Rapportage pilot Varkensinfluenza
surveillance

RIVM-briefrapport 2023-0443
A. Meijer et al.

Rapportage pilot Varkensinfluenza surveillance
RIVM-briefrapport 2023-0443

RIVM-briefrapport 2023-0443

Colofon

© RIVM 2023
Delen uit deze publicatie mogen worden overgenomen op voorwaarde
van bronvermelding: Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu
(RIVM), de titel van de publicatie en het jaar van uitgave.
Het RIVM hecht veel waarde aan toegankelijkheid van zijn producten.
Op dit moment is het echter nog niet mogelijk om dit document volledig
toegankelijk aan te bieden. Als een onderdeel niet toegankelijk is, wordt
dit vermeld. Zie ook www.rivm.nl/toegankelijkheid.
DOI 10.21945/RIVM-2023-0443
A. Meijer (auteur), RIVM
D. Eggink (auteur), RIVM
A. Kroneman (auteur), RIVM
R. Fouchier (auteur), Erasmus-MC
M. Houben (auteur), GD
E. van der Vries (auteur), GD
E. Germeraad (auteur), WBVR
J. van der Giessen (auteur), RIVM
Contact:
J.W.B. van der Giessen
Centrum voor Zoonosen en Omgevingsmicrobiologie
joke.van.der.giessen@rivm.nl
Dit onderzoek werd verricht in opdracht van Ministerie van VWS in het
kader van Nationaal Actieplan Versterken Zoonosenbeleid project
V/150200/01/SV

Dit is een uitgave van:
Rijksinstituut voor Volksgezondheid
en Milieu
Postbus 1 | 3720 BA Bilthoven
Nederland
www.rivm.nl

Pagina 2 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Publiekssamenvatting

Rapportage pilot Varkensinfluenza surveillance
Varkensgriep bij varkens komt veel voor in West-Europese landen.
Sommige varkensgriepvirussen kunnen overgaan van varken naar
mens. Dat gebeurt niet vaak en meestal alleen bij mensen die veel in
contact komen met varkens. De klachten zijn over het algemeen mild,
maar griepvirussen van varkens en mensen kunnen ook vermengen en
dan tot ernstigere klachten leiden. Het is niet bekend welke
griepvirussen voorkomen bij varkens in Nederland.
De ministeries van Volksgezondheid, Welzijn en Sport (VWS) en
Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit (LNV) willen daarom meer inzicht
krijgen welke varianten van varkensgriep op Nederlandse
varkensbedrijven voorkomen.
Deze varianten kunnen dan zo nodig worden vergeleken met de
varianten van griepvirussen die bij mensen zijn gevonden. Hiervoor is in
2022 in nauwe samenwerking met varkensdierenartsen een pilot
opgezet.
In de pilot zijn bij 90 varkenshouderijen monsters getest op
griepvirussen die kunnen voorkomen bij zoogdieren, mensen en vogels.
Er zijn verschillende varianten van varkensgriepvirussen van het
subtype H1 en één van het subtype H3 gevonden. De zeer besmettelijke
variant van vogelgriep (H5) is niet aangetoond bij varkens. De
medicijnen, die bij mensen werken tegen griepvirussen, bleken ook te
werken tegen de gevonden varkensgriepvirussen.
In de pilot is onder andere veel kennis verzameld over de erfelijke
eigenschappen van varkensgriepvirussen. Met deze informatie kan beter
worden achterhaald waar het virus vandaan komt als mensen met een
varkensgriepvirus zijn besmet. Ook kan zo worden achterhaald of
varkens-, vogel- en menselijke griepvirussen vermengen.
Het onderzoek is anoniem gedaan op verschillende soorten
varkensbedrijven: bij reguliere varkenshouderijen, enkele
varkensbedrijven waar varkens buiten lopen en bij bedrijven waarbij
naast varkens ook pluimvee, koeien of paarden aanwezig zijn.
De monsters zijn op de bedrijven genomen door in een hok met varkens
met griepachtige verschijnselen een touw op te hangen om aan te
kauwen. Ook zijn uitstrijken genomen uit de neus bij een ziek dier.
Daarnaast zijn monsters onderzocht van dode varkens waarbij het
vermoeden was dat ze griep hadden. Dit is ook gedaan bij een groep
controlevarkens zonder griepverschijnselen.
De pilot is uitgevoerd door een samenwerkingsverband van het RIVM,
de Gezondheidsdienst voor dieren (Royal GD), het Erasmus Medisch
Centrum (EMC) en de Wageningen Bioveterinairy Research (WBVR). Dit
consortium beveelt aan om dit onderzoek meerdere jaren te blijven
doen. Dat geeft meer inzicht hoe de varkensvirussen zich verspreiden op
Pagina 3 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

de varkensbedrijven, of er nog meer varianten zijn, en of er
besmettingen zijn met vogel- en menselijke griepvirussen.
Kernwoorden: varkensgriep, vogelgriep, One Health, Nederland,
monitoring, varkensbedrijf

Pagina 4 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Synopsis

Report on the swine influenza surveillance pilot
Swine influenza is prevalent among pigs in Western European countries.
Some swine influenza viruses can be transmitted to humans. However,
this is a rare occurrence and typically restricted to individuals who have
significant contact with pigs. Symptoms are generally mild, but when
swine and human influenza viruses mix, they can lead to more severe
symptoms. Currently, the specific swine influenza virus strains that are
present in the Netherlands are unknown.
The Ministry of Health, Welfare and Sport and the Ministry of
Agriculture, Nature and Food Quality would therefore like to gain a
better understanding of the swine influenza strains on Dutch pig farms.
These strains can then be compared with the influenza virus strains
found in humans when necessary. To achieve this, a pilot was
established in 2022 in close cooperation with pig veterinarians.
In the pilot, samples from 90 pig farms were tested for influenza viruses
that can infect mammals, humans and birds. Various strains of swine
influenza viruses of subtype H1 and one of subtype H3 were identified.
The highly contagious avian influenza strain (H5) was not detected in
pigs. Medicines effective against human influenza viruses were also
found to work against the identified swine influenza viruses.
In addition, the pilot yielded extensive knowledge about the genetic
characteristics of swine influenza viruses. This information can help
trace the origins of a swine influenza virus when humans are infected
and can also help determine whether swine, avian and human influenza
viruses have mixed.
The surveillance was conducted anonymously on various types of pig
farms, including regular pig farms, some with free-range pigs, and
mixed farms where pigs poultry, cattle or horses are raised together.
Samples were collected on the farms by having pigs chew on a rope or
taking individual nasal swabs from diseased pigs. In addition, samples
were examined from dead pigs at autopsy suspected of having
contracted swine influenza and a group of control pigs with no suspicion
of influenza.
The pilot was carried out by a consortium of RIVM, Royal GD, Erasmus
Medical Center (EMC) and Wageningen Bioveterinary Research (WBVR).
This consortium recommends extending the surveillance on swine
influenza in a One Health setting in order to gain more insight into how
viruses spread on pig farms and to identify any additional strains.
Keywords: swine influenza, avian influenza, One Health, Netherlands,
surveillance, pig farm

Pagina 5 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Pagina 6 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Leeswijzer

Varkensgriepvirussen kunnen besmettingen bij mensen veroorzaken.
Doordat bepaalde kennis over deze virussen op Nederlandse
varkensbedrijven ontbreekt, kan de oorsprong van een dergelijke
zoönose nu niet worden gevonden. Om dit hiaat te ondervangen is in
een One Health pilot een netwerk van dierenartsen (peilstations)
opgezet voor het verzamelen van monsters van varkens met
griepklachten. Dit rapport beschrijft de eerste resultaten van deze pilot.
Er is onderzocht welke griepvirussen circuleren onder varkens, of deze
virussen ook bij mensen gevonden worden, en of deze virussen gevoelig
zijn voor de beschikbare antivirale medicijnen en vaccins. Alle informatie
is overzichtelijk gemaakt voor de partners binnen dit consortium in een
onlinedatabase. Op basis van deze resultaten worden in dit briefrapport
aanbevelingen gedaan voor een meerjarig surveillancesysteem. Deze
pilot is een samenwerking tussen RIVM, Royal GD (GD), Erasmus MC
(EMC) en Wageningen Bioveterinary Research (WBVR).

Pagina 7 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Pagina 8 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Inhoudsopgave

1

Samenvatting — 11

2

Inleiding — 15

3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5

Methoden — 17
Opzetten van een surveillancesysteem — 17
Isolatie van influenzavirussen d.m.v. celkweek. — 18
Typering middels WGS op origineel en gekweekt materiaal — 19
Rondzending ter vergelijking WGS-resultaten — 19
Humane-dierlijke database voor opslag meta-data en sequenties
verkregen met whole genome sequencing (WGS) van varkens- en
humane stammen representatief voor elk griepseizoen — 19
Analyse van de varkensinfluenzavirus sequenties in de context van
relevante influenzavirussen uit de humane surveillance. — 20
Antivirale gevoeligheid. — 20
Antigene karakterisering selectie van varkensstammen. — 21
Delen van Data in Europese en wereldwijde netwerken. — 21
Opstellen samenwerkingsovereenkomst. — 21

3.6
3.7
3.8
3.9
3.10
4
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
5
5.1

Resultaten — 23
Verzameling circa 200 varkensinfluenzastammen. — 23
Kweek van PCR positieve monsters en Typering door Whole Genome
Sequencing — 26
Rondzendingen ter vergelijking van de WGS-resultaten — 26
Humane-dierlijke influenza platform voor opslag meta-data en
sequenties — 26
Analyse van de varkensinfluenzavirus sequenties in de context van
relevante influenzavirussen uit de humane surveillance — 27
Antivirale gevoeligheid varkensinfluenzavirussen — 29
Antigene karakterisering varkensinfluenzavirussen — 35
Rapportage en delen van sequenties internationaal. — 39
Samenwerkingsovereenkomst — 39

5.2
5.3
5.4
5.5
5.6
5.7
5.8

Discussie en aanbevelingen — 41
Verzameling van monsters en influenza stammen, bedrijfstypen en
beantwoording vraagstelling. — 41
H3N2 — 41
Whole Genome Sequencing (WGS) — 42
Moleculair Platform — 42
Antivirale gevoeligheid — 43
Antigene diversiteit — 43
Humane casussen — 44
Aanbevelingen — 44

6

Dankwoord — 47

7

Referenties — 49

Pagina 9 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Pagina 10 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

1

Samenvatting

Aanleiding en doel
Varkensgriep bij varkens is endemisch in veel landen in West-Europa.
Mensen kunnen ook varkensgriep krijgen. Sinds 1986 zijn er in
Nederland negen besmettingen met varkensinfluenzavirussen bij
mensen gerapporteerd.
De oorsprong van het virus kon niet worden vastgesteld. Een belangrijke
oorzaak hiervan is het gebrek aan inzicht over de aanwezigheid van
varkensinfluenzavirusstammen en virusvarianten op Nederlandse
varkensbedrijven. In 2022 is daarom de pilot One Health surveillance
varkensinfluenza gestart om een geanonimiseerd en low level
achtergrond surveillance programma op te zetten voor
varkensinfluenzavirussen. Het doel van dit programma was het
monitoren en karakteriseren van circulerende varkensinfluenzavirus
stammen op Nederlandse varkensbedrijven en deze te vergelijken met
humane influenzavirusstammen. Met deze informatie kan beter duiding
worden gegeven aan de infectierisico’s van varkensinfluenzavirussen
voor publieke gezondheid.
Aanpak
Voor de surveillance is een nieuw netwerk van dierenartsenpeilstations
opgezet en is een online-database (moleculair platform: MPF) gebouwd
voor het beheer en analyse van virusgenoomsequenties. Gedurende het
project (2022-2023) zijn er vanuit 90 varkensbedrijven 913 monsters
verzameld van varkens, waarvan de meeste dieren (91%) met klinische
klachten. Deze bedrijven waren verspreid over Nederland, inclusief het
noorden met een relatief lage varkensdichtheid, het midden, en het
zuiden met de hoogste varkensdichtheid van Nederland. Verschillende
soorten bedrijven zijn geanalyseerd: conventionele varkensbedrijven,
varkensbedrijven met buitenuitloop en gemengde bedrijven. Naast de
monsters via de peilstations (n=908), zijn 73 influenzavirus PCRpositieve monsters verzameld uit verschillende routine monsterstromen
van GD.
In het online-database (MPF) zijn uiteindelijk de volledige sequenties
van 129 influenzavirusstammen afkomstig van varkens (anoniem)
geüpload. Deze onlinedatabase werd daarnaast aangevuld met
sequenties van 4 varkensinfluenazastammen waarvan in Nederland
geregistreerde vaccins voor varkens beschikbaar zijn en met een
referentieset van 545 publiek beschikbare humane en zoönotische
influenzavirusstammen.
Verwantschap en verschillen influenzastammen.
De eerste fylogenetische analyse van de 129 influenzavirussen liet zien
dat er een grote diversiteit aan circulerende varkensinfluenzastammen
is. Er waren 128 virussen van het subtype H1 en 1 virus van het
subtype H3. De H1 virussen behoorden tot drie verschillende lineages
(Classical Swine (CS) lineage (clade 1A.3.3.2, dat wil zeggen pdm09achtig), Eurasian Avian (EA) lineage (clade 1C.2.1 en clade 1C.2.2) en
Pagina 11 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

de Human Seasonal (HS) lineage (clade 1B.1.2.1)). De laatste twee
lineages zijn in het verleden overgegaan van respectievelijk vogels en
mensen op varkens. Het gedetecteerde H3N2 virus heeft een HA gen
van clade 2000.3 en is voor alle gensegmenten nauw verwant aan
varkensvirussen die in 2015-2016 circuleerden in Duitsland. Er is geen
H5 specifieke aviaire influenza gevonden bij varkens in deze pilot.
Op elk van 21 varkensbedrijven zijn meerdere influenzavirus stammen
aangetoond en gesequenced. Op 4 daarvan zijn dit genetisch
verschillende virusstammen. Bij 3 van deze bedrijven verschillen deze
stammen op alle genoomsegmenten van elkaar, wat duidt op
gelijktijdige circulatie van verschillende H1N1 varkensgriep varianten.
Op één bedrijf zijn twee identieke H1 varkensinfluenzavirussen
gevonden, die clusteren met alle segmenten bij de humane stammen.
Het betreft geen reassortant, maar duidt op een recente mens op
varken overdracht (anthropozoönose). Fylogenetische analyses laten
zien dat er bij diverse andere gedetecteerde virussen wel uitwisselingen
van genoomsegmenten (reassortments) plaats hebben gevonden, maar
om dit goed te duiden zijn uitgebreidere analyses nodig.
Antivirale gevoeligheid
Het is belangrijk om de gevoeligheid van varkensinfluenza virussen voor
medicijnen gericht tegen influenzavirussen te weten voor als mensen
besmet raken met deze virussen en behandeling nodig hebben. Daar is
nu weinig informatie over bekend. Alle 39 gekweekte virussen
ontvangen bij RIVM zijn fenotypisch getest op antivirale gevoeligheid
tegen oseltamivir en zanamivir en vergeleken met een set van humane
influenzavirussen. Naast deze set zijn alle varkensinfluenzavirussen in
het MPF genetisch gecontroleerd op markers voor resistentie. Enkele
virussen bleken minder gevoelig voor baloxivir maar niet voor
oseltamivir en zanamivir. Wel bleken alle varkensinfluenzavirussen
resistent tegen amantidine en rimantidine zoals alle humane influenza A
virussen dat ook zijn. De analyse laat zien dat, ondanks significante
verschillen, de antivirale gevoeligheid voor varkensinfluenzavirussen
over het algemeen niet gekenmerkt kan worden als verlaagd gevoelig
ten opzichte van humane seizoensinfluenzavirussen. Het is wel goed om
de antivirale gevoeligheid in de komende jaren te blijven vervolgen.
Antigene karakterisering
Antigene karakterisering van varkensinfluenzavirussen is nodig om te
onderzoeken in hoeverre deze virussen veranderen ten opzichte van de
immuniteit, die in mensen en dieren is opgebouwd en dus in hoeverre
de nieuwe varianten kunnen gaan spreiden. Ook is het nodig om te
weten of de humane pre-pandemische vaccinstammen van de WHO nog
bescherming kunnen bieden tegen de in Nederland circulerende
varkensinfluenzavirussen, mochten die naar mensen overstappen. Voor
de varkenssector zelf is de informatie van belang voor het updaten voor
vaccins voor varkens. Alle 26 gekweekte virussen ontvangen bij
Erasmus MC zijn in de haemagglutinatieremming (HAR) getest tegen
beschikbare frettensera. De meeste virussen die behoorden tot clade
1A.3.3.2 vertoonden nauwelijks reactiviteit met de beschikbare
frettensera, wat aangeeft dat ze inmiddels fors antigeen afwijkend zijn
van de "voorouder” A/California/7/2009. Verdere antigene
karakterisering met nieuw te genereren frettensera is nodig. Ook de
Pagina 12 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

geteste clade 1B.1.2.1 virussen vertoonden geen substantiële reactie
met de beschikbare frettensera. Verdere antigene karakterisering met
nieuw te genereren frettensera is ook hiervoor nodig. De 11 EA lineage
virussen behorend tot clades 1C.2.1 en 1C.2.2 vertoonden wel
substantiële reactie in de HAR met de frettensera die beschikbaar
waren. Deze virussen werden goed herkend door frettensera opgewekt
tegen de oudere virussen van clade 1C en recente virussen van clades
1C.2.1 en 1C.2.2. De EA virussen van clade 1C.2.1 en 1C.2.2 zijn met
de beschikbare frettensera niet te onderscheiden.
Herkomst varkensinfluenzavirus duiden met MPF
Binnen de looptijd van deze pilot zijn in de regulier humane
influenzavirus surveillance twee casussen van A(H1N2v) (2022) en
A(H1N1) v (2023) varkensinfluenzavirus infectie bij mensen gevonden
als toevalsbevinding, dus niet als gevolg van monitoring onder aan
varkens blootgestelde mensen met luchtwegklachten. Bij de casus van
2022 kon directe blootstelling aan varkens in de ziektegeschiedenis
worden vastgesteld en bleek dat het virus van de patiënt identiek was
aan het virus op het bedrijf. Voor de casus van 2023 kon geen directe
blootstelling aan varkens worden vastgesteld. Het virus van de patiënt
bleek echter nauw verwant met varkensvirussen die in Nederland in
2023 in de pilot varkensinfluenzavirus surveillance zijn gevonden. De
pilot surveillance varkensinfluenzavirussen heeft een belangrijke
bijdrage geleverd om deze beide casussen te kunnen duiden.
Conclusies en aanbevelingen
Het aantal geanalyseerde varkensinfluenzastammen bleek voldoende om
de diversiteit aan stammen in Nederland kaart te brengen. Verschillende
soorten bedrijven zijn in de pilot geanalyseerd: conventionele
varkensbedrijven, varkensbedrijven met buitenuitloop, gemengde
bedrijven en bedrijven met meerdere verschillende
varkensinfluenzavirussen op hetzelfde bedrijf. Ook bleek dat bij de
humane casussen met een varkensinfluenzavirus de herkomst (antigene
verwantschap) en antivirale gevoeligheid snel kon worden geduid met
behulp van de MPF database.
Het advies is om het project meerjarig te vervolgen met een
vergelijkbaar aantal te analyseren influenzavirussen. In dit project is een
eerste fylogenetische analyse gemaakt. In een vervolgproject zullen
uitgebreide fylogenetische analyses uitgevoerd moeten worden om zo
meer inzicht te geven in de frequentie, de mogelijke rol in pathogenese,
het zoönotisch potentieel van respectievelijk de reassortments en de rol
van meerdere stammen op een varkensbedrijf. De in deze pilot
geanalyseerde stammen worden internationaal gedeeld via de GISAID
sequentiedatabase voor influenzavirussen.
Verder is het zinvol is om dit onlineplatform met de database niet alleen
te continueren, maar ook te laten aansluiten bij het internationale EU4H
project Strong1H, gecoördineerd door het RIVM met dezelfde partners.
In dat project zullen ook varkensbedrijven met buitenuitloop en wilde
zoogdieren onderzocht worden op influenza A virussen Door aan te
sluiten op EU4H Strong1H kunnen influenza virus sequenties van de
zoogdieren systematisch worden verzameld, geanalyseerd en op
Pagina 13 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

mutaties worden gecheckt met aviaire influenza uit wilde vogels en
pluimvee. Dit kan mogelijk op dezelfde wijze met een referentieset zoals
in de pilot voor humane influenzavirussen is gedaan. Binnen het One
Health consortium kan vervolgens gezamenlijk duiding worden gegeven
aan de gevonden influenzavirusstammen en risico’s beter worden
ingeschat mede in het kader van de pandemische paraatheid.

Pagina 14 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

2

Inleiding

Varkensgriep is endemisch in veel landen in West-Europa. Voor
influenzavirussen bij varkens bestaat geen monitoring in Nederland.
Tijdens een risicobeoordeling in 2017 bleek dat influenzamonitoring bij
varkens van toegevoegde waarde is voor het huidige influenza
monitoringsprogramma gezien het mogelijke zoönotische potentieel van
influenzavirussen van dierlijke oorsprong.
Directe aanleiding voor het opstarten van deze pilot was een casus in
2020, waarbij een man uit Limburg besmet bleek met een
varkensinfluenzavirus (Eurasian-Avian like H1N1). Deze casus is dat jaar
besproken in het Signaleringsoverleg Zoönosen (SO-Z). Echter, vragen
over de besmetting van de patiënt en de oorsprong van het virus
konden niet worden beantwoord door gebrek aan kennis en inzicht over
de aanwezigheid van varkensinfluenzavirus stammen en varianten bij
Nederlandse varkensbedrijven. Zodoende kon niet worden vastgesteld of
dit virus bijvoorbeeld representatief was voor aanwezige
varkensinfluenzavirusstammen. Van dit geïsoleerde virus is overigens
binnen het WHO Global Influenza Programme (GIP) een nieuw
"Candidate Vaccine Virus” (CVV) gegenereerd in het kader van het
Pandemic Influenza Preparedness framework (PIP)
(A/Netherlands/10370-1b/2020), evenals van een eerder Nederlands
zoönotisch H1N1 virus (A/Netherlands/3315/2016).
In 2022 is daarom in een gezamenlijke opdracht van het ministerie van
Volksgezondheid, Welzijn en Sport (VWS) en het ministerie van
Landbouw, Natuur en Voedselkwaliteit, een pilotproject gestart om een
geanonimiseerd en low level achtergrond surveillance programma op te
zetten voor varkensinfluenzavirussen. Het doel van dit programma was
het monitoren en karakteriseren van circulerende varkensinfluenzavirus
stammen op Nederlandse varkensbedrijven en deze te vergelijken met
influenzavirus stammen uit de humane populatie. Met deze informatie
kan beter duiding worden gegeven aan de infectierisico’s van
varkensinfluenzavirussen voor publieke gezondheid.
Het belang voor een dergelijk surveillanceprogramma werd nog verder
gesterkt door recente berichtgeving over de uitbraak van een nieuw
zorgwekkend varkensinfluenzavirus (Eurasian Avian-like H1N1 virus
genotype G4) in China met een hoog zoönotisch potentieel en de
verspreiding van hoogpathogene vogelgriep (H5N1) onder wilde vogels
en overdracht naar pluimveebedrijven zoals deze zich ook in Nederland
heeft voorgedaan met als risico ook de overdracht naar varkens.
Sinds 2023 is er de meldingsplicht voor hoogpathogeen aviaire influenza
(HPAI) bij zoogdieren ingesteld bij een positieve HPAI H5 laboratorium
uitslag met PCR, HAR of ELISA. Bij pluimvee en wilde vogels was dit al
meldingsplichtig.
Bij de mens is influenza ten gevolge van dierlijke influenzavirussen een
meldingsplichtige ziekte groep B1. Daarvoor is het belangrijk meer
inzicht in circulerende varkensinfluenzavirussen in Nederland te hebben,
Pagina 15 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

zodat nieuwe humane zoönotische influenzacasussen met als oorsprong
varkens beter te duiden zijn. Voor deze monitoring van
influenzavirussen in varkens is samenwerking tussen de veterinaire en
humane medische gezondheidszorg essentieel. Deze pilot is zodoende
een samenwerking tussen RIVM, Royal GD (GD), Erasmus MC (EMC) en
Wageningen Bioveterinary Research (WBVR).
In deze rapportage wordt een overzicht gegeven van de opzet en
resultaten van deze pilot en worden ook aanbevelingen gedaan voor een
meerjarig surveillancesysteem gebaseerd op de ervaringen uit deze
pilot.
De pilot surveillance varkensinfluenzavirussen bestaat uit de volgende
onderdelen, die hieronder in meer detail worden beschreven:
1. Opzetten van een surveillancesysteem.
2. Isolatie van influenzavirussen d.m.v. celkweek.
3. Typering middels WGS op origineel en gekweekt materiaal.
4. Kwaliteitsrondzending ter vergelijking van de WGS-resultaten.
5. Opzetten humane-dierlijke influenza referentiedatabase voor
opslag meta-data en sequenties.
6. Analyse van de varkensinfluenzavirussequenties in de context
van relevante influenzavirussen uit de humane surveillance.
7. Antivirale gevoeligheidsbepalingen.
8. Antigene karakterisering van relevante stammen.
9. De sequenties worden gedeeld in Europese en wereldwijde
initiatieven zoals het Global Influenza Surveillance and Response
System (GISRS)-netwerk van WHO en OFFLU over prepandemische preparedness van varkensinfluenzavirussen bij
mens en varken, via GISAID.
10. Opstellen van een samenwerkingsovereenkomst met afspraken
over het delen van de data.

Pagina 16 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

3

Methoden

3.1

Opzetten van een surveillancesysteem
a. Opbouwen nieuw peilstation netwerk van varkensdierenartsen
GD heeft binnen haar netwerk dierenartsenpraktijken benaderd die zich
toeleggen op de veterinaire zorg van varkensbedrijven. Hen is gevraagd
als peilstation actief deelnemer te worden van het
varkensinfluenzasurveillancesysteem. In totaal hebben 10
dierenartsenpraktijken en 30 individuele dierenartsen zich hiervoor
aangemeld.
b. Verzamelen van monsters vanuit het peilstationnetwerk
Deelnemende dierenartsenpraktijken ontvingen GD monsternamepakketten om de monsters op de varkensbedrijven te kunnen nemen. In
het pakket zat een instructie met de inclusiecriteria, een instructie voor
monstername, en een inzendformulier met een vragenlijst voor
registratie van klinische verschijnselen. Per inzending werden 5
neusswabs van individuele dieren verzameld met een steriele FLOQswab
in Universal Transport Medium (UTM) (Copan) en 4 groepspeekselmonsters met katoenen kauwtouwen (GD Happy bite
monsterpakket [1]). Deze kauwtouwen werden 20-30 minuten aan de
hokinrichting van een hok met varkens bevestigd, waarbij het uiteinde
van het touw in het hok bereikbaar was voor de varkens. De dieren in
het hok beten vervolgens in het touw waarbij speeksel in het touw
achterbleef. Daarna werd het touw van de hokinrichting afgehaald en
het speeksel uitgeknepen in een bijgeleverde buis. Aan dit
speekselmonster werd vervolgens 1 ml virustransportmedium
toegevoegd. De monsters werden vervolgens gekoeld naar GD gestuurd
voor laboratoriumanalyse en opslag.
c. Verzamelen van aanvullende monsters vanuit de diagnostiek en
historische opslag
Pathologisch onderzoek: GD ontvangt op jaarbasis ongeveer 2000
varkens voor postmortaal (sectie) onderzoek. Dit onderzoek wordt
binnen GD uitgevoerd door gespecialiseerde veterinaire pathologen. Bij
verdenking van een influenzavirusinfectie (longafwijkingen/
longontstekingen) wordt op longmateriaal van deze dieren de influenza
A virus matrix PCR uitgevoerd. Ongeveer 2.5% (50) van deze dieren
testen influenzavirus-positief. Tijdens deze studie zijn deze influenza A
PCR positieve longmateriaalmonsters verzameld voor verdere opwerking
en typering, evenals monsters, die voor routinediagnostiek werden
ingestuurd. Ter aanvulling zijn nog 13 historische longmonsters
(longenmateriaal) geselecteerd. Om uit te sluiten dat een sampling bias
door de patholoog tot gevolg heeft dat monsters gemist worden is een
batch van 30 longen zonder klinische verdenking van de patholoog met
de influenza A virus matrix PCR onderzocht op de aanwezigheid van het
influenzavirus.
d. Verzamelen van epidemiologische en klinische gegevens
In de vragenlijst voor de deelnemende dierenartspraktijken werd
gevraagd naar bedrijfsgegevens, zoals de aan/afwezigheid van andere
Pagina 17 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

diersoorten op het bedrijf (e.g., pluimvee, rundvee, kleine herkauwers,
paarden), de toegang tot een buitenuitloop en de klinische
verschijnselen. Deze klinische verschijnselen werden per diercategorie
(b.v., biggen, gelten, zeugen) uitgevraagd. Uitgevraagde klachten
besloegen: sloomheid, koorts, neusuitvloeiing, niezen, anorexie, hijgen,
geforceerd ademen, bek open, buikslag, blijven liggen en sterfte.
Specifiek voor de vermeerderingsdieren werd ook het terugkomen en
abortus uitgevraagd. Tevens werd om een algemene indruk van de
morbiditeit gevraagd. Van de (long)monsters uit de diagnostiek zijn
behalve de bedrijfslocatie (regio), geen aanvullende bedrijfs- en
klinische gegevens bekend voor deze surveillancepilot.
Van alle influenzavirus-positieve monsters die opgeslagen zijn, is
vastgelegd uit welke regio de monsters afkomstig was. In verband met
het voorkomen van herleidbaarheid, zijn 3 regio’s gedefinieerd voor
verdere analyse van rapportages: noord, midden en zuid. De regio
noord omvat de provincies Groningen, Friesland, Drenthe en Overijssel,
de regio midden omvat de provincies Gelderland, Utrecht, Noord- en
Zuid-Holland, de regio zuid betreft de provincies Zeeland, NoordBrabant en Limburg.
e. Verwerken van de samples
Monsters werden direct na aankomst gesplitst voor nadere verwerking
en opslag. Een deel van het monster is direct opgeslagen bij <-60ºC.
Het andere deel werd bewaard in de koelkast en binnen 2 werkdagen
onderzocht op de aanwezigheid van het influenza A virus met behulp
van een generieke influenza A (matrix) PCR. Alle influenzavirus-positieve
monsters en de nucleïnezuur eluaten hiervan werden vervolgens ook
opgeslagen bij <-60ºC. De influenzavirus-negatieve monsters werden
niet opgeslagen en vernietigd.
f. Anonimiseren en naamgeving van de sequenties
Om te voorkomen dat monsters herleid konden worden naar individuele
bedrijven zijn de monsters waarvoor sequentieanalyse is uitgevoerd
geanonimiseerd. Een virusstam die het resultaat was van een
viruskweek kreeg als monsternaam GDV-XXXXX. Een sequentieanalyse
die uitgevoerd is direct op monstermateriaal en niet op een gekweekte
virusstam kreeg als monsternaam GDE-XXXXX. De volgorde van het
volgnummer XXXXX is willekeurig gekozen.
3.2

Isolatie van influenzavirussen d.m.v. celkweek.
Influenzavirusisolatie (het kweken of opgroeien van het virus) is batchgewijs uitgevoerd door GD (in januari, februari en juni 2023) door het
kweken van de virussen op een adherente monocellaag bestaande uit
een mengsel van Madin-Darby Canine Kidney (MDCK-I) en MDCK-SIAT1
cellen. Deze cellen werden bij 37°C in een CO2-stoof (5%) gekweekt.
Alleen monsters werden geselecteerd met een cycle threshold (Ct)
waarde van de influenza A matrix PCR kleiner dan Ct 30, waarbij een
lagere Ct waarde correspondeert met een hogere virale load. Wanneer
meerdere monsters van hetzelfde bedrijf positief waren werd het
monster met de laagste Ct-waarde geselecteerd. Celkweken werden
dagelijks microscopisch beoordeeld op het ontstaan van een
cytopathologisch beeld (CPE) en een influenza A matrix PCR en
hemagglutinatietest werd uitgevoerd ter bevestiging van een positieve
kweek.
Pagina 18 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

3.3

Typering middels WGS op origineel en gekweekt materiaal
WGS-analyse is tijdens deze pilot uitgevoerd bij GD en WBVR. Hiervoor
is oorspronkelijk materiaal en gekweekt virus gebruikt als
uitgangsmateriaal. WBVR heeft de WGS uitgevoerd, zoals eerder
beschreven [2]. In het kort, RNA van het influenzavirus is geïsoleerd
met de High Pure Viral RNA kit (Roche). Het RNA is vermenigvuldigd
door een universele 8 segment primer PCR en toen direct gesequenced.
De gezuiverde amplicons zijn vervolgens met een hoge dekkingsgraad
gesequenced (gemiddeld >1000 nucleotide posities), met behulp van de
Nextera XT DNA Library Preparation Kit en MiSeq paired-end 150-bp
sequencing (Illumina). We hebben de consensus sequenties bepaald in
de CLC Genomics Workbench (QIAGEN, Duitsland), waarbij gebruik is
gemaakt van de referentie set van aviaire influenzavirussen die is
aangevuld met referentie sequenties van varkensinfluenzavirussen.
GD heeft de WGS uitgevoerd, in essentie, zoals eerder beschreven door
King en haar collega's (King, et al. 2020). In het kort, RNA van het virus
werd geïsoleerd met de DNA/RNA pathogen kit (Thermofisher). Het RNA
is vervolgens met behulp van een universele primerset voor alle 8
segmenten geamplificeerd in een PCR. De PCR amplicons zijn gezuiverd
met behulp van AMpure XP magnatic beads (Beckman). De Nanopore
ligation-sequencing kit was gebruikt voor het opwerken van de
amplicons en sequencing was uitgevoerd met behulp van Nanopore
sequencing (Oxford Nanopore). De IRMA pipeline is gebruikt voor de
assembly, variant calling en het maken van een consensus sequentie
[3]. Sequenties zullen worden gedeeld via een internationale publieke
database GISAID (zie onderdeel 9).

3.4

Rondzending ter vergelijking WGS-resultaten
Om te bevestigen dat locatie van WGS geen invloed heeft op de
sequentie en typering is een rondzending georganiseerd. Twee
varkensinfluenza A virussen van het A(H1N1) en A(H1N2) subtype
werden geselecteerd en opgekweekt. Van beide virussen werd
monstermateriaal, nucleïnezuur eluaat en het supernatant van de
kweek, gealiquoteerd, ingevroren (<-60C) en opgestuurd naar de
partners binnen het consortium voor WGS-analyse (zie Tabel 1).
Resultaten van deze monsters (consensus sequenties en fastQ files) en
feedback werden vervolgens teruggestuurd naar GD en geanalyseerd.
Tabel 1 Monsters voor de rondzending

Virus

gdv-12808
gdv-15583
3.5

Monster
(Ct waarde)
28.0
28.7

Kweek
(Ct-waarde)
23.6
14.2

Eluaat
(Ct-waarde)
28.0
28.7

Subtype
H1N2
H1N1

Humane-dierlijke database voor opslag meta-data en sequenties
verkregen met whole genome sequencing (WGS) van varkensen humane stammen representatief voor elk griepseizoen
De WGS-resultaten van varkens worden gedeeld door de partners in de
gezamenlijke animale-humane One Health database, die door RIVM is
opgezet in het moleculair platform (MPF). Elke partner levert via een
webportaal eigen sequenties en metadata aan in het MPF. Beheer van
het MPF ligt bij het RIVM. Door systematische opslag van de metadata
Pagina 19 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

en sequenties van varkensinfluenzavirussen kunnen deze onderling
worden vergeleken en met relevante, representatieve humane
influenzavirussen. Hiervoor zijn door RIVM sequenties geselecteerd als
representanten van de in Nederland circulerende A(H1N1) pdm09 en
A(H3N2) virussen (van de diverse clades met unieke hemagglutinine
aminozuur compositie) van de griepseizoenen sinds 2014, van humane
vaccinvirussen sinds 2011 en van alle gerapporteerde Nederlandse
zoönotische varkensinfluenzavirussen sinds 1986. Typering van de
segmenten gebeurt buiten het MPF door degene, die de sequenties
aanlevert (submitter) en wordt in daarvoor aangemaakte velden per
stam in de database opgeslagen. Dit gaat om het HA en NA type en de
HA clade. Het MPF fungeert als een extra tool om in een beveiligde
omgeving met de beschikbare gegevens extra data te kunnen delen en
snelle analyses en visualisaties te kunnen uitvoeren. Het MPF is via
internet bereikbaar voor WBVR, GD en het Nationaal Influenza Centrum
(NIC) (RIVM & Erasmus MC referentie centra) met een login account en
wachtwoord.
Eerder zijn al MPF-systemen opgezet voor humaan-dierlijke uitwisseling
van onder andere hepatitis E virus (HEV). De hierin opgedane
ervaringen zijn ingezet voor de opzet van deze varkensinfluenzavirus
database.
3.6

Analyse van de varkensinfluenzavirus sequenties in de context
van relevante influenzavirussen uit de humane surveillance.
Door het analyseren van de sequenties die verkregen worden middels
WGS, zal inzicht worden verkregen welke stammen en subtypen
circuleren, en of er aanwijzingen zijn voor uitwisseling (reassortment)
van genetisch materiaal tussen verschillende stammen of subtypen van
varken naar varken, maar juist ook varken naar mens en mens naar
varken. Ook worden de varkensinfluenzavirussen geanalyseerd voor
markers voor virulentie, adaptatie richting mens en resistentie tegen
antivirale middelen als Oseltamivir en Baloxavir.
De sequenties worden zoals hierboven genoemd gedeeld via GISAID en
daarnaast gedeeld in Europese en wereldwijde initiatieven zoals het
Global Influenza Surveillance and Response System (GISRS)-netwerk
van WHO en OFFLU over pre-pandemische preparedness van
varkensinfluenzavirussen bij mens en varken.

3.7

Antivirale gevoeligheid.
Van de gedetecteerde varkensinfluenzavirussen waarvan een isolaat is
verkregen wordt de fenotypische antivirale gevoeligheid voor
neuraminidaseremmers bepaald en vergeleken met de gevoeligheid van
humane influenzavirussen. Voor bepaling van de 50% remmende
concentratie (IC50) voor de neuraminidase remmers oseltamivir en
zanamivir wordt de door WHO aanbevolen MUNANA assay gebruikt die
in-house geoptimaliseerd is [4,5]. IC50 data van alle humane
influenzavirussen A(H1N1) pdm09 en A(H3N2) uit de humane
griepsurveillance uit de periode 2019-2023 worden gebruikt voor
vergelijking van varkens virus N1 met humaan virus N1pdm09 en
varkens virus N2 met humaan virus N2 en beide subtypen met elkaar.
De statistische test die gebruikt wordt om verschillen tussen dataset te
Pagina 20 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

testen is de Mann-Whitney test voor ranks; p<0.05 wordt als statistisch
significant beschouwd.
Van de gedetecteerde varkensinfluenzavirussen waarvan sequenties zijn
verkregen wordt het neuraminidase eiwit (NA), het polymerase acid
eiwit (PA) en het matrix 2 eiwit (M2) geanalyseerd op het voorkomen
van markers die (potentieel) kunnen leiden tot verlaagde gevoeligheid
voor respectievelijk de antivirale middelen: neuraminidase remmers
oseltamivir en zanamivir, polymerase remmer baloxavir marboxil en M2
blokkers amantadine en rimantadine.
3.8

Antigene karakterisering selectie van varkensstammen.
Op basis van de genetische karakterisering van de hemagglutinine (HA)
eiwitten van de verkregen varkensvirussen wordt voor ieder van de
circulerende virus subtypes en lineages een selectie gemaakt van
representatieve virussen voor antigene karakterising. Deze
representatieve virussen worden in een hemagglutinatieremmingsreactie (HAR) vergeleken met nauw verwante virussen uit
varkens en mensen uit historische of internationale collecties, waartegen
frettensera zijn opgewekt. Wanneer er geen frettensera beschikbaar zijn
die goed met de varkensvirussen reageren worden er nieuwe frettensera
opgewekt, zodat een panel frettensera beschikbaar komt om alle in
Nederland circulerende varkensvirussen (inclusief zoönosen) snel te
kunnen karakteriseren. De HAR en de interpretatie en visualisatie
daarvan met antigene kartografie wordt uitgevoerd zoals eerder
beschreven [6].

3.9

Delen van Data in Europese en wereldwijde netwerken.
De sequenties worden gedeeld in Europese en wereldwijde initiatieven
zoals het Global Influenza Surveillance and Response System (GISRS)netwerk van WHO en OFFLU over pre-pandemische preparedness van
varkensinfluenzavirussen bij mens en varken, via GISAID. In principe
rapporteert ieder zijn/haar eigen sequenties. Wel is besloten om voor
rapportage naar GISAID eerst met elkaar de sequenties te analyseren
en te duiden. RIVM en EMC zullen de contacten onderhouden met de
WHO en OFFLU.

3.10

Opstellen samenwerkingsovereenkomst.
Juridische zaken van het RIVM stelt bij de start van de pilot een
samenwerkingsovereenkomst met afspraken over het delen van de data
op. Uitgangspunten zijn dat het om een anonieme deling van data zal
gaan, waarbij dan AVG wordt gerespecteerd. De conceptversie zal met
de partners en hun juridische afdelingen worden afgestemd.

Pagina 21 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Pagina 22 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

4

Resultaten

4.1

Verzameling circa 200 varkensinfluenzastammen.
Opzetten peilstations
Het opzetten en betrokken houden van de peilstations bleek tijdrovend.
Aan de ene kant toonden dierenartsen interesse om mee te werken, aan
de andere kant was er twijfel over de mogelijke gevolgen van de
resultaten van deze studie voor de varkenshouders. Dit toont aan dat bij
samenwerkingen waarbij vanuit de One Health-gedachte de
varkenssector betrokken wordt, er naast aandacht voor de klinische en
inhoudelijke kant, ook aandacht moet zijn voor het bouwen aan
vertrouwen binnen de sector. Hoe werk je samen, hoe interpreteer je
samen de gevonden resultaten, met waardering voor ieders specifieke
kennis? Uiteindelijk hebben 10 dierenartsenpraktijken en 30 individuele
dierenartsen monsters verzameld bij de bij hen aangesloten
varkensbedrijven. Een belangrijke motivatie van veel dierenartsen om
mee te doen met het project was hun interesse in de uitslag. Deze
uitslag bestond uit de resultaten van de influenza A matrix PCR en een
subtypering op basis van een fylogenetische vergelijking met de in
Nederland veel gebruikte varkensinfluenza vaccinstammen. Deze uitslag
werd vervolgens gebruikt in de begeleiding van de gezondheid van de
varkens op deze bedrijven. Om dierenartsen betrokken te houden en
monsters in te blijven sturen is het belangrijk om de tijd tussen
monstername en rapportage van de typering te verkorten tot maximaal
2 weken.
Verzameling van circa 200 varkensinfluenzastammen.
Gedurende het project (2022-2023) zijn er in totaal 913 monsters
verzameld. Hiervan waren 825 monsters (364 speeksel-, 460 neusswabs
en 1 longweefselmonster) afkomstig van de betrokken
dierenartsenpraktijken uit het opgezette surveillance systeem.
Daarnaast werden er 45 influenza PCR-positieve longweefsels verzameld
in de sectiezaal van GD en 30 influenza PCR-positieve monsters uit de
routinematige diagnostische monsterstroom. De longmonsters
geselecteerd uit de sectiezaal afkomstig van varkens zonder verdenking
van een influenza A virusinfectie waren allemaal negatief. De monsters
uit het surveillance peilstationsysteem (n=825) waren afkomstig van 90
verschillende unieke varkensbedrijven. De meeste bedrijven (92%)
namen met slechts één inzending deel aan het project. Twee bedrijven
(6.7%) namen deel met 2 inzendingen en één met 3 inzendingen.
Deelname per regio: 54% van de bedrijven bevond zich in regio zuid,
27% in noord en 8.9% in de regio midden (10% onbekend). Deze
verdeling komt ruwweg overeen met de spreiding van varkensbedrijven
over Nederland.
Gemiddeld bestond iedere inzending uit 5 monsters. Met in het
achterhoofd dat de monsters genomen waren bij dieren met klinische
verschijnselen, bleek dat het percentage positieve PCR-resultaten
significant verschilde per monstertype. 57.9% van de speekselmonsters
bleek positief, terwijl slechts 28.5% van de neusswabs positief bleek
(Pearon's Chi-squared test; P < 0.05). Tijdens de gehele looptijd van de
Pagina 23 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

studie kon influenzavirus worden aangetoond, al varieerde het
percentage positieve monsters per monstertype gedurende de
verzamelperiode (Figuur 1).

Figuur 1 Percentage PCR-positieve speeksel- (driehoek) en neusswab –
monsters (cirkel) per maand tijdens de verzamelperiode (november 2022 - juli
2023).

Het percentage positieve bedrijven per regio verschilde. Het hoogste
percentage positieve bedrijven werd gevonden in de regio noord
(Tabel 2). Het verschil in percentage positieve bedrijven tussen de
regio's laat zich moeilijk verklaren. De aanwezigheid van een hoog
prevalente stam die op veel bedrijven tegelijk circuleert in Nederland is
niet aangetroffen. Dat zou kunnen betekenen dat er mogelijk bedrijfs- of
dierenartskenmerken een rol kunnen spelen bij de verspreiding van
influenzavirussen in Nederland. Bijvoorbeeld de afwezigheid van andere
verwekkers van respiratoire klachten op dergelijke bedrijven. Het blijft
derhalve belangrijk om in de verschillende regio’s te monitoren.
Tabel 2 Percentage PCR positieve bedrijven per regio.

Regio

Noord

Midden

Zuid

Onbekend

100%
(24/24)

50%
(4/8)

77.5%
(38/49)

44.4%
(4/9)

Achtergrond van de varkensbedrijven
Van de bemonsterde bedrijven (n=90) had 77,8% (70/90) tenminste 1
positieve PCR-uitslag. En op 3 (3.3%) van de bedrijven hadden varkens
toegang tot een buitenuitloop. Bij al deze bedrijven werd tenminste 1
influenzavirus-positief monster gevonden.
Op tenminste 13 (23%) van de varkensbedrijven werden naast varkens
ook andere diersoorten gehouden, waaronder pluimvee (n=4; 4.0%),
waarvan 3 bedrijven tenminste 1 positieve PCR-uitslag had; herkauwers
Pagina 24 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

(n=7; 7.8%), waarvan 6 bedrijven een positieve PCR-uitslag hadden; en
paarden (n=2; 2.2%). Van 20 bedrijven was de uitloopstatus en andere
aanwezige diersoorten niet bekend (22%) (Tabel 3).
Tabel 3 Bedrijven waar andere diersoorten aanwezig zijn

Pluimvee

Aantallen
(%)
PCR-positief
(%)

4 (4.0%)
3/4
75%

Alleen
herkauwers
7 (7.8%)
6/7
86%

Alleen
paarden
2 (2.2%)
2/2
100%

Geen
ander vee
55 (61%)
40/55
73%

Onbekend
22 (24%)
19/22
86%

Wat de klinische verschijnselen betreft, helaas werd van 20
varkensbedrijven in geen van de leeftijdsgroepen informatie
geregistreerd over klinische symptomen. In andere varkensbedrijven
ontbrak informatie over klinische symptomen voor sommige
leeftijdsgroepen. Dit kan komen doordat een bepaalde groep niet
aanwezig is op het bedrijf, omdat er geen informatie is geregistreerd of
omdat er geen klinische symptomen zijn waargenomen (en er geen
“geen klinische symptomen” zijn geregistreerd). Wat betreft de
varkensbedrijven waarvan er klinische gegevens voor tenminste één
leeftijdsgroep beschikbaar waren, waren de gespeende biggen 1 het
vaakst de groep dieren waarvan gemeld werd dat ze klinische
symptomen vertoonden, gevolgd door zogende biggen. Beren werden
zelden klinisch aangetast. Klinische symptomen bij biggen waren vaak
koorts, sloom en ademhalingssymptomen, waaronder neusuitvloeiing,
niezen en/of hoesten. Klinische symptomen bij gelten en zeugen
omvatten vaak vruchtbaarheidsproblemen, koorts en sloom.
Tabel 4 geeft een samenvatting van het aantal varkensbedrijven dat
klinische verschijnselen rapporteert in bepaalde leeftijdsgroepen,
evenals het percentage van deze positieve bedrijven dat PCR-positief
was in tenminste één monster.
Tabel 4 Samenvatting van de klinische verschijnselen op bedrijven

Totaal
PCRpositief
%

A

B

C

D

E

F

G

H

I

27

57

61

17

68

19

15

66

3

23

48

50

11

55

14

11

52

2

85.2

84.2

82.0

64.7

80.9

73.7

73.3

78.8

66.7

A: Zogende biggen. B: Gespeende biggen. C: Biggen*. D: Gelten. E: Biggen* of gelten. F:
Drachtige zeugen. G: Lacterende zeugen. H: Biggen* of zeugen**
I: Beren; *Biggen, zowel zogende als gespeende biggen; **Zeugen, drachtige of
lacterende zeugen.

1
Ongespeende biggen zijn biggen van 0-4 weken leeftijd. Gespeende biggen zijn varkens die geen moedermelk
meer krijgen en deze dieren zijn 4-10 weken oud. Zodra een varken 10 weken oud is wordt ze vleesvarken
genoemd. Deze varkens worden op ongeveer 6 maanden leeftijd geslacht. We spreken van zeugen en beren na
ongeveer 8 maanden leeftijd. Zeugen zijn de varkens die biggetjes krijgen, beren zijn de mannelijke dieren op
een varkensbedrijf en gelten zijn jonge vrouwelijke dieren die later zeug zullen worden.

Pagina 25 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

4.2

Kweek van PCR positieve monsters en Typering door Whole
Genome Sequencing
Binnen dit project werden in totaal 129 varkensstammen sequenced.
Van deze sequenties waren er 100 compleet en van de incomplete
sequenties misten met name sequenties van de drie langste genoom
segmenten (coderend voor het polymerase complex PB2, PB1 en PA).
Neusswabs en materialen afkomstig uit long (sectie) leverde betere
sequentiekwaliteit op in vergelijking met speekselmonsters.
Tabel 5 Aantallen influenza WGS-sequenties

Influenza subtype

4.3

Subtype

H1N1
H1N2

74
51

H3N2
Onbekend (geen HA
sequentie verkregen)
Totaal

1
3
129

Rondzendingen ter vergelijking van de WGS-resultaten
Binnen het project zijn verschillende monsters (origineel monster,
kweek supernatant en eluaat) van een H1N1 en H1N2 stam verstuurd
naar de samenwerkende laboratoria. De sequentieresultaten van deze
labs zijn vervolgens teruggestuurd voor analyse naar het centrale lab
(GD). Algemeen werden door alle labs (EMC, RIVM, GD, WBVR) de
virussen correct gesequenced vanuit de verschillende
monstermaterialen. Bij GD was het verschil in de coverage per segment
het grootst, waarbij met name de coverage van de polymerase
gensequenties (PB2, PB2, PA) achterbleef. Deze bevinding kwam ook
tijdens de pilot zelf naar voren (zie hiervoor sectie 4.3).

4.4

Humane-dierlijke influenza platform voor opslag meta-data en
sequenties
De WGS-sequenties afkomstig van varkens werden samen met het
anonieme GD biobanknummer (GDV), datum van monstername en
bedrijfslocatie regio (Noord, Midden, Zuid) op het moleculair platform
(MPF) geüpload (Tabel 5). Het MPF werd daarnaast aangevuld met
sequenties van 4 varkens vaccinstammen en door RIVM met een
referentieset van publiek beschikbare humane en zoönotische influenza
stammen. Deze set bestond uit 193 influenza A(H1N1) pmd09 stammen
gedetecteerd in Nederland tussen 2014 en 2023 en 319 Nederlandse
A(H3N2) stammen uit diezelfde periode, elk met unieke HA aminozuur
compositie. Daarnaast is de referentie set aangevuld met 24
internationale A(H1N1) pdm09 en A(H3N2) prototype vaccinstammen
sinds 2011 en een set van de 9 stammen van bekende zoönose
casussen tussen varken en mens in Nederland sinds 1986. Van deze
varkensstammen is het HA en NA subtype aangegeven als H1v, H3v,
N1v en N2v. Deze referentie set bevatte ook de H1vN1v stammen uit de
recente humane varkensgriep casussen in Nederland.

Pagina 26 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

4.5

Analyse van de varkensinfluenzavirus sequenties in de context
van relevante influenzavirussen uit de humane surveillance
Fylogenetische analyses hebben als doel de verwantschap en verschillen
tussen influenzastammen inzichtelijk te maken. Hierbij kan zowel de
diversiteit in circulerende stammen geanalyseerd worden, alsmede de
verwantschap met humane influenzavirussen. Een eerste globale
fylogenetische analyse is uitgevoerd binnen het pilotproject. Algemeen
beeld is de aanwezigheid van een grote diversiteit aan circulerende
varkensstammen (Figuur 2). De H1 virussen behoren tot de Classical
Swine (CS) lineage (allen clade 1A.3.3.2, dat wil zeggen pdm09-like),
Eurasian Avian (EA) lineage (clade 1C.2.1 en clade 1C.2.2) en de
Human Seasonal (HS) lineage (clade 1B.1.2.1).
In figuur 2 zijn diverse weergaves gegeven van de verwantschap van
het HA gen. In panel A is de verwantschap tussen de gedetecteerde
stammen en bestaande vaccin stammen weergegeven, in panel B zijn de
HA sequenties gekleurd op het corresponderende NA gen en in panel C
zijn binnen het H1 cluster de classical swine, human seasonal en
Eurasian Avian lineages weergegeven, in respectievelijk, de kleuren
geel, groen, en rood. Buiten dit weergegeven cluster bevindt zich het
enige gedetecteerde A(H3N2) virus. Deze HA behoort tot clade 2000.3
en dit virus is voor alle gensegmenten nauw verwant aan
varkensvirussen, die in 2015-2016 circuleerden in Duitsland.
A

B

C

Figuur 2 Fylogenetische analyse van de varkensinfluenza HA segmenten. HA
segment gekleurd op A) herkomst (pig = varkensinfleunza stam gedetecteerd
binnen dit project, pig(vaccine) = de stammen gebruikt voor de ontwikkeling
van beschikbare varkensgriep vaccins), B) NA type en C) HA clade.

Op basis van deze eerste analyses kan reeds geconcludeerd worden dat
de waargenomen genetische virusdiversiteit groot is in vergelijking met
de diversiteit tussen stammen in de humane populatie. Dit wil zeggen
dat de verschillen tussen H1 stammen in varkens groter is dan binnen
H1 virussen die momenteel voorkomen bij mensen. In de HA en NA
Pagina 27 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

bomen is deze diversiteit het meest zichtbaar, waarin de humane H1 en
N1 sequenties (in rood) sterk geclusterd zijn, terwijl deze voor de
varkensstammen (in groen) verdeeld is over meerdere clusters (Figuur
3A en C).
A

B

C

D

Figuur 3 HA (A, B) en NA (C, D) segmenten van alle humane en varkensgriep
stammen uit de MPF database, gekleurd op respectievelijk A) en C) herkomst
(groen = varkensgroep stammen uit dit project, rood = humane influenza
virussen en blauw = de stammen gebruikt voor de ontwikkeling van vaccins) en
B) en D) varkens en humane H1 aangegeven in rood en zoönotische H1v en N1v
in groen

De paarse pijl in Figuur 3 geeft twee identieke varkensvirussen van één
bedrijf weer die clusteren met de virussen uit mensen. Deze bevinding
suggereert dat er een besmetting van een varken heeft plaatsgevonden
met een humane influenza A(H1N1) pdm09 virus afkomstig van mensen
(antropozoönose) met vervolgens overdracht tussen varkens. Dit laatste
blijkt uit het feit dat deze stam wel clustert met alle segmenten bij de
humane stammen, maar op elk segment wel enige genetische afstand
heeft tot de humane stammen. Dit betreft dus geen reassortant, maar
duidt op een mens op varken transmissie in de recente geschiedenis, al
duidt de afstand tot de humane virussen op enige tijd van circulatie
onder varkens.
Nadere fylogenetische analyses laten zien dat er diverse uitwisselingen
van genoomsegmenten (reassortments) plaatsvinden. Nader onderzoek
naar de aard hiervan zal meer inzicht geven in de frequentie hiervan en
de mogelijk rol in pathogenese en zoönotisch potentieel.
De ene H3N2 varkensstam die gevonden is clustert op alle segmenten
met H3N2 virussen die in 2015-2016 in varkens en Duitsland werden
gerapporteerd.
Van 21 bedrijven zijn bij elk meerdere stammen verzameld en
gesequenced. Op 4 daarvan zijn dit genetisch verschillende stammen.
Bij 3 van deze bedrijven verschillen deze stammen op alle segmenten
van elkaar, wat duidt op gelijktijdige circulatie van verschillende H1N1
varkensgriep varianten.
Bij 1 bedrijf (code BX) verschillen de stammen op 4 van de 8 genoom
segmenten (HA, NA, PB1, NA) en zijn ze vrijwel identiek op de andere 4
segmenten (PB2, NP, NS, MP). Het gaat hierbij om een H1N1 en een
H1N2 stam. Dit duidt op uitwisseling (reassortment) van genoom
segmenten tijdens gelijktijdige voorkomen van meerdere varianten op 1
bedrijf, waarbij 1 varken dan gelijktijdig is geïnfecteerd met beiden,
Pagina 28 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

waardoor in dat varken reassortment kon optreden. Deze nieuwe variant
is vervolgens vermoedelijk overgedragen op andere varkens op het
bedrijf. Deze sequenties worden momenteel nader geanalyseerd en
moeten meer opvolging krijgen om beter te duiden wat dit betekent.
Humane casussen met varkensinfluenzavirussen
Binnen de looptijd van deze pilot zijn in de regulier humane influenzavirus
surveillance twee casussen van A(H1N2) v (2022) en A(H1N1) v (2023)
varkensinfluenzavirus infectie bij mensen gevonden als toevalsbevinding
en niet als gevolg van monitoring onder aan varkens blootgestelde
mensen met luchtwegklachten. De pilot surveillance
varkensinfluenzavirussen heeft hierbij een belangrijke bijdrage geleverd
om deze beide casussen te kunnen duiden. Voor de casus van 2022, bij
welke er directe blootstelling aan varkens in de ziektegeschiedenis kon
worden vastgesteld, bleek met opvolging van bemonstering op het
varkensbedrijf waar de casus was blootgesteld dat het virus van de
patiënt identiek was aan het virus op het bedrijf. Voor de casus van 2023
kon geen directe blootstelling aan varkens worden vastgesteld. Het virus
van de patiënt bleek echter zeer vergelijkbaar met varkensvirussen die in
Nederland in 2023 in de pilot varkensinfluenza surveillance zijn gevonden.
4.6

Antivirale gevoeligheid varkensinfluenzavirussen
Bepaling van de antivirale gevoeligheid van varkensinfluenzavirussen is
nodig om steeds vooraf te weten welke antivirale middelen bruikbaar zijn
wanneer er sprake is van overdracht van varkensinfluenzavirus van
varken naar mens. RIVM ontving daartoe van GD 39 isolaten voor
fenotypisch testen op antivirale gevoeligheid. Het betrof 11 virussen van
de Classical Swine (CS) lineage (allen clade 1A.3.3.2, d.w.z. pdm09-like),
20 virussen van de Eurasian Avian (EA) lineage (2 van clade 1C.2.1 en 18
van clade 1C.2.2) en 5 virussen van de Human Seasonal (HS) lineage
(allen clade 1B.1.2.1). Drie hadden geen H- en/of N-subtype en clade
aanduiding. Van 7, inclusief de 3 hiervoor genoemde, was de
neuraminidase activiteit te laag voor een fenotypische neuraminidase
gevoeligheid bepaling. Een poging om deze 7 op te groeien en alsnog te
karakteriseren, loopt op het moment van schrijven van deze rapportage.
Van 32 virussen (Tabel 6) werd de fenotypische gevoeligheid voor
neuraminidase remmers oseltamivir en zanamivir bepaald. De buiten deze
pilot uitgevoerde antivirale gevoeligheid analyse van de beide recente
humane casussen van A(H1N2) v (2022) en A(H1N1) v (2023)
varkensinfluenzavirus infectie is bij de huidige analyse meegenomen.
De verdeling van IC50 waarden van de N1- en N2-subtype
varkensinfluenzavirussen staat weergegeven in Figuur 4. Bij N1 zanamivir
en N2 oseltamivir en zanamivir (van hetzelfde virus) was er één milde
uitbijter waarde, die nog steeds als normaal geremd vallen te
beschouwen (voud-verschil t.o.v. de mediaan <10). Wat echter wel
opvalt is dat de spreiding in IC50 waarden voor zanamivir (N1 range 3.91;
N2 range 9.19) behoorlijk groter is dan voor oseltamivir (N1 range 0.93;
N2 range 0.61) en waarbij het verschil tussen de hoogste en laagste
IC50waarde meer dan 10-voudig is. De oorzaak hiervan wordt onderzocht.
Wat verder opvalt is dat N2 oseltamivir waarden significant lager zijn dan
die voor N1 (p=0.0005), maar dat de N2 zanamivir waarden significant

Pagina 29 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

hoger zijn dan die voor N1 (p=0.0019). Dat is vergelijkbaar met
bevindingen voor humaan seizoensinfluenzavirus N1 en N2 (Figuur 5).
Tabel 6 Overzicht van virussen waarvoor de fenotypische gevoeligheid voor
oseltamivir en zanamivir is bepaald.

Virus

Subtype Lineage Clade

A/Swine/Netherlands/719/2019

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/3247/2019

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/8711/2019

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/4322/2020

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/8376/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/9529/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/12899/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/16954/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/10495/2023

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/12189/2023

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/18903/2023

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/5652/2023

H1N1

EA

1C.2.1

A/Swine/Netherlands/11135/2023

H1N1

EA

1C.2.1

A/Swine/Netherlands/15583/2019

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/7975/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/12257/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/12875/2022

H1N2

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/15163/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/19458/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/3825/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/6151/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/9498/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/11053/2023

H1N2

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/11184/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/11595/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/15159/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/15331/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/16792/2023

H1N2

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/17298/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/20121/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/5591/2023

H1N2

HS

1B.1.2.1

A/Swine/Netherlands/13417/2023

H1N2

HS

1B.1.2.1

Pagina 30 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

De verdeling van IC50 waarden van de N1- en N2-subtype
varkensinfluenzavirussen staat weergegeven in Figuur 4. Bij N1
zanamivir en N2 oseltamivir en zanamivir (van hetzelfde virus) was er
één milde uitbijter waarde, die nog steeds als normaal geremd vallen te
beschouwen (voud-verschil t.o.v. de mediaan <10). Wat echter wel
opvalt is dat de spreiding in IC50 waarden voor zanamivir (N1 range
3.91; N2 range 9.19) behoorlijk groter is dan voor oseltamivir (N1 range
0.93; N2 range 0.61) en waarbij het verschil tussen de hoogste en
laagste IC50waarde meer dan 10-voudig is. De oorzaak hiervan wordt
onderzocht. Wat verder opvalt is dat N2 oseltamivir waarden significant
lager zijn dan die voor N1 (p=0.0005), maar dat de N2 zanamivir
waarden significant hoger zijn dan die voor N1 (p=0.0019). Dat is
vergelijkbaar met bevindingen voor humaan seizoensinfluenzavirus N1
en N2 (Figuur 5).

Figuur 4 IC50 waarden voor oseltamivir en zanamivir per N-subtype
varkensinfluenzavirussen en antiviraal middel. Rode stippen: uitschieters na
Tukey Box and Whisker plot analyse.

De verkregen IC50 waarden zijn ook vergeleken met de IC50 waarden
van humane seizoensinfluenzavirussen A(H1N1) pdm09 voor de
varkensinfluenzavirussen met N1 neuraminidase (Figuur 5A) en met die
van seizoensinfluenzavirussen A(H3N2) voor de
varkensinfluenzavirussen met N2 neuraminidase (Figuur 5B). De data
van de seizoensinfluenzavirussen zijn afkomstig van virussen verzameld
in de respiratoire seizoenen 2019/2020 t/m 2022/2023 in de
huisartsenpeilstation en Infectieradar algemene bevolking surveillance
voor acute respiratoire infecties en virussen ingestuurd door laboratoria
naar het RIVM voor karakterisering. Al deze seizoensvirussen zijn
normaal geremd door oseltamivir en zanamivir, zodat dit goed kan
functioneren om te bepalen of de varkensinfluenzavirussen een
vergelijkbaar patroon laten zien wat past voor wildtype normaal geremd
profiel voor oseltamivir en zanamivir. Een meer dan 10-voudig verschil
in IC50 waarde van varkensinfluenzavirus t.o.v. de mediaan van het
bijpassende N-subtype seizoensinfluenzavirus is een indicatie voor
verlaagde remming en bij meer dan 100-voudig verschil indicatie voor
sterk verlaagde remming. De voud-verschillen tussen de mediane IC50
Pagina 31 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

waarden voor varkensinfluenzavirussen en seizoensinfluenzavirussen per
subtype en antiviraal zijn <10 (Tabel 7). Alleen het outlier varkens N2 in
Figuur 4 heeft voor zanamivir net een voud-verschil waarde boven 10
(10.67) met mediaan seizoensinfluenzavirus N2. Dit is ook gevolg van
het feit dat seizoensinfluenzavirus N2 een significant lagere mediane
IC50 heeft vergeleken met die voor varkensinfluenzavirus N2
(p<0.0001). Voor oseltamivir is de mediane IC50 voor
varkensinfluenzavirus N2 ook hoger dan die voor seizoensinfluenzavirus
N2, echter niet significant (p=0.0891).
A

B

Figuur 5 IC50 waarden voor oseltamivir en zanamivir per N-subtype
varkensinfluenzavirussen, humane seizoensinfluenzavirussen en antiviraal
middel. (A) voor het N1-subtype en (B) voor het N2 subtype.

Het varkensinfluenzavirus N1 heeft een significant lagere mediane IC50
dan de seizoensinfluenzavirus N1 voor oseltamivir (p=0.0221).
Vergelijkbaar met N2 heeft varkensinfluenzavirus N1 een significant
hogere mediane IC50 voor zanamivir dan die voor seizoensinfluenzavirus
N1 (p=0.0055). Deze analyse laat zien dat mediane IC50
referentiewaarden voor humane seizoensinfluenzavirus N1 en N2 niet
toegepast mogen worden voor analyse van gevoeligheid niveau van
varkensinfluenzavirussen N1 en N2 en het vinden van varkensvirussen
met verlaagde gevoeligheid voor neuraminidaseremmers oseltamivir en
zanamivir. Toch laat de analyse ook zien dat, ondanks significante
verschillen, het gevoeligheidsniveau voor varkensinfluenzavirussen op
één uitbijter na niet gekenmerkt kan worden als verlaagd gevoelig ten
opzichte van humane seizoensinfluenzavirussen (< 10-voudig verschil
medianen).

Pagina 32 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Tabel 7 Vergelijking van IC50 waarden van varkensinfluenzavirussen en humane seizoensinfluenzavirussen per N-subtype en antiviraal
middel

N-subtype

Gastheer

Oseltamivir

Zanamivir

mediane IC50
(nM) (95% CI)

N1
N2

Intern gebruik

Varken (n=16)

IC50 voudIC50
IC50 voudmediane IC50 (nM) IC50 voud- IC50
IC50 voudverschil
(nM)
verschil max (95% CI)
verschil
(nM)
verschil max
mediaan
max
varken vs
mediaan
max
varken vs
varken vs
varken mediaan
varken vs varken mediaan
mediaan
humaan
mediaan
humaan
humaan
humaan
0.49 (0.41-0.71)
0.73
1.10
1.67 0.99 (0.57-1.55)
1.53
4.10
6.36

Mens (n=185)

0.66 (0.61-0.70)

Varken (n=16)

0.27 (0.19-0.33)

Mens (n=428)

0.22 (0.21-0.23)

0.65 (0.61-0.68)
1.23

0.75

3.41

2.90 (1.39-4.00)
0.90 (0.88-0.94)

3.22

9.60

10.67

RIVM-briefrapport 2023-0443

De mediane IC50 waarden voor varkensinfluenzavirus N1 en N2 in Tabel
7 kunnen als referentie genomen worden voor toekomstige analyse van
het gevoeligheidsniveau van varkensinfluenzavirus N1 en N2 afkomstig
van H1N1 en H1N2 van beschreven clades in Tabel 6. Een hoger aantal
virussen zal vooral voor zanamivir de betrouwbaarheid van deze
referentiewaarde verbeteren. De totaal aantallen per N1 en N2 waren te
laag om een analyse uit te kunnen voeren op basis van verschillen in
aminozuur compositie van het NA binnen N1 en N2 subtype. Dit zal
onderdeel zijn van toekomstige studies.
Het NA-segment (n=126), PA-segment (n=126) en het M-segment
(n=126) zijn geanalyseerd voor genetische markers voor verlaagde
antivirale middelen gevoeligheid voor respectievelijk neuraminidase
remmers (oseltamvir en zanamivir), polymerase-remmer (baloxavir
marboxil) en M2-blokkers (amantadine en rimantadine). Van de 126
virussen hebben er zeven (allen subtype A(H1N1)) een NA-Y155H
aminozuurverandering die in voormalig humaan seizoensinfluenzavirus
A(H1N1) hoog gereduceerde remming door oseltamivir en zanamivir
veroorzaakte. Twee van de virussen met deze aminozuurverandering
zijn fenotypische getest en bleken normaal geremd door oseltamivir en
zanamivir. Waarschijnlijk is de volledige gensequentie van het
varkensvirus NA meer overeenkomstig met het voormalig
seizoensinfluenzavirus NA hiervan de oorzaak. Zoals dat ook het geval is
voor A(H1N1) pdm09 humaan influenzavirus waar deze
aminozuurverandering ook geen effect heeft op gevoeligheid voor
neuraminidase remmers. De humane casus A(H1N1) v van 2023 bevatte
ook NA-Y155H en bleek ook fenotypisch normaal geremd door
oseltamivir en zanamivir. In twee virussen, een H1N1 en een H1N2
virus, is de aminozuurverandering PA-I38V gevonden. Deze
aminozuurverandering geeft volgens de WHO-lijst voor humaan
H1N1pdm09 virus een 2- to 4-voudig hogere IC50 waarde dan
referentievirus. Een >3-voudig hogere IC50 waarde wordt als voorlopige
grenswaarde gehanteerd voor verlaagde gevoeligheid voor baloxavir
marmboxil. Fenotypische test bij een gespecialiseerd laboratorium (WHO
CC Atlanta, VS en WHO CC Tokyo, Japan) kan bevestigen of deze
aminozuursubstitutie in de achtergrond van varkens PA hetzelfde effect
heeft. Tevens wordt gewerkt om deze gevoeligheidstest voor baloxavir
ook binnen het consortium uit te kunnen voeren (RIVM). De beide
humane casussen van A(H1N2) v (2022) en A(H1N1) v (2023)
varkensinfluenzavirus infectie dragen geen markers voor verminderde
gevoeligheid voor baloxavir marboxil. Alle 126 virussen dragen de M2S31N aminozuurverandering die resistentie tegen M2-blokkers geeft.
Van deze virussen dragen er 58 de M2-V27A aminozuurverandering,
waarvan 52 ook M2-L26I, beiden veroorzaken ook M2-blokker
resistentie. Daarnaast zijn er 7 die de combinatie M2-S31N met M2-L26F
dragen en 1 die de combinatie M2-S31N met M2-V27I draagt. Beiden
aminozuurveranderingen op positie 26 en 27 hebben ook M2-blokker
resistentie tot gevolg. Kortom, alle virussen zijn ten gevolge van 1-3
aminozuurveranderingen in het M2 resistent tegen de M2-blokkers. De
beide humane casussen van A(H1N2) v (2022) en A(H1N1) v (2023)
varkensinfluenzavirus infectie hadden eenzelfde patroon van resistentie
tegen M2 blokkers met respectievelijk M2-L26I, -V27A en-S31N en M2S31N .
Pagina 34 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

4.7

Antigene karakterisering varkensinfluenzavirussen
Antigene karakterisering van varkensinfluenzavirussen is nodig om te
onderzoeken en te begrijpen in hoeverre bescherming door vaccinatie of
eerdere infectie beschermt tegen de onderzochte virussen. EMC ontving
28 virusisolaten als een eerste batch van genetisch gekarakteriseerde
virussen voor antigene karakterisatie. Het betrof 10 virussen van de
Classical Swine (CS) lineage (allen Clade 1A.3.3.2, d.w.z. pdm09-like),
11 virussen van de Eurasian Avian (EA) lineage (2 van clade 1C.2.1 en 9
van clade 1C.2.2) en 5 virussen van de Human Seasonal (HS) lineage
(allen clade 1B.1.2.1). EMC kon 2 virussen vooralsnog niet verder
opgroeien en deze zijn dus nog niet verder gekarakteriseerd.
Tabel 8 Overzicht van virussen die antigeen gekarakteriseerd zijn.

Virus

Subtype

Lineage

Clade

A/swine/Netherlands/719/2019

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/swine/Netherlands/4322/2020

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/9529/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/10495/2023

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/12899/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/16954/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/18903/2023

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/3247/2019

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/8376/2022

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/Swine/Netherlands/8711/2019

H1N2

CS

1A.3.3.2

A/swine/Netherlands/11135/2023

H1N1

EA

1C.2.1

A/Swine/Netherlands/5652/2023

H1N1

EA

1C.2.1

A/swine/Netherlands/6151/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/19135/2019

H1N2

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/12257/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/12875/2022

H1N2

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/15163/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/15583/2019

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/19458/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/3825/2023

H1N1

EA

1C.2.2

A/Swine/Netherlands/7975/2022

H1N1

EA

1C.2.2

A/swine/Netherlands/5591/2023

H1N2

HS

1B.1.2.1

A/swine/Netherlands/8836/2022

H1N1

HS

1B.1.2.1

A/Swine/Netherlands/12808/2022

H1N2

HS

1B.1.2.1

A/Swine/Netherlands/13417/2023

H1N2

HS

1B.1.2.1

A/Swine/Netherlands/20413/2022

H1N2

HS

1B.1.2.1

Pagina 35 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

De 26 virussen (Tabel 8) werden in de HAR getest tegen de in
Rotterdam beschikbare frettensera (Tabel 9). Het betrof 1 frettenserum
tegen een clade 1A.3.3.2 virus en 7 frettensera tegen diverse clade 1C
virussen van varkens en mensen (zoönosen). De HAR werd uitgevoerd
met rode bloedcellen van kalkoenen en met frettensera die tevoren
werden behandeld met cholerafiltraat en een pre-adsorptie stap met
rode bloedcellen van kalkoenen

Pagina 36 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Tabel 9 HAR tabel voor Nederlandse varkensvirussen. In iedere rij staat een virus, met informatie over subtype en clade. Clades zijn ook met kleur gemarkeerd. De Nederlandse virussen die door GD zijn
ingestuurd zijn cursief vetgedrukt weergegeven. Iedere kolom aan de rechterkant geeft een frettenserum weer waartegen de virussen zijn getitreerd. De getallen zijn titers (eindpuntverdunning van de antisera)
tegen de virussen, waarbij homologe titers vetgedrukt en onderlijnd zijn. Negatieve data zijn weergegeven als titers <10, in ongekleurde cellen.

A/Cal/7/2009
F07/16

A/NL/386/1986
F562/3

A/sw/Best/5M/1996 A/Bretagne A/Hebei-haigang A/Hessen/47/2020 A/NL/3315/2016 A/NL/10370-1b/2020
F571
F41/21
F30/20
F02/21
F21/17
F18/21

A/California/7/2009
H1N1pdm 1A.3.3.2
A/swine/Netherlands/719/2019
H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/3247/2019 H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/8711/2019 H1N2
1A.3.3.2
A/swine/Netherlands/4322/2020
H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/8376/2022 H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/9529/2022 H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/12899/2022 H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/16954/2022 H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/10495/2023 H1N2
1A.3.3.2
A/Swine/Netherlands/18903/2023 H1N2
1A.3.3.2

640
320
<10
<10
<10
<10
10
10
<10
40
<10

80
80
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

640
480
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

480
480
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

160
120
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

A/swine/Netherlands/8836/2022
H1N1
A/Swine/Netherlands/12808/2022 H1N2
A/Swine/Netherlands/20413/2022 H1N2
A/swine/Netherlands/5591/2023
H1N2
A/Swine/Netherlands/13417/2023 H1N2

1B.1.2.1
1B.1.2.1
1B.1.2.1
1B.1.2.1
1B.1.2.1

<10
<10
<10
<10
<10

<10
80
<10
120
<10

<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10

<10
<10
<10
<10
<10

A/Netherlands/386/1986
H1N1
A/swine/Best/5M/1996
H1N1
A/Bretagne/24241/2021 (E222G)
H1N2
A/Hebei-haigang/1572/2019
H1N1
A/Hessen/47/2020
H1N1
A/Netherlands/3315/2016
H1N1
A/Netherlands/10370-1b/2020
H1N1
A/Swine/Netherlands/5652/2023 H1N1
A/swine/Netherlands/11135/2023 H1N1
A/Swine/Netherlands/19135/2019 H1N2
A/Swine/Netherlands/15583/2019 H1N1
A/Swine/Netherlands/7975/2022 H1N1
A/Swine/Netherlands/12257/2022 H1N1
A/Swine/Netherlands/12875/2022 H1N2
A/Swine/Netherlands/15163/2022 H1N1
A/Swine/Netherlands/19458/2022 H1N1
A/Swine/Netherlands/3825/2023 H1N1
A/swine/Netherlands/6151/2023
H1N1

1C
1C
1C.2.4
1C.2.3
1C.2.2
1C.2.1
1C.2.1
1C.2.1
1C.2.1
1C.2.2
1C.2.2
1C.2.2
1C.2.2
1C.2.2
1C.2.2
1C.2.2
1C.2.2
1C.2.2

480
<10
<10
240
640
40
480
<10
160
960
640
240
640
240
240
240
480
240

480
1280
<10
240
80
240
80
40
160
240
80
160
320
40
120
80
160
80

240
1920
<10
<10
<10
40
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
20
<10

<10
<10
2560
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10
<10

640
320
<10
640
640
480
480
320
640
1280
960
480
1280
320
640
320
640
320

480
10
10
640
960
40
320
80
480
1280
640
480
1280
320
640
320
640
320

40
240
<10
120
<10
960
120
80
160
80
80
40
40
<10
160
40
240
40

320
40
<10
320
160
320
640
160
480
480
160
320
480
160
80
120
240
160

Pagina 37 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

De 10 CS lineage virussen (clade 1A.3.3.2, groen in Tabel 9) vertoonden
nauwelijks reactiviteit met de beschikbare frettensera. Alleen virus
A/Swine/NL/719/2019 gaf vergelijkbare HAR patronen met
A/California/7/2009 (de clade 1A.3.3.2 "ancestor”). Verder was er
slechts minimale kruisreactie meetbaar met het 1A.3.3.2 antiserum
tegen 3 varkensvirussen van clade 1A.3.3.2. Dit geeft aan dat de
meeste clade 1A.3.3.2 varkensvirussen in Nederland inmiddels fors
antigeen afwijkend zijn van de "ancestor” A/California/7/2009. Verdere
analyse met additionele frettensera die wel kruisreageren is nodig om de
antigene karakterisering te voltooien.
De 5 HS lineage virussen (clade 1B.1.2.1, blauw in Tabel 9) vertoonden
geen substantiële reactie met de beschikbare frettensera opgewekt
tegen CS en EA lineage varkensvirussen. Frettensera tegen (homologe)
HS lineage virussen waren niet beschikbaar. Slechts twee clade 1B.1.2.1
virussen gaven lichte kruisreactie met het frettenserum tegen het EA
lineage virus A/NL/386/1986 (clade 1C). Verdere antigene
karakterisering met additionele frettensera is ook hiervoor nodig.
De 11 EA lineage virussen (clades 1C.2.1 en 1C.2.2, oranje in Tabel 9)
vertoonden wel substantiële reactie in de HAR met de frettensera die
beschikbaar waren. Deze virussen werden goed herkend door
frettensera opgewekt tegen de oudere virussen van clade 1C en recente
virussen van clades 1C.2.1 en 1C.2.2. De EA-virussen van clade 1C.2.1
en 1C.2.2 zijn met de beschikbare frettensera niet te onderscheiden.
Een initiële antigene kaart werd gemaakt voor de beschikbare HAR data
(Figuur 6). Zo’n kaart visualiseert in hoeverre virusstammen gelijk of
verschillend zijn in hun antigene eigenschappen. Virussen die clusteren
hebben vergelijkbare antigene kenmerken, waar virussen die verder
weg liggen antigeen verschillend zijn. Aangezien meerdere (>3)
numerieke waarden nodig zijn om virussen en sera goed te positioneren
in de kaart zijn de posities van de meeste CS en HS lineage virussen en
antisera niet betrouwbaar en behoeven nader onderzoek zoals hierboven
reeds benoemd. De meeste Nederlandse EA lineage virussen van clade
1C.2.1 en 1C.2.2 clusteren dicht bij elkaar, binnen 2 antigene units van
elkaar. Twee clade 1C.2.2 EA lineage virussen waren uitbijters (links en
rechts in de kaart) De oudere Nederlandse clade 1C.2.1 en 1C.2.2
virussen uit 1986 en 2016 waren ook uitbijters, onderaan de kaart.

Pagina 38 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Figuur 6 initiële antigene kaart voor de hierboven getoonde HAR tabel. In de
antigene kaart worden virussen (weergegeven als cirkels) en antisera
(weergegeven als vierkanten) zo gepositioneerd dat de afstand hiertussen bij
benadering omgekeerd evenredig is met de HAR titers. Hierdoor is in een
oogopslag te zien welke virussen antigeen verwant zijn (dicht bij elkaar in een
kaart) en welke antigeen verschillend zijn (ver van elkaar). De
referentievirussen en sera die daartegen zijn opgewekt zijn weergegeven in
grijs, de Nederlandse EA lineage virussen van clade 1C.2.1 en 1C.2.2 in rood en
het Nederlandse CS lineage virus van clade 1A.3.3.2 in groen. De grid geeft 1
antigene unit (AU; een 2-voudige verdunning van antiserum) weer.

4.8

Rapportage en delen van sequenties internationaal.
De sequenties worden gedeeld in Europese en wereldwijde initiatieven
zoals het WHO/GISRS netwerk en OFFLU (WOAH/FAO) samenwerking
over pre-pandemische preparedness van varkensinfluenzavirussen bij
mens en varken. Hiervoor wordt de GISAID database gebruikt en twee
keer per jaar samenvattende rapportage uiterlijk een week voor de
humane vaccinsamenstelling aanbevelingsvergadering van de WHO in
februari en september. Daar wordt ook de selectie van pre-pandemische
zoönotische kandidaat vaccin stammen besproken.
(https://oiebulletin.fr/?panorama=03-3-2020-2_offlu). In deze pilot
periode zijn de gegenereerde sequenties nog niet gedeeld met WHO en
zullen na de nationale rapportage naar GISAID worden gestuurd.

4.9

Samenwerkingsovereenkomst
Juridische zaken van het RIVM heeft bij de start van de pilot een
samenwerkingsovereenkomst opgesteld en deze is in het consortium
met de partners meerdere keren besproken en aangepast.
Pagina 39 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Uitgangspunten zijn dat het om een anonieme deling van data zal gaan,
waarbij dan AVG wordt gerespecteerd. Er is veel tijd genomen om de
uitwisseling van de data goed te beschrijven en ook het gebruik van het
moleculair platform is door de gelijktijdige inrichting hiervan visueel
toegelicht. Dit heeft wel bijgedragen dat de
samenwerkingsovereenkomst voor de verzameling en uitwisseling van
data voor alle partijen kon worden getekend. Ervaringen en inhoud van
deze samenwerkingsovereenkomst zal ook gebruikt worden als basis
voor toekomstige projecten zoals het vervolgproject surveillance
varkensinfluenza en het Strong1H project.

Pagina 40 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

5

Discussie en aanbevelingen

Dit rapport beschrijft het opzetten van een varkensinfluenza
surveillance. Hiervoor is een nieuw netwerk van dierenartsen
peilstations opgezet en zijn positieve varkensinfluenzavirus PCR samples
met WGS gesequenced voor genetische en fenotypische karakterisering
en isolaten getest op gevoeligheid voor antivirale middelen en antigeen
gekarakteriseerd.
5.1

Verzameling van monsters en influenza stammen, bedrijfstypen
en beantwoording vraagstelling.
Dierenartsen bleken goed in staat om de dieren te identificeren die
verdacht waren van een influenzavirusinfectie. Ongeveer 41% van de
verzamelde monsters was positief op influenzavirus type A. Om de
verzameling van monsters op gang te krijgen en te houden bleek het
(veelvuldige) contact met de peildierenartsenpraktijken essentieel. Ten
eerste voor de uitleg van de doelstelling van de bemonstering en tevens
voor de uitleg over de monstername zelf. In het vervolg bleef contact
essentieel voor het versturen van de monsternamepakketten en om de
varkensdierenartsen te blijven motiveren om bij griepachtige
verschijnselen monsters te nemen. Daarnaast is het ook belangrijk om
de resultaten te blijven bespreken. De contacten blijven onderhouden is
zeker ook belangrijk met de bedrijven waar opvolging in het
vervolgproject noodzakelijk is.
Voor de dierenartsen en de varkenshouders bleek de rapportage van de
resultaten essentieel. Het raakt aan "what’s in it for me?". Ze willen
graag meedoen, maar graag zelf ook meer kennis opdoen over de
gezondheid van hun dieren.
Om dit project langdurig te laten functioneren is het verkorten van de
tijd van monsterafname tot een uitslag voor de inzendende dierenarts
en varkenshouder essentieel.
Het aantal stammen dat in dit project werd verzameld bleek voldoende
om te voldoen aan de vraagstelling die voorafgaand aan het project
geformuleerd was. Er zijn bedrijven bemonsterd waar de varkens
toegang hebben tot een buitenuitloop. Er zijn varkens bemonsterd op
bedrijven waar andere dieren, waaronder pluimvee, aanwezig waren
(gemengde bedrijven). Er zijn bedrijven gevonden waar meerdere
influenzavirus stammen tegelijk lijken te circuleren. Er is een recent
introductie event van humaan naar varken aangetroffen. En de database
van stammen bleek bij de humane casus van infectie met een
varkensinfluenzavirus in augustus 2023 informatie te leveren over de
aangetroffen stam.

5.2

H3N2
Er is in de verzameling van monsters/sequenties maar eenmaal een H3
influenzavirus aangetroffen. Het weinig voorkomen van H3 komt
overeen met andere recente onderzoeken (7;8). Deze onderzoeken zijn
net als deze pilot gebaseerd op passieve surveillance op basis van de
aanwezigheid van klinisch verschijnselen. De vraag of H3 stammen bijna
niet meer aanwezig zijn bij varkens in de Nederlandse varkenshouderij,
Pagina 41 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

of dat deze stammen minder klinische verschijnselen veroorzaken,
waardoor de inclusiecriteria van de monstername ervoor gezorgd heeft
dat de prevalentie van H3 onderbelicht is kan alleen maar verklaard
worden door een actief surveillance van influenza A in varkens (dus niet
alleen maar op basis van klinisch verschijnselen). Tevens kan er een
selectiebias zijn in de positieve monsters en zorgt een H1 infectie voor
lagere Ct waardes (hogere virale load), waardoor binnen een inzending
van een 1 locatie op 1 bepaald tijdstip de H1 stammen geselecteerd zijn
voor verdere moleculaire typering. Om deze bias in samples te
ondervangen zullen in het vervolg alle positieve monsters gescreend
worden met een H3 specifieke typerings-PCR. Mocht blijken dat er
binnen een inzending samples zijn met een hogere Ct, maar wel met
een H3, dan kunnen deze monsters extra geselecteerd worden voor
moleculaire typering. Mocht er met deze aanpassing van de werkwijze
nog steeds bijna geen H3 stammen worden gevonden, kan ervoor
gekozen worden om de inclusie/selectiecriteria op het varkensbedrijf aan
te passen.
5.3

Whole Genome Sequencing (WGS)
Het consortium heeft succesvol WGS-resultaten onderling uitgewisseld
en gezamenlijk geanalyseerd. Sequencing resultaten zijn goed
vergelijkbaar. Dit geeft de mogelijkheid om bij specifieke vraagstellingen
op te schalen en voorkomt afhankelijkheid van één laboratorium.
Verdere ontwikkeling van analyses pipelines waarin sequentie data van
de diverse subtypen varkensinfluenza goed en snel geanalyseerd worden
blijft nodig.

5.4

Moleculair Platform
Er is een database opgezet (MPF) waarin sequentiedata en
achtergrondgegevens door de partners gedeeld en geanalyseerd kunnen
worden. Elke partner heeft hierin toegang tot de beschikbare data. De
projectleden hebben sequenties gedeeld in deze besloten database vóór
de laatste controleslagen en administratieve stappen die nodig zijn voor
het delen naar het publieke domein. Dit levert tijdwinst op, zodat
Nederlandse data gearchiveerd worden, gezamenlijk inzichtelijk
gemaakt kunnen worden en bijzonderheden sneller opgepikt worden. Op
deze wijze is de meerwaarde dat de analyses gezamenlijk in een One
Health setting uitgevoerd kunnen worden, zodat voor het duiden van de
gegevens alle aanwezige expertise (moleculair virologisch, veterinair en
humaan medisch) direct ingezet kan worden in het netwerk.
Diverse analyse tools zijn succesvol geïmplementeerd in het MPF,
waaronder weergave van enkele virus eigenschappen en diverse
fylogenetische analyses en weergaves. Met name reassortment analyses
zijn complex en behoeven nog meer gestandaardiseerde
analysemethodes.
Het moleculair platform moet nog worden uitgebreid met internationale
referentievirussen van varkens. Een complete wereldwijde dataset is
toegezegd door het referentielaboratorium voor varkensinfluenza in de
Verenigde Staten.

Pagina 42 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

5.5

Antivirale gevoeligheid
Uit de analyse van antivirale gevoeligheid blijkt dat alle geanalyseerde
virussen resistent zijn tegen M2-blokkers amantadine en rimantadine
door 1 tot 3 aminozuurveranderingen in het M2 eiwit. Dit is
vergelijkbaar met humane seizoensinfluenzavirussen waar praktisch alle
influenza A virussen resistent zijn tegen M2-blokkers door de M2-S31N
aminozuurverandering. Uit die analyse blijkt ook dat alle geanalyseerde
virussen normaal gevoelig zijn voor de neuraminidase remmers
oseltamivir en zanamivir op basis van NA eiwit analyse, bevestigd met
fenotypische analyse voor een subset van de virussen met H1N1 en
H1N2 subtype. Deze fenotypische analyse geeft een goede voorlopige
schatting van het niveau van gevoeligheid voor neuraminidase remmers.
Dit is het uitgangspunt voor volgen van gevoeligheid van
varkensvirussen op langere termijn, en breidt de wereldwijde kennis
over gevoeligheid van influenzavirussen voor neuraminidase remmers
uit. Dit is ook relevant als uitgangspunt voor humane therapie en
profylaxe mocht er (uitgebreide) transmissie van varken naar mens
gaan optreden. Op enkele virussen na zijn alle virussen op basis van
analyse van bekende markers gevoelig voor het nieuwe antivirale middel
baloxavir marboxil. Twee virussen dragen een aminozuurverandering die
bij humane virussen leidt tot milde resistentie tegen baloxavir marboxil.
Voor deze virussen is nader onderzoek door referentielaboratoria van de
WHO nodig om de fenotypische gevoeligheid te bepalen, zolang deze
technieken in Nederland nog niet geïmplementeerd zijn. Deze bevinding
voor varkensinfluenzavirussen is ook nieuw en van belang voor
internationale rapportage.
De beide humane casussen van A(H1N2) v (2022) en A(H1N1) v (2023)
varkensinfluenzavirus infectie hadden eenzelfde patroon van resistentie
tegen M2 blokkers en normale gevoeligheid voor neuraminidaseremmers
oseltamivir en zanamivir en polymerase remmer baloxavir marboxil.
De huidige bevindingen van deze pilot laten het nut zien van analyse
van varkensinfluenzavirussen voor antivirale gevoeligheid in kader van
opties voor humane therapie en profylaxe, mocht er doorgaande
transmissie van varken naar mens en mens naar mens met ernstige
ziekte tot gevolg gaan optreden. Een continue monitoring van antivirale
gevoeligheid van varkensinfluenzavirussen is daarom aan te bevelen.

5.6

Antigene diversiteit
Er is naast de grote genetische diversiteit ook grote antigene diversiteit
tussen de in Nederland circulerende varkensvirussen. Voor de Classical
Swine lineage virussen is nauwelijks nog kruisreactie te zien met het
"oudervirus" A/California/7/2009. Voor de Eurasian Avian lineage
virussen is diversiteit klein binnen de onderzochte recente virussen maar
fors t.o.v. de oudere virussen die in Nederland als zoönosen werden
gemeld in 1986 en 2016. We kunnen geen conclusies trekken voor de
Human Seasonal lineage omdat (nog) geen sera met kruisreactiviteit
beschikbaar zijn. Deze antigene karakterising laat duidelijk de noodzaak
zien om referentiepanels van virussen en antisera op peil te brengen.
Nieuwe sera zijn nodig voor antigene karakterisering van virussen van
m.n. de Classical Swine en Human Seasonal lineages. Voor alle 3
lineages (CS, HS, EA) worden momenteel nieuwe frettensera
gegenereerd tegen 2 genetische varianten. Er is met het Wereld
Pagina 43 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Influenza Centrum (WIC, Crick Institute, Londen) afgesproken om sera
uit te wisselen en zo de investering te beperken. Dat neemt niet weg dat
lokaal nog meer frettensera moeten worden gegenereerd om de
genetische en antigene diversiteit van varkensvirussen in Nederland
goed in kaart te brengen.
De tweede batch virussen die klaar staat bij GD bevat ook weer nieuwe
genetische varianten waarvoor een antigene karakterisering nodig is.
Meest praktisch is om nieuwe analyse van de CS en HS lineage virussen
voorlopig uit te stellen totdat nieuwe sera beschikbaar zijn en te
beginnen met de lineages waarvoor wel voldoende sera beschikbaar
zijn.
5.7

Humane casussen
De H1N1v humane casus, die door RIVM in Nederland in augustus werd
gemeld was genetisch nauw verwant aan de virussen in onze antigene
kaart (zie Figuur 6). Op basis van de genoomsequentie kon dus direct
een goed onderbouwde interpretatie van de antigene eigenschappen
worden gemaakt, die – door de beschikbaarheid van referentievirussen
en antisera – ook direct experimenteel kan worden bevestigd. Op basis
van deze data heeft het WIC al aangegeven een nieuwe prepandemische
CVV (candidate vaccine virus) te willen maken. Om met zoönosen in de
toekomst even voortvarend te kunnen optreden is het zinvol de
genetische en antigene karakterisering van varkensvirussen in
Nederland door te zetten en referentiematerialen (database, virussen,
antisera) up-to-date te brengen.

5.8

Aanbevelingen
Deze pilot was opgezet om een beter beeld te krijgen van de
circulerende influenza A virus stammen in de Nederlandse
varkenspopulatie. De pilot heeft al waardevolle inzichten geleverd
betreffende de genetische en antigene diversiteit in
varkensinfluenzavirus stammen en hun antivirale gevoeligheid, wat het
belang (noodzaak) om deze surveillance voort te zetten illustreert. In
deze pilot zijn ook influenzavirussen aangetroffen en geanalyseerd bij
varkens op varkensbedrijven waar andere diersoorten aanwezig waren
(gemengde bedrijven). Het advies is dan ook deze surveillance de
komende jaren te continueren. Hierbij kan met het huidige aantal
varkensinfluenzavirussen al veel inzicht verkregen worden in de
eigenschappen van de verschillende subtypen influenzavirussen.
Vanwege bovengenoemde mogelijke selectiebias zal in het vervolg bij de
diagnostiek al specifiek getest worden op H3.
De introductie van humane influenzavirus type A subtypen in de
varkenspopulatie zoals nu is gevonden, kan in een vervolgproject verder
worden opgevolgd. Dit kan helpen in het voorspellen van het zoönotisch
potentieel van deze virussen alsmede het inschatten van het risico op de
vorming van nieuwe reassortments. Hiervoor zullen de sequenties van
de stammen aanwezig in het MPF wel nog dieper moeten worden
geanalyseerd, omdat na een eerste, meer algemene analyse hiervoor de
tijd nu ontbrak.

Pagina 44 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Eventuele nieuwe humane infecties met varkensinfluenzavirus kunnen
met een voortgaande surveillance ook beter in context geplaatst worden
van circulerende varkensinfluenzavirussen in Nederland, zoals bij de
recente casussen. Zeker als er geen duidelijk contact met varkens in de
klinische geschiedenis van de patiënt aangetroffen wordt, zoals bij de
laatste casus, in 2023. Ook de monitoring van de antivirale gevoeligheid
is een belangrijk onderdeel van de toekomstige monitoring omdat hier
nog heel weinig kennis over aanwezig is en voor vroegtijdige detectie
van veranderingen in antivirale gevoeligheid die gevolgen hebben voor
de keuze van antivirale middelen bij behandeling na transmissie van
varkensinfluenzavirus van varken naar mens.
De antigene karakterisatie zal ook een belangrijk onderdeel zijn omdat
naast de grote genetische diversiteit ook grote antigene diversiteit
tussen de in Nederland circulerende varkensvirussen is gevonden,
waarbij het nu niet goed mogelijk is om conclusies te trekken over de
antigene verwantschap van humane seizoensinfluenzavirussen met
varkensinfluenzavirussen door gebrek aan goed reagerende recente
referentiesera tegen een deel van de gevonden
varkensinfluenzavirussen. Dit is relevant om te bepalen of, en in welke
mate, er mogelijk immuniteit in de humane populatie tegen
varkensinfluenzavirussen is. Daarom is het nodig om referentiepanels
van virussen en antisera op peil te brengen door van deze groep nieuwe
sera te ontwikkelen. Dit zal ook een onderdeel van het vervolg moeten
zijn.
De combinatie van de aanwezige online analysetools en de op de
Nederlandse situatie toegespitste referentieset maakte het mogelijk om
snel informatieve fylogenetische bomen te genereren en te analyseren.
Bij een eventueel vervolgproject zou het zinvol zijn om dit online
platform met de database niet alleen te continueren, maar ook te
gebruiken en uit te breiden voor aviaire influenzavirussen. De
virussequenties afkomstig van de zoogdieren kunnen op deze wijze
systematisch worden verzameld, geanalyseerd en op mutaties worden
gecheckt met aviaire influenza uit wilde vogels en pluimvee. Mogelijk op
dezelfde wijze met een referentieset zoals nu ook voor de humane
influenzavirussen wordt gedaan. Deze opzet zal de komende drie jaar
verder worden onderzocht in het EU4H Strong1H project, waarbij het
One Health consortium vervolgens gezamenlijk duiding zal geven aan de
gevonden influenzavirusstammen om zo de zoönotische risico’s beter in
te kunnen schatten.

Pagina 45 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Pagina 46 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

6

Dankwoord

We bedanken alle dierenartsen en varkenshouders voor inzenden van
monsters van varkens aan GD. We bedanken van GD, Corneel
Vermeulen en Rianne Buter voor sequentieanalyse, Christiaan
Sanderman, Lucia Díeste en Bas Engel voor contact met het netwerk,
Rick Elbert voor het kweken en sequencen van de virussen en Henk-Jan
Brokers voor projectmanagement. We bedanken Frank Harders en Rene
Heutink voor de WGS-analyse bij WBVR. Ook bedanken we de analisten
Marima Bagheri, Gabriel Goderski en Sharon van den Brink (RIVM) voor
bepaling van de antivirale gevoeligheid, doorkweken en sequencing van
de varkensinfluenzavirus isolaten ontvangen van GD. We bedanken hen,
en in hen andere analisten in het RIVM-team, ook voor hun bijdrage in
het verkrijgen van de dataset van humane influenzavirussen in
Nederland. Analisten Mark Pronk en Pascal Lexmond by Erasmus MC
worden bedankt voor de antigene karakterisering van de virussen.
We bedanken GISAID en collega’s die sequenties via GISAID
beschikbaar hebben gesteld van de in dit onderzoek gebruikte humane
prototype vaccin influenzavirussen. Tot slot bedanken we Arieke Dokters
van Leeuwen voor de ondersteuning bij het projectmanagement.

Pagina 47 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

Pagina 48 van 49

RIVM-briefrapport 2023-0443

7

Referenties

[1] https://edepot.wur.nl/203168

[2] Emerg Infect Dis. 2017 Dec;23(12):1974-1981. doi:
10.3201/eid2312.171062. Multiple Reassorted Viruses as Cause of
Highly Pathogenic Avian Influenza A(H5N8) Virus Epidemic, the
Netherlands, 2016. Nancy Beerens, Rene Heutink, Saskia A Bergervoet,
Frank Harders, Alex Bossers, Guus Koch
[3] BMC Genomics. 2016 Sep 5;17(1):708. doi: 10.1186/s12864-0163030-6. Viral deep sequencing needs an adaptive approach: IRMA, the
iterative refinement meta-assembler. Samuel S Shepard, Sarah Meno,
Justin Bahl, Malania M Wilson, John Barnes, Elizabeth Neuhaus
[4] Antiviral Res. 2009 Sep;83(3):290-7. doi:
10.1016/j.antiviral.2009.07.003. Epub 2009 Jul 8.
Dynamics of antiviral-resistant influenza viruses in the Netherlands,
2005-2008. M Jonges, I M van der Lubben, F Dijkstra, L Verhoef, M
Koopmans, A Meijer
[5] Antiviral Res. 2014 Oct:110:31-41. doi:
10.1016/j.antiviral.2014.07.001. Global update on the susceptibility of
human influenza viruses to neuraminidase inhibitors, 2012-2013. Adam
Meijer, Helena Rebelo-de-Andrade, Vanessa Correia, Terry Besselaar,
Renu Drager-Dayal, Alicia Fry, Vicky Gregory, Larisa Gubareva, Tsutomu
Kageyama, Angie Lackenby, Janice Lo, Takato Odagiri, Dmitriy
Pereyaslov, Marilda M Siqueira, Emi Takashita, Masato Tashiro, Dayan
Wang, Sun Wong, Wenqing Zhang, Rod S Daniels, Aeron C Hurt
[6] J Virol. 2007 Apr;81(8):4315-22. doi: 10.1128/JVI.02458-06. Epub
2007 Feb 7. Antigenic and genetic evolution of swine influenza A (H3N2)
viruses in Europe. J C de Jong, D J Smith, A S Lapedes, I Donatelli, L
Campitelli, G Barigazzi, K Van Reeth, T C Jones, G F Rimmelzwaan, A D
M E Osterhaus, R A M Fouchier
(7) Cell Host Microbe. 2020 Oct 7;28(4):614-627.e6. doi:
10.1016/j.chom.2020.07.006. Epub 2020 Jul 27. PMID: 32721380.
Surveillance of European Domestic Pig Populations Identifies an
Emerging Reservoir of Potentially Zoonotic Swine Influenza A Viruses.
Henritzi D, Petric PP, Lewis NS, Graaf A, Pessia A, Starick E, Breithaupt
A, Strebelow G, Luttermann C, Parker LMK, Schröder C, Hammerschmidt
B, Herrler G, Beilage EG, Stadlbauer D, Simon V, Krammer F, Wacheck
S, Pesch S, Schwemmle M, Beer M, Harder TC.
(8) Dynamic swine flu map van CEVA:
https://swine.ceva.com/home/diseases/dynamic-swine-flu-map/

Pagina 49 van 49

Dit is een uitgave van:
Rijksinstituut voor Volksgezondheid
en Milieu
Postbus 1 | 3720 BA Bilthoven
Nederland
www.rivm.nl
november 2023

De zorg voor morgen
begint vandaag