Faculty of Veterinary Medicine
Department Population Health Sciences
Farm Animal Health Unit

SARS-CoV-2 antistoffen
onderzoek bij varkens in
Nederland

Eindrapportage

Prof. dr. J.A. Stegeman
Namens de consortium partners
Universiteit Utrecht
Erasmus MC
Royal GD Deventer
Amphia Ziekenhuis

Oktober 2020

1

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Inhoud
Hoofdstuk 1

3

Introductie

3

Aanleiding
SARS-CoV-2 bij varkens

3
3

Hoofdstuk 2

6

Materiaal en methoden

6

Evaluatie van de SARS-CoV-2 antilichaamtest
Seroprevalentie status voor SARS-CoV-2 bij varkens
Bedrijfsselectie
Steekproef
Monsterverzameling en -verwerking
Test algoritme

6
6
7
7
8
8

Gegevensanalyses en -statistiek
Ethiek en data eigendom

8
8

Hoofdstuk 3

9

Resultaten

9

Evaluatie van de SARS-CoV-2 antilichaamtesten
Serologie resultaten voor SARS-CoV-2 bij varkens

Hoofdstuk 4

9
10

12

Discussie en conclusie

12

Conclusie en relevantie

13

Hoofdstuk 5

14

Referenties

14

Bijlage 1

16

2

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Hoofdstuk 1

Introductie
Aanleiding

In Nederland is SARS-CoV-2 sinds begin 2020 wijd verspreid bij mensen.
In maart 2020 werd in een specifieke regio van de provincie Noord-Brabant
een opvallende dichtheid van COVID-19 infecties waargenomen, waarbij de
gemeenten Uden en Gemert-Bakel ~215 gevallen per 100.000 inwoners
rapporteerden (Osiris-Algemene-Infectieziekten-database, 2020). Deze
regio is ook een van de meest varkensdichte regio's in het land en
verschillende media veronderstelden associaties tussen de hoge aantallen
humane patiënten met SARS-CoV-2 en infecties bij vee.
SARS-CoV-2 bij varkens

In de vroege fase van de epidemie, maart 2020, waren er zorgen dat
varkens besmet zouden kunnen worden met SARS-CoV-2 en het potentieel
bijkomend risico voor de mens. Een van de redenen voor deze hypothese
was dat de aminozuren die coderen voor het angiotensine-converterende
enzym 2 (ACE2) receptor bij varkens een hoge homologie vertonen met de
genetische code voor de ACE2 receptor bij mensen. Deze receptor is
belangrijk voor SARS-CoV-2 om cellen te infecteren (Gu and Korteweg,
2007; Imai et al., 2005; Wan et al., 2020). Bovendien hadden Chinese
onderzoekers in 2018 melding gemaakt van massale sterfte en acute
diarree bij varkens veroorzaakt door een ander vleermuis gerelateerd
Coronavirus, genaamd SADS (Zhou et al., 2018). Ten slotte kunnen varkens
wel experimenteel worden besmet met SARS-CoV-1 (SARS coronavirus 1)
en MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus), maar
varkens fungeren voor deze virussen als eindgastheer. Varkens vertonen
geen openlijke tekenen van ziekte en kunnen deze infecties niet efficiënt
overbrengen naar andere varkens. De bijdrage van varkens aan de
blootstelling van mensen aan deze corona virussen is op grond van deze
gegevens verwaarloosbaar.
Voor andere specifieke coronavirussen is het bekend dat deze heel efficiënt
tussen varkens kunnen verspreiden en tevens endemisch kunnen worden
op varkensbedrijven, zoals het respiratoir varkens coronavirus (PRCV), het
gastro-enteritisvirus (TGEV), het porcine epidemische diarree virus (PEDV)
en het hemagglutinatie encefalomyelitisvirus (PHEV). Bij het gebruik van
diagnostische tests voor detectie van antistoffen tegen SARS-CoV-2 moet
rekening worden gehouden met de mogelijke kruisreacties met de
endemisch voorkomende coronavirussen. ErasmusMC heeft verschillende
SARS-CoV-2 antilichaamtesten opgezet, (Okba et al., 2020; Westerhuis et
3

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

al., 2020) wat onderzoek naar blootstelling aan SARS-CoV-2 mogelijk
maakt.
Het potentieel vermogen van SARS-CoV-2 om varkens te infecteren,
eventuele klinische effecten en eventuele overdracht tussen varkens onder
geconditioneerde omstandigheden, is onlangs onderzocht in verschillende
onderzoekscentra wereldwijd (Harbin (HRVI, CN) (Shi et al., 2020),
IRTA/CReSA (ES) (Veragara-Alert et al., 2020), FLI (GE) (Schlottau et al.,
2020), CFIA (CA) (Pickering et al., 2020) en KSU (USA) (Meekins et al.,
2020). In deze studies (Bijlage 1, Tabel 1) bleek bij de meeste
experimenteel blootgestelde varkens dat varkens niet besmet kunnen
worden. Vier van de vijf gepubliceerde experimentele studies melden
afwezigheid van klinische verschijnselen, evenals afwezigheid van virus of
slechts zeer lage en voorbijgaande niveaus van virusdetectie na
blootstelling. Slechts één studie maakt melding van één monster met
infectieus SARS-CoV-2 virus, geïsoleerd uit een lymfeklier op dag 13 na
infectie (Pickering et al., 2020). Een andere studie toonde aan dat varkens
na intraveneuze of intramusculaire infectie een antilichaamrespons hebben
die specifiek is voor SARS-CoV-2 (Veragara-Alert et al., 2020). Er wordt op
basis van deze resultaten gesuggereerd dat het virus immunogeen is voor
varkens, in reactie op specifieke blootstellingsroutes (Veragara-Alert et al.,
2020).
De resultaten van de experimentele studies met SARS-CoV-2 bij varkens
sluiten niet per se uitbraken onder veldomstandigheden uit. In
dierexperimenten blijkt namelijk de wijze van blootstelling en transmissie
in het veld soms moeilijk na te bootsen. Voorbeelden van verschillen tussen
transmissie na experimentele en natuurlijke blootstelling van andere
virussen bij varkens zijn mond- en klauwzeer virus bij gevaccineerde
varkens (Orsel et al., 2007) en Hepatitis E virus (Bouwknegt et al., 2009).
Ook onderzoekers van SARS-CoV-2 infecties bij varkens benoemen de
noodzaak van veldonderzoek (Pickering et al., 2020).
In deze studie evalueren wij of SARS-CoV-2 heeft geleid tot uitbraken in de
varkensstapel, door middel van het meten van antilichamen tegen SARSCoV-2 bij varkens uit de regio Uden/Gemert-Bakel. We veronderstellen dat
verschillende varkensbedrijven rond de gemeenten Uden en Gemert-Bakel
zijn blootgesteld aan SARS-CoV-2 dat circuleert onder de humane
bevolking. De infecties in de nertsenhouderij tonen ook aan dat dieren in
deze regio zijn blootgesteld aan het virus. In het geval dat het varken in
staat is het virus efficiënt over te brengen (R0>1, ofwel een geïnfecteerd

4

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

dier infecteert meer dan 1 andere dieren), kan dit na introductie van het
virus resulteren in grote uitbraken (d.w.z. de meerderheid van de dieren
raakt geïnfecteerd). De kans op zo’n grote uitbraak is (1-(1/R0)).
Bijvoorbeeld in geval R0=3 is de kans op een grote uitbraak 2/3 en zal de
verwachte prevalentie van antistoffen in een groep uiteindelijk ±94% zijn
(de fractie vatbare individuen aan het eind van een uitbraak is:
𝑠𝑠(∞) = exp (−𝑅𝑅0 (1 − 𝑠𝑠(∞)) (Kermack, 1927)). Derhalve zijn beperkte
steekproefgroottes per bedrijf voldoende om efficiënte spreiding onder
varkens op te sporen.
Om het bestuderen van de onderzoeksvraag mogelijk te maken, moet de
specificiteit van de beschikbare serologische SARS-CoV-2 tests bij gebruik
op varkensserum worden geëvalueerd. Daarom zijn de doelstellingen van
deze studie:
1. De kruisreactiviteit van de SARS-CoV-2 serologische tests evalueren op
antilichamen tegen andere coronavirussen bij varkens.
2. Onderzoeken van het percentage dieren dat antistoffen heeft tegen
SARS-CoV-2-virus bij slachtvarkens uit de gemeente Uden en omgeving
(d.w.z. Gemert-Bakel, Deurne, Sint-Anthonis, Landerd en Meierijstad) in
het voorjaar en de vroege zomer van 2020 (tijdens mogelijke blootstelling).

5

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Hoofdstuk 2

Materiaal en methoden
Het
project
bestond
uit
twee
fasen;
seroprevalentieonderzoek van slachtvarkens.

testevaluatie

en

het

Evaluatie van de SARS-CoV-2 antilichaamtest

Beschikbare serologische testen voor detectie van antilichamen tegen
SARS-CoV-2 zijn niet eerder gevalideerd voor gebruik bij varkens. Om de
specificiteit van de test in deze studie te evalueren zijn serummonsters
geselecteerd die in 2014 zijn verkregen uit dieren van de Academic Training
Facility "de Tolakker" van de Universiteit Utrecht. Zestig (60)
serummonsters van varkens (fokzeugen en gelten >10 weken leeftijd),
waarvan bekend is dat een proportie positief heeft getest op antilichamen
tegen PHEV (bèta-coronavirus van varkens), werden geselecteerd voor
evaluatie van de SARS-CoV-2 antilichaam test.
De sera werden gescreend op de aanwezigheid van IgG-antilichamen tegen
het SARS-CoV-2 “spike ectodomain” en tegen de varkenscoronavirussen
PHEV en SDCV S1-antigenen met behulp van de protein microarray, zoals
eerder beschreven voor andere coronavirussen (Reusken et al., 2013a;
Reusken et al., 2013b) en voor SARS-CoV-2 (Westerhuis et al., 2020).
Fluorescentiesignalen werden gekwantificeerd zoals eerder beschreven
(Reusken et al., 2013a). Alle sera zijn getest in een verdunning van 1/20.
De afkapwaarde, waarboven sera als “mogelijk positief” worden
geclassificeerd, werd bepaald op basis van de gemiddelde signaalintensiteit
plus 3 standaarddeviaties, resulterend in een waarde van 9.000 relatieve
fluorescentie-eenheden (RFU). Bevestiging van mogelijke positieve sera
vindt plaats door middel van een neutralisatietest (Plaque Reduction
Neutralisation Test (PRNT)), die eerder is gevalideerd voor humaan gebruik
(Okba et al., 2020). De PRNT test wordt gezien als zeer specifiek.
Seroprevalentie status voor SARS-CoV-2 bij varkens

Van vleesvarkensbedrijven die leveren aan Nederlandse slachterijen is
herhaaldelijk een steekproef genomen van vleesvarkens tijdens het
slachtproces in de slachterij. De oorsprong van de varkens was beperkt tot
het vooraf gedefinieerde geografische gebied.

6

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Bedrijfsselectie

Initieel zijn eenentwintig bedrijven met vleesvarkens geïdentificeerd die aan
de inclusiecriteria voldeden; 1) gelegen in de specifieke geografische regio
met een straal van ~10km rond Uden/Gemert-Bakel, 2) worden beschouwd
als frequente leveranciers van specifieke slachterijen in Nederland omdat
het doel was om herhaaldelijk bloed van varkensleveringen van deze
bedrijven te verzamelen, 3) waarvan historische monsters uit 2019
beschikbaar zijn voor eventuele vergelijking. Drie bedrijven leverden in de
studieperiode geen varkens aan de slachterijen en werden daarom niet
bemonsterd.
Van elke bedrijf werden bloedmonsters van vleesvarkens verzameld van
meerdere leveringen, die normaliter routinematig al genomen worden in de
slachterij voor onderzoek op Toxoplasma gondii en Mycobacterium Avium
spp.. Bloedmonsters werden verzameld tussen 1 april en 30 juli 2020. Er
werd verondersteld dat deze varkens in februari-maart 2020, tussen de één
en vijf maanden oud waren en mogelijk zijn blootgesteld aan besmette
mensen, wat overeenkomt met het begin van de epidemie bij mensen in
Nederland.
Steekproef

De beoogde steekproefgrootte per bedrijf was bepaald op twaalf
serummonsters, gebaseerd op de veronderstelling dat, na introductie zou
resulteren in een grote uitbraak (kans = (1-(1/R0)) en transmissie in een
gesloten varkenseenheid, >63% van de varkens zal infecteren en daarmee
tot hetzelfde percentage antistoffen zal leiden (dit is de verwachte waarde
wanneer R0>1.5) en dat daarna transmissie in het bedrijf wordt
gehandhaafd. Hoewel zes monsters per groep dieren voldoende zouden
moeten zijn om een dergelijke seroprevalentie met 95% betrouwbaarheid
te detecteren, is dit op de meeste bedrijven een veelvoud van dit aantal
geanalyseerd omdat de varkens werden geleverd uit meerdere groepen, in
afzonderlijke leveringen.
Van 18 bedrijven werden in totaal 660 varkensserummonsters verzameld
waarvan er van 17 bedrijven 417 serummonsters zijn geanalyseerd. Per
levering zijn 2 tot 6 serummonsters verzameld van minimaal één levering
tot maximaal zes leveringen per bedrijf (Bijlage 1, Tabel 2).
Van drie bedrijven zijn de meeste varkens laat in de projectperiode geslacht
en zijn er slechts 10, 6 en 0 monsters getest. Gezien de resultaten op de
andere bedrijven is besloten om de overige monsters niet verder te
analyseren.

7

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Monsterverzameling en -verwerking

Bloedmonsters werden verzameld (in serumgelbuizen) in de slachterij bij
verbloeding en vervolgens naar het laboratorium gestuurd voor
centrifugatie. Vervolgens werd 1 milliliter serum in 96-Well Polypropyleen
DeepWell™ opslagplaten gepipetteerd en opgeslagen bij -20°C totdat
monsters voor analyse naar het Erasmus Medisch Centrum in Rotterdam
werden vervoerd.
Test algoritme

Monsters werden als negatief beschouwd voor SARS-CoV-2 antilichamen
wanneer deze negatief testten met de protein array.
Monsters met positieve testresultaten in de protein array alsmede monsters
waarvan de testuitslag niet bepaald kon worden, als gevolg van hoge
achtergrondsignalen, werden vervolgens getest in de PRNT, zoals eerder
beschreven (Okba et al., 2020; Westerhuis et al., 2020).
In het geval dat de PRNT-test een positief signaal gaf (titer ≥40) werden
de monsters vervolgens opnieuw getest in een zogenaamde ReceptorBinding-Domain ELISA-test (RBD-ELISA), aangepast aan Okba et al. (2020)
die ook gebruikt wordt voor antistofdiagnostiek bij nertsen, honden en
katten. De afkapwaarde voor de RBD-ELISA was ingesteld op 0.300.
Monsters die positief testten in zowel de PRNT als RBD-ELISA werden als
positief voor SARS-CoV-2 antilichamen beschouwd.
Vervolgens werden de testresultaten besproken door het panel van auteurs
met als doel om tot een consensus te komen.
Gegevensanalyses en -statistiek

Analyse van de serologische test uitslagen werd uitgevoerd met GraphPad
Prism (versie 6.02) en de data is geanalyseerd met MS Excel™.
Ethiek en data eigendom

De bloedmonsters zijn genomen tijdens het verbloeden van vleesvarkens in
Nederlandse slachterijen. De monsters zijn afkomstig van willekeurig
geselecteerde slachtvarkens (~ 180 dagen oud) van geselecteerde
bedrijven (zie eerder). Deze manier van monstername valt niet onder de
Wet op de Dierproeven en verlening van een vergunning door de CCD was
derhalve niet noodzakelijk. De bloedmonsters zijn eigendom van de
slachterij die heeft ingestemd met en meegewerkt aan de monstername.
De monsters zijn geanonimiseerd en de resultaten zijn niet herleidbaar naar
specifieke herkomstbedrijven.

8

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Hoofdstuk 3

Resultaten
Evaluatie van de SARS-CoV-2 antilichaamtesten

De testevaluatie is uitgevoerd op 60 serummonsters van zeugen en gelten
van varkensbedrijf “de Tolakker” van de Universiteit Utrecht uit 2014, waar
in een eerder onderzoek een deel positief is getest voor antistoffen tegen
PHEV.
Een van zestig (1/60) sera had een RFU-waarde boven de afkap-waarde
voor SARS-CoV-2 antilichamen in de protein array. Dat serum testte
vervolgens niet positief op PHEV-antilichamen. De PRNT test voor
neutraliserende antistoffen tegen SARS-CoV-2 (Okba et al., 2020)
resulteerde in een negatieve uitslag voor het monster dat een uitslag boven
de afkapwaarde had in de protein array (Figuur 1).

Figuur 1. Reactiviteit van varkens serum van de Tolakker uit 2014 met SARS-CoV-2 spike
ectodomain, en varkenscoronavirussen PHEV en SDCV S1 antigenen met behulp van de protein
Microarray. De afkapwaarde is vastgesteld op 9.000 RFU voor SARS-ecto-T.

Op basis van deze resultaten is geconcludeerd dat serum van varkens van
een bevestigd PHEV positief bedrijf slechts minimale reactiviteit toont tegen
SARS-CoV-2 in de protein microarray. Het serummonster met de hoogste
fluorescentie tegen SARS-CoV-2 in de protein array, kon niet worden
bevestigd met de SARS-CoV-2 PRNT. De protein array kan daarmee worden
gebruikt om varkensserummonsters vooraf te screenen met gebruik van de
PRNT ter bevestiging van monsters met hogere fluorescentiewaarden.

9

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Serologie resultaten voor SARS-CoV-2 bij varkens

In totaal zijn 417 monsters van 17 bedrijven getest. 368/417
bloedmonsters van 17 bedrijven hebben een negatieve testuitslag in de
protein array (88.2%) (Figuur 2 en Bijlage 1, Tabel 2). Een klein deel van
de sera (24/417 (5.8%)) toonde lichte reactiviteit in de protein array en
werd getest in de SARS-CoV-2 PRNT, evenals 25/417 (6.0%) monsters
waarvoor het resultaat in de protein array "onbepaald" was (hoge
achtergrond) (Figuur 2).
Zes van de 24 monsters met lage reactiviteit in de protein array waren laag
positief in de PRNT (titer 40-160), allemaal afkomstig van hetzelfde bedrijf
(bedrijf 1) (en verzameld uit dezelfde levering op één gegeven moment)
(Bijlage 1, Tabel 3). Bovendien waren twee andere sera, van twee andere
bedrijven, positief in de PRNT, maar voor deze monsters kon een
testresultaat voor de protein array niet worden bepaald vanwege een hoog
achtergrondsignaal). De overige 23 monsters met een hoog
achtergrondsignaal in de protein array testten negatief in de PRNT.
Alle sera (acht monsters) met een positieve PRNT (≥ titer 40) werden ook
getest met de RBD-ELISA. De zes monsters van één bedrijf waren negatief
in de RBD-ELISA. Een van de twee andere monsters met een hoog PRNT
signaal testte negatief in de RBD-ELISA (Figuur 2, Bijlage 1, Tabel 3).
Eén monster testte positief met de RBD-ELISA èn in de PRNT. Voor het
bedrijf waar dit monster, met zowel een positieve PRNT als RBD-ELISA
uitslag, is gevonden hebben in zowel de twee bemonsterde leveringen vóór
als de drie bemonsterde leveringen ná de betreffende levering alle varkens
negatief getest (N=35) (Bijlage 1, Tabel 3).
Samenvattend, op 16 van de 17 bedrijven zijn, op basis van het
testalgoritme, geen antilichamen tegen SARS-CoV-2 aangetoond. Op één
bedrijf testte één van de 36 serummonsters positief.

10

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

24 bedrijven
voldoen aan inclusiecriteria
6 bedrijven
niet geleverd in
studieperiode
18 bedrijven
660 serummonsters
verzameld

3 bedrijven
laat in studieperiode geleverd:
12, 6 of 0 monsters geanalyseerd

17 bedrijven
417 serum monsters
geanalyseerd

Protein Array:

Protein Array:

Protein Array:

368x

25x

24x

Negatief

Te hoge achtergrond

Lichte reactiviteit

PRNT:

PRNT:

PRNT:

PRNT:

23x

2x

18x

6x

Negatief

Laag positief

Negatief

Laag positief

RBD-ELISA:

RBD ELISA:

1x

6x

Negatief

Negatief

RBD-ELISA:
1x
Positief

Figuur 2. Samenvatting van het aantal bedrijven, het aantal verzamelde en geanalyseerde serum
monsters met bijbehorende resultaten.

11

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Hoofdstuk 4

Discussie en conclusie
Het doel van deze studie was om uit te sluiten dat SARS-CoV-2 zich efficiënt
verspreid heeft onder de varkens in de regio Uden/Gemert-Bakel, waar het
virus zich in het voorjaar van 2020 eerder verspreidde onder de algemene
humane bevolking.
De resultaten van de testevaluatiefase (serum uit 2014 en negatief voor
SARS-CoV-2 antistoffen) geven aan dat in de protein array weliswaar enige
reactiviteit zichtbaar was, maar de PRNT kon die reactiviteit niet bevestigen.
De specificiteit van de gekozen seriële testprocedure voor het doel van het
screenen van varkensserum voor antistoffen tegen SARS-CoV-2 is goed.
De bevindingen ten aanzien van de serummonsters van slachtvarkens (1
van de 417 serum monster positief getest) rechtvaardigt de conclusie dat
SARS-CoV-2 in het voorjaar van 2020 niet op grote schaal is geïntroduceerd
en verspreid op varkensbedrijven in de regio Uden/Gemert-Bakel.
Wanneer aangenomen wordt dat de immuunrespons tegen SARS-CoV-2
zoals gemeten met de PRNT en RBD ELISA niet transient, maar langdurig
is, is het ene positief geteste serummonster op drie verschillende manieren
te verklaren. Er kan sprake zijn van een kruisreactie, bijvoorbeeld met
andere CoVs die bij varkens circuleren. Er kan ook sprake zijn van een
beginnende uitbraak van SARS-CoV-2 op het bedrijf. De bevindingen bij
monsters van hetzelfde bedrijf uit leveringen vóór (n=2) en ná (n=3) het
positief geteste dier sluiten de beginnende uitbraak uit. Tenslotte kan
sprake zijn van een zogenaamde ‘kleine’ uitbraak met beperkte
verspreiding of een immuunrespons ten gevolge van blootstelling zonder
virusvermeerdering.
Het initiële testprotocol, screenen met de protein array en bevestiging met
de PRNT, gaf bij sera van vijf verschillende boerderijen een laag positief
signaal, volgens de vooraf gedefinieerde afkapwaardes. De sera zijn ook
onderzocht met de RBD-ELISA, die ook gebruikt wordt als diagnostische
test voor SARS-CoV-2 bij andere diersoorten, zoals nertsen, honden en
katten. Geen van de sera was uiteindelijk positief in alle SARS-CoV-2
testen. Kruisreactiviteit in het varkensserum kan niet worden uitgesloten,
deels als gevolg van het ontbreken van betrouwbare serologische testen
voor andere coronavirussen bij varkens. In de studie van Veragara-Alert
wordt een transiënte serologische reactie tegen het N-eiwit vóór challenge
12

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

geobserveerd bij één big en ook als kruisreactie geïnterpreteerd (VeragaraAlert et al., 2020). In de testen zoals beschreven in dit rapport is echter
geen gebruik gemaakt van dit eiwit, wat vaker kruisreactiviteit tussen
verschillende coronavirussen laat zien.
Op bedrijf 1 was sprake van een zwak signaal bij 6 van 6 dieren uit één
levering volgens het testalgoritme. Een hertest met de RBD-ELISA op deze
monsters resulteerde in een signaal onder de afkapwaarde en daarmee is
het zeer onwaarschijnlijk dat deze dieren werkelijk specifieke antistoffen
tegen SARS-CoV-2 hadden. Bovendien hebben vervolgmonsters van
hetzelfde bedrijf allen negatief getest en derhalve lijkt hier geen sprake te
zijn van een uitbraak.
Zowel in de experimentele studies met varkens als in het serologisch
onderzoek van slachtvarkens in de regio Uden/Gemert-Bakel is geen
aanwijzing gevonden voor uitgebreide transmissie van SARS-CoV-2 onder
varkens. Gezien de lagere incidentie van SARS-CoV-2 bij mensen in andere
delen van Nederland ten tijde van deze studie, is het onwaarschijnlijk dat
onderzoek van varkens elders in Nederland tot een andere conclusie had
geleid.

Conclusie en relevantie

Op basis van de bevindingen in dit onderzoek is geconcludeerd dat er geen
aanwijzingen zijn voor spreiding van SARS-CoV-2 op varkensbedrijven in
de regio rond Uden en Gemert-Bakel.
Op grond van de huidige informatie wordt de rol van varkens aan de
epidemie van SARS-CoV-2 bij de mens verwaarloosbaar geacht.

13

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

Hoofdstuk 5

Referenties
•

Bouwknegt, M., Rutjes, S.A., Reusken, C.B., Stockhofe-Zurwieden, N., Frankena, K.,
de Jong, M.C., de Roda Husman, A.M., Poel, W.H., 2009. The course of hepatitis E virus
infection in pigs after contact-infection and intravenous inoculation. BMC Vet Res 5, 7.

•

Gu, J., Korteweg, C., 2007. Pathology and pathogenesis of severe acute respiratory
syndrome. Am J Pathol 170, 1136-1147.

•

Imai, Y., Kuba, K., Rao, S., Huan, Y., Guo, F., Guan, B., Yang, P., Sarao, R., Wada, T.,
Leong-Poi, H., Crackower, M.A., Fukamizu, A., Hui, C.C., Hein, L., Uhlig, S., Slutsky,
A.S., Jiang, C., Penninger, J.M., 2005. Angiotensin-converting enzyme 2 protects from
severe acute lung failure. Nature 436, 112-116.

•

Kermack, W.O.M., A. G., 1927. A contribution to the mathematical theory of epidemics.
Proc. R. Soc. Lond. A 115, 700-721.

•

Meekins, D.A., Morozov, I., Trujillo, J.D., Gaudreault, N.N., Bold, D., Artiaga, B.L.,
Indran, S.V., Kwon, T., Balaraman, V., Madden, D.W., Feldmann, H., Henningson, J.,
Ma, W., Balasuriya, U.B.R., Richt, J.A., 2020. Susceptibility of swine cells and domestic
pigs to SARS-CoV-2. bioRxiv, 2020.2008.2015.252395.

•

Okba, N.M.A., Muller, M.A., Li, W., Wang, C., GeurtsvanKessel, C.H., Corman, V.M.,
Lamers, M.M., Sikkema, R.S., de Bruin, E., Chandler, F.D., Yazdanpanah, Y., Le
Hingrat, Q., Descamps, D., Houhou-Fidouh, N., Reusken, C.B.E.M., Bosch, B.-J.,
Drosten, C., Koopmans, M.P.G., Haagmans, B.L., 2020. SARS-CoV-2 specific antibody
responses in COVID-19 patients. medRxiv, 2020.2003.2018.20038059.

•

Orsel, K., de Jong, M.C., Bouma, A., Stegeman, J.A., Dekker, A., 2007. Foot and mouth
disease virus transmission among vaccinated pigs after exposure to virus shedding
pigs. Vaccine 25, 6381-6391.

•

Osiris-Algemene-Infectieziekten-database, 2020. Covid-19 cumulative numbers per
municipality, 21 Mei 2020 ed. RIVM/I&V/EPI, Bilthoven, the Netherlands.

•

Pickering, B.S., Smith, G., Pinette, M.M., Embury-Hyatt, C., Moffat, E., Marszal, P.,
Lewis, C.E., 2020. Susceptibility of domestic swine to experimental infection with
SARS-CoV-2. bioRxiv, 2020.2009.2010.288548.

•

Reusken, C., Mou, H., Godeke, G.J., van der Hoek, L., Meyer, B., Muller, M.A.,
Haagmans, B., de Sousa, R., Schuurman, N., Dittmer, U., Rottier, P., Osterhaus, A.,
Drosten, C., Bosch, B.J., Koopmans, M., 2013a. Specific serology for emerging human
coronaviruses by protein microarray. Euro Surveill 18, 20441.

•

Reusken, C.B., Haagmans, B.L., Muller, M.A., Gutierrez, C., Godeke, G.J., Meyer, B.,
Muth, D., Raj, V.S., Smits-De Vries, L., Corman, V.M., Drexler, J.F., Smits, S.L., El
Tahir, Y.E., De Sousa, R., van Beek, J., Nowotny, N., van Maanen, K., HidalgoHermoso, E., Bosch, B.J., Rottier, P., Osterhaus, A., Gortazar-Schmidt, C., Drosten, C.,
Koopmans, M.P., 2013b. Middle East respiratory syndrome coronavirus neutralising
serum antibodies in dromedary camels: a comparative serological study. Lancet Infect
Dis 13, 859-866.

•

Schlottau, K., Rissmann, M., Graaf, A., Schon, J., Sehl, J., Wylezich, C., Hoper, D.,
Mettenleiter, T.C., Balkema-Buschmann, A., Harder, T., Grund, C., Hoffmann, D.,
Breithaupt, A., Beer, M., 2020. SARS-CoV-2 in fruit bats, ferrets, pigs, and chickens:
an experimental transmission study. Lancet Microbe 1, e218-e225.

14

26-10-20

SARS-CoV-2 antistoffen onderzoek varkens

Universiteit Utrecht, Faculteit Diergeneeskunde

•

Shi, J., Wen, Z., Zhong, G., Yang, H., Wang, C., Liu, R., He, X., Shuai, L., Sun, Z.,
Zhao, Y., Liang, L., Cui, P., Wang, J., Zhang, X., Guan, Y., Chen, H., Bu, Z., 2020.
Susceptibility of ferrets, cats, dogs, and different domestic animals to SARScoronavirus-2. bioRxiv, 2020.2003.2030.015347.

•

Veragara-Alert, J., Rodon, J., Carrillo, J., Te, N., Useros, N.I., n, M.a.L.R.g.d.l.C., Nieto,
C.v., Guallar, V.c., Valencia, A., Cantero, G., Blanco, J., Clotet, B., Bensaid, A., s, J.S.,
2020. Pigs are not susceptible to SARS-CoV-2 infection but are a model for viral
immunogenicity studies. Accepted in Transboundary and Emerging Diseases

•

Wan, Y., Shang, J., Graham, R., Baric, R.S., Li, F., 2020. Receptor Recognition by the
Novel Coronavirus from Wuhan: an Analysis Based on Decade-Long Structural Studies
of SARS Coronavirus. Journal of Virology 94, e00127-00120.

•

Westerhuis, B.M., de Bruin, E., Chandler, F.D., Ramakers, C.R.B., Okba, N.M.A., Li, W.,
Goossens, H., de Jong, M.D., Bosch, B.J., Haagmans, B.L., Fraaij, P.L.A., Sikkema,
R.S., Koopmans, M.P.G., 2020. Homologous and heterologous antibodies to
coronavirus 229E, NL63, OC43, HKU1, SARS, MERS and SARS-CoV-2 antigens in an
age stratified cross-sectional serosurvey in a large tertiary hospital in The Netherlands.
medRxiv, 2020.2008.2021.20177857.

•

Zhou, P., Fan, H., Lan, T., Yang, X.L., Shi, W.F., Zhang, W., Zhu, Y., Zhang, Y.W., Xie,
Q.M., Mani, S., Zheng, X.S., Li, B., Li, J.M., Guo, H., Pei, G.Q., An, X.P., Chen, J.W.,
Zhou, L., Mai, K.J., Wu, Z.X., Li, D., Anderson, D.E., Zhang, L.B., Li, S.Y., Mi, Z.Q., He,
T.T., Cong, F., Guo, P.J., Huang, R., Luo, Y., Liu, X.L., Chen, J., Huang, Y., Sun, Q.,
Zhang, X.L., Wang, Y.Y., Xing, S.Z., Chen, Y.S., Sun, Y., Li, J., Daszak, P., Wang, L.F.,
Shi, Z.L., Tong, Y.G., Ma, J.Y., 2018. Fatal swine acute diarrhoea syndrome caused by
an HKU2-related coronavirus of bat origin. Nature 556, 255-258.

15

26-10-20

Bijlage 1

virus replicatie gevonden

virus teruggevonden
<D4 post-infectie

seroconversie

~6

i.n.

10^5
pfu

Geen

N

N

Neg

IRTA
(Spanje)

20

NA

Conventioneel

Landrace x
Large White

5-6

i.n. / e.t.
/ i.m. /
i.v.

10^5.8
TCID50

Geen

N

1 big

J

FLI
(Dld)
CFIA
(Canada)

9

3

‘high health'

9

i.n.

N

N

Neg

2

Conventioneel lokaal

8

i.n. &
intra
pharynx

10^5
TCID50
1X
10^6
pfu

Geen

16

German
Landrace
American
Yorkshire
Crossbred

±l

6

‘high
health’

NA

5

oral &
i.n. &
i.t.

J; op dag 13
p.i. RNA +,
virus reisolatie uit Lnn.
bij 1 big
N

2 biggen
weinig
RNA

9

Transiente
ooguitvloeiing, 1
big ook neus
uitvloeiing
1x big hoest
Geen

J

Geen

KSU
(USA)

10^6
TCID50

Referentie

Klinische verschijnselen

Landrace &
Large White

Transmissie geobserveerd

route van blootstelling

SPF

Serologie & resultaten

Leeftijd varken (wkn)

3

Blootstelling dosis

herkomst varkens

5

Ras varkens

# contact varkens

Harbin
(China)

Instituut

# varkens blootgesteld

Tabel 1. Overzicht van resultaten uit gepubliceerde studies naar experimentele blootstelling van varkens aan SARS-CoV-2 virus (t/m 15-9-2020).
# = aantal, N = Nee, Neg = Negatief, NA = Niet uitgevoerd/bepaald, + = positieve testuitslag, ± = inconsistent

PRNT &
Double antigen
ELISA: Neg
Anti-N-ELISA +:
1x i.m. & alle i.v.
biggen +
1 big i.t. 1x D-0
Anti-S1 & S2 ELISA
& VNT +:
alle i.m. & i.v. titers
(40-160) +
IFA & VNT:
Neg
PRNT & VNT: 2
dieren enkele +
monster gevolgd
door – uitslagen

NA

Shi
et al. 2020

NA

Vergara-Alert
et al. 2020

N

Schlottau
et al. 2020
Pickering
et al. 2020

microneutralization assay
& RBD ELISA +: 1
sentinel pig
transient effect

N

N

Meekins
et al. 2020

16

Bijlage 1
Tabel 2. Overzicht verzamelde en geteste bloedmonsters en resultaten volgens het test algoritme.

Bedrijf
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
Totaal

maand van bloed verzamelen
apr-20 mei-20 jun-20 jul-20
18
6
24
6
12
6
21
6
18
18
6
12
6
18
6
17
6
20
24
6
6
12
12
12
6
6
12
6
12
6
25
6
12
6
12
6
12
6
12
6
18
18
6
11
6
12
6
12
6
12
6
12
6
6
8
12
12
6
12
6
18
66
215
108
271

totaal

getest

48
45
42
42
49
36
36
24
49
36
36
24
35
36
36
20
42
24
660

48
18
42
42
23
24
24
10
20
36
18
6
18
18
18
12
40
0
417

17

Bijlage 1
Tabel 3. Overzicht van testresultaten per bedrijf per maand.
PA = protein array, PRNT = Plaque reductie neutralisatie test. RBD-ELISA = Receptor Binding Domain
ELISA test. "+", “-“ = aantal positief en respectievelijk negatief geteste monsters in de betreffende
maand.

Test
resultaat
per
bedrijf
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Totaal

apr-20
PA + &
PA PRNT +
6
6
6
6

6
6
6

6
6
12
66

0

maand van verzamelen
mei-20
jun-20
PA + &
PA + &
PA PA PRNT +
PRNT +
12
6
6
12
17
1
12
6
17
24
12
12
6
4
12
2
11
1
6
12
6
18
12
12
6
6
12
4
207
8
52
0

18

jul-20
PA + &
PA PRNT +
24
18
18

12

12
84

0

Totaal per test en resultaat
PA 42
18
41
42
23
24
24
10
20
35
18
6
18
18
18
12
40
409

PA + &
RBD
PRNT + ELISA 6
6
1

1

1

8

RBD
ELISA +

1

7

26-10-20

1