Antibioticaresistente bacteriën,
resistentiegenen en antibioticaresiduen
in mest

RIVM Briefrapport 2019-0112
H. Schmitt et al.

Antibioticaresistente bacteriën,
resistentiegenen en antibioticaresiduen
in mest

RIVM Briefrapport 2019-0112
H. Schmitt et al.

RIVM Briefrapport 2019-0112

Colofon

© RIVM 2019
Delen uit deze publicatie mogen worden overgenomen op voorwaarde
van bronvermelding: Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu
(RIVM), de titel van de publicatie en het jaar van uitgave.
DOI 10.21945/RIVM-2019-0112
H. Schmitt (auteur), RIVM
H. Blaak (auteur), RIVM
P. Hoeksma (auteur), WUR
M. van de Schans (auteur), WFSR
M. Kemper (auteur), RIVM
S. de Rijk (auteur), RIVM
A. M. de Roda Husman (auteur), RIVM
Contact:
Heike Schmitt
Z&O
RIVM, Centrum Zoonosen en Omgevingsmicrobiologie (Z&O), onderdeel
van het Centrum Infectieziektenbestrijding (CiB)
heike.schmitt@rivm.nl
Met dank aan: alle betrokken mestverwerkers en veehouders.
Dit onderzoek werd verricht in opdracht van het ministerie van
Volksgezondheid, Welzijn en Sport (VWS).

Dit is een uitgave van:
www.rivm.nl
Rijksinstituut voor Volksgezondheid
en Milieu
Postbus 1 | 3720 BA Bilthoven
Nederland

Pagina 2 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Publiekssamenvatting

Antibioticaresistente bacteriën, resistentiegenen en
antibioticaresiduen in mest
In mest blijken bacteriën voor te komen die ongevoelig (resistent) zijn
voor bepaalde soorten antibiotica. Ook zijn er in mest resten van
antibiotica gevonden. Mest van landbouwhuisdieren, zoals koeien en
varkens, wordt gebruikt om landbouwgrond mee te bemesten.
Dit blijkt uit onderzoek van het RIVM. Wetenschappers onderzochten
hoeveel resistente bacteriën via mest in het Nederlandse milieu (in
bodem en water) terechtkomen. In de onderzochte mest zijn bijzonder
resistente micro-organismen (BMRO), namelijk de ESBL-producerende
bacterie E. coli gemeten. Het voorkomen van deze bacterie verschilt per
diersoort. Het komt tussen 40 procent (mest van leghennen) en 90
procent (mest van kalveren) voor.
De hoogste concentraties ESBL-producerende E. coli zijn gevonden in
mest van leghennen. De hoeveelheid mest die op het land wordt
gebracht verschilt per diersoort. Doordat er veel minder pluimveemest
op het land terecht komt dan mest van andere diersoorten, belasten alle
soorten mest het milieu met ongeveer dezelfde hoeveelheid.
Naast mest van landbouwhuisdieren is afvalwater de belangrijkste ‘bron’
waardoor resistente bacteriën in het milieu belanden. Resistente
bacteriën komen met menselijke ontlasting in
afvalwaterzuiveringsinstallaties terecht. Doordat de bacteriën daar niet
helemaal worden verwijderd, belanden ze dus in het oppervlaktewater,
zoals een rivier. Wetenschappers laten met dit onderzoek zien dat de
totale hoeveelheid resistentie die vanuit mest op de bodem belandt
ongeveer hetzelfde is als de hoeveelheid die vanuit afvalwater in het
oppervlaktewater terecht komt. Vanuit mest en bodem belandt slechts
een deel van de resistente bacteriën in oppervlaktewater. Daarom is
afvalwater van mensen een grotere bron van resistente bacteriën in
water dan mest. Mensen kunnen in aanraking komen met resistentie in
het milieu na contact met water.
Kernwoorden: ESBL, BMRO, mest, afvalwater, milieu,
landbouwhuisdieren, antibioticaresistentie

Pagina 3 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Pagina 4 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Synopsis

Antibiotic resistant bacteria, resistance genes and residues of
antibiotics in manure
Bacteria that are resistant to certain types of antibiotics are present in
manure. In addition, residues of antibiotics have been found in manure.
Manure from farm animals, such as cows and pigs, is used to fertilise
farmland.
This was the conclusion of a study carried out by RIVM (National
Institute for Public Health and the Environment). Scientists investigated
how many resistant bacteria end up in the environment of the
Netherlands (in soil and water) via manure. The manure investigated
was found to contain highly resistant microorganisms (HRMO), namely
the ESBL producing E. coli bacteria. The incidence of these bacteria
differs per species of animal. It is found in between 40% (manure from
laying hens) and 90% (manure from calves) of samples.
The highest concentrations of ESBL producing E. coli were found in the
manure of laying hens. The quantity of manure spread on the soil differs
per animal species. Since the amount of poultry manure applied on
farmland is much less than the amount of manure from other animal
species, the different types of manure all have approximately the same
impact on the environment.
Besides manure from farm animals, waste water is the most important
source of resistant bacteria ending up in the environment. Resistant
bacteria end up in waste water treatment facilities via human faeces. As
these bacteria are not completely removed in these facilities, they end
up in surface water such as rivers. Through this study, scientists show
that the total number of resistant bacteria that end up in the soil via
manure is approximately the same as the number that end up in surface
water via waste water. Only a part of the resistant bacteria present in
manure and soil ends up in surface water. Waste water from humans
therefore makes a greater contribution to resistant bacteria in surface
water than does manure. People can come into contact with resistant
bacteria in the environment via contact with water.
Keywords: ESBL, HRMO, manure, wastewater, environment, farm
animals, antibiotic residues, antibiotic resistance genes.

Pagina 5 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Pagina 6 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Inhoudsopgave

Samenvatting — 9
1
1.1
1.2
1.3
1.4
1.4.1

Inleiding — 13
Aanleiding — 13
Doel — 13
Aanpak — 13
Achtergrond — 14
Antibioticaresistentie in mest — 14

2
2.1
2.2
2.3
2.4
2.5

Methoden — 15
Monstername — 15
Analyse van ESBL-EC en E. coli in mest — 15
Analyse van resistentiegenen in mest — 17
Analyse van residuen van antibiotica in mest — 17
Berekenen van vrachten — 18

3
3.1
3.2
3.3
3.4
3.4.1
3.4.2
3.4.3
3.4.4
3.4.4.1
3.4.4.2
3.4.4.3
3.4.4.4
3.5

Resultaten — 19
Prevalentie en concentraties van ESBL-EC en E. coli in mest — 19
Prevalentie en concentraties van resistentiegenen in mest — 21
Prevalentie en concentraties van antibiotica in mest — 23
Vrachten van ABR in mest — 25
Emissies van ESBL-EC met mest naar landbouwgrond — 25
Emissies van resistentiegenen met mest naar landbouwgrond — 26
Emissies van antibiotica met mest naar landbouwgrond — 26
Afspoeling van bacteriën en resistentiegenen van landbouwground naar
oppervlaktewater — 27
Vrijzetting van bacteriën uit mest en invloed van neerslag — 27
Inactivatie van bacteriën — 28
Mestapplicatie — 28
Observaties op stroomgebiedsschaal — 28
Vrachten van ABR – vergelijking van mest en humaan afvalwater — 28

4

Discussie — 31

5

Conclusies — 33

6
6.1
6.1.1
6.1.2

Annex — 35
Analyse van antibioticaresiduen — 35
Analysis of tetracyclines, sulfonamides, macrolides and quinolones — 35
Analysis of aminoglycosides — 35

7

Referenties — 37

Pagina 7 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Pagina 8 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Samenvatting

Aanleiding en doel
De belangrijkste bronnen en routes waarlangs antibioticaresistente
bacteriën, resistentiegenen en antibioticaresten (hier gezamenlijk ABR
genoemd) het milieu bereiken zijn via mest en afvalwater. De
aanwezigheid van resistente bacteriën in mest is in Nederland tot nu toe
alleen onderzocht in een kleine steekproef. Dit rapport heeft tot doel
met behulp van een grotere steekproef de concentraties van resistente
bacteriën, residuen van antibiotica en resistentiegenen in dierlijke mest
en de emissies naar het milieu te kwantificeren, en deze met emissies
uit menselijk afvalwater te vergelijken.
Aanpak
In mestmonsters verkregen na opslag van mest op de boerderij werden
het vóórkomen en de concentraties van ESBL-producerende E. coli
(ESBL-EC), van 2 resistentiegenen en van antibiotica onderzocht. Er zijn
mestmonsters genomen van vleesvarkens, zeugen, melkkoeien,
kalveren, leghennen en vleeskuikens. In combinatie met de totale
hoeveelheden mest worden deze resultaten geëxtrapoleerd naar de
totale hoeveelheden ABR die jaarlijks met mest op het milieu worden
geloosd. Daarnaast zijn literatuurgegevens over de afspoeling van
bacteriën in mest naar oppervlaktewater gebruikt om de hoeveelheid
ABR uit mest te kunnen vergelijken met de hoeveelheid ABR die uit
humane bronnen in oppervlaktewater komt.
ESBL-producerende E. coli in mest
In 101 mestmonsters genomen in de periode 2016 en 2017 werd de
percentage positieve monsters (prevalentie) en concentratie van ESBLEC en E. coli bepaald en samengevat met gegevens uit een eerdere
monstername in 2013/2014. ESBL-EC werden in alle onderzochte
mestsoorten gevonden. De prevalentie lag, afhankelijk van de
mestsoort, tussen 42% en 90% en was het hoogst in kalverenmest en
varkensmest. De hoogste concentratie ESBL-EC werd gevonden in mest
van leghennen, en de laagste in mest van melkvee.
Resistentiegenen in mest
Er werden twee resistentiegenen onderzocht die coderen voor vaak
gebruikte antibiotica: sul1 voor sulfonamide resistentie en ermB voor
macrolide resistentie. De genen sul1 en ermB werden in nagenoeg alle
mestmonsters (n=94) aangetroffen. De hoogste concentraties werden in
mest van vleeskuikens gevonden (rond 1010 kopieën / g), in melkvee
waren de concentraties het laagst (rond 108 kopieën / g), in
overeenstemming met ander internationaal onderzoek.
Antibioticaresiduen in mest
In de onderzochte mestmonsters (n=100) werden een aantal antibiotica
gevonden. Kalverenmest bevatte het grootste aantal verschillende
antibiotica (17) en de hoogste concentraties van antibiotica.
Tetracyclines, sulfonamides en macroliden werden het vaakst
aangetroffen, in overeenstemming met hun gebruik en hoge stabiliteit.
Ook fluorochinolonen werden aangetroffen, terwijl deze in Nederland
Pagina 9 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

zeer beperkt worden ingezet. De hoogste concentraties lagen bij enkele
μg/kg.
Vrachten van ESBL-EC en resistentiegenen in mest
Van alle dierlijke mest wordt het grootste deel gebruikt voor bemesting
en op landbouwgrond uitgereden. Daarom werd het aantal ESBL-EC dat
per jaar met mest op het land wordt gebracht berekend (de vracht of
jaaremissie). De vracht wordt berekend uit de concentratie ESBL-EC in
mest en de jaarlijkse hoeveelheid uitgereden mest. Ondanks verschillen
in de hoeveelheden uitgereden mest tussen de diersoorten dragen zowel
kalverenmest, mest van melkvee en mest van varkens en zeugen
ongeveer even veel bij aan de totale hoeveelheid ESBL-EC, die uit de
mest in het milieu komt. De bijdrage van pluimveemest is iets lager dan
de bijdrage van de andere mestsoorten, vooral omdat de hoeveelheid
uitgereden pluimveemest laag is in vergelijking met de andere
mestsoorten. In totaal worden ongeveer 1015-1016 ESBL-EC met
dierlijke mest op landbouwgrond uitgebracht. De onzekerheid van deze
schattingen, veroorzaakt door de variaties in de gevonden ESBL-EC
concentratie per monster, is relatief groot (95% percentiel tot 10 keer
hoger). De jaaremissies van de resistentiegenen sul1 en ermB bedragen
ongeveer 1019 kopieën. Ook hier is de onzekerheid van de schattingen
groot (95% percentiel ongeveer 5 keer hoger).
Vrachten van ABR uit mest in vergelijking met vrachten uit afvalwater
De vracht aan ESBL-EC die met mest het Nederlandse milieu bereiken is
binnen de onnauwkeurigheid van de schattingen gelijk aan de vracht die
met afvalwater (uit RWZIs, overstorten en foutaansluitingen in gebieden
met gescheiden riolering) het oppervlaktewater bereikt. Een fractie van
ABR in mest belandt vanuit de bodem door afspoeling en uitspoeling in
het grondwater en het oppervlaktewater. Voor de menselijke
blootstelling aan ABR in het milieu is deze fractie belangrijk. Het is niet
aan te geven hoe groot deze fractie precies is, vanwege de complexe
processen die bij uitspoeling een rol spelen, zoals inactivatie van
bacteriën, hechting van bacteriën aan bodemdeeltjes en rol van neerslag
voor de uitspoeling. Toch is aan te nemen dat de bijdrage van humane
bronnen aan het voorkomen van ABR in oppervlaktewater waarschijnlijk
beduidend groter is dan de bijdrage van mest.
Conclusies
1. Dierlijke mest bevat ook na opslag op de boerderij zowel ESBLEC alsook resistentiegenen en residuen van antibiotica. Mest is
daarmee een bron van waaruit ABR in het Nederlandse milieu
terecht kan komen. De prevalenties en concentraties van ESBLEC, resistentiegenen en residuen hangen af van de mestsoort,
maar tonen ook binnen een mestsoort grote variaties.
2. Alle verschillende mestsoorten dragen bij aan de totale vrachten
aan resistente bacteriën, resistentiegenen en antibiotica die op
landbouwgrond terecht komen. Er is geen mestsoort die het gros
van de emissies van zowel ESBL-EC, alsook van resistentiegenen
en residuen van antibiotica veroorzaakt.
3. De totale vracht aan ABR die met mest Nederlandse
landbouwgrond bereikt is vergelijkbaar met de totale vracht die
met afvalwater het oppervlaktewater bereikt. Voor de humane
blootstelling is ABR in oppervlaktewater van grotere relevantie
Pagina 10 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

dan ABR op landbouwgrond. De totale vracht die vanuit mest in
het oppervlaktewater terechtkomt, is waarschijnlijk beduidend
kleiner dan de vracht vanuit afvalwater.

Pagina 11 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Pagina 12 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

1

Inleiding

1.1

Aanleiding
Wereldwijd worden op steeds grotere schaal infecties met bacteriën
gesignaleerd die resistent zijn voor antibiotica. Het landelijke
programma ‘aanpak van antibioticaresistentie’ richt zich op alle
domeinen in welk antibioticaresistente bacteriën kunnen voorkomen: in
de gezondheidszorg, bij dieren, in voedsel en in het milieu (One Health
benadering).
De belangrijkste bronnen en routes waarlangs resistente bacteriën en
antibioticaresten het milieu bereiken zijn via mest en afvalwater. Met
deze stromen bereiken ook antibioticaresistentiegenen en residuen van
antibiotica het milieu. Het voorkomen van resistente bacteriën in het
milieu werd in Nederland nog niet systematisch onderzocht. Daarom
werden in een eerder project nulmetingen van het voorkomen van
antibioticaresistentie in humaan afvalwater verricht (Schmitt et al.
2017a). De invloed van bemesting met dierlijke mest op het voorkomen
van resistente bacteriën in het milieu werd in deze eerdere studie alleen
in een pilot onderzocht. Dit rapport heeft tot doel structurele metingen
(“nulmetingen”) uit te voeren van de concentraties van resistente
bacteriën, residuen van antibiotica en resistentiegenen in dierlijke mest
en de emissies naar het milieu te kwantificeren.

1.2

Doel
Doel van dit project is om de concentraties van antibioticumresistente
bacteriën, antibioticaresistentiegenen en residuen van antibiotica in
mest van landbouwhuisdieren te bepalen (nulmetingen), en de totale
stromen te kwantificeren die met dierlijke mest het milieu bereiken.

1.3

Aanpak
Metingen geven inzicht in welke mate ABR (resistente bacteriën,
resistentiegenen en antibioticaresiduen) momenteel in dierlijke mest
vóórkomen. De nulmetingen in deze studie werden uitgevoerd in mest
van verschillende landbouwhuisdieren, en specifiek in mest na opslag op
de boerderij, zoals gebruikt wordt voor bemesting van landbouwgrond.
In combinatie met de totale hoeveelheden mest kunnen deze resultaten
geëxtrapoleerd worden naar schattingen over de totale hoeveelheden
ABR die jaarlijks met mest op het milieu worden geloosd. Deze kunnen
vervolgens vergeleken worden met de totale hoeveelheden die met
menselijk afvalwater het milieu bereiken.
De resistente bacteriën, resistentiegenen en antibioticaresiduen
verspreiden zich, nadat de mest is uitgereden over het land, naar de
bodem, het grondwater en naar oppervlaktewater. Daarnaast kunnen ze
worden afgebroken of geïnactiveerd worden. Voor de humane
blootstelling zijn vooral de emissies naar het oppervlaktewater relevant.
Daarom wordt de stand van de literatuur betreffende de afspoeling van
bacteriën vanuit mest naar oppervlaktewater beschreven.

Pagina 13 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

1.4

Achtergrond

1.4.1

Antibioticaresistentie in mest
Het gebruik van antibiotica in de veeteelt daalt sinds 2010, het jaar
waarin concrete doelen voor de reductie van het antibioticagebruik in de
veehouderij vastgesteld werden. Ten opzichte van 2009 is het totale
gebruik in de vier grote diersectoren inmiddels (2017) met 38-72%
afgenomen, en ook het specifieke gebruik van derde keuze middelen is
gereduceerd.
Na behandeling van dieren met antibiotica worden meestal meer dan
10% en voor sommige antibiotica tot 90% van de toegediende
hoeveelheden uitgescheiden. De concentraties van antibiotica in dierlijke
mest kunnen voor enkele antibiotica (sulfonamiden en tetracyclinen) in
de orde van grootte van mg/kg liggen (Heuer et al. 2011, Masse et al.
2014). Dit geldt ook voor Nederlandse fecesmonsters, zoals in monsters
van kalveren en varkens (Berendsen et al. 2015). Andere antibiotica,
zoals beta lactams en macroliden, zijn relatief snel afbreekbaar tijdens
mestopslag (Schmitt et al. 2017b).
Terwijl het voorkomen van bijzonder resistente micro-organismen
(BRMO) in dierlijke feces incidenteel wordt onderzocht, bleek uit een in
2014 uitgevoerde kennissynthese (Huijbers et al. 2015) dat er geen
literatuur beschikbaar was over de aanwezigheid en concentraties van
ABR in mest op het moment dat het uitgereden wordt over land.
Het voorkomen van antibioticaresistentiegenen in dierlijke feces en
dierlijke mest is relatief goed onderzocht, voor een deel ook in mest op
het moment van uitrijden. Ook werd herhaaldelijk gevonden dat
bemesting tot een (tijdelijke) verhoging van het niveau van
resistentiegenen in bemeste gronden leidt (Chee-Sanford et al. 2009,
Heuer et al. 2011, Xie et al. 2018).

Pagina 14 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

2

Methoden

2.1

Monstername
De monstername was gericht op dierlijke mest van verschillende
diersoorten zoals gebruikt voor verwerking of bemesting van
landbouwgrond, dus na opslag op de producerende veehouderijen. De
monstername werd daartoe uitgevoerd bij mestverwerkingsinstallaties
direct na aanvoer van de mest. De monsters werden gekoeld bewaard
en naar het laboratorium getransporteerd en binnen 24 uur
geanalyseerd.
De samenstelling van de monsters is weergegeven in Tabel 1.
Tabel 1. Mestmonsters genomen in 2017.

Diersoort

Aantal

Leghennen
Kuikens
Kalveren – wit
Kalveren – rose
Rundvee
Zeugen
Totaal

12
10
10
10
14
20
76

Voor de analyses van de vrachten van ESBL-EC in mest en voor de
analyse van residuen werden de hier verkregen resultaten gecombineerd
met resultaten van vergelijkbare mestmonsters onderzocht in
2013/2014 en 2016 (Schmitt et al. 2017). De reden daarvoor is dat het
aantal monsters van een specifieke diersoort in de meeste gevallen klein
is, wat tot onzekerheden in de schattingen van prevalenties van
resistente bacteriën leidt.
De concentraties van resistentiegenen en antibioticaresiduen werden in
de monsters genoemd in Tabel 1 bepaald, en ook in 24 monsters die in
2016 genomen werden (Schmitt et al. 2017).
2.2

Analyse van ESBL-EC en E. coli in mest
Drijfmest monsters werden 1:1 verdund in gebufferd pepton water
(BPW) in een filterzak en vervolgens gehomogeniseerd met behulp van
een Pulsifier®. Droge mest werd 1:1 of 1:2 keer verdund met BPW in
een potje (afhankelijk van hoe droog het was), en gemengd met behulp
van een steriele lepel. Vervolgens werd hiervan een 10x verdunning
gemaakt in een filterzak in BPW, en werd dit gehomogeniseerd met
behulp van een Pulsifier®. Van de gehomogeniseerde mest werd
vervolgens een 10-voudige verdunningsreeks gemaakt in peptonfysiologisch zout (PFZ). Hiervan werd 100 µl van een 10-1 tot 10-4
verdunning uitgespateld op ‘tryptone bile X-glucuronide’ (TBX) agar voor
de isolatie van E. coli, en 100 µl en 1 ml (in drie porties van 333 ul) van
de 1:1 (drijfmest) of 10-1 (droge mest) verdunning op ChromID® ESBL
agar voor de isolatie van ESBL-EC en op TBX agar aangevuld met
Pagina 15 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

1 µg/ml cefotaxime (CTX) voor de isolatie van AmpC en ESBL-EC.
Tenslotte werd 20g gehomogeniseerde mest (drijfmest) of 10 g pure
droge mest opgenomen in BPW aangevuld met 1 μg/ml CTX voor
ophoping van ESBL-en AmpC producerende E. coli. Kweken werden 4
uur bebroed bij 37°C gevolgd door 18-24 uur bij 44°C. Daarna werden
de verdachte kolonies geteld voor het bepalen van de concentraties.
Als de ‘directe’ kweken negatief waren (detectiegrens 1,8 kve/g voor
drijfmest en 10,5 kve/g voor droge mest) werden de ophopingen
afgeënt op TBX/CTX en ESBL-chromID, en 18-24 uur gekweekt bij 37°C.
Indien monsters negatief waren in de directe kweek maar positief in de
ophoping wil dat zeggen dat de hoeveelheid bacteriën < 1,8 of 10,5
kve/g was, maar meer dan 0,1 kve/g.
Omdat ESBL-EC op zowel TBX/CTX platen alsook op ChromID brilliance
platen worden gevonden en omdat TBX/CTX platen ernaast ook AmpCproducerende E.coli aantonen, werd het maximum van de gemeten
concentraties op TBX/CTX en ChromID ESBL platen als concentratie van
ESBL/AmpC in het monster gedefineerd.
De gegevens werden aangevuld met data zoals gerapporteerd in
(Schmitt et al. 2017). In 2016 werd dezelfde methode gebruikt als hier
gerapporteerd, in 2013/2014 werd een vergelijkbare methode gebruikt
maar werd in plaats van TBX/CTX agar BECSA/TBX agar gebruikt.
Tellingen en monstervolumes van de analyse op E. coli en ESBL-EC
werden in Mathematica (versie 11.1.0.0, Wolfram Inc, Champaign,
Illinois) ingelezen en bewerkt. De ESBL analyses omvatten twee
experimentele methodes (gebaseerd op ESBL Brilliance platen; of op
platen met toevoeging van cefotaxime). De hoogste telling van ESBL-EC
op een van de twee soorten platen werd als telling van ESBL-EC
gebruikt.
Als in een monster van 2016 of 2017 geen ESBL-EC werd gedetecteerd,
bedroeg het monstervolume dat van de plaattelling en de ophoping
tezamen. Indien de ophoping ESBL-EC positief was maar niet de directe
tellingen, werd aangenomen dat er 1 kolonievormende eenheid in het
monstervolume zat (dit is een onderschatting van de echte
concentratie).
De volgende berekeningen werden per mestcategorie (melkvee,
kalveren, varkens, leghennen en kuikens) uitgevoerd:
1. Het aantal monsters werd geteld.
2. Het percentage positieve monsters werd berekend uit het aantal
ESBL-EC positieve monsters gedeeld door het aantal E. coli
positieve monsters en vermenigvuldigd met een factor honderd.
3. Rekenkundig en geometrische gemiddelde, de mediane en
maximale concentraties werden berekend uit de concentraties
per monster (telling gedeeld door volume).
4. Aangenomen dat de bacteriën per monster-suspensie homogeen
verdeeld zijn, zijn de concentraties tussen monsters met volumes
V1…VN Gammaverdeeld met parameter r en λ en de
bacterietellingen negatief binomiaal verdeeld met parameters r
en 1/(1+λVi) (Teunis et al. 2009). Schattingen van de waarden
voor r en λ staan gedetailleerd beschreven in (Schijven et al.
2014, Schijven et al. 2011). Het product rλ is de gemiddelde
waarde van de Gammaverdeling en komt ongeveer overeen met
Pagina 16 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

het rekenkundig gemiddelde. Op basis van de Gammaverdeelde
concentraties werden ook 5-percentielen en 95-percentielen
berekend.
5. Op basis van paarsgewijze ratio’s van de concentraties van ESBLEC en E. coli werd een betaverdeling met parameters α en β gefit
(EstimatedDistribution), waarvan een gemiddelde ratio en de 95percentielwaarde werden afgeleid.
2.3

Analyse van resistentiegenen in mest
Mestmonsters werden opgeslagen bij -20°C. Voor DNA extractie werd
gebruikt gemaakt van een gemodificieerd protocol gebaseerd op het
QIAamp Fast DNA 96 stool mini kit protocol (Qiagen, cat. no. 51604),
aangevuld met een bead beating stap, zoals beschreven in (Knudsen et
al. 2016). De DNA werd voor qPCR 100x verdund. qPCR vond plaats op
de genen ermB (macrolide resistentie) en sul1 (sulfonamide resistentie).
De gebruikte primers en reacties zijn samengevat in Tabel 2 en Tabel 3.
De reacties werden uitgevoerd met IQSybrgreen mastermix (Biorad)
onder toevoeging van BSA tot een concentratie van 0.4 ug/ul, en met
gebruik van 2 ul DNA template. Als calibratiecurves werden synthetische
DNA standarden gebruikt.
Tabel 2. Primer sequenties van de gebruikte qPCR reacties.

Gen

Referentie

Naam

Sequentie

ermB

Knapp et al.,
2010

ErmB-F
ErmB-R

AAAACTTACCCGCCATACCA
TTTGGCGTGTTTCATTGCTT

sul1

Pei et al., 2006

Sul1-F
Sul1-R

CGCACCGGAAACATCGCTGCAC
TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG

Tabel 3. qPCR reactie parameter.

Gen

2.4

Reactievolume

Amplificatieprotocol

ermB

Primer
concentratie in
reactie
400 nM

10 ul

95ºC 5 min 40x(95ºC
15s 61ºC 30s) + melting
curve 65ºC-95ºC 0.5/5s

sul1

400 nM

10 ul

95ºC 5 min 40x(95ºC
15s 61ºC 30s) + melting
curve 65ºC-95ºC 0.5/5s

Analyse van residuen van antibiotica in mest
Deze analysen vonden plaats bij Wageningen Food Safety Research
(WFSR, voorheen RIKILT). De gedetailleerde methoden zijn opgenomen
in Annex 5.1. In het kort werd per monster een extractie uitgevoerd. Per
monster werd een parallelmonster met referentiestoffen gespiked, ter
controle van de analyse. In de extracten werden de concentraties
antibiotica door middel van LC-MS/MS bepaald. Voor monsters genomen
in 2016 werden ook antibiotica uit de aminoglycosiden-groep
onderzocht, deze zijn niet onderzocht in de monsters genomen in 2017.
Pagina 17 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

2.5

Berekenen van vrachten
Uit de gemiddelde concentraties van E. coli en ESBL-EC, alsmede hun
95-percentielwaarden, werden per diersoort de vrachten of te wel
jaaremissies berekend. De jaaremissie is het product van concentratie
(aantal bacteriën per g of ml mest) en de jaarlijks geproduceerde mest
(orde van groottes van 1012 g = megaton) voor mest gebruikt op het
eigen bedrijf, en op andere grond in Nederland. De mestproducties
werden ontleend aan (van Leuken et al. 2017).

Pagina 18 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

3

Resultaten

3.1

Prevalentie en concentraties van ESBL-EC en E. coli in mest
In nagenoeg alle monsters werden E. coli aangetroffen (in de meetseries
van 2017 werd in een leghenmonster geen E. coli gedetecteerd, in de
eerdere jaren in een leghenmonster en een kuikenmonster). Indien geen
E. coli kan worden aangetoond, wordt ervan uitgegaan dat het monster
niet valide is.
De prevalentie en de concentraties van ESBL-EC is voor alle drie
meetcampagnes samen en voor de monsters genomen in 2016 en 2017
weergegeven in Tabel 4. De aantallen monsters per diersoort en
meetcampagne zijn meestal te laag om uitspraken te doen over een
afname of toename van de prevalenties of concentraties van ESBL-EC in
de tijd, of te wel tussen de meetcampagnes. De analyse focust zich
daarom op de data als een geheel, wat inhoudt dat mogelijke
veranderingen in de tijd (zoals door reductie van het gebruik van
cephalosporines in de laatste jaren) hier niet beschouwd kunnen
worden.
De concentraties toonden grote variatie binnen een mestsoort. Er zijn
duidelijke verschillen tussen de diersoorten: de hoogste prevalenties
worden gevonden in varkens en kalveren (Figuur 1), terwijl de hoogste
concentraties aan ESBL-EC (en E. coli) in ESBL-positieve monsters in
pluimvee (zowel leghennen alsook vleeskuikens) gevonden worden, en
de laagste concentraties in melkvee (Figuur 2).

Figuur 1. Percent ESBL-EC positieve mestmonsters per diersoort (gegevens van
3 meetcampagnes tussen 2013 en 2017 samengevat).

Pagina 19 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Figuur 2. Concentraties van ESBL-producerende E. coli en E. coli in diverse
soorten mestmonsters. Alleen concentraties in positieve monsters zijn getoond.

Pagina 20 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Tabel 4. Prevalentie en concentratie van ESBL-producerende E. coli in
mestmonsters genomen tussen 2013 en 2017. Het gemiddelde geeft bij
benadering het gemiddelde van alle monsters aan, dus inclusief de ESBL-EC
negatieve monsters. De mediaan is de mediaan van de ESBL-EC positieve
monsters. Alle concentraties zijn aangegeven in kve/g mest.Het totale aantal
monsters over alle jaren bedroeg 201.

3.2

Meetcampagne

Diersoort

n

E. coli
positief

ESBLEC
positief
(%)

ESBLEC Mediaan

ESBL-EC max

42
61
90
64

ESBLEC Gemiddelde
(rλ)
3100
8100
530
20

alle jaren
alle jaren
alle jaren
alle jaren

Leghennen
Vleeskuikens
Kalveren
Melkvee –
vloeibaar

21
14
39
55

19
13
39
55

9520
610
60
5,4

37000
98000
12800
423

alle jaren

Melkvee –
droog

2

2

0

Nvt

nvt

Nvt

alle jaren
2016/2017
2016/2017
2016/2017
2016/2017

Varkens
Leghennen
Vleeskuikens
Kalveren
Melkvee vloeibaar

70
18
12
25
14

70
16
11
25
14

83
38
55
96
93

280
1200
420
610
32

23
4395
4980
40
5,5

6500
10560
13500
12800
299

2016/2017

Melkvee vast

2

2

0

nvt

nvt

Nvt

2016/2017

Varkens

30

30

90

570

23

6500

Prevalentie en concentraties van resistentiegenen in mest
In 94 mestmonsters genomen in 2016 en 2017 werden de
resistentiegenen ermB en sul1 onderzocht. Deze werden in alle
mestmonsters (behalve dan twee monsters van leghennenmest)
gevonden. De concentraties verschilden tussen de diersoorten. Ook
werd een grote spreiding in de concentraties binnen de mestsoorten
gevonden. De hoogste concentraties van ermB en sul1 werden in mest
van vleeskuikens gevonden (Figuur 3, Tabel 5).

Pagina 21 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Figuur 3. Concentraties van de antibioticaresistentiegenen ermB en sul1 in
diverse soorten mestmonsters.
Tabel 5. Prevalentie en concentratie van de resistentiegenen sul1 en ermB in
mestmonsters, in log10 kopieën per g mest. Mestsoorten met dezelfde letter in
de kolom ‘significantie’ verschillen statistisch niet significant van elkaar,
mestsoorten met een andere letter wel.

Diersoort

gen

N

Leghennen
Vleeskuiken
Kalveren
Melkvee
Varkens

ermB
ermB
ermB
ermB
ermB

19
11
20
14
30

%
positieve
monsters
100
100
100
100
100

Leghennen
Vleeskuiken
Kalveren
Melkvee
Varkens

sul1
sul1
sul1
sul1
sul1

19
11
20
14
30

89
100
100
100
100

Pagina 22 van 38

Gemiddelde

Mediaan

Min

Max

Significantie

8,8
9,5
9,0
8,5

8,7
9,8
8,9
8,4

7,5
7,5
8,4
8,1

10,7
10,2
9,5
9,3

d
bc
b
a

8,4
9,0
10,5
8,5
7,7
8,2

8,4
8,7
10,7
8,6
7,7
8,2

7,5
7,9
8,3
7,9
7,1
7,5

9,4
10,8
11,6
9,3
8,4
9,0

ac
ac
a
bc
d
d

RIVM Briefrapport 2019-0112

3.3

Prevalentie en concentraties van antibiotica in mest
In 100 mestmonsters genomen in 2016 en 2017 werden antibiotica
bepaald. Enkele antibiotica werden in veel monsters aangetroffen,
waaronder tetracyclines (oxytetracycline, tetracycline en doxycycline),
sulfonamides (sulfadiazine en sulfadimidine) en macroliden (tilmicosin,
in kalveren) (Figuur 3, Tabel 5). Ook het fluorochinoloon flumequin werd
relatief vaak gevonden (50% positieve varkensmestmonsters en 92%
positieve kalverenmestmonsters). De concentraties varieerden sterk
binnen een mestsoort en ook tussen de mestsoorten. De meeste
positieve monsters en de hoogste concentraties werden in mest van
kalveren gevonden. In melkvee en varkens werden vooral tetracyclinen
gevonden. In pluimvee was het aantal positieve monsters het laagst.
Beta lactam antibiotica werden niet onderzocht, omdat deze naar
verwachting beneden de detectielimiet liggen, aangezien deze groep
antibiotica onstabiel zijn in mest.

Figuur 4. Concentraties van antibioticaresiduen in mestmonsters van
verschillende diersoorten.

Pagina 23 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Tabel 6. Prevalentie en concentratie van residuen van antibiotica in
mestmonsters, in µg per g mest. Het totale aantal onderzochte monsters was
100. Het gemiddelde, de median, min en max is berekend over alle monsters
met waarnemingen boven het detectielimiet.Het detectielimiet verschilt per
monster en is als bandbreedte aangegeven.

Diersoort

Antibioticum

n

Leg-

Doxycycline
Tylosine
Spiramycin
Tildipirosin
Dihydrostreptomycine
Doxycycline

hennen

Vleeskuiken

Kalveren

Gemiddelde

Mediaan

19
19
19

%
positieve
monsters
11
5
11

1266
400
27

1266
400
27

19

5

47

47

1-100

19
12

5
8

1
1800

1
1800

1-20
3-40

Sulfamethoxazole
Trimethoprim
Ciprofloxacin
Enrofloxacin
Flumequin

12
12
12
12
12

17
25
8
8
25

355
528
270
1500
10

355
650
270
1500
13

190
23

520
910

4

14

1-10
1-40
1-80
1-60
1-5

Spiramycin

12

8

7

7

7

7

1-40

Lincomycin

12

17

164.5

164.5

49

280

1-20

12

8

1

1

1

1

1-20

25

96

2254

1700

11

12000

1-40

25
25
25
25
25

4
88
100
68
52

61
23
2806
19
938

61
24
2000
4.6
23

5
530
1
2

52
7000
65
5100

10-40
2-70
3-40
1-2
1-3

25
25
25
25
25
25
25
25

12
4
44
12
92
12
8
96

3.7
19
3
3
586
7.7
19.5
171

3
19
2
3
143
5
19.5
30.5

1

7

1
3
1
4
18
6

9
4
4000
14
21
2000

1-10
1-15
1-80
1-60
1-5
1-30
3-80
3-40

25
25

20
12

1
1

1
1

1
1

1
1

1-20
1-20

Dihydrostrept
omycine
Oxytetracycline
Chloortetracycline
Tetracycline
Doxycycline
Sulfadiazine
Sulfadimidine
Sulfamethoxa
zole
Marbofloxacin
Ciprofloxacin
Enrofloxacin
Flumequin
Tylosine
Tulathromycin
Tilmicosin
Dihydrostreptomycine
Gentamicine
Pagina 24 van 38

Min

Max

Detectielimiet

32

2500

16

38

3-40
1-30
1-40

RIVM Briefrapport 2019-0112

Diersoort

Antibioticum

n

Melkvee

Neomycine
Oxytetracyclin

Varkens

Tetracycline
Doxycycline
Sulfadiazine
Ciprofloxacin
Flumequin
Lincomycin
Oxytetracyclin

Zeugen

Gemiddelde

Mediaan

Tetracycline
Doxycycline
Sulfadiazine
Sulfadoxine
Trimethoprim
Flumequin
Tildipirosin

25
14
14
14
14
14
14
14
9
9
9
9
9
9
9
9

%
positieve
monsters
20
71
36
29
36
14
36
14
56
11
89
33
11
11
22
11

122
26
8
45
10
6.5
8
2
4053
85
523
198
1
100
3
26

70
19.5
8
51
7
6.5
6
2
48
85
200
3
1
100
3
26

Dihydrostreptomycine

9

56

1

1

9
21
21
21
21
21
21

11
67
43
29
10
10
5

1
51
425
34
2.5
4
2

1
35
160
10.5
2.5
4
2

21
21
21

24
5
19

1
1
25

1
1
25

Neomycine
Oxytetracyclin
Doxycycline
Sulfadiazine
Sulfadoxine
Ciprofloxacin
Flumequin
Dihydrostreptomycine
Gentamicine
Neomycine

Min

Max

Detectielimiet

15
3
7
13
3
4
4
2
23

380
75
11
63
26
9
15
2
20000

7
2

2200
590

100
3

100
3

1

1

1-20

6
15
1
2
4

230
1300
123
3
4

50-100
1-40
3-40
1-2
1-10
1-80
1-5

1

1

1

49

3.4

Vrachten van ABR in mest

3.4.1

Emissies van ESBL-EC met mest naar landbouwgrond
Uit de concentraties van E. coli en ESBL-EC werden jaaremissies
berekend. De jaaremissie is het product van de bacteriënconcentratie en
de jaarlijks geproduceerde mest voor mest gebruikt op het eigen bedrijf,
en op andere grond in Nederland. De mestproducties werden ontleend
aan (van Leuken et al. 2017). De mestproductie varieert per diersoort,
en loopt uiteen tussen 0,15 en 45 megaton per jaar. De emissies van
ESBL-EC liggen voor vleeskuikens, kalveren, en melkvee rond 1015
kve/jaar (Tabel 7), voor vleeskuikens iets lager en voor varkens en
zeugen iets hoger. Door relatief grote verschillen tussen de ESBL-EC
concentraties per monster is de spreiding van deze schattingen groot –
het 95% percentiel ligt ongeveer een factor 10 hoger dan het
gemiddelde.

Pagina 25 van 38

50-100
1-40
2-70
3-40
1-2
1-80
1-5
1-20
1-40
2-70
3-40
1-2
1-10
1-40
1-5
1-100

1-20
1-20
50-100

RIVM Briefrapport 2019-0112

Tabel 7. Vrachten van ESBL-producerende E. coli die met mest op het land
worden uitgebracht. De vrachten worden aangegeven in kve/jaar, en de
gemiddelde schattingen en het 95% percentiel van de schattingen is
weergegeven.

Diersoort

Mestproductie
3

ESBL-EC vracht
[kve / jaar],
gemiddeld

ESBL-EC vracht
[kve / jaar], 95%
percentiel

Leghennen

0,15

5*10

2*10

Vleeskuikens

0,15

1*10

Kalveren

3,9

2*10

Melkvee

44,9

9*10

Varkens+zeugen

9,7

3*10

6

[10 m /jaar]

3.4.2

14
15

7*10

15

1*10

14

5*10

15

1*10

15
15
16
15
16

Emissies van resistentiegenen met mest naar landbouwgrond
Uit de concentraties van de resistentiegenen werden zoals onder 3.4.1
jaaremissies berekend. De emissies van resistentiegenen liggen voor
kalveren, melkvee en varkens en zeugen rond 1018-1019 kopieën/jaar
(Tabel 8), voor leghennen iets lager. De spreiding van deze schattingen
is groot – het 95% percentiel ligt voor de enkele diersoorten tot
ongeveer een factor 10 hoger dan het gemiddelde, en voor de totale
emissie vanuit alle diersoorten ongeveer een factor 5 hoger. Melkvee
heeft de grootste bijdrage aan de ermB emissies, terwijl vleeskuikens de
grootste bijdrage aan de emissies van sul1 hebben.
Tabel 8. Vrachten van resistentiegenen die met mest op het land worden
uitgebracht. De vrachten worden aangegeven in kopieën/jaar, en de schattingen
gebaseerd op het geometrisch gemiddelde van de concentraties en het 95%
percentiel van de schattingen is weergegeven. Voor zeugen zijn de concentraties
zoals gemeten in varkens aangenomen.

Diersoort

Mestproductie
[10

6

ermB vracht
[kve / jaar],
gemiddeld

3

m /jaar]
Leghennen

0,15

9*10

Vleeskuikens

0,15

5*10

Kalveren

3,9

4*10

Melkvee
Varkens+
zeugen

44,9

1*10

9,7

1*10

3.4.3

16
17
18
19
18

ermB vracht
[kve / jaar],
95%
percentiel
1*10
2*10
8*10
4*10
8*10

18
18
18
19
18

sul1 vracht
[kve / jaar],
gemiddeld

2*10
5*10
1*10
2*10
8*10

sul1 vracht
[kve / jaar],
95%
percentiel

17
18
18
18
17

Emissies van antibiotica met mest naar landbouwgrond
Zoals beschreven in 3.3 werden de meeste antibiotica maar in een
fractie van de onderzochte monsters gevonden. Het totale aantal
onderzochte monsters (n=100) was daarnaast lager dan voor de
concentraties van ESBL-EC (n=201), omdat de monsters genomen in
2013 en 2014 niet op antibiotica werden geanalyseerd. Daarom werd de
meetonzekerheid te groot geacht om jaaremissies van antibiotica met
mest te schatten. Meer onderzoek is nodig om hier een inschatting van
te maken.
Pagina 26 van 38

5*10
3*10
5*10
7*10
2*10

18
19
18
18
18

RIVM Briefrapport 2019-0112

3.4.4

Afspoeling van bacteriën en resistentiegenen van landbouwground naar
oppervlaktewater
De totale vrachten van ESBL-EC en van resistentiegenen geven de
hoeveelheid ABR aan die via mest het Nederlandse milieu bereikt. Deze
vrachten kunnen vervolgens worden vergeleken met de vrachten die
vanuit humane ontlasting met afvalwater het oppervlaktewater en
daarmee het Nederlandse milieu bereiken.
Landbouwgrond en oppervlaktewater zijn echter niet direct te
vergelijken wat betreft de menselijke blootstelling aan ABR. In het
algemeen zijn de volgende routes van humane blootstelling aan ABR in
het milieu mogelijk:
- Via zwemmen in officiële zwemwaterlocaties die beïnvloedt zijn
door humaan afvalwater of afspoeling van bemeste akkers of
graslanden;
- Via contact met oppervlaktewater in niet-officiële
zwemwaterlocaties (tijdens kanoën of andere vormen van
recreatie of andersoortig contact), die beïnvloedt zijn door
humaan afvalwater of afspoeling van bemeste akkers of
graslanden;
- Via aerosolisatie van bacteriën en opname door inhalatie in
nabijheid van bemeste landbouwgronden.
Het milieu kan daarnaast ook bij transmissie via voedsel een rol spelen,
bijvoorbeeld via vlees, indien landbouwhuisdieren contact met
oppervlaktewater hebben, of met groente, indien oppervlaktewater voor
irrigatie wordt gebruikt.
Nagenoeg alle van deze routes lopen via oppervlaktewater, behalve dan
aerosolisatie van bacteriën uit bemeste akkers. Daarom is niet alleen de
totale emissie van ABR naar het milieu van belang, maar ook de
hoeveelheid van ABR die via mest in oppervlaktewater terecht kan
komen.
Op de schaal van Nederland is op dit moment nog geen goede
inschatting mogelijk van het percentage resistente bacteriën die via
mest in oppervlaktewater terechtkomt. De reden daarvoor is dat de
afspoeling van bacteriën uit mest naar oppervlaktewater een complex
proces is en sterk afhangt van lokale omstandigheden (Blaustein et al.
2015, Cho et al. 2016). Deze omstandigheden omvatten bijvoorbeeld de
hoeveelheid regenval, het bodemtype, de helling van het terrein, de
temperatuur, en de tijd tussen bemesting en afspoeling waarin
inactivatie van de bacteriën op kan treden. Ook zijn er nagenoeg geen
gegevens over resistente bacteriën beschikbaar, maar vooral over
bacteriën van fecale oorsprong in het algemeen.
Om een indruk van de orde van grootte van de afspoeling van fecale
bacteriën naar oppervlaktewater te krijgen, worden een aantal studies
die deelaspecten van de keten van bemesting naar afspoeling naar
oppervlaktewater onderzocht, beneden samengevat.

3.4.4.1

Vrijzetting van bacteriën uit mest en invloed van neerslag
In principe vindt vrijzetting van bacteriën uit mest pas plaats indien
bemesting heeft plaatsgevonden en indien daarna neerslag valt. In een
Pagina 27 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

metaanalyse van de beschikbare studies schat Blaustein et al. (2015)
het percentage E. coli dat uit vloeibare mest vrijgezet kan worden. Dit is
afhankelijk van de neerslag: Bij 20 mm neerslag is dat <1%, bij 60 mm
neerslag werd 30% van de totale E. coli vrijgezet. In Nederland wordt
op ongeveer 5 dagen in het jaar een neerslaghoeveelheid van 50 mm
bereikt 1. Voor vaste mest was de hoeveelheid vrijgezette fecale
bacteriën en E. coli minder afhankelijk van de neerslag en varieerde
sterk tussen de studies (tussen 0.01% en ongeveer 50%). Voor
koeienmest van weidedieren vonden Blaustein et al. (2015) en
McDowell et al. (2006) een vrijzetting van enkele % van de E. coli in de
mest tot 50 dagen na applicatie.
Zowel het uitrijden van mest alsook het neerslagpatroon toont pieken.
Deze pieken kunnen tot een sterke variatie van de hoeveelheid
afgespoelde fecale bacteriën in de tijd leiden.
3.4.4.2

Inactivatie van bacteriën
De inactivatie van fecale bacteriën wordt door de temperatuur en het
bodemtype beïnvloedt. De gemiddelde inactivatie van commensale E.
coli in bodem bij 15 graden is ongeveer 0.015 log kve/dag (Franz et al.
2014), in een maand wordt de concentratie van E. coli dus ongeveer
met 0.45 log of te wel ongeveer 50% gereduceerd. De hoeveelheid uit
mest vrijgezette bacteriën wordt dus lager naarmate droogte na de
mestapplicatie langer duurt.

3.4.4.3

Mestapplicatie
Bij applicatie van mest onder de bodemoppervlakte, zoals bij
mestinjectie zoals gebruikt in Nederland, is de vrijzetting van microorganismen uit mest lager dan bij applicatie van mest op de bodem
(Blaustein et al. 2015).

3.4.4.4

Observaties op stroomgebiedsschaal
De bovengenoemde data berusten op onderzoek op relatief kleine schaal
(veldplots). Enkele recente studies uit Nederland en België geven inzicht
in de bijdrage van verschillende bronnen van fecale bacteriën op de
schaal van een rivier of stroomgebied. In het stroomgebied van de
Schelde in België werd de contributie van landbouwgerelateerde
bronnen van fecale indicatorbacteriën aan hand van metingen op
ongeveer 1% van het totaal geschat (Ouattara et al. 2011)– modellering
gaf een vergelijkbaar resultaat (Ouattara et al. 2013). Het merendeel
van de fecale bacteriën werd door afvalwaterzuiveringsinstallaties
uitgestoten en was daarmee van humane oorsprong. In een landelijk
stroomgebied in Nederland werd gevonden dat de bijdrage van
landbouw aan ESBL-EC en fecale indicatorbacteriën gemeten
benedenstrooms de eerste afvalwaterzuivering in het stroomgebied zeer
klein was (Blaak et al. 2018).

3.5

Vrachten van ABR – vergelijking van mest en humaan afvalwater
In eerder onderzoek werd bepaald hoeveel resistente bacteriën en
resistentiegenen met afvalwater vanuit afvalwaterzuiveringsinstallaties
(RWZI), vanuit overstorten en vanuit foutaansluitingen in wijken met
1

https://www.knmi.nl/kennis-en-datacentrum/achtergrond/hoe-vaak-komt-extreme-neerslag-zoals-op-28-julitegenwoordig-voor-en-is-dat-anders-dan-vroeger

Pagina 28 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

gescheiden riolering het oppervlaktewater kunnen bereiken (Blaak et al.
2018, Schmitt et al. 2017a). Bij gescheiden riolering wordt regenwater
door gescheiden leidingsystemen naar het oppervlaktewater geleidt.
Indien er, bijvoorbeeld na reparaties, fouten in de aansluitingen van de
leidingen optreden, is het mogelijk dat het regenwater naar het riool
wordt geleid en het ruwe afvalwater zonder zuivering direct naar het
oppervlaktewater.
Deze schattingen werden gemaakt door de concentraties van ESBL-EC
en van resistentiegenen in gezuiverd afvalwater van 100 RWZIs en in
monsters van overstorten te bepalen en met het volumen van
afvalwater de jaaremissies te berekenen. De totale vracht aan ESBL-EC
en aan resistentiegenen die met mest de bodem bereiken is, de
onnauwkeurigheid van deze schattingen inachtnemend, nagenoeg
identiek aan de vrachten die vanuit RWZIs, overstorten en wijken met
gescheiden riolering het oppervlaktewater bereiken (Tabel 9).
Dit geldt echter waarschijnlijk niet voor de vrachten ESBL-EC die het
Nederlandse oppervlaktewater bereiken. Het gedrag van ABR wijkt
waarschijnlijk niet sterk af van het gedrag van fecale bacteriën in het
algemeen, en ESBL-EC tonen waarschijnlijk hetzelfde gedrag als E. coli.
Zoals in 3.4.4 beschreven, is de vracht van fecale bacteriën die vanuit
mest naar het oppervlaktewater worden afgespoeld of uitgespoeld een
fractie van de vracht van fecale bacteriën in de mest. Hoe groot deze
fractie op nationale schaal is, is op dit moment niet in een algemeen
richtcijfer aan te geven. Onder de meeste omstandigheden zal deze
fractie waarschijnlijk kleiner zijn dan 10%. Afhankelijk van de ligging
van het oppervlaktewater (met of zonder invloed van puntbronnen van
afvalwater zoals RWZIs en overstorten) kan een bijdrage van humane
bronnen überhaupt wel of niet mogelijk zijn. Ook hangt de invloed van
mest op de aanwezigheid van ABR in het oppervlaktewater af van het
tijdstip van uitrijden van mest en het neerslagpatroon (zie 3.4.4.1).
Variaties in het neerslagpatroon kunnen daarom tot grote variaties in de
vrachten leiden. Over het hele jaar genomen en op grotere schaal zullen
humane bronnen de vrachten ABR in het oppervlaktewater
waarschijnlijk domineren.
Tabel 9. Vrachten van ESBL-EC en resistentiegenen die in Nederland met mest
op landbouwgrond worden uitgebracht, en die vanuit afvalwater het
oppervlaktewater bereiken

Bron

ESBL-EC
vracht
[kve / jaar]

Mest totaal

7*10

RWZI

3*10

Overstorten

1*10

Gescheiden
riolering

3*10

Bron

ermB
vracht
[kopieën / jaar]

Deze
studie

2*10

15

1)

2*10

15

2)

3*10

15

2)

8*10

15

19

1*10

19
17
18

sul1
vracht
[kopieën / jaar]

2*10
– 9*10

19

4*10
3*10

Deze
studie

19

20
18

Bron

1)
– 3*10

20

19

1): (Schmitt et al. 2017a), 2): (Blaak et al. 2018)

Pagina 29 van 38

1)
1)

RIVM Briefrapport 2019-0112

Pagina 30 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

4

Discussie

Prevalentie en concentraties van ESBL-EC in mest
ESBL-EC werden in alle onderzochte mestsoorten gevonden. De
prevalentie lag, afhankelijk van de mestsoort, tussen 42% en 90% en
was het hoogst in kalverenmest en varkensmest.
In Nederland werd tot nu toe vooral de prevalentie van ESBL-EC in verse
feces van dieren (genomen op het bedrijf of bij de slacht) onderzocht.
De prevalenties in mest na opslag zijn niet direct te vergelijken met
prevalenties zoals onderzocht in feces van enkele dieren of in
mengmonsters van mest op het bedrijf, omdat de effecten van
mestopslag en van homogenisering van de mest in de mestkelder op de
prevalentie niet goed bekend zijn. Ook verschillen de gebruikte
opwerkmethodes, wat tot verschillen in de gevoeligheid van de detectie
van ESBL-EC kan leiden, en hadden de meeste studies een relatief
kleine omvang.
De prevalentie van ESBL-EC op bedrijfsniveau is onder ander onderzocht
voor melkvee en bedroeg in 2011 41% (Gonggrijp et al. 2016) en in een
kleinere studie 2014-2015 40% (ESBLAT rapport, 2018). De hier
gevonden prevalentie is iets hoger (64%). Ook de hier onderzochte
kalverenmest had een hogere prevalentie (90%) dan in een
retrospectieve studie op bedrijfsniveau tijdens 2006-2010 (10-39%,
(Hordijk et al. 2013)). In contrast ermee is de hier gevonden prevalentie
van vleeskuikens (61%) lager dan in studies uit 2013 en 2016 (100% en
nagenoeg 100%, (ESBLAT rapport, 2018)), misschien veroorzaakt door
de relatief droge condities tijdens opslag van vleeskuikenmest.
Er zijn zeer weinig gegevens over de concentraties van ESBL-EC in
dierlijke mest beschikbaar. Hier werd de hoogste ESBL-EC concentratie
gevonden in mest van leghennen, en de laagste concentratie in mest
van melkvee. In mest van leghennen was ook de concentratie aan E.
coli beduidend hoger dan in de andere mestsoorten. De ESBL-EC
concentraties binnen een mestsoort tonen grote variaties.
Prevalentie en concentraties van antibioticaresiduen en resistentiegenen
in mest
In mestmonsters werden vooral residuen van relatief persistente
antibiotica gevonden, zoals tetracyclines, sulfonamides en
fluorochinolonen. Dit stemt overeen met resultaten van metingen van
residuen in feces van varkens en melkvee (Berendsen et al. 2015). De
aanwezigheid van fluorochinolonen in 92% van de
kalverenmestmonsters (maar ook in 20-30% van de mestmonsters van
vleeskippen, varkens en melkvee) is hoger dan verwacht, aangezien
deze derde keuze middelen in Nederland zeer beperkt ingezet worden
(Stichting Diergeneesmiddelenautoriteit 2017).
De concentraties van de resistentiegenen ermB en sul1 die in
Nederlandse mestmonsters werden gevonden komen grofweg overeen
met andere internationale metingen. Bijvoorbeeld vonden Garder et al.
en Luby et al. (Garder et al. 2014, Luby et al. 2016) concentraties in
Pagina 31 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

varkensmest in Iowa van 108-1012 kopieën per g en daarmee
vergelijkbare concentraties als in Nederland. In Chinese (verse)
mestmonsters werden de hoogste concentraties ermB en sul1 in
pluimveemest gevonden en de laagste in runderen (Mu et al. 2015), in
overeenstemming met de hier gerapporteerde bevindingen.
Vrachten van ESBL-EC en resistentiegenen
De vrachten van ESBL-EC en resistentiegenen die met mest
landbouwgrond bereiken werd berekend uit de mestproductie en uit de
gevonden concentraties van ESBL-EC en resistentiegenen. Vrachten van
antibioticaresiduen konden, vanwege de grote spreiding in gemeten
concentraties en het grote aantal monsters waarin bepaalde
antibioticaresiduen niet konden worden aangetoond, niet met voldoende
betrouwbaarheid worden berekend.
Ondanks de grote verschillen in mestproductie per mestsoort dragen
nagenoeg alle mestsoorten bij aan de totale vracht. Terwijl de hoogste
aantallen ESBL-EC door uitbrengen van kalveren- en varkensmest het
milieu bereiken, draagt mest van vleeskuikens en melkvee voornamelijk
bij aan de emissies van de resistentiegenen sul1 en ermB. Kalverenmest
toont de hoogste prevalenties en concentraties aan antibioticaresiduen.
De totale vrachten die met mest het milieu bereiken zijn ongeveer even
groot als de totale vrachten die met afvalwater het oppervlaktewater
bereiken. Geen van deze beide bronnen is dus dominant.
De concentratie van ABR in oppervlaktewater is voor de menselijke
blootstelling aan ABR waarschijnlijk belangrijker dan de emissies van
ABR naar bemeste landbouwgrond, omdat de belangrijkste potentiele
blootstellingsroutes via water verlopen (zoals zwemmen of watersport in
officieel en niet-officieel zwemwater). De concentraties en vrachten van
ABR in oppervlaktewater, die door afspoeling en uitspoeling van
bemeste grond afkomstig zijn, zijn niet eenvoudig op een landelijke
schaal te bepalen. In het algemeen zullen de ABR-vrachten die vanuit
mest het oppervlaktewater bereiken echter substantieel lager zijn dan
de vrachten die op de grond worden gebracht. Redenen daarvoor zijn
onder andere de beperkte vrijzetting van bacteriën uit mest onder droge
omstandigheden, en de inactivatie van microorganismen na uitrijden
van mest, zo blijkt uit studies met niet-resistente bacteriën. Op een
landelijke schaal zijn daarom emissies van ABR met afvalwater
waarschijnlijk van groter belang voor de menselijke blootstelling dan
emissies van ABR met mest.
Bij deze conclusies moet ook de onzekerheid van de
vrachtenschattingen mee worden gewogen: Omdat het aantal monsters
per mestsoort relatief laag is, en omdat er grote spreidingen in de
concentraties van ESBL-EC en resistentiegenen binnen een mestsoort
werden gevonden, hebben de schattingen van de vrachten een relatief
grote meetonzekerheid.

Pagina 32 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

5

Conclusies

1. Dierlijke mest bevat na opslag op de boerderij zowel ESBL-EC
alsook resistentiegenen en residuen van antibiotica. Mest is
daarmee een bron van waaruit ABR in het Nederlandse milieu
terecht komt. De prevalenties en concentraties van ESBL-EC,
resistentiegenen en residuen hangen af van de mestsoort, maar
tonen ook binnen een mestsoort grote variaties.
2. Alle verschillende mestsoorten dragen bij aan de totale vrachten
aan resistente bacteriën, resistentiegenen en antibiotica die op
landbouwgrond terecht komen. Er is geen mestsoort die het gros
van de emissies van zowel ESBL-EC, alsook van resistentiegenen
en residuen van antibiotica veroorzaakt.
3. De totale vracht aan ABR die met mest Nederlandse
landbouwgrond bereikt is vergelijkbaar met de totale vracht die
met afvalwater het oppervlaktewater bereikt. Voor de humane
blootstelling is ABR in oppervlaktewater van grotere relevantie
dan ABR op landbouwgrond. De totale vracht die vanuit mest in
het oppervlaktewater terechtkomt, is waarschijnlijk beduidend
kleiner dan de vracht vanuit afvalwater.

Pagina 33 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Pagina 34 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

6

Annex

6.1

Analyse van antibioticaresiduen

6.1.1

Analysis of tetracyclines, sulfonamides, macrolides and quinolones
Analysis of tetracyclines, sulfonamides, macrolides and quinolones were
performed as in Berendsen 2015, with an extraction that was optimized
during the course of the analyses (Jansen et al. 2019).

6.1.2

Analysis of aminoglycosides
Analysis of aminoglycosides was performed as in (Bello Gonzalez et al.
2015), with adaptations as summarized in the following paragraphs:
Sample pre-treatment
Two 2 gram portions of each sample of manure were weighed into
separate 50 mL tubes, after which internal standards were added. To
one of these portions aminoglycosides were added at a level of 100
μg/kg. Twenty mL of extraction liquid (10 mM KH2PO4 with 0.4 mM
EDTA and 2% TCA) were added, samples were mixed by means of a
vortex and shaken head-over-head for 30 min. The extract was
centrifuged (15 min, 4600 g). The supernatant was brought to pH 7.67.9 and centrifuged (15 min, 4600 g). The complete extract was
transferred to a conditioned CBX cartridge, followed by washing with 4
mL of water and drying. The aminoglycosides were eluted with 3 mL
acetic acid (10% in MeOH). The eluate was dried at 60°C, evaporated
under N2 and taken up in 400 μL HFBA (0.065%).
LC-MS / MS
The following gradient was applied: 0-0.5 min, 0% B; 0.5-5 min, linear
increase to 45% B; 5-8 min, linear increase to 60% B; 8-10 min, linear
increase to 100% B. The injection volume was 40 μL. Detection was
carried out by a Waters (Milford, MA, USA) Quattro Ultima mass
spectrometer in positive electrospray ionization (ESI) mode. The
parameters used were: capillary voltage, 2.7 kV; desolvation
temperature, 500 ° C; source temperature, 120 ° C; cone gas, 150 L/h
and desolvation gas 550 L/h.

Pagina 35 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Pagina 36 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

7

Referenties

(2018) ESBL-Attributieanalyse. Mevius, D., Heederik, D. and van Duijkeren, E.
(eds), De Stichting TKI Agri&Food (TKI).
Bello Gonzalez, T.d.J., Zuidema, T., Bor, G., Smidt, H. and van Passel, M.W.
(2015) Study of the Aminoglycoside Subsistence Phenotype of Bacteria
Residing in the Gut of Humans and Zoo Animals. Front Microbiol 6, 1550.
Berendsen, B.J.A., Wegh, R.S., Memelink, J., Zuidema, T. and Stolker, L.A.M.
(2015) The analysis of animal faeces as a tool to monitor antibiotic usage.
Talanta 132, 258-268.
Blaak, H., Schilperoort, R. and Schmitt, H. (2018) Rol van afvalwater bij
verspreiding antibioticaresistentie. Rioned, S.S. (ed), STOWA / Stichting
Rioned.
Blaustein, R.A., Pachepsky, Y.A., Shelton, D.R. and Hill, R.L. (2015) Release
and Removal of Microorganisms from Land-Deposited Animal Waste and
Animal Manures: A Review of Data and Models. J Environ Qual 44(5),
1338-1354.
Chee-Sanford, J.C., Mackie, R.I., Koike, S., Krapac, I.G., Lin, Y.F., Yannarell,
A.C., Maxwell, S. and Aminov, R.I. (2009) Fate and transport of antibiotic
residues and antibiotic resistance genes following land application of
manure waste. J Environ Qual 38(3), 1086-1108.
Cho, K.H., Pachepsky, Y.A., Oliver, D.M., Muirhead, R.W., Park, Y., Quilliam,
R.S. and Shelton, D.R. (2016) Modeling fate and transport of fecallyderived microorganisms at the watershed scale: State of the science and
future opportunities. Water Res 100, 38-56.
Franz, E., Schijven, J., de Roda Husman, A.M. and Blaak, H. (2014) Metaregression analysis of commensal and pathogenic Escherichia coli survival
in soil and water. Environ Sci Technol 48(12), 6763-6771.
Garder, J.L., Moorman, T.B. and Soupir, M.L. (2014) Transport and persistence
of tylosin-resistant enterococci, genes, and tylosin in soil and drainage
water from fields receiving Swine manure. J Environ Qual 43(4), 14841493.
Gonggrijp, M.a., Santman-Berends, I.M.G.A., Heuvelink, A.E., Buter, G.J., van
Schaik, G., Hage, J.J. and Lam, T.J.G.M. (2016) Prevalence and risk factors
for extended-spectrum β-lactamase- and AmpC-producing Escherichia coli
in dairy farms. Journal of Dairy Science 99(11), 9001-9013.
Heuer, H., Schmitt, H. and Smalla, K. (2011) Antibiotic resistance gene spread
due to manure application on agricultural fields. Curr Opin Microbiol 14(3),
236-243.
Hordijk, J., Wagenaar, J.A., van de Giessen, A., Dierikx, C., van EssenZandbergen, A., Veldman, K., Kant, A. and Mevius, D. (2013) Increasing
prevalence and diversity of ESBL/AmpC-type beta-lactamase genes in
Escherichia coli isolated from veal calves from 1997 to 2010. J Antimicrob
Chemother 68(9), 1970-1973.
Huijbers, P.M., Blaak, H., de Jong, M.C., Graat, E.A., Vandenbroucke-Grauls,
C.M. and de Roda Husman, A.M. (2015) Role of the Environment in the
Transmission of Antimicrobial Resistance to Humans: A Review. Environ Sci
Technol 49(20), 11993-12004.
Jansen, L.J.M., van de Schans, M.G.M., de Boer, D., Bongers, I.E.A., Schmitt,
H., Hoeksma, P. and Berendsen, B.J.A. (2019) A new extraction procedure
to abate the burden of non-extractable antibiotic residues in manure.
Chemosphere 224, 544-553.
Pagina 37 van 38

RIVM Briefrapport 2019-0112

Knudsen, B., Bergmark, L., Munk, P., Lukjancenko, O., Priemé, A., Aarestrup,
F. and Pamp, S. (2016) Impact of Sample Type and DNA Isolation
Procedure on Genomic Inference of Microbiome Composition. mSystems
1(5).
Luby, E.M., Moorman, T.B. and Soupir, M.L. (2016) Fate and transport of
tylosin-resistant bacteria and macrolide resistance genes in artificially
drained agricultural fields receiving swine manure. Sci Total Environ 550,
1126-1133.
Masse, D.I., Saady, N.M. and Gilbert, Y. (2014) Potential of Biological Processes
to Eliminate Antibiotics in Livestock Manure: An Overview. Animals (Basel)
4(2), 146-163.
McDowell, R.W., Muirhead, R.W. and Monaghan, R.M. (2006) Nutrient,
Sediment, and Bacterial Losses in Overland Flow from Pasture and
Cropping Soils Following Cattle Dung Deposition. Communications in Soil
Science and Plant Analysis 37(1-2), 93-108.
Mu, Q., Li, J., Sun, Y., Mao, D., Wang, Q. and Luo, Y. (2015) Occurrence of
sulfonamide-, tetracycline-, plasmid-mediated quinolone- and macrolideresistance genes in livestock feedlots in Northern China. Environ Sci Pollut
Res Int 22(9), 6932-6940.
Ouattara, N.K., de Brauwere, A., Billen, G. and Servais, P. (2013) Modelling
faecal contamination in the Scheldt drainage network. Journal of Marine
Systems 128, 77-88.
Ouattara, N.K., Passerat, J. and Servais, P. (2011) Faecal contamination of
water and sediment in the rivers of the Scheldt drainage network. Environ
Monit Assess 183, 243-257.
Schijven, J.F., Rutjes, S.A., Smeets, P. and Teunis, P.F. (2014) QMRAspot: a
tool for quantitative microbial risk assessment for drinking water - Manual
QMRAspot version 2.0. , RIVM, Bilthoven.
Schijven, J.F., Teunis, P.F., Rutjes, S.A., Bouwknegt, M. and de Roda Husman,
A.M. (2011) QMRAspot: a tool for Quantitative Microbial Risk Assessment
from surface water to potable water. Water Res 45(17), 5564-5576.
Schmitt, H., Blaak, H., Kemper, M., Van Passel, M., Hierink, F., Van Leuken, J.,
De Roda Husman, A.M., van der Grinten, E., Rutgers, M., Schijven, J., de
Man, H., Hoeksma, P. and Zuidema, T. (2017a) Bronnen van
antibioticaresistentie in het milieu en mogelijke maatregelen. RIVM rapport
2017-0058.
Schmitt, H., ter Laak, T. and Duis, K. (2017b) Development and dissemination
of antibiotic resistance in the environment under environmentally relevant
concentrations of antibiotics and its risk assessment, UBA.
Stichting Diergeneesmiddelenautoriteit (2017) Het gebruik van antibiotica bij
landbouwhuisdieren in 2017, Stichting Diergeneesmiddelenautoriteit.
Teunis, P.F., Rutjes, S.A., Westrell, T. and de Roda Husman, A.M. (2009)
Characterization of drinking water treatment for virus risk assessment.
Water Res 43(2), 395-404.
van Leuken, J.P.G., Hoeksma, P., Nijsten, D.R.E., Schijven, J.F., Schmitt, H.
and de Roda Husman, A.M. (2017) Verkenning van de microbiologische
risico's van mest voor de gezondheid: Op basis van een systematisch
literatuuronderzoek. RIVM (ed), RIVM, Bilthoven.
Xie, W.Y., Shen, Q. and Zhao, F.J. (2018) Antibiotics and antibiotic resistance
from animal manures to soil: a review. European Journal of Soil Science
69(1), 181-195.

Pagina 38 van 38

Contra-expertise op bepalingen van
radioactiviteit van afvalwater
en ventilatielucht van de kernenergiecentrale Borssele
Periode 2013
RIVM Briefrapport 2015-0010
P.J.M. Kwakman | R.M.W. Overwater

RIVM
De zorg voor morgen begint vandaag