzoekslijn	  is	  daarna	  gestaakt.	  	  	  
Hersenonderzoek	  
Dit	  voorbeeld	  illustreert	  de	  behoefte	  aan	  gedegen	  proefdieronderzoek	  voor	  de	  ontwikkeling	  van	  
nieuwe	  medische	  technologie.	  De	  meeste	  medische	  doorbraken	  zijn	  toe	  te	  schrijven	  aan	  onderzoek	  
met	  proefdieren.	  In	  het	  hersenonderzoek	  bestuderen	  wetenschappers	  de	  werking	  van	  zenuwcellen	  
om	  te	  begrijpen	  hoe	  gezonde	  hersenfuncties	  werken	  en	  ook	  hoe	  deze	  verstoord	  raken	  door	  ziekte.	  
Zo	  is	  er	  veel	  geleerd	  over	  hoe	  we	  onze	  aandacht	  richten,	  hoe	  we	  dingen	  kunnen	  leren	  en	  wat	  er	  in	  
onze	  hersenen	  gebeurt	  wanneer	  informatie	  doordringt	  in	  het	  bewustzijn.	  Dit	  soort	  kennis	  over	  
hersenfuncties	  vormt	  de	  basis	  voor	  de	  bestrijding	  van	  hersenziekten	  zoals	  parkinson,	  alzheimer,	  
huntington,	  depressie,	  schizofrenie,	  autisme,	  herseninfarcten	  en	  de	  gevolgen	  van	  bijvoorbeeld	  het	  
zikavirus.	  Hersenonderzoek	  is	  van	  groot	  maatschappelijk	  belang	  omdat	  een	  kwart	  van	  de	  mensen	  in	  
Nederland	  een	  hersenaandoening	  krijgt2	  en	  de	  kosten	  die	  gemoeid	  met	  hersenziekten	  enorm	  zijn	  
(meer	  dan	  10	  miljard	  per	  jaar	  in	  Nederland)3.	  Hoewel	  ook	  onderzoek	  bij	  mensen	  wordt	  verricht	  en	  
computermodellen	  en	  weefselkweken	  een	  belangrijke	  rol	  spelen	  in	  het	  onderzoek	  ontbreekt	  nog	  
veel	  basale	  kennis	  waardoor	  proefdieronderzoek	  vooralsnog	  onontbeerlijk	  is.	  	  
Zorgvuldigheid	  
Als	  onderzoekers	  denken	  dat	  een	  dierproef	  nodig	  is,	  komen	  de	  drie	  v’s	  in	  beeld:	  vervanging,	  
verfijning	  en	  vermindering	  van	  dierproeven.	  Voorafgaand	  aan	  de	  proef	  moeten	  de	  onderzoekers	  
aantonen	  dat	  het	  beoogde	  experiment	  van	  belang	  is,	  dat	  dezelfde	  informatie	  niet	  zonder	  een	  
dierproef	  kan	  worden	  verkregen,	  dat	  ze	  niet	  meer	  dieren	  gebruiken	  dan	  nodig	  is	  en	  dat	  het	  ongerief	  
voor	  de	  dieren	  zo	  klein	  mogelijk	  wordt	  gehouden.	  Dit	  wordt	  getoetst	  door	  de	  Instantie	  voor	  
Dierenwelzijn	  (IvD),	  de	  Dierexperimentencommissie	  (DEC)	  en	  de	  Centrale	  Commissie	  Dierproeven	  
(CCD).	  	  
Waarom	  apen?	  
Voor	  sommige	  wetenschappelijke	  en	  medische	  vragen	  over	  de	  hersenen	  is	  onderzoek	  met	  apen	  
noodzakelijk4.	  Dit	  geldt	  voor	  onderzoek	  naar	  complexere	  hersenfuncties	  die	  niet	  bestudeerd	  kunnen	  
1

	  	  Zie	  voor	  een	  beschrijving	  https://www.wired.com/2002/09/vision/	  en	  ook	  het	  boek	  van	  Jens	  Naumann	  
(2012),	  Search	  for	  Paradise,	  A	  Patient's	  Account	  of	  the	  Artificial	  Vision	  Experiment	  
2
	  https://dutchbraincouncil.nl/Over_DBC/missie	  
3
	  https://wetenschap.hersenstichting.nl/alles-­‐over-­‐hersenen/hersenaandoeningen/cijfers-­‐over-­‐
patienten/cijfers-­‐over-­‐patienten	  
4
	  Gebruik	  van	  niet-­‐humane	  primaten	  (NHP)	  als	  proefdier	  nut	  en	  noodzaak?	  KNAW	  (2014)	  
Roelfsema,	  P.	  R.	  &	  Treue,	  S.	  Basic	  neuroscience	  research	  with	  nonhuman	  primates:	  A	  small	  but	  indispensable	  
component	  of	  biomedical	  research.	  Neuron	  82,	  1200–1204	  (2014).	  	  

Convocatie

worden	  in	  bijvoorbeeld	  knaagdieren.	  Onderzoekers	  zijn	  zeer	  terughoudend	  met	  het	  gebruik	  van	  apen	  
voor	  onderzoek,	  het	  gaat	  om	  0.05%	  van	  de	  dierproeven	  in	  Nederland5.	  Onderzoek	  met	  apen	  heeft	  
tot	  doorbraken	  geleid	  op	  het	  gebied	  van	  hersenprothesen	  voor	  patiënten	  met	  verlammingen	  en	  ook	  
op	  het	  gebied	  van	  de	  diepe	  hersenstimulatie,	  een	  methode	  waarbij	  een	  elektrode	  wordt	  aangebracht	  
in	  de	  hersenen	  om	  het	  trillen	  en	  de	  stijfheid	  van	  patiënten	  met	  de	  ziekte	  van	  Parkinson	  te	  
verminderen	  (andere	  therapievormen	  zijn	  in	  ontwikkeling6).	  Met	  deze	  methode	  zijn	  meer	  dan	  
100.000	  patiënten	  over	  de	  wereld	  behandeld.	  Diepe	  hersenstimulatie	  wordt	  nu	  ook	  toegepast	  in	  de	  
psychiatrie	  als	  behandeling	  voor	  bijvoorbeeld	  ernstige	  dwangneurosen.	  In	  haar	  rapport	  “Van	  aap	  
naar	  beter	  -­‐	  Een	  verkenning	  en	  dialoog	  over	  proeven	  met	  apen"	  van	  begin	  dit	  jaar	  vroeg	  het	  
Rathenau	  Instituut	  aandacht	  voor	  een	  aantal	  dilemma’s	  in	  het	  onderzoek	  met	  apen.	  De	  meeste	  van	  
deze	  vragen	  werden	  beantwoord	  door	  het	  recente	  rapport	  van	  de	  SCHEER-­‐commissie	  van	  de	  EU	  
“The	  need	  for	  non-­‐human	  primates	  in	  biomedical	  research,	  production	  and	  testing	  of	  products	  and	  
devices”7.	  Hierin	  wordt	  gesteld	  dat	  onderzoek	  met	  apen	  op	  een	  aantal	  wetenschappelijke	  gebieden,	  
waaronder	  het	  hersenonderzoek,	  vooralsnog	  onmisbaar	  is.	  	  
	  
Concluderend	  
Het	  aantal	  proefdieren	  dat	  nodig	  is	  voor	  de	  ontwikkeling	  van	  nieuwe	  technologie	  is	  deels	  afhankelijk	  
van	  de	  risicobereidheid	  van	  patiënten,	  artsen	  en	  de	  autoriteiten	  die	  nieuwe	  behandelingen	  
beoordelen.	  Hoeveel	  informatie	  over	  de	  werking	  en	  veiligheid	  van	  een	  nieuwe	  behandeling	  moet	  zijn	  
verkregen	  in	  dierproeven	  voordat	  hij	  in	  patiënten	  mag	  worden	  getest?	  Te	  hoge	  eisen	  leiden	  tot	  extra	  
dierproeven	  en	  vertragen	  de	  introductie	  van	  nieuwe	  technologie	  in	  de	  kliniek.	  Te	  weinig	  preklinisch	  
onderzoek	  kan	  leiden	  tot	  ongewenste	  medische	  risico’s.	  	  
Hoe	  moet	  het	  nu	  verder	  met	  blinde	  patiënten	  zoals	  Jens	  Naumann?	  Er	  zijn	  ca.	  40	  miljoen	  blinden	  in	  
de	  wereld	  en	  76.000	  in	  Nederland8.	  Proefdieronderzoek	  leverde	  inmiddels	  nieuwe	  
behandelingsmogelijkheden	  op,	  zoals	  een	  prothese	  voor	  het	  netvlies	  van	  het	  oog.	  Ook	  is	  gentherapie	  
voor	  oogziekten	  in	  ontwikkeling.	  Bij	  een	  aanzienlijk	  percentage	  van	  de	  patiënten,	  zoals	  Naumann,	  zijn	  
de	  ogen	  echter	  te	  zeer	  beschadigd	  voor	  therapie.	  Voor	  deze	  patiënten	  kunnen	  onderzoekers,	  dankzij	  
de	  sterk	  verbeterde	  technologie,	  weer	  inzetten	  op	  de	  mogelijkheid	  om	  een	  camera	  op	  de	  
hersenschors	  aan	  te	  sluiten.	  Het	  Nederlands	  Herseninstituut	  is	  een	  belangrijk	  onderzoekscentrum	  in	  
de	  wereld	  waar	  onderzoek	  naar	  hersenschorsprothesen	  wordt	  gedaan	  om	  in	  de	  toekomst	  een	  veilige	  
prothese	  voor	  blinde	  patiënten	  te	  ontwikkelen.	  	  

	  
	  
	  

	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  
5

	  Zodoende	  2015.	  Ter	  vergelijking	  met	  de	  voedselconsumptie:	  het	  gaat	  om	  ca.	  een	  aap	  in	  onderzoek	  per	  
1.000.000	  dieren	  die	  in	  Nederland	  worden	  geconsumeerd	  	  
6
	  www.volkskrant.nl/wetenschap/nieuwe-­‐parkinsontherapie-­‐succesvol-­‐bij-­‐apen-­‐klaar-­‐om-­‐op-­‐mensen-­‐getest-­‐
te-­‐worden~a4514063	  
7
	  De	  publiekssamenvatting	  vindt	  u	  hier:	  
ec.europa.eu/health/sites/health/files/scientific_committees/docs/citizens_primates_en.pdf	  	  
8
	  http://www.vision2020.nl/sitNL.html	  

Convocatie

Robert Passier

ONTWIKKELING VAN PROEFDIERVRIJE ONDERZOEKSMETHODEN
Blok 4: Dierproeven in het kader van het het beperken van gezondheidsrisico’s.
Robert Passier, hoogleraar en hoofd van de afdeling Applied Stem Cell Technologies aan de
Universiteit Twente.
Humane stamcellen als veelbelovend alternatief voor het gebruik van proefdieren.
Stamcellen hebben de eigenschap dat ze kunnen vermeerderen en onder de juiste omstandigheden
kunnen differentiëren naar functionele celtypes van het lichaam. Er zijn verschillende soorten
stamcellen: zo kunnen we de zogenaamde adulte en pluripotente stamcellen onderscheiden. Adulte
stamcellen kunnen we vinden in verschillende organen, zoals bijvoorbeeld in bloed, huid, darm,
lever, hersenen, etc. Een belangrijk verschil tussen adulte en pluripotente stamcellen is het
vermogen om te differentiëren naar verschillende celtypes van het lichaam. Adulte stamcellen van
bijvoorbeeld de huid kunnen wél verschillende celtypes van de huid vormen, maar niet van andere
organen, zoals bijvoorbeeld de hersenen. Echter, pluripotente stamcellen hebben de capaciteit om
te differentiëren naar elk celtype van het lichaam. Pluripotente stamcellen vinden we dan ook
tijdens de zeer vroege embryonale ontwikkeling, kort na de bevruchting van de eicel. In 1998 zijn
voor het eerst humane embryonale pluripotente stamcellen geïsoleerd en in kweek gebracht. In
2007 zorgden een Japans team van wetenschappers onder leiding van Shinya Yamanaka voor een
enorme doorbraak door in kweek gebrachte huidcellen van de mens om te zetten naar pluripotente
stamcellen, de zogenaamde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). Deze iPSC hebben
vergelijkbare eigenschappen met embryonale pluripotente stamcellen, maar hebben duidelijke
voordelen op basis van ethische overwegingen en de mogelijkheid om patiënt-specifieke situaties na
te bootsen in een kweekschaaltje (in vitro). De afgelopen 10 jaar zijn er enorme vooruitgangen
geboekt, waardoor het eenvoudiger is geworden om van patiënten iPSC te genereren (uit
bloedcellen of zelfs van cellen uit urine). Daarnaast zijn procedures om iPSC te differentiëren naar
vele verschillende celtypes van het menselijk lichaam sterk verbeterd. In 2012, slechts 5 jaar na deze
ontdekking, werd de nobelprijs uitgereikt aan Shinya Yamanka, wat het belang van deze ontwikkelde
technologie nog eens onderstreept. De afgelopen jaren hebben onderzoekers aangetoond dat
humane stamcellen (zowel adulte als pluripotente) kunnen dienen als een in vitro testmodel voor
het bestuderen van patiënt-specifieke ziekten en het testen van medicijnen en mogelijk een
belangrijke rol kunnen spelen in de regeneratieve geneeskunde1.
Een realistische transitie naar proefdiervrij door een kritische en multidisciplinaire benadering
Er zijn gebieden aan te duiden waar er goede mogelijkheden zijn om de transitie naar proefdiervrij
onderzoek te maken. Het gebruik van humane hartspiercellen, afkomstig van humane pluripotente
stamcellen, voor het testen van cardiotoxiciteit (schadelijke neveneffecten op hartspiercellen) zou
mogelijk een goed alternatief kunnen zijn voor het gebruik van proefdieren, aangezien de
neveneffecten van medicijnen in het algemeen een direct effect hebben op de hartspiercellen. Dit
wordt ook door het CiPA (comprehensive in vitro proarrythmia initiative)2 van de FDA ondersteund,
waarin het gebruik van deze humane stamcellen gebruikt dienen te worden voor het testen van de
neveneffecten van medicijnen op hartspiercellen.

Convocatie

Aan de andere kant is het zeer lastig om bepaalde processen alleen in vitro te bestuderen. Het
bestuderen van de embryonale ontwikkeling in proefdieren heeft bijvoorbeeld veel informatie
opgeleverd, waardoor we veel te weten zijn gekomen over de morfologische veranderingen en
processen, regulerende moleculaire netwerken en cellulaire interacties, die belangrijk zijn voor het
verkrijgen van de noodzakelijk kennis om biologische processen tijdens de normale ontwikkeling en
tijdens ziekten beter te begrijpen. Deze processen zijn soms (maar zeker niet altijd) vergelijkbaar
tussen de verschillende diersoorten en de mens. Deze kennis gebruiken we bijvoorbeeld om humane
pluripotente stamcellen te differentiëren naar de juiste celtypes door de stappen te volgen zoals
deze ook plaatsvinden tijdens de embryonale ontwikkeling.
Ziekten of processen waarbij meerder organen en systemen een rol spelen, zijn op dit moment lastig
te bestuderen zonder proefdieren te gebruiken. Bijvoorbeeld, regeneratie van hartweefsel voor
herstel van functie na een hartinfarct is met de kennis van nu niet mogelijk zonder proefdieren.
Echter, bij al deze complexe multifactoriële processen is het mogelijk om onderzoeksprojecten te
initiëren die deelsegmenten van dit proces kunnen nabootsen. Met name geavanceerd gebruik van
humane 3D systemen (zogenaamde organoïden of orgaan-op-chip modellen) in combinatie met een
multidisciplinaire aanpak (e.g. samenwerking tussen biologen, technologen, clinici, chemici,
farmacologen, mathematici, etc.) zijn veelbelovend en passen in de Nationale Wetenschapsagenda
en het TOP sectoren beleid. Belangrijk om in dit kader te noemen dat het Human organ and disease
models technologies (hDMT) consortium (https://www.hdmt.technology) is opgericht om de
samenwerking van onderzoeksgroepen van verschillende universiteiten en instituten, die aan
orgaan-op-chip modellen (proefdiervrije innovaties) werken, te stimuleren.
Het is van belang om ook het fundamentele onderzoek een belangrijke rol te geven. Het is
namelijk niet altijd realistisch dat we binnen een korte periode van 3-5 jaar zien of het onderzoek tot
een toepassing of product gaat leiden. Desalniettemin, deze inzichten zijn wel belangrijk om stappen
te maken. Immers, het is moeilijk om te bouwen zonder een goed fundament!
In het kader van een multidisciplinaire samenwerking is het belangrijk om overheden, regulerende
instanties, gezondheidsfondsen en bedrijven, en dierenwelzijns- en patiëntenorganisaties te
betrekken bij het onderzoek om voor alle belanghebbenden een duidelijk en realistisch beeld te
krijgen van de huidige stand van zaken en de verschillende mogelijkheden. Echter, om de
samenwerking tussen academische en private partners te vergroten, is een ander cofinancieringsmodel gewenst. Samenwerking door oprechte gezamenlijke interesse is meer
waardevol dan de veelal verplichte in cash bijdrage, waardoor veel bedrijven afhaken.

1.
2.

Passier, P. C. J. J. (2016). Waar het hart vol van is. Enschede: Universiteit Twente.
Cavero, I. & Holzgrefe, H. Comprehensive in vitro Proarrhythmia Assay, a novel in vitro/in silico paradigm to detect
ventricular proarrhythmic liability: a visionary 21st century initiative. Expert Opin Drug Saf. 13, 745–758 (2014).

Convocatie

Rondetafelgesprek over Ontwikkeling van
proefdiervrije onderzoeksmethoden
Overige commentaren

C. Hendriksen, faculteit Diergeneeskunde UU
J. Knoester, Universiteit Groningen en M. Joëls, Universitair Medisch
Centrum Groningen

Donderdag 14 september 2017
14.00 – 17.00 uur

Deze reader is uitsluitend voor intern gebruik en voor deelnemers aan het gesprek.

Convocatie

C. Hendriksen

Bijdrage	  is	  gepubliceerd	  in	  het	  boek	  ‘Hoe	  Zwaar	  is	  Licht’	  (pagina	  140	  –	  
142),	  samengesteld	  door	  Beatrice	  de	  Graaf	  en	  Alexander	  Rinnooy	  Kan	  
(2016).	  Voor	  gebruik	  in	  de	  reader	  is	  toestemming	  verkregen	  van	  de	  
Uitgever:	  uitgeverij	  Balans.	  	  	  

Kunnen	  nieuwe	  medicijnen	  ontwikkeld	  worden	  zonder	  proefdieren?	  
Coenraad	  F.M.Hendriksen,	  Emeritus	  hoogleraar	  alternatieven	  voor	  dierproeven,	  
Faculteit	  Diergeneeskunde,	  Universiteit	  Utrecht	  
Onderzoek	  naar	  aandoeningen	  bij	  de	  mens	  doen	  we	  al	  eeuwen.	  Vanaf	  het	  begin	  hebben	  
studies	  in	  dieren	  daarvan	  deel	  uitgemaakt.	  Sterker	  nog,	  het	  dier	  was	  tot	  voor	  60	  jaar	  
geleden	  een	  van	  de	  weinige	  modellen	  die	  we	  tot	  onze	  beschikking	  hadden.	  Dat	  het	  
onderzoek	  met	  dieren	  wat	  opgeleverd	  heeft	  valt	  moeilijk	  te	  ontkennen.	  Het	  poliovaccin	  
of	  	  een	  geneesmiddel	  als	  Tamoxifen	  tegen	  borstkanker	  zou	  er	  niet	  zijn	  geweest	  zonder	  
dierproeven.	  Aan	  meer	  dan	  de	  helft	  van	  de	  Nobelprijzen	  voor	  de	  Geneeskunde	  heeft	  –	  
geheel	  of	  gedeeltelijk	  –	  dierexperimenteel	  onderzoek	  ten	  grondslag	  gelegen.	  	  
Momenteel	  gebruiken	  we	  jaarlijks	  zo’n	  550.000	  dieren,	  het	  merendeel	  knaagdieren,	  
voor	  uiteenlopende	  doeleinden	  als	  hart-­‐	  en	  vaatziekten,	  het	  effect	  van	  
klimaatveranderingen	  op	  vogeltrek,	  onderwijs	  of	  de	  diagnostiek	  van	  botulisme.	  Van	  alle	  
dierproeven	  is	  circa	  30	  procent	  voor	  de	  ontwikkeling	  en	  controle	  van	  geneesmiddelen	  
en	  vaccins.	  Zonder	  dierproeven	  had	  de	  wereld	  er	  anders	  uitgezien,	  dat	  is	  zeker.	  	  
Toch	  schuurt	  er	  iets.	  Veel	  experimenten	  zouden	  we	  niet	  op	  onszelf	  willen	  doen,	  waarom	  
dan	  wel	  op	  dieren?	  Vanuit	  dat	  gevoel	  zijn	  de	  meeste	  Nederlanders	  voor	  een	  verbod	  op	  
dierproeven,	  al	  worden	  de	  reacties	  genuanceerder	  wanneer	  we	  dieper	  ingaan	  op	  die	  
vraag:	  geen	  dierproeven	  voor	  het	  zoveelste	  tabletje	  tegen	  hoofdpijn	  maar	  wel	  voor	  een	  
medicijn	  tegen	  kanker.	  	  
De	  maatschappelijke	  bezwaren	  tegen	  dierproeven	  zijn	  	  verwoord	  in	  Europese	  en	  
nationale	  wetgeving:	  de	  enige	  wetgeving	  op	  het	  gebied	  van	  bescherming	  van	  dieren	  die	  
specifiek	  op	  maar	  één	  categorie	  dieren	  is	  gericht.	  Onze	  Wet	  op	  de	  dierproeven	  (Wod)	  
verplicht	  iedere	  onderzoeker	  om	  een	  nieuw	  projectvoorstel	  te	  laten	  toetsen	  door	  een	  
Dierexperimentencommissie	  en	  door	  de	  Centrale	  Commissie	  Dierproeven	  (CCD).	  Deze	  
commissies	  beoordelen	  of	  het	  belang	  van	  het	  onderzoek	  opweegt	  tegen	  het	  ongerief	  
voor	  de	  dieren	  en	  of	  het	  onderzoek	  ook	  niet	  zonder	  dieren	  kan.	  Wetgeving	  wordt	  wel	  
eens	  gestolde	  ethiek	  genoemd.	  
Ook	  vanuit	  de	  onderzoekswereld	  zelf	  groeit	  de	  onvrede	  over	  het	  proefdiergebruik.	  
Dierproeven	  zijn	  duur	  en	  tikken	  zwaar	  op	  de	  onderzoeksbudgetten.	  Daarnaast	  zorgt	  het	  
papierwerk	  rondom	  een	  projectaanvraag	  ervoor	  dat	  een	  onderzoeker	  pas	  maanden	  na	  
indiening	  met	  het	  onderzoek	  kan	  beginnen.	  	  Maar	  de	  achilleshiel	  van	  de	  dierproef	  is	  toch	  
het	  feit	  dat	  het	  onderzoek	  een	  surrogaat	  is	  voor	  de	  mens.	  Resultaten	  van	  dierproeven	  
moeten	  altijd	  met	  een	  kritische	  blik	  worden	  bezien;	  hoe	  vertaalbaar	  zijn	  die	  resultaten	  
naar	  de	  mens.	  Waarom	  vallen	  9	  van	  de	  10	  ontwikkelde	  geneesmiddelen	  die	  door	  de	  
dierstudies	  zijn	  gekomen	  alsnog	  af	  als	  ze	  in	  een	  klinische	  studie	  op	  de	  mens	  worden	  

Convocatie

getest?	  De	  tijd	  dat	  het	  adagium	  ‘in	  vivo	  veritas’	  gold,	  waarmee	  bedoeld	  werd	  dat	  de	  
waarheid	  in	  de	  dierproeven	  lag,	  hebben	  we	  gehad.	  	  
Als	  dierproeven	  niet	  de	  gouden	  standaard	  zijn,	  wat	  dan?	  De	  oplossing	  wordt	  gezocht	  in	  
de	  ontwikkeling	  van	  3V-­‐alternatieven:	  methoden	  die	  het	  proefdiergebruik	  kunnen	  
Verfijnen	  (minder	  dieronvriendelijk),	  Verminderen	  en	  vooral	  Vervangen.	  Sinds	  de	  jaren	  
zeventig	  vormt	  het	  3V-­‐principe	  wereldwijd	  het	  uitgangspunt	  van	  alle	  bestaande	  
wetgeving	  op	  het	  gebied	  van	  dierproeven	  en	  heeft	  een	  significant	  effect	  gehad	  op	  het	  
proefdiergebruik.	  Tussen	  1980	  en	  2000	  daalde	  het	  proefdiergebruik	  met	  50	  procent,	  
vooral	  omdat	  er	  veel	  kritischer	  over	  werd	  nagedacht:	  is	  die	  dierstudie	  nu	  echt	  nodig	  of	  
kunnen	  we	  niet	  met	  minder	  dieren	  werken?	  Vervangingsalternatieven,	  zoals	  in	  vitro-­‐
methoden	  (weefselkweek),	  werden	  populair,	  maar	  de	  resultaten	  waren	  vaak	  niet	  
zodanig	  dat	  ze	  konden	  wedijveren	  met	  die	  van	  de	  dierstudies.	  Wel	  waren	  in	  vitro-­‐	  
methoden	  uitermate	  geschikt	  voor	  het	  screenen	  van	  grote	  aantallen	  stoffen	  op	  een	  
mogelijke	  farmacologische	  werking	  en	  op	  neveneffecten.	  Farmaceutische	  bedrijven	  
beschikken	  tegenwoordig	  over	  opstellingen	  met	  honderden	  gerobotiseerde	  in	  vitro-­‐
methoden	  die	  mogelijk	  interessante	  stoffen	  eruit	  pikken,	  voordat	  zij	  het	  bij	  dieren	  
verder	  bestuderen.	  Per	  stof	  leidde	  dat	  tot	  een	  sterke	  daling	  in	  het	  proefdiergebruik,	  
maar	  die	  werd	  deels	  weer	  teniet	  gedaan	  doordat	  door	  de	  snelle	  en	  effectieve	  selectie	  er	  
meer	  stoffen	  beschikbaar	  kwamen	  voor	  bestudering	  in	  het	  dier.	  	  
Toch	  is	  er	  een	  reden	  optimistisch	  te	  zijn	  over	  de	  mogelijkheden	  voor	  de	  toekomst.	  De	  
wetenschap	  maakt	  grote	  stappen	  op	  het	  gebied	  van	  in	  vitro-­‐methoden,	  die	  ons	  veel	  
relevante	  informatie	  geven	  en	  eveneens	  de	  potentie	  hebben	  om	  proefdieren	  te	  
vervangen.	  Het	  gaat	  om	  innovatieve	  weefselkweekmethoden	  zoals	  het	  gebruik	  van	  
stamcellen,	  vaak	  gekweekt	  in	  een	  3D-­‐structuur	  als	  miniorgaantjes	  (zogenaamde	  
organoid	  culturen),	  of	  complexe	  celkweken	  zoals	  organs-­‐on-­‐a-­‐chip,	  waarbij	  de	  
verschillende	  celtypen	  van	  een	  orgaan	  met	  elkaar	  kunnen	  communiceren.	  Dat	  zal	  het	  
mogelijk	  maken	  de	  effecten	  van	  potentiele	  geneesmiddelen	  op	  orgaanniveau	  te	  
bestuderen.	  Maar	  het	  gaat	  om	  meer.	  Bij	  het	  geneesmiddelenonderzoek	  wordt	  het	  –	  
onder	  strikte	  voorwaarden	  –	  steeds	  vaker	  mogelijk	  om	  met	  de	  meer	  relevante	  
menselijke	  (stam)cellen	  te	  werken.	  Ook	  kunnen	  nu	  technologieën	  gebruikt	  worden	  die	  
menselijke	  vrijwilligers	  kunnen	  blootstellen	  aan	  minieme	  doseringen	  van	  een	  mogelijk	  
geneesmiddel	  en	  zo	  te	  leren	  over	  distributie	  in	  het	  lichaam.	  Dat	  alles	  is	  ook	  interessant	  
voor	  ‘personalised	  medicine’,	  waarbij	  de	  effectiviteit	  van	  geneesmiddelen	  wordt	  
verbeterd	  door	  ze	  af	  te	  stemmen	  op	  patiëntengroepen.	  Verder	  kunnen	  bijvoorbeeld	  
vaccins	  steeds	  beter	  gekarakteriseerd	  worden	  met	  analytische	  technieken	  als	  
massaspectrometrie,	  vaak	  beter	  dan	  met	  een	  dierproef.	  En	  tenslotte	  zie	  je	  dat	  er	  in	  
toenemende	  mate	  nagedacht	  wordt	  over	  andere	  onderzoeksstrategieën	  waarin	  niet	  de	  
dierproeven	  maar	  de	  proefdiervrije	  methoden	  de	  standaard	  zijn.	  	  
Het	  onderzoek	  en	  daarmee	  ook	  de	  ontwikkeling	  van	  geneesmiddelen	  staat	  op	  een	  
kantelpunt.	  Tot	  op	  heden	  waren	  de	  dierproeven	  daarin	  leidend,	  ondanks	  de	  	  
beperkingen	  daarvan.	  De	  proefdiervrije	  methoden	  hebben	  nog	  beperkingen	  en	  
onderzoek	  doen	  is	  vaak	  het	  kiezen	  tussen	  twee	  ‘kwaden’.	  Maar	  de	  beperkingen	  van	  de	  
proefdiervrije	  methoden	  zijn	  vroeg	  of	  laat	  op	  te	  lossen	  zoals	  het	  recente	  rapport	  In	  
Transitie	  van	  de	  gezondheidsonderzoek	  financierende	  organisatie	  ZonMw	  dat	  laat	  zien.	  
Ook	  het	  advies	  van	  het	  Nationale	  Comité	  advies	  dierproevenbeleid	  (NCad),	  in	  december	  
2016	  uitgebracht	  aan	  de	  staatsecretaris	  van	  het	  ministerie	  Economische	  Zaken,	  wijst	  in	  
die	  richting.	  Vòòr	  2025	  zouden	  we	  af	  moeten	  kunnen	  van	  proefdiergebruik	  voor	  het	  
veiligheidsonderzoek	  op	  geneesmiddelen.	  Dat	  zal	  een	  uitdaging	  zijn,	  want	  zoals	  zo	  vaak	  
zit	  het	  venijn	  in	  de	  staart.	  	  Zeker	  voor	  nieuwe	  geneesmiddelen	  geldt	  dat	  we	  ze	  één	  keer	  

Convocatie

in	  een	  complexer	  organisme	  dan	  een	  celkweek	  willen	  beoordelen	  voordat	  het	  medicijn	  
aan	  mensen	  wordt	  toegediend.	  Op	  het	  gebied	  van	  complexiteit	  schieten	  de	  innovatieve	  
methoden	  nog	  tekort.	  Daarnaast	  is	  het	  geneesmiddelenonderzoek	  onderhevig	  aan	  
internationale	  wet-­‐	  en	  regelgeving	  die	  voorschrijft	  onder	  welke	  voorwaarden	  een	  
geneesmiddel	  op	  de	  markt	  mag	  komen.	  We	  zijn	  daardoor	  afhankelijk	  van	  andere	  landen	  
die	  soms	  een	  andere	  ambitie	  hebben	  dan	  het	  terugdringen	  van	  het	  proefdiergebruik.	  	  
Het	  antwoord	  op	  de	  vraag	  of	  nu	  nieuwe	  medicijnen	  zonder	  proefdieren	  ontwikkeld	  
kunnen	  worden,	  is	  dus	  ontkennend.	  Maar	  een	  utopie	  is	  het	  zeker	  niet	  meer.	  Er	  zal	  eens	  
een	  dag	  komen	  dat	  we	  ons	  afvragen	  waarom	  we	  in	  hemelsnaam	  ooit	  dieren	  hebben	  
kunnen	  gebruiken	  voor	  geneesmiddelenontwikkeling.	  	  

Korte	  biosketch:	  
Coenraad	  Hendriksen	  studeerde	  diergeneeskunde	  aan	  de	  Universiteit	  van	  Utrecht.	  Na	  
zijn	  afstuderen	  is	  hij	  als	  onderzoeker	  en	  proefdierdeskundige	  werkzaam	  geweest	  bij	  het	  
RIVM	  en	  thans	  bij	  het	  Instituut	  voor	  Translationele	  Vaccinologie	  (Intravacc)	  te	  
Bilthoven.	  Zijn	  onderzoek-­‐interesses	  liggen	  vooral	  op	  het	  gebied	  van	  de	  alternatieven	  
voor	  dierproeven,	  in	  het	  bijzonder	  binnen	  het	  vaccinonderzoek.	  Van	  2000	  tot	  2016	  is	  hij	  
als	  bijzonder	  hoogleraar	  alternatieven	  voor	  dierproeven	  verbonden	  geweest	  aan	  de	  
faculteit	  Diergeneeskunde	  van	  de	  Universiteit	  Utrecht.	  Thans	  is	  hij	  emeritus	  hoogleraar	  
bij	  de	  faculteit.	  	  

Convocatie

Convocatie