Source: Basiswettenbestand
URL: BWBR0011393/2004-10-10_0/xml/BWBR0011393_2004-10-10_0.xml

Document:
Besluit Protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999
  Besluit Protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999
  
    
  Het Bestuur van het Productschap Pluimvee en Eieren heeft,
  
    gelet op de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999,
  
  
    op 31 mei 2000 vastgesteld het navolgende
    BESLUIT
  

    
      
  
    Artikel
    1
  
  Dit besluit neemt de terminologie, als omschreven in artikel 1 van de Verordening hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999, over.
20013120-07-200131-05-2000PPE 5020013120-07-200131-05-2000PPE 5021-07-2001
      
  
    Artikel
    2
  
  Laboratoria die erkend willen worden, als bedoeld in artikel 3, vijfde lid, van de verordening, dienen te voldoen aan de in Bijlage I opgenomen erkenningsvoorwaarden.
  Erkende laboratoria dienen de analyse van de monsters uit te voeren overeenkomstig de voorschriften opgenomen in Bijlagen II, III, IV en V.
20013120-07-200131-05-2000PPE 5020013120-07-200131-05-2000PPE 5021-07-2001
      
  
    Artikel
    3
  
  
    1
    Dit besluit kan worden aangehaald als "Besluit Protocollen hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999".
  
  
    2
    Dit besluit treedt in werking met ingang van de dag van zijn publicatie in het Verordeningenblad Bedrijfsorganisatie.
  
20013120-07-200131-05-2000PPE 5020013120-07-200131-05-2000PPE 5021-07-2001
    
    
  
    
      Voor het bestuur,
      
        ir. R.J.
        Tazelaar
      
      voorzitter
    
    
      
        drs. S.B.M.
        Jongerius
      
      secretaris
    
  
20013120-07-200131-05-2000PPE 5020013120-07-200131-05-2000PPE 5021-07-2001
    
  
    Bijlage
    I
    : Erkenningsvoorwaarden voor laboratoria die de analyses van monsters op de aan- of afwezigheid van Salmonella en/of Campylobacter uitvoeren.
  
  
    
      A.
      Sinds 1 juli 2000 dienen de laboratoria de laboratoria geaccrediteerd te zijn voor de door de branche opgestelde analyse methode inzake de bepaling van Salmonella en per 1 januari 2005 voor de bepaling van Campylobacter Dat wil zeggen dat het laboratorium met ingang van deze datum over een accreditatiecertificaat op basis van de norm ISO/IEC 17025 moet beschikken die door de Raad voor Accreditatie te Utrecht (hierna te noemen RvA) wordt verleend. Hieronder dient tenminste de bepaling van Salmonella in de matrix mest volgens de door de branche opgestelde analyse methode te vallen.
    
    
      B.
      Voor laboratoria die in het buitenland zijn gevestigd zal geen Nederlandse accreditatie door de RvA vereist zijn maar een gelijkwaardige erkenning van het betreffende land.
    
    
      C.
      De laboratoria dienen voor de bepaling van Salmonella en Campylobacter gebruik te maken van door de branche opgestelde analyse methodes. De analyse methodes zijn bij dit besluit opgenomen. Aangezien de RvA volledig gevalideerde analysemethoden accrediteert, dienen de branche-methodes van een validatie rapport te worden voorzien. Het Productschap draagt zorg, op basis van het aangeleverde validatierapport, voor de beoordeling van de methode door de RvA inzake zijn geschiktheid voor accreditatie als branchemethode.
    
    
      D.
      Het laboratorium heeft de mogelijkheid tot het gebruik van één van de toegelaten methoden. Er mogen, om te bepalen of het monster al dan niet besmet is met Salmonella, niet meerdere testen naast elkaar toegepast worden. Om verder te kunnen serotyperen dient echter bij toepassing van één van de snelle detectiemethoden een positief monster worden geïsoleerd middels de MSRV-methode.
    
    
      E.
      Indien het laboratorium bij toepassing van een snelle detectiemethode een positieve bepaling wordt gedaan en het monster ten behoeve van de serotypering niet verder geïsoleerd kan worden, moet op het uitslagenformulier hiervan melding worden gemaakt.
    
    
      F.
      Alle laboratoria dienen mee te doen met Salmonella-ringonderzoek, tot nu toe georganiseerd door het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieuhygiëne te Bilthoven (hierna te noemen RIVM). Zodra een ringonderzoek voor Campylobacter is opgezet, dient een laboratorium ook aan dit ringonderzoek mee te doen.
    
    
      G.
      Het laboratorium verstrekt het Productschap elk kwartaal een overzicht waarop is aangegeven hoeveel koppels of hoeveel analyses door het betreffende laboratorium zijn onderzocht respectievelijk zijn uitgevoerd. Tevens geeft het laboratorium aan hoeveel koppels of analyses hiervan positief waren. Voor zover afgesproken met de pluimveehouder/broederij of slachterij zendt het laboratorium op aanvraag de resultaten van analyses door aan het Productschap (bijvoorbeeld Salmonella paratyphi B var. Java)
    
    
      H.
      Jaarlijks moeten de laboratoria monsters Salmonella enteritidis (S.e.) of Salmonella typhimurium (S.t.) opsturen naar het RIVM. Dit ten behoeve van het faagtyperingsonderzoek, dat het RIVM uitvoert in het kader van de EU- Zoönoserapportage.
    
    
      I.
      De serotypering van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium mag door ieder erkend laboratorium worden uitgevoerd. De serotypering van de overige Salmonella serotypen mag uitsluitend uitgevoerd worden door de erkende laboratoria die voor deze verrichting uiterlijk op 1 januari 2005 een erkenning hebben bij de RvA. Het betreft serotypen die op een door het Productschap opgestelde lijst van veel vòòrkomende serotypen in pluimvee staan vermeld. De op deze lijst vermelde serotypen kunnen worden gewijzigd als de in pluimvee/pluimveeproducten vòòrkomende serotypen wijzigen.
    
    
      J.
      De laboratoria die de serotyperingen uitvoeren zijn verplicht:
      
        
          de serotyperingen uit te voeren conform het antigenen schema van Kaufmann White;
        
        
          jaarlijks maximaal 10 isolaten door te sturen naar het RIVM ter serotypering. Dit is een duplo onderzoek om de kwaliteit van het serotyperen te toetsen;
        
        
          deel te nemen aan ringonderzoeken, die de kwaliteit van het serotyperen eveneens testen;
        
        
          isolaten, afkomstig van andere erkende laboratoria die geen serotypering van de typen met uitzondering van S.e. en S.t. kunnen uitvoeren, te analyseren. Hiervoor mogen geen afwijkende tarieven in rekening worden gebracht.
        
      
    
  
20041127-02-200412-02-2004PPE 2220041127-02-200412-02-2004PPE 2229-02-2004
    
  
    Bijlage
     II
    : Analysemethoden voor het aantonen van Salmonella en Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren
  
  Voor het aantonen van Salmonella en/of Campylobacter in pluimvee(vlees) en eieren staat de pluimveesector een aantal analysemethoden ter beschikking, welke goedgekeurd zijn door de Raad voor Accreditatie.
  Het laboratorium kan deze analysemethoden toepassen voor de analyses in het kader van de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij 1999 en de Verordening Hygiënevoorschriften Pluimveeverwerkende industrie 1999. Het laboratorium dient dan wel de betreffende analysemethode onder haar accreditatie van de Raad voor Accreditatie (ISO/IEC 17025) onder te brengen.
  De analysemethoden zijn:
  
    
      1.
      PVE Branchemethode MSRV voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee.
    
    
      2.
      Alternatieve PVE Branchemethode ProbeliaTM PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee.
    
    
      3.
      Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons afkomstig van pluimvee.
    
    
      4.
      PVE Branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante Campylobacter spp. in monsters pluimvee, pluimveeproducten en omgevingsmonsters.
    
    
      5.
      PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van de VIDAS CAM test in pluimveeproducten.
    
  
  
    
      Pve branchemethode msrv voor het aantonen van salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee
    
    
      
        1
        Onderwerp
      
      Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces (mest) en vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De Raad voor Accreditatie heeft de methode goedgekeurd voor de matrix mest, dons, vellen en eindproduct.
    
    
      
        2
        Definities
      
      Salmonella: micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.
      Detectie van Salmonella: bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.
    
    
      
        3
        Principe
      
      Na voorincubatie van de te onderzoeken matrix in een voorophopingsmedium, wordt geënt op een half-vast medium, waarna wordt afgestreken op een selectief isolatiemedium.
    
    
      
        4
        Reagentia en andere materialen
      
      Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn.
      
        Niet-selectief voorophopingsmedium 
        
          
          
          
          
            
              
                
                  gebufferd pepton water
                
              
              
                BPw
              
              
                bijlage 1.1
              
            
          
        
      
      
        Selectief ophopingsmedium 
        
          
          
          
          
            
              
                
                  modified semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium
                
              
              
                MSRV
              
              
                bijlage 1.2
              
            
          
        
      
      
        Selectieve agar 
        
          
          
          
          
            
              
                
                  briljant groen agar
                
              
              
                BGA
              
              
                bijlage 1.3
              
            
          
        
      
      
        Bevestigingsmedia 
        
          
          
          
          
            
              
                
                  ureumagar
                
              
              
                UA
              
              
                bijlage 1.4
              
            
            
              
                
                  triple-sugar-ironagar
                
              
              
                TSI
              
              
                bijlage 1.5
              
            
            
              
                
                  lysine-decarboxylase medium
                
              
              
                LDC
              
              
                bijlage 1.6
              
            
          
        
      
      
        
          Salmonella polyvalent agglutinatie serum
        
        De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn.
      
    
    
      
        5
        Apparatuur en glaswerk
      
      Gebruikelijke apparatuur en glaswerk voor een microbiologisch laboratorium en in het bijzonder de onderstaande:
      
        
          Opmerking:
        
        Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.
        
          
            5.1.
            Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ° C ± 1 ° C
          
          
            5.2.
            Broedstoof voor het bebroeden bij 42 ° C ± 0,5 ° C
          
          
            5.3.
            Waterbad ingesteld op 47 ° C ± 2 ° C
          
          
            5.4.
            Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm.
          
          
            5.5.
            Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.
          
          
            5.6.
            Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm.
          
          
            5.7.
            Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.
          
        
      
    
    
      
        6
        Werkwijze
      
      De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.
      
        
          Voorbehandeling van het monster
        
        Verdun het monster 1:10 in BPw.
        In de volgende tabel1Noot: standaard monsters in 225 ml BPw mag ook uitgevoerd worden. Het gaat er om dat er minimaal een 1: 10 verdunning gemaakt worden. Een ruimere verdunning dan 1: 10 is niet toegestaan. is ter illustratie de relatie tussen de verschillende monsterhoeveelheden en het volume BPw weergegeven:
        
          
            
            
            
            
            
            
              
                
                   aantallen 
                
                
                   (hoeveelheid (circa)) 
                
                
                   BPw 
                
                
                   type monster 
                
              
              
                
                  2x25
                
                
                  swabs
                
                
                  (12,5 gram)
                
                
                  112,5 ml
                
                
                  swabs broederijen
                
              
              
                
                  3x20
                
                
                  swabs
                
                
                  (10 gram)
                
                
                  90
                  ml
                
                
                  swabs stallen
                
              
              
                
                  2x 15
                
                
                  swabs
                
                
                  (7,5 gram)
                
                
                  67,5 ml
                
                
                  swabs
                
              
              
                
                  2
                
                
                  paar
                
                
                  (10 gram)
                
                
                  90
                  ml
                
                
                  overschoentjes
                
              
              
                
                  6x 25
                
                
                  swabs
                
                
                  (12,5 gram)
                
                
                  112,5 ml
                
                
                  swabs
                
              
              
                
                  2x 30
                
                
                  swabs
                
                
                  (15 gram)
                
                
                  135 ml
                
                
                  swabs
                
              
              
                
                  30
                
                
                  swabs
                
                
                  (15 gram)
                
                
                  135 ml
                
                
                  blinde darmmest
                
              
              
                
                  25
                
                
                  gram
                
                
                  (25 gram)
                
                
                  225 ml
                
                
                  dons
                
              
              
                
                  25
                
                
                  gram
                
                
                  (25 gram)
                
                
                  225 ml
                
                
                  eindproduct
                
              
              
                
                  25
                
                
                  gram
                
                
                  (25 gram)
                
                
                  225 ml
                
                
                  vel van de borstkap
                
              
              
                
                  40
                
                
                  stukjes
                
                
                  (60 gram)
                
                
                  540 ml
                
                
                  inlegvellen
                
              
            
          
        
        Incubeer de potten BPw 18 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.
        De potten mogen tussentijds gedurende 2 dagen in de koelkast bewaard worden, deze ‘koudestap’ is mogelijk.
      
      
        
          Beënting en bebroeding
        
        Breng 0,1 mI BPw-cultuur op een MSRV plaat (bij 9 cm platen 3 druppels, met een gezamenlijk volume van 0,1 ml in een driehoek. Incubeer de platen 1 x 24 ± 2 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C. De platen moeten met het deksel van de petrischaal naar boven geïncubeerd worden, aangezien het een half-vast medium is. Niet verdachte of negatieve platen dienen nogmaals 1 x 24 ± 2 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C bebroed te worden. Een verdachte MSRV-plaat vertoont groei in de agar (zwerming vanuit de entingsplaats) en heeft een wit/grijze kleur. Verdachte platen worden afgeënt door aan de rand van de zwermzone met een öse materiaal uit de agar te nemen en daarmee een gedroogde BGA plaat te beënten. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.
      
      
        
          Beoordeling
        
        Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als ‘vermoedelijk positief’ aangemerkt.
      
      
        
          Bevestiging
        
        Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 specifieke kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 specifieke kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur totdat een positief resultaat wordt verkregen. De kolonies worden vanaf de BGA plaat geënt in UA middels het afstrijken op het oppervlak van de agar en in TSI middels ladderen over het schuingestolde oppervlak en een steekenting tot op de bodem van de buis. Beënt tevens een buis LDC door een hoeveelheid koloniemateriaal tegen de wand van de buis net onder het vloeistof oppervlak af te strijken. De buizen worden 24 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C geïncubeerd.
      
      
        
          Opmerking :
        
        Wanneer geen goed losliggende kolonies op de BGA plaat zijn verkregen of bij de aanwezigheid van veel spreidende of overgroeiende stoorflora is het nodig ter zuivering een nieuwe reinstrijk op een gedroogde BGA- of nutriëntenagarplaat te maken. Bij verontreiniging van de Salmonella- kolonie met andere bacteriën wordt een afwijkend biochemisch patroon verkregen. Het is toegestaan om eerst de bevestigingstest met de TSI uit te voeren, en bij een verdachte uitslag door te gaan met ureum en LDC.
        Na incubatie geven voor Salmonella verdachte kolonies de volgende biochemische resultaten:
        
          
            
            
            
            
              
                
                  
                    TSI agar
                  
                
                
                
              
            
            
              
                
                  onderin de buis
                
                
                  - geel
                  - zwart
                  - bellen/scheuren
                
                
                  - glucose positief (100%)
                  - vorming van H2S (91,6%)
                  - gasvorming van glucose (91,9%)
                
              
              
                
                  schuine gedeelte
                
                
                  - rood/onveranderd
                
                
                  - lactose en/of sucrose negatief (resp. 99,2% en 99,5%)
                
              
            
          
        
        
          
            
            
            
            
              
                
                  
                    Ureum agar
                  
                
                
                
              
              
                
                
                  - geen kleuromslag van het medium
                
                
                  - negatief (100%)
                
              
            
          
        
        
          
            
            
            
            
              
                
                  
                    LDC
                  
                
                
                
              
              
                
                
                  - paarse kleur en groei in medium
                
                
                  - positief (94,6%)
                
              
            
          
        
        Het gebruik van biochemische kits (zoals API, Crystal) is ook toegestaan.
        Biochemisch verdachte kolonies dienen serologisch bevestigd te worden met een polyvalent serum. Dit werkvoorschrift is opgenomen in bijlage 3.1.
        De totale beoordeling van biochemische en serologische resultaten is als volgt:
        
          
            
            
            
            
            
              
                
                  
                    Biochemische reacties
                  
                
                
                  
                    Auto-agglutinatietabel
                  
                
                
                  
                    Agglutinatie met serum
                  
                
                
                  
                    Werkwijze / Resultaat
                  
                
              
              
                
                  pos
                
                
                  neg
                
                
                  pos
                
                
                  Salmonella
                
              
              
                
                  pos
                
                
                  neg
                
                
                  neg
                
                
                  RIVM
                
              
              
                
                  pos
                
                
                  pos
                
                
                  --
                
                
                  RIVM
                
              
            
          
        
        Indien een stam alleen biochemisch verdacht is, wordt deze opgestuurd naar het RIVM. Een andere mogelijkheid is het inzetten van een zogenaamde ‘lange bonte rij’ of een biochemische kit. Op het resultaat van het RIVM hoeft niet gewacht te worden, alvorens een uitslag wordt afgegeven.
        Voor de donsmonsters en faecesmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella Enteritidis en Salmonella Typhimurium. (indien nog niet bij pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is het werkvoorschrift opgenomen.
      
    
    
      
        7
        Controle
      
      Voor de eerstelijnscontrole 2Indien een ingangscontrole wordt toegepast per batch, kan de negatieve controle komen te vervallen. van de methode dienen te worden meegenomen:
      
        
          Positieve controle
        
        
          Negatieve controle
        
        
          Blanco controle
        
      
      De eerstelijnscontroles met MSRV platen staan beschreven in bijlage 2.
    
    
      
        8
        Opgave van het resultaat
      
      Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal’ (zie bijlage III) als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol. Bij de uitslag kan tussen haakjes aangegeven worden om hoeveel gram het ongeveer gaat dat is onderzocht.
      Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).
    
    
      
        9
        Bronvermelding
      
      
        
          NEN-EN 12824 Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - horizontale methode voor het aantonen van Salmonella (ISO 6579:1993, gewijzigd).
        
        
          Zee, van der H., E. De Boer, P. Van Netten, 1990, Salmonella isolatie met behulp van MSRV, De Ware (n) chemicus 20: 189-199.
        
        
          Hartman, dr. E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, september 1999
        
      
    
    
      
        Bijlage
         1
        : Samenstelling en bereiding van media en reagentia
      
      
        
          1.1
          Gebufferd pepton water (BPw)
        
        samenstelling:
        
          
            
            
            
              
                
                  pepton
                
                
                  10,0 g
                
              
              
                
                  NaCI
                
                
                  5,0 g
                
              
              
                
                  Na2HP04.12H20
                
                
                  9,0 g
                
              
              
                
                  KH2P04
                
                
                  1,5 g
                
              
              
                
                  water
                
                
                  1000 ml
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).
          
          
            Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 25 ° C.
          
          
            Verdeel het medium over daarvoor geschikte flessen.
          
          
            Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 ° C).
          
        
      
      
        
          1.2
          Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis medium (MSRV)3
        
        oplossing A (basis):
        
          
            
            
            
              
                
                  tryptose
                
                
                  4,59 g
                
              
              
                
                  caseine hydrolysaat
                
                
                  4,59 g
                
              
              
                
                  NaCI
                
                
                  7,34 g
                
              
              
                
                  KH2P04
                
                
                  1,47 g
                
              
              
                
                  MgCl2
                
                
                  10,93 g
                
              
              
                
                  malachietgroen oxalaat
                
                
                  0,037 g
                
              
              
                
                  agar
                
                
                  2,7 g
                
              
              
                
                  gedestilleerd water
                
                
                  1000 ml
                
              
            
          
        
        bereiding
        
          
            Los de ingrediënten op in het water.
          
          
            Breng het mengsel onder voortdurend schudden aan de kook (NIET AUTOCLAVEREN).
          
          
            Stel de pH op 5,2 ± 0,2.
          
          
            Koel het mengsel af tot 50 ° C.
          
        
        oplossing B (novobiocine):
        
          
            Los 10 mg novobiocine op in 2 ml gedestilleerd/demi water.
          
          
            Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie (filter 22 μ m).
          
        
        bereiding MSRV medium:
        
          
            Voeg oplossing B toe aan 500 ml oplossing A.
          
          
            Meng de oplossing.
          
          
            Giet uit in petrischalen en verwijder de luchtbellen.
          
          
            Even aan de lucht drogen om een nat oppervlak te voorkomen.
          
        
      
      
        
          1.3
          BriIjant groen agar (BGA)
        
        oplossing A (basis):
        
          
            
            
            
              
                
                  vleesextract
                
                
                  5,0 g
                
              
              
                
                  pepton
                
                
                  10,0 g
                
              
              
                
                  gistextract
                
                
                  3,0 g
                
              
              
                
                  Na2HP04
                
                
                  1,0 g
                
              
              
                
                  NaH2P04
                
                
                  0,6 g
                
              
              
                
                  agar
                
                
                  12 g tot 18 g1= afhankelijk vande sterkte van de gel.
                
              
              
                
                  water
                
                
                  900 ml
                
              
            
          
          
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Los de ingrediënten op in het water (indien nodig via verhitting).
          
          
            Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,0 ± 0,2 is.
          
          
            Schenk het medium in daarvoor geschikte buizen/flessen.
          
          
            Steriliseer in een autoclaaf (15 min. 121 ° C).
          
        
        oplossing B (suiker/fenol rood oplossing):
        
          
            
            
            
              
                
                  lactose
                
                
                  10,0 g
                
              
              
                
                  sucrose
                
                
                  10,0 g
                
              
              
                
                  fenolrood
                
                
                  0,09 g
                
              
              
                
                  water tot een eindvolume van 100 ml
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Los de componenten op in ± 50 mI water.
          
          
            Vul met water aan tot een eindvolume van 100 ml.
          
          
            Verhit gedurende 20 min. in een waterbad van 70 ° C.
          
          
            Koel af tot 47 ° C ± 1 ° C.
          
          
            Gebruik de oplossing direct.
          
        
        oplossing C (briljant groen oplossing):
        
          
            
            
            
              
                
                  briljant groen
                
                
                  ± 0,5 g
                
              
              
                
                  water
                
                
                  100 ml
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Voeg het briljant groen (concentratie tussen 4,5 mg/l en 6 mg/l) toe aan het water.
          
          
            Bewaar de oplossing tenminste 1 dag in het donker zodat auto-sterilisatie optreedt.
          
        
        bereiding complete medium:
        
          
            
            
            
              
                
                  oplossing A
                
                
                  900 mI
                
              
              
                
                  oplossing B
                
                
                  100 ml
                
              
              
                
                  oplossing C
                
                
                  1 mI
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Voeg, onder aseptische omstandigheden, oplossing C toe aan de (tot 47 ° C ± 1 ° C) afgekoelde oplossing B.
          
          
            Voeg deze oplossing toe aan oplossing A en meng het medium.
          
        
        bereiding van de agar platen:
        
          
            Giet het vers bereide medium in grote (± 40 ml) of in kleine petrischalen (±15 ml).
          
          
            Laat de platen stollen.
          
          
            Droog de platen voor gebruik.
          
        
      
      
        
          1.4
          Ureumagar (UA)
        
        oplossing A (basismedium):
        
          
            
            
            
              
                
                  pepton
                
                
                  1,0 g
                
              
              
                
                  glucose
                
                
                  1,0 g
                
              
              
                
                  NaCI
                
                
                  5,0 g
                
              
              
                
                  KH2P04
                
                
                  2,0 g
                
              
              
                
                  fenolrood
                
                
                  12,0 mg
                
              
              
                
                  agar
                
                
                  12,0 tot 18,0 g1= afhankelijk van de sterkte van de gel
                
              
              
                
                  gedestilleerd water
                
                
                  1000 mI
                
              
            
          
          
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Los de ingrediënten op in het water.
          
          
            Stel de pH op 6,8 ± 0,2 bij 25 ° C en filtreer de oplossing.
          
          
            Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 121 ° C in een autoclaaf.
          
          
            Laat de oplossing afkoelen tot 47 ° C.
          
        
        oplossing B (ureumoplossing):
        
          
            
            
            
              
                
                  ureum
                
                
                  400 g
                
              
              
                
                  gedestilleerd water
                
                
                  1000 ml
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Los de ureum op in het water
          
          
            Steriliseer de oplossing d.m.v. filtratie en controleer de steriliteit.
          
        
        
          
            
            
            
              
                
                  
                    bereiding complete medium :
                
                
              
              
                
                  oplossing A
                
                
                  950 ml
                
              
              
                
                  oplossing B
                
                
                  50 ml
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Voeg oplossing B (ureumoplossing) toe aan oplossing A (basismedium).
          
          
            Verdeel het medium over steriele buizen, per buis 10 ml medium.
          
          
            Laat de buizen stollen zodat een schuin gedeelte ontstaat.
          
        
      
      
        
          1.5
          Triple-sugar-ironagar (TSI)
        
        samenstelling:
        
          
            
            
            
              
                
                  vleesextract
                
                
                  3,0 g
                
              
              
                
                  gistextract
                
                
                  3,0 g
                
              
              
                
                  pepton
                
                
                  20,0 g
                
              
              
                
                  NaCI
                
                
                  5,0 g
                
              
              
                
                  lactose
                
                
                  10,0 g
                
              
              
                
                  sucrose
                
                
                  10,0 g
                
              
              
                
                  glucose
                
                
                  1,0 g
                
              
              
                
                  ijzer (III) citraat
                
                
                  0,3 g
                
              
              
                
                  natriumthiosulfaat
                
                
                  0,3 g
                
              
              
                
                  fenoIrood
                
                
                  0,024 g
                
              
              
                
                  agar
                
                
                  12,0 tot 18,0 g1= afhankelijk van de sterkte van de gel
                
              
              
                
                  gedestilleerd water
                
                
                  1000 mI
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).
          
          
            Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is.
          
          
            Verdeel het medium over buizen, per buis 10 ml medium.
          
          
            Steriliseer de oplossing gedurende 15 min bij 120 ° C in een autoclaaf.
          
          
            Laat de buizen stollen zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, een schuin gedeelte ontstaat.
          
        
      
      
        
          1.6
          Lysine-decarboxylase medium (LDC)
        
        samenstelling:
        
          
            
            
            
              
                
                  1-lysine monohydrochloride
                
                
                  5,0 g
                
              
              
                
                  gistextract
                
                
                  3,0 g
                
              
              
                
                  glucose
                
                
                  1,0 g
                
              
              
                
                  bromocresol purper
                
                
                  0,015 g
                
              
              
                
                  water
                
                
                  1000 ml
                
              
            
          
        
        bereiding:
        
          
            Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting).
          
          
            Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 6,8 ± 0,2 is.
          
          
            Verdeel het medium over smalle reageerbuizen; per buis 5 mI medium.
          
          
            Steriliseer in een autoclaaf (10 min. 121 ° C).
          
        
      
    
    
      
        Bijlage
        2
         : Eerstelijnscontrole met MSRV platen
      
      
        
          Onderwerp
        
        Deze bijlage beschrijft een methode voor de eerstelijnscontrole op de analyse van Salmonella met MSRV.
      
      
        
          Werkwijze
        
        Om de kwaliteit van de geproduceerde media te bewaken, dient iedere dag een controle volgens onderstaand schema te worden uitgevoerd.
        
          
            
            
            
              
                
                  
                    Inoculum:
                  
                
                
                  Kolonie aanstippen met entoogje en afstrijken langs de wand van een buisje met gebufferd peptonwater (BPW). Ca. 24 ± 2 uur bij 37 ° C incuberen in BPw (108 ) en verdunnen tot 103 of commercieel verkrijgbaar bij de IGB Groningen.
                
              
            
          
        
      
      
        
          Controlestam:
        
        
          
        
      
    
  
  
    
      Alternatieve PVE Branchemethode PROBELIA TM PCR voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee Versie 14 november 2002
    
    
      
        1
        Onderwerp
      
      Dit protocol beschrijft een 24-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de PROBELIATM test (Bio-Rad Laboratories) in dons, faeces (mest), vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV.
    
    
      
        2
        Definities
      
      Salmonella : Salmonella spp. , d.w.z. alle typen Salmonella waarvan het DNA aan de hand van de Polymerase Chain Reactie (PCR) wordt aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.
      Detectie van Salmonella : bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.
    
    
      
        3
        Principe
      
      Uit een voorophopingsmedium wordt, na voorincubatie, het DNA van Salmonella geïsoleerd. Vervolgens vindt amplificatie plaats van een voor Salmonella specifieke en gepatenteerde DNA- sequentie, het lagA gen, met behulp van de PCR. Het vermenigvuldigde DNA wordt na hybridisatie op een microtiterplaatstrip aangetoond middels een colorimetrische reactie. Inclusief voorophoping wordt een positieve of negatieve uitslag verkregen binnen 24 uur.
    
    
      
        4
        Reagentia en andere materialen
      
      De PROBELIATMSalmonella test bestaat uit kant-en-klare reagentia, inclusief voorophopingmedium. Het te gebruiken gedestilleerde water moet van analysekwaliteit zijn.
      
        
          
          
          
          
            
              
                Niet-selectief voorophopingsmedium
              
            
            
              
                gebufferd pepton water (BPw)
              
              
                
                  Bio-Rad code 356-4684 (500 g)
                
                [bijlage 1.1]
                of Bio-Rad code 355-4170 (225 ml)
              
            
            
              
                PROBELIA TMSalmonella test
              
            
            
              
                Amplificatie kit
              
              
                
                  Bio-Rad code 357-8000
                
              
              
                [bijlage 1.2]
              
            
            
              
                Detectie kit
              
              
                
                  Bio-Rad code 357-8001
                
              
              
                [bijlage 1.2]
              
            
          
        
      
      De samenstelling en bereiding van media en kits is opgenomen in bijlage 1.
    
    
      
        5
        Apparatuur en verbruiksmaterialen
      
      De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de PROBELIATM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:
      
        
          Opmerking:
        
        Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.
        
          
            5.1
            Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ± 10 C
          
          
            5.2
            Micropipetten (5-50 en 20-200 μl)
          
          
            5.3
            Microcentrifuge voor 1,5 ml centrifugebuisjes (max. 10.000-15.000 rpm)
          
          
            5.4
            Verhittingsblokken of waterbaden ingesteld op 56± 1 °C en 100 ± 1 °C
          
          
            5.5
            Bio-Rad iCycler thermocycler voor PCR
          
          
            5.6
            Bio-Rad microtiterplaat shaker/incubator Model Stat-Fax
          
          
            5.7
            Bio-Rad microtiterplaat washer Model PW-40/41
          
          
            5.8
            Bio-Rad microtiterplat reader Model 550 met 450 nm en 620 nm filters
          
          
            5.9
            Stomacherzak met filter
          
          
            5.10
            Steriele centrifuge buisjes 1,5 ml
          
          
            5.11
            Steriele micropipetpunten met filter
          
          
            5.12
            Steriele PCR-tubes 200 μl
          
        
      
    
    
      
        6
        Specifieke eisen betreffende de laboratorium ruimtes
      
      PCR technologie is zeer gevoelig: amplificatie van een enkel molecuul genereert miljoenen identieke kopieën van de gewenste sequentie. Deze kopieën kunnen via aërosolen in de laboratorium ruimte circuleren.
      Om besmetting van nieuwe monsters met DNA sequenties vanuit amplificaties van voorgaande monsters te voorkòmen, is het essentiëel om de ruimtes waar de monster behandeling en het mixen van de reagentia plaatsvindt (pre-PCR ruimte) te scheiden van de ruimte waar de amplicon analyse plaatsvindt en de centrifugebuisjes worden geopend (post-PCR ruimte).
      Het gebruik van de PROBELIATM PCR test vereist een minimum van 2 afgescheiden ruimtes. Elke ruimte is voorzien van eigen gebruiksmaterialen zoals pipetten, handschoenen, laboratorium jassen, etc., die niet mogen circuleren van de ene werkplek naar de andere.
    
    
      
        7
        Werkwijze
      
      Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V.
      De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.
      
        
          Voorbehandeling van het monster
        
        Verdun het monster 1:10 in BPw in een stomacherzak met filter. Stomacher, en incubeer de BPw gedurende 18± 2 uur bij 370 C ± 10 C.
        Bij verwerking van nekvel ten behoeve van de verdunning dient zo min mogelijk onderhuids vet meegesneden te worden; een overmaat vet kan de isolatie van DNA bemoeilijken en inhibitie van de PCR-reactie veroorzaken. Mest en dons vergen geen bijzondere voorbehandeling.
      
      
        
          Amplificatie en detectie van DNA met PROBELIA TM Salmonella
        
        Na voorophoping wordt de inhoud van de stomacherzak lichtjes gehomogeniseerd middels voorzichtig zwenken. Vervolgens wordt met een steriele pipet (bij voorkeur met filter) 1 ml homogenaat uit de stomacherzak gepipetteerd in een 1,5 ml centrifuge buisje. Hierbij moeten geen vet, donsresten of andere vaste substanties worden meegepipetteerd.
        Overige stappen worden uitgevoerd conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIATMSalmonella testkit (instructie van de fabrikant).
      
      
        
          Beoordeling
        
        Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de PROBELIATMSalmonella testkit (instructie van de fabrikant). Deze zijn gebaseerd op bepaling van de optische densiteit (OD) verkregen op de Salmonella detectiestrip (H1), vergeleken met de OD van hetzelfde monster op de detectiestrip van de interne controle (H0). Zie ook onderstaande tabel:
        
          
            
            
            
            
            
              
                
                
                  
                    Salmonellae (H1)
                
                
                  Interne controle (H0)
                
                
                  Resultaat
                
              
              
                
                  1
                
                
                  OD &gt; 0.070
                
                
                  niet van belang
                
                
                  positief
                
              
              
                
                  2
                
                
                  OD &lt; 0.070
                
                
                  OD &gt; 0.070
                
                
                  negatief
                
              
              
                
                  3
                
                
                  OD &lt; 0.070
                
                
                  OD &lt; 0.070
                
                
                  inhibitie
                
              
            
          
        
        In het geval van inhibitie van de amplificatiereactie (de OD’s voor monster en corresponderende interne controle zijn lager dan de gestelde cut-off value van 0.070) dient een nieuwe test te worden uitgevoerd. Hiertoe wordt het supernatant van het betreffende monster, verkregen na isolatie van DNA, 1:10 verdund met steriel water (instructie van de fabrikant). Vervolgens wordt de PCR opnieuw ingezet.
        Voor een positief resultaat geldt: Salmonella aanwezig. Voor een negatief resultaat geldt: Salmonella afwezig. Verdere bevestiging van positieve uitslagen verkregen met de PROBELIATMSalmonella is ter beoordeling van de gebruiker maar is niet vereist.
        Echter in die gevallen waarin volgens de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 of de Verordening Hygiënevoorschriften pluimveeverwerkende industrie 1999 nadere serotypering van de Salmonella bevinding is vereist, dient met dezelfde BPw-voorophoping als waaruit de PCR is uitgevoerd alsnog een isolatie met MSRV en BGA uitgevoerd te worden, zie hiervoor de PVE branchemethode MSRV.
        In bijlage IV is het werkvoorschrift voor serotypering van isolaten opgenomen.
      
    
    
      
        8
        Controle
      
      De PROBELIATMSalmonella test kit bevat één positieve en twee negatieve controles. Een additionele interne controle in elk monster bepaald de efficiëntie van de PCR-reactie en is een indicator voor vals-negatieve reacties. Genoemde controles worden in elke test meegenomen.
      
        
          Validatie van de test:
        
        De OD van de beide negatieve controles dient kleiner te zijn dan 0.050; deze waarde bevindt zich meestal tussen de 0.020 en 0.030. De OD van de positieve controle dient groter te zijn dan 2.000. De test is alleen geldig indien de optische densiteit van de controles voldoet aan bovengenoemde condities.
        Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:
        
          
            Positieve controle
          
          
            Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)
          
          
            Blanco controle
          
        
      
    
    
      
        9
        Opgave van het resultaat
      
      Het resultaat wordt opgegeven als ‘aan- of afwezigheid van Salmonella in het betreffende monstermateriaal’ als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol.
      Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).
    
    
      
        10
        Bronvermelding
      
      Fach P., Dilasser F., Grout J., and Tache J., Evaluation of a polymerase chain reaction-based test for detecting Salmonella spp. in food samples: PROBELIATMSalmonella spp. Journal of Food Protection, Vol. 62 (12): 1387-1393 (1999).
      Hartman E.G. Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr 401919, september 1999.
      Miras I., Hermant N., Arricau N., Popoff M.Y. Nucleotide sequence of lagA and lagB genes involved in invasion of HeLa cells by Salmonella enterica subsp. Enterica ser. Typhy . Research in Microbiology, Vol. 146 (1): 17-20 (1995).
      PROBELIATMSalmonella spp .: AFNOR certification, attest SDP-07/2-06/96.
      Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector 2000+ .
      Van der Zee, H., et al. Vergelijking van de Salmonella bepaling met behulp van de conventionele branchemethode (MSRV) en een snelle alternatieve detectiemethode (PROBELIATM PCR) in de pluimveesector. PVE, september 2002.
    
    
      
        11
        Bijlagen
      
      
        
          Bijlage
          1
          : Samenstelling van voorophopingsmedium en PROBELIA TM testkits
        
        
          
            1.1
            Voorophopingsmedium: Gebufferd peption water (BPw)
          
          Samenstelling:
          
            
              
              
              
                
                  
                    Pepton
                  
                  
                    10,0 g
                  
                
                
                  
                    NaCI
                  
                  
                    5,0 g
                  
                
                
                  
                    Na2HPO4
                  
                  
                    3,5 g
                  
                
                
                  
                    KH2PO4
                  
                  
                    1,5 g
                  
                
                
                  
                    Water
                  
                  
                    1000 ml
                  
                
              
            
          
          Bereiding:
          
            
              Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting)
            
            
              Stel de pH, zodat deze na sterilisatie 7,2 ± 0,2 bedraagt bij 250 C
            
            
              Verdeel het medium over de daartoe geschikte flessen
            
            
              Steriliseer in een autoclaaf (15 min. , 1210 C)
            
          
        
        
          
            1.2
            PROBELIA TM Salmonella test
          
          Samenstelling amplificatie kit
          
            
              
              
              
              
              
                
                  
                    A1
                  
                  
                    Lysis reagens
                  
                  
                    1 fles
                  
                  
                    22 ml
                  
                
                
                  
                    A2
                  
                  
                    
                      Salmonella spp. amplificatie mix
                  
                  
                    2 buizen
                  
                  
                    2 x 2,5 ml
                  
                
                
                  
                    A3
                  
                  
                    PCR Positieve controle
                  
                  
                    1 buis
                  
                  
                    0,25 ml
                  
                
                
                  
                    A4
                  
                  
                    PCR Negatieve controle
                  
                  
                    1 buis
                  
                  
                    0,5 ml
                  
                
                
                  
                    A5
                  
                  
                    Denaturatie reagens
                  
                  
                    1 fles
                  
                  
                    6 ml
                  
                
              
            
          
          Samenstelling detectie kit:
          
            
              
              
              
              
              
                
                  
                    H0
                  
                  
                    96 wells plaat (12x8) gecoat met een probe specifiek voor de interne controle
                  
                  
                    1 microtiterplaat
                  
                
                
                  
                    H1
                  
                  
                    96 wells plaat (12x8) gecoat met een probe specifiek voor Salmonella spp.
                  
                  
                    1 microtiterplaat
                  
                
                
                  
                    H2
                  
                  
                    Hybridisatie buffer
                  
                  
                    1 fles
                  
                  
                    100 ml
                  
                
                
                  
                    H3
                  
                  
                    Peroxidase-gelabelde probes specifiek voor Salmonella spp. en de interne controle
                  
                  
                    1 buis
                  
                  
                    100 ml
                  
                
                
                  
                    H4
                  
                  
                    Was buffer (10x geconcentreerd)
                  
                  
                    1 fles
                  
                  
                    100 ml
                  
                
                
                  
                    H5
                  
                  
                    Substraat buffer
                  
                  
                    1 fles
                  
                  
                    60 ml
                  
                
                
                  
                    H6
                  
                  
                    Chromogeen: tetramethulbenzidine (TMB)
                  
                  
                    1 buis
                  
                  
                    1 ml
                  
                
                
                  
                    H7
                  
                  
                    Stop oplossing (1,5 N zwavelzuur) Afdekfolie voor de microtiterplaat
                  
                  
                    1 fles 20 stuks
                  
                  
                    28 ml
                  
                
              
            
          
        
      
    
  
  
    
      Alternatieve PVE Branchemethode VIDAS SLM voor het aantonen van Salmonella in dons, afkomstig van pluimvee Versie 14 november 2002
    
    
      
        1
        Onderwerp
      
      Dit protocol beschrijft een 48-uurs methode voor het aantonen van Salmonella met behulp van de VIDAS SLM test (bioMérieux) in dons afkomstig van pluimvee. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode MSRV.
    
    
      
        2
        Definities
      
      Salmonella : Salmonella spp. , d.w.z. alle typen Salmonella waarvan zowel O als H antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.
      Detectie van Salmonella : bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro-organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.
    
    
      
        3
        Principe
      
      VIDAS SLM is een enzym immunoassay voor detectie van Salmonella antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en geautomatiseerd uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.
      De voorophoping en de selectieve ophopingen vinden achtereenvolgens plaats gedurende 18 uur in een voorophopingsmedium, 6-8 uur in 2 verschillende selectieve ophopingsmedia en als laatste gedurende 18 uur in een 3e ophopingsmedium. Van dit laatste ophopingsmedium wordt een hoeveelheid verhit en in een reagens strip gebracht. De reagens strip wordt in het VIDAS analyse apparaat gebracht, waarna het aantonen van aanwezigheid van Salmonella antigenen met behulp van een cocktail van specifieke monoclonale antilichamen en een fluorescentie reactie volledig geautomatiseerd verloopt. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 45 minuten beschikbaar.
    
    
      
        4
        Reagentia en andere materialen
      
      Alle gebruikte grondstoffen en het gedestilleerde water moeten van analysekwaliteit zijn.
      
        
          
          
          
          
            
              
                Niet-selectief voorophopingsmedium
              
            
          
          
            
              
                
                  gebufferd pepton water
                
              
              
                BPw bijvoorbeeld bioMérieux ref. 42043 
                of Branchemethode MSRV [bijlage 1]
              
            
            
              
                Selectief ophopingsmedium
              
            
            
              
                
                  Rappaport-Vassiliadis bouillon
                
              
              
                RV
              
              
                bijvoorbeeld bioMérieux ref. 42073
              
            
            
              
                
                  seleniet cysteine bouillon
                
              
              
                SC
              
              
                bijvoorbeeld bioMérieux ref. 42052
              
            
            
              
                
                  M bouillon
                
              
              
                Mb
              
              
                bijvoorbeeld bioMérieux ref. 42077
              
            
            
              
                Selectieve agar
              
            
            
              
                
                  briIjant groen agar
                
              
              
                BGA PVE Branchemethode MSRV
              
            
          
        
      
      
        
          
          
          
          
            
              
                Bevestigingsmedia
              
            
          
          
            
              
                
                  ureumagar
                
              
              
                UA
              
              
                PVE Branchemethode MSRV
              
            
            
              
                
                  triple-sugar-ironagar
                
              
              
                TSI
              
              
                PVE Branchemethode MSRV
              
            
            
              
                
                  lysine-decarboxylase medium
                
              
              
                LDC
              
              
                PVE Branchemethode MSRV
              
            
            
              
                Salmonella polyvalent agglutinatie serum
              
              
              
                PVE Branchemethode MSRV
              
            
          
        
      
      De samenstelling en bereiding van media en reagentia is opgenomen in bijlage 1 van de PVE Branchemethode MSRV. Er mag echter ook gebruik gemaakt worden van media die commercieel verkrijgbaar zijn.
      De VIDAS SLM test bestaat uit kant-en-klare reagentia, zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM 30 702 test, instructie van de fabrikant.
    
    
      
        5
        Apparatuur en verbruiksmaterialen
      
      De gebruikelijke apparatuur voor een microbiologisch laboratorium en de voor de VIDAS SLM test benodigde apparatuur en verbruiksmaterialen, zoals onderstaand vermeld:
      
        
          Opmerking:
        
        Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.
        
          
            Broedstoof voor het bebroeden bij 37 ° C ± 1°C
          
          
            Broedstoof voor het bebroeden bij 42 ° C ± 0,5°C
          
          
            Micropipet (500 μl)
          
          
            Steriele micropipetpunten
          
          
            Waterbad (1000 C) of equivalent
          
          
            Steriele entnaalden met een oog met een diameter van ca. 3 mm.
          
          
            Steriele pipetten met een schaalverdeling van 0,1 ml en een meetvolume van 1 ml.
          
          
            Petrischalen met een middellijn van ca. 9 cm.
          
          
            Cultuurbuizen van 17/18 x 150 mm en van 8 x 160 mm.
          
          
            Stomacherzakken (met filter)
          
          
            VIDAS analyse apparaat
          
        
      
    
    
      
        6
        Werkwijze
      
      Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V.
      De monsters dienen binnen 4 uur na ontvangst ingezet te worden. Indien de monsters echter binnen 48 uur op het laboratorium aanwezig zijn, mag gewacht worden met het inzetten van de monsters totdat maximaal 48 uur + 4 uur na de datum van monstername is verstreken.
      
        
          Voorophoping
        
        Verdun het monster 1:10 in BPw (25 gram dons in 225 ml BPw).
        Stomacher, en incubeer de BPw 18 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.
        
          
            Selectieve ophoping
          
          Breng na incubatie van de BPw 1 ml van deze suspensie over in 10 ml SC bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 37 ° C ± 1 ° C .
          Breng tegelijkertijd ook 0,1 ml van deze BPw suspentie over in 10 ml RV bouillon. Incubeer 6-8 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C
        
      
      
        
          Na-ophoping
        
        Breng na incubatie van de SC bouillon 1 ml hiervan over in 10 ml M bouillon. Breng na incubatie van de RV bouillon 1 ml hiervan over in een 2e buis met 10 ml M bouillon. Her-incubeer de SC bouillon en de RV bouillon voor nog eens 18 uur, om bevestiging achteraf mogelijk te maken. Incubeer de M bouillon buizen gedurende 18 uur bij 42 ° C ± 0,5 ° C.
        Meng de M bouillon buizen na incubatie en breng uit elke buis 1 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS SLM test uit volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
        Bewaar de overgebleven bouillons bij 2-8 ° C voor bevestiging.
        
          
            Beoordeling
          
          Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, gebruiksaanwijzing van de fabrikant. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar de zgn. Test Value. Resultaten met een Test Value onder de 0,23 betreffen monsters waarin Salmonella antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een test Value = 0,23 worden als Salmonella -positief gerapporteerd. Positieve resultaten moeten worden bevestigd met behulp van de bewaarde ophopings- en na-ophopingsmedia.
        
        
          
            Bevestiging van positieve resultaten
          
          Ent met een öse vanuit de ophopingsbouillons (RV en SC) vanuit de broedstoven en vanuit de M bouillons vanuit de koeling af op gedroogde BGA platen. Incubeer deze platen gedurende 24 ± 2 uur bij 37 ° C ± 1 ° C.
        
        
          
            Beoordeling BGA platen
          
          Controleer de bebroede BGA-platen op de vorming van roze kolonies. Dergelijke kolonies worden als ‘vermoedelijk positief’ aangemerkt. Bevestiging van deze specifieke kolonies, zowel biochemisch als serologisch, vindt vervolgens plaats zoals omschreven in de PVE Branchemethode MSRV.
          Voor donsmonsters vindt serotypering plaats voor de 4 hoofdgroepen van Salmonella (B, C, D en E) en indien van toepassing identificatie van Salmonella enteritidis en Salmonella typhimurium (indien bij de pluimveehouder het serotype nog niet bekend is). In bijlage IV is hiervoor het werkvoorschrift opgenomen.
        
      
    
    
      
        7
        Controle
      
      De VIDAS SLM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS SLM test, instructie van de fabrikant.
      Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:
      
        
          Positieve controle
        
        
          Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)
        
        
          Blanco controle
        
      
    
    
      
        8
        Opgave van het resultaat
      
      Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Salmonella in dons’, als Salmonella al dan niet is aangetoond volgens dit protocol.
      Indien bij het aanleveren van de monsters door de opdrachtgever afwijkingen worden geconstateerd van de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting de opdrachtgever (zie bijlage V).
    
    
      
        9
        Bronvermelding
      
      Hartman, E.G., Validatierapport van de isolatie van Salmonella uit de matrix pluimvee faeces m.b.v. het Modified Semi-solid Rappaport Vassiliadis (MSRV)-medium, Gezondheidsdienst voor Dieren, projectnr. 401919, september 1999.
      ISO 6579:1993(E). Microbiology. General guidance on methods for the detection of Salmonella .
      Productschappen Vee, Vlees en Eieren, Verzamelband Actieplan Salmonella en Campylobacter in de pluimveevleessector 2000+ .
      Van der Zee, H. et al. Validatierapport van de Salmonella bepaling in de matrix dons met behulp van de VIDAS SLM methode. PVE, september 2002.
    
  
  
    
      Pve branchemethode voor de bepaling van de aan- of afwezigheid van thermotolerante campylobacter spp. in monsters pluimvee, pluimveeproducten en omgevingsmonsters
    
    
      
        1
        Onderwerp en toepassingsgebied
      
      Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in pluimvee, verse pluimveeproducten en omgevingsmonsters zoals mestmonsters en blindedarm mestmonsters.
    
    
      
        2
        Normatieve verwijzingen
      
      NEN-EN-ISO 6887-1:1999 , Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen.
      NEN-EN-ISO 6887-2:2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten.
      NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken.
      NVN-ENV-ISO 11133-1:2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium
    
    
      
        3
        Termen en definities
      
      Campylobacter : micro-organismen die de voor deze bacteriën karakteristieke groei vertonen en specifieke morfologische, biochemische en serologische reacties vertonen wanneer wordt gekweekt respectievelijk getest volgens de beschreven werkwijze.
    
    
      
        4
        Beginsel
      
      Mestmonsters en blindedarm mestmonsters worden rechtstreeks geënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).
      Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 24 uur bebroed bij 41,5°C. Vervolgens wordt afgeënt op een selectieve vaste voedingsbodem (mCCDA).
      Selectieve vaste voedingsbodems worden microaëroob gedurende 48 uur bij 41,5°C bebroed, waarna beoordeeld wordt op aanwezigheid van specifieke kolonies.
      Specifieke kolonies worden bevestigd met behulp van oxidase reactie en microscopie. Als extra controle wordt een deel van de isolaten biochemisch en/of serologisch bevestigd.
    
    
      
        5
        Voedingsmedia en verdunningsvloeistoffen
      
      
        
          5.1
          Algemeen
        
        Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn.
        Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten.
        Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd.
        Gebruik voor de meting van de pH een pH-meter; referentietemperatuur 25°C.
        Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1°C en 5°C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven.
        Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.
      
      
        
          5.2
          Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed)
        
        
          
            5.2.1
            Preston basismedium
          
          
            
              5.2.1.1
              Samenstelling
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Vleesextractpoederaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      10,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Peptonaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      10,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium chlorideaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      5,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium pyruvaatbook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement"of FBP supplement)
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium metabisulfietbook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement"of FBP supplement)
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Ijzer (II) sulfaatbook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement"of FBP supplement) (FeSO4.7H2O)
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Water
                    
                    
                      1000
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
          
          
            
              5.2.1.2
              Bereiding
            
            Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25ºC. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.
          
        
        
          
            5.2.2
             Preston antibiotica oplossing
          
          
            
              5.2.2.1
              Samenstelling
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Polymyxine-B
                    
                    
                      5000
                    
                    
                      IU
                    
                  
                  
                    
                      Rifampicine
                    
                    
                      0,01
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Trimethoprim lactaat
                    
                    
                      0,01
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Amphotericine-B
                    
                    
                      0,01
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Water
                    
                    
                      4
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
            OPMERKING
            Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het “vroeger” gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-B, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-B.
          
          
            
              5.2.2.2
              Bereiding
            
            Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter)
          
        
        
          
            5.2.3
            Compleet Preston ophopingsmedium
          
          
            
              5.2.3.1
              Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Basismedium
                    
                    
                      1000
                    
                    
                      ml
                    
                  
                  
                    
                      Antibiotica oplossing
                    
                    
                      4
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
          
          
            
              5.2.3.2
              Bereiding compleet Preston ophopingsmedium
            
            Koel het basismedium af tot onder de 45ºC.
            Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.
            OPMERKING
            In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs- Reitsma et al ., 2003).
          
        
      
      
        
          5.3
          Selectieve voedingsbodem: modified Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar (mCCDA)
        
        
          
            5.3.1
            mCCDA Basismedium
          
          
            
              5.3.1.1
              Samenstelling
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Vleesextractpoederaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      10,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Peptonaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      10,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium chlorideaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      5,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Bacteriologische charcoal
                    
                    
                      4,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Caseïne hydrolysaat
                    
                    
                      3,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium deoxycholaat
                    
                    
                      1,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Ijzer (II) sulfaat (FeSO4.7H2O)
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natriumpyruvaat
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Agar
                    
                    
                      12,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Water
                    
                    
                      1000
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
          
          
            
              5.3.1.2
              Bereiding
            
            Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 bedraagt bij 25ºC. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.
          
        
        
          
            5.3.2
            mCCDA antibiotica supplement
          
          
            
              5.3.2.1
              Samenstelling
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Cefoperazone
                    
                    
                      32
                    
                    
                      mg
                    
                  
                  
                    
                      Amphotericine-B
                    
                    
                      10
                    
                    
                      mg
                    
                  
                  
                    
                      Water
                    
                    
                      4
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
            OPMERKING
            Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als mCCDA supplement.
          
          
            
              5.3.2.2
              Bereiding
            
            Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter)
          
        
        
          
            5.3.3
            Complete mCCDA voedingsbodem
          
          
            
              5.3.3.1
              Samenstelling
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Basismedium
                    
                    
                      1000
                    
                    
                      ml
                    
                  
                  
                    
                      Antibiotica oplossing
                    
                    
                      4
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
          
          
            
              5.3.3.2
              Bereiding
            
            Koel het basismedium af tot ongeveer 45ºC.
            Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig. Giet de agar uit in petrischalen met nok en laat stollen.
          
        
        
          
            5.4
            Bevestigingsmedia
          
          
            
              5.4.1
              Oxidase reagens
            
            
              
                5.4.1.1
                Samenstelling
              
              
                
                  
                  
                  
                  
                    
                      
                        N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdihloride
                      
                      
                        0,1
                      
                      
                        gram
                      
                    
                    
                      
                        Water
                      
                      
                        10
                      
                      
                        ml
                      
                    
                  
                
              
            
            
              
                5.4.1.2
                Bereiding
              
              Los het N,N,N’,N’-tetramethyl-1,4-fenyleendiammoniumdihloride op in het water. Bereid het reagens vlak voor uitvoering van de oxidasetest.
              Dit reagens is ook kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar. Handel dan volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant.
            
          
          
            
              5.4.2
              Latexagglutinatietest voor bevestiging van Campylobacter
            
            Llatexagglutinatietesten voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn commerciëel verkrijgbaar. Enkele leveranciers staan vermeld in Bijlage A.
          
          
            
              5.4.3
              Triple Sugar/Iron agar (TSI)
            
            
              
                5.4.3.1
                Samenstelling
              
              
                
                  
                  
                  
                  
                    
                      
                        Vleesextract
                      
                      
                        3,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Gistextract
                      
                      
                        3,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Pepton
                      
                      
                        20,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Natriumchloride
                      
                      
                        5,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Lactose
                      
                      
                        10,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Sucrose
                      
                      
                        10,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Glucose
                      
                      
                        1,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        IJzer (III) citraat
                      
                      
                        0,3
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Natriumthiosulfaat
                      
                      
                        0,3
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Fenolrood
                      
                      
                        0,024
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Agar
                      
                      
                        12,0
                      
                      
                        g
                      
                    
                    
                      
                        Water
                      
                      
                        1000
                      
                      
                        ml
                      
                    
                  
                
              
            
            
              
                5.4.3.2
                Bereiding
              
              Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,4 ± 0,2 is.
              Verdeel het medium over geschikte reageerbuizen, 10 ml medium per buis.
              Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.
              Laat de agar stollen, zodat er bovenop 2,5 cm agar onderin de buis, nog een schuin gedeelte ontstaat.
            
          
        
      
    
    
      
        6
        Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen
      
      Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN-ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande:
      
        
          6.1
        
        Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) ° C.
      
      
        
          6.2
        
        Suspendeertoestel, Stomacher
      
      
        
          6.3
        
        Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas-zakjes’).
      
      
        
          6.4
        
        Microscoop, bij voorkeur met fase-contrast, vergroting 1000x.
      
      OPMERKING
      Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.
    
    
      
        7
        Monstername
      
      Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd.
      Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4°) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage V. Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever.
      Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.
      Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet.
    
    
      
        8
        Werkwijze
      
      
        
          8.1
          Algemeen
        
        In alle gevallen geldt dat de agarplaten na beënten zonder uitstel onder micro-aërobe condities geïncubeerd dienen te worden, omdat Campylobacter obligaat micro-aërofiel is en onder andere omgevingscondities snel afsterft.
      
      
        
          8.2
          Direct uitplaten
        
        
          
            8.2.1
            Monstervoorbehandeling
          
          Monsters waarin hoge aantallen Campylobacter worden verwacht, zoals mest en blindedarm, worden rechtstreeks op het isolatiemedium afgestreken.
          Maak 1 mengmonster van de 30 afzonderlijke blindedarmen door deze elk op steriele wijze open te knippen en uit elke darm een evenredige hoeveelheid materiaal over te brengen in een lege steriele petrischaal. Meng goed (bijvoorbeeld met een steriele swab of entoog).
        
        
          
            8.2.2
            Isolatie
          
          Beënt vanuit het mengmonster met behulp van de swab of entoog een halve mCCDA-plaat. Beënt de rest van de plaat middels verdunningsstrepen met behulp van een steriele öse, zodanig dat na incubatie losliggende kolonies kunnen ontstaan.
          Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende 48 (± 4) uur bij 41,5 (± 1)°C.
        
      
      
        
          8.3
          Ophoping
        
        
          
            8.3.1
            Monstervoorbehandeling
          
          Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).
        
        
          
            8.3.2
            Ophoping
          
          Incubeer de ophopingsbouillon (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1)°C in micro-aëroob milieu.
          Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.
        
        
          
            8.3.3
            Isolatie
          
          Ent met behulp van een entoog (10 μl) de Preston-cultuur na incubatie uit op een mCCDA-plaat. Incubeer mCCDA platen micro-aëroob gedurende (48 ± 4) uur bij (41,5 ± 1)°C.
        
      
      
        
          8.4
          Beoordeling kolonies op mCCDA
        
        Beoordeel bebroede mCCDA-platen op de aanwezigheid van kolonies met de volgende morfologische eigenschappen: grijs, metalig, laag convex, amorf en de neiging om met de entstreep mee te groeien. Deze kolonies worden als ‘verdacht positief’ aangemerkt.
      
    
    
      
        9
        Bevestiging
      
      
        
          9.1
          Algemeen
        
        Voor de bevestiging uit met minimaal 1 tot maximaal 3 verdachte kolonies per plaat in geval van reincultuur en tot 5 verdachte kolonies (indien aanwezig) in geval van mengcultuur, totdat een positief resultaat wordt verkregen.
        Ter bevestiging wordt een oxidase reactie uitgevoerd en worden de verdachte kolonies microscopisch beoordeeld.
      
      
        
          9.2
          Oxidase reactie
        
        Ent met een entoog (anders dan van nikkel/chroom) vanaf de mCCDA plaat een verdachte kolonie op een filtreerpapiertje bevochtigd met oxidasereagens. Lees na maximaal 10 seconden de reactie af. De reactie is positief bij paarskleuring en negatief indien er geen verkleuring optreedt.
      
      
        
          9.3
          Microscopie
        
        Maak van de verdachte kolonie een hangende-druppel-preparaat of nat-preparaat en beoordeel met een fasecontrast of donkerveld microscoop (100x objectief) op de karakteristieke kurketrekker-vormige morfologie en grote beweeglijkheid van Campylobacter . Bij kleuring volgens Gram tonen Campylobacter bacteriën zich als kurketrekker-vormig gebogen Gram- negatieve staafjes. De karakteristieke vorm is ook goed te zien bij kleuring met Oost-Indische inkt. Bij oude culturen (&gt; 2 dagen op plaat) kan Campylobacter coccoïde en minder beweeglijke vormen aannemen.
      
      
        
          9.4
          Aanvullende bevestiging
        
        Bij twijfel of als extra controle op de juiste identificatie wordt aanbevolen om regelmatig een aanvullende bevestiging uit te voeren met een latexagglutinatietest of een TSI-buis, bijvoorbeeld met 1 op 50 bevestigde kolonies. Voer eerst een reinstrijk uit op bijvoorbeeld een bloedplaat of een mCCDA-basis agar plaat (zonder antibiotica supplement).
        
          
            9.4.1
            Latexagglutinatietest
          
          Latexagglutinatietesten zijn bij diverse firma’s commercieel verkrijgbaar (zie Bijlage A) en moeten volgens de gebruiksaanwijzing van de fabrikant worden ingezet en afgelezen.
        
        
          
            9.4.2
            TSI buis
          
          Beënt een TSI buis middels ladderen van het schuin gestolde deel en middels steek-enten in de agar. Incubeer deze buis (24 ± 2) uur bij (41,5 ± 1)°C in micro-aëroob milieu. Beoordeel de reacties als weergegeven in tabel 1.
        
      
      
        
          9.5
          Interpretatie bevestigingsreacties
        
        Campylobacter bacteriën vertonen de karakteristieken zoals omschreven in tabel 1.
        
          Tabel 1- Karakteristieken van Campylobacter
          
            
            
            
            
              
                
                  
                    Test
                  
                
                
                  
                    Omschrijving
                  
                
                
                  
                    Campylobacter
                    -specifiek resultaat
                  
                
              
              
                
                  Microscopie
                
                
                  Karakteristieke kurketrekker- vormige morfologie en grote beweeglijkheid
                
                
                  +
                
              
              
                
                  Oxidase
                
                
                  Paarsvorming
                
                
                  +
                
              
              
                
                  TSI
                
                
                  rood/onveranderd
                  geen zwartkleuringNegatief:
                
                
                  -
                
              
              
                
                  -Glucose (zuurvorming)
                
                
                  gehele buis rood
                  Positief: voet geel, schuine deel rood;
                
                
                  -
                
              
              
                
                  -Glucose (gasvorming)
                
                
                  Neg.:geen bellen/scheuren 
                  Pos.: belletjes en/of scheuren in agar
                
                
                  -
                
              
              
                
                  -Lactose
                
                
                  Positief: gehele buis geel
                
                
                  -
                
              
              
                
                  -Sucrose
                
                
                  Positief: gehele buis geel
                
                
                  -
                
              
              
                
                  -H2S-vorming
                
                
                  Positief: zwarte kleur in voet
                
                
                  -
                
              
              
                
                  Latexagglutinatie
                
                
                  Volgens voorschrift fabrikant
                
                
                  +
                
              
            
          
        
        * Indien het een Campylobacter coli betreft kan de buis toch enige zwarting te zien geven (dit species is namelijk beperkt in staat tot H2S-vorming).
      
    
    
      
        10
        Opgave van het resultaat
      
      Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze).
    
    
      
        11
        Precisie
      
      Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden.
    
    
      
        12
        Verslag
      
      Vermeld in het verslag:
      
        
          de gevolgde methode;
        
        
          de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster;
        
        
          de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend;
        
        
          het resultaat volgens hoofdstuk 8;
        
        
          eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.
        
      
    
    
      
        13
        Bronvermelding
      
      NEN-EN ISO 10272.:1995 Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method for the detection of thermotolerant Campylobacter + technical corrigenda (ISO10272:1995/Cor.1:1996(E) and ISO 10272:1995/Cor:1997(E).
      Jacobs-Reitsma, W.F. (1994). Epidemiology of Campylobacter in Poultry. Thesis Agricultural University Wageningen, The Netherlands.
      Jacobs-Reitsma W., M. van der Wal, R. Achterberg and J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation at the 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark.
      PVE Branchemethode (MSRV) voor het aantonen van Salmonella in dons, faeces, vellen en eindproduct afkomstig van pluimvee (inclusief 5 bijlagen), d.d. 20-07-01 Vb. Bo. nr. 31.
    
    
      
        Bijlage
         A
      
      Beschikbare latex agglutinatie testen voor bevestiging van thermotolerante Campylobacter zijn onder andere:
      DryspotCampylobacterTest , Oxoid DR 150M Oxoid ltd., Basingstoke Hampshire, England
      
        
          
          
          
            
              
                In NL via :
              
              
                Oxoid
              
            
            
              
              
                Pieter Goedkoopweg 38
              
            
            
              
              
                Postbus 490, 2000 AL Haarlem
              
            
            
              
              
                Tel: 023 5319173
              
            
            
              
              
                Fax: 023 5310543
              
            
          
        
      
      INDX® - Campy (jcl)™ 50 test kit Catalog # 2200-01-50
      (voorheen Meritec™-Campy (jcl), #203050, Meridian Diagnostics)
      Integrated Diagnostics, Inc.
      Baltimore, MD 21227 USA
      
        
          
          
          
            
              
                in NL via:
              
              
                Biotrading
              
            
            
              
              
                Postbus 254
              
            
            
              
              
                3640 AG Mijdrecht
              
            
            
              
              
                Tel: 0297 286848
              
            
            
              
              
                Fax: 0297 287570
              
            
          
        
      
      Microscreen ®Campylobacter , M46
      Microgen Bioproducts Ltd. (voorheen Mercia Diagnostics)
      1, Admiralty Way, Camberley, Surrey GU15 3DT, UK
      
        
          
          
          
            
              
                In NL via:
              
              
                Lucron bioproducts BV.
              
            
            
              
              
                Postbus 57
              
            
            
              
              
                6590 AB Gennep
              
            
            
              
              
                Tel: 0485 511675
              
            
            
              
              
                Fax: 0485 512052
              
            
          
        
      
    
    
      
        Bijlage
        B
      
      Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:
      
        
          - Blanco controle
        
        Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle buis wordt afgeënt op een mCCDA-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op de mCCDA-plaat.
        Indien een hoeveelheid (blindedarm)mest direct met behulp van een swab wordt geënt op een mCCDA-plaat, dan wordt een onbeënte mCCDA-plaat gebruikt als blanco controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure mag er geen groei zijn op deze mCCDA-plaat.
      
      
        
          - Positieve controle
        
        Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni . (bijvoorbeeld ATCC 29428).
        Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Preston-buis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle buis wordt afgeënt op een mCCDA-plaat. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mCCDA-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken.
        Indien op het laboratorium monsters (blindedarm)mest worden ingezet, dan wordt een mCCDA- plaat aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Na incubatie volgens de beschreven procedure moet op de mCCDA-plaat groei te zien zijn met de typische morfologische kenmerken.
        Tevens kan deze referentiestam gebruikt worden als positieve controle bij de uitvoering van de oxidase test, de microscopie en eventueel de agglutinatie test en/of TSI-buis.
        Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen:
        
          
            Positieve controle
            zie boven
          
          
            Negatieve controle
          
        
        Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze controlestam mag op een mCCDA-plaat geen ‘verdachte’ kolonies te zien geven.
        Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden.
        Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden.
      
    
  
  
    
      Alternatieve PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. met behulp van de VIDAS CAMtest in pluimveeproducten Versie mei 2004
    
    
      
        1
        Onderwerp en toepassingsgebied
      
      Dit protocol beschrijft een methode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter spp. (in dit protocol verder als Campylobacter aangeduid) in verse pluimveeproducten. De methode is gevalideerd ten opzichte van de door de branche opgestelde en door de Raad voor Accreditatie goedgekeurde analyse methode.
    
    
      
        2
        Normatieve verwijzingen
      
      NEN-EN-ISO 6887-1:1999 , Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van het monster en bereiding van verdunningen door microbiologisch onderzoek; Deel 1: Algemene regels voor de bereiding van de primaire verdunning en verdere decimale verdunningen.
      NEN-EN-ISO 6887-2:2002, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Voorbereiding van monsters en bereiding van verdunningen voor microbiologisch onderzoek; Deel 2: Specifieke werkwijze voor vlees en vleesproducten.
      NEN-ISO 7218:1996, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders - Algemene regels voor microbiologische onderzoeken.
      NVN-ENV-ISO 11133-1:2000, Microbiologie van voedingsmiddelen en diervoeders; Richtlijnen voor de kwaliteitsborging en productie van kweekmedia; Deel 1: Algemene richtlijnen voor kwaliteitsborging van de voorbereiding van kweekmedia in het laboratorium
    
    
      
        3
        Termen en definities
      
      Campylobacter : Campylobacter spp., dat wil zeggen alle typen Campylobacter waarvan de specifieke antigenen met behulp van de Enzyme Linked Fluorescent Assay (ELFA) techniek worden aangetoond, wanneer wordt getest volgens de beschreven werkwijze.
      Door de selectieve ophoping te incuberen bij 41,5 ± 1º C wordt geselecteerd op alleen de thermotolerante Campylobacter species.
      Detectie van Campylobacter : bepalen van de aan- of afwezigheid van deze micro- organismen als het onderzoek wordt uitgevoerd volgens de beschreven werkwijze.
    
    
      
        4
        Beginsel
      
      VIDAS CAM is een enzym immunoassay voor de detectie van Campylobacter antigenen, waarbij gebruik wordt gemaakt van de ELFA methode en die geautomatiseerd wordt uitgevoerd op het VIDAS analyse apparaat.
      Pluimveeproducten (bijvoorbeeld vel van de borstkap of filet) worden in porties van 25 gram gedurende 1 minuut gestomacherd met 100 ml selectief ophopingsmedium (Preston). Hierna wordt het monstermateriaal verwijderd en alleen het ophopingsmedium gedurende 48 uur bebroed bij 41,5°C. Vervolgens wordt de VIDAS CAM assay uitgevoerd. Het test resultaat van deze aantoningsstap is na ca. 70 minuten beschikbaar. Verdere bevestiging van positieve uitslagen is niet noodzakelijk.
    
    
      
        5
        Voedingsmedia
      
      
        
          5.1
          Algemeen
        
        Gebruik materialen die voldoende zuiver zijn.
        Gebruik gedestilleerd of op een andere wijze gedemineraliseerd water. Het water mag geen voor micro-organismen giftige bestanddelen bevatten.
        Voor een goede reproduceerbaarheid van de resultaten verdient het aanbeveling uit te gaan van in de handel verkrijgbare droge ingrediënten of geschikt bevonden droge voedingsmedia. De instructies van de fabrikant voor de bereiding moeten nauwgezet worden gevolgd.
        Gebruik voor de meting van de pH een pH-meter; referentietemperatuur 25°C.
        Indien het voedingsmedium niet direct wordt gebruikt, moet dit in het donker tussen 1°C en 5°C worden bewaard en onder omstandigheden waarbij geen veranderingen in de samenstelling optreden. Bewaar het voedingsmedium niet langer dan een maand, tenzij elders in dit protocol anders wordt aangegeven.
        Er mag ook gebruik worden gemaakt van media die kant-en-klaar commercieel verkrijgbaar zijn.
      
      
        
          5.2
          Selectief ophopingsmedium: Preston bouillon (zónder paardenbloed)
        
        
          
            5.2.1
            Preston basismedium
          
          
            
              5.2.1.1
              Samenstelling
            
            
              
                
                
                
                
                
                  
                    
                      Vleesextractpoederaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      10,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Peptonaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      10,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium chlorideaook tezamen kant-en-klaar verkrijgbaar onder de naam Nutriënt Broth No. 2
                    
                    
                      5,0
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium pyruvaatbook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FBP supplement) 
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Natrium metabisulfietbook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FBP supplement) 
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Ijzer (II) sulfaatbook tezamen verkrijgbaar als supplement (zgn. "groeisupplement" of FBP supplement)  (FeSO4.7H2O)
                    
                    
                      0,25
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Water
                    
                    
                      1000
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
          
          
            
              5.2.1.2
              Bereiding
            
            Los de ingrediënten op in het water (indien nodig d.m.v. verhitting). Stel de pH zo in dat deze na sterilisatie 7,5 ± 0,2 bedraagt bij 25ºC. Steriliseer gedurende 15 minuten bij (121 ± 1)ºC.
          
        
        
          
            5.2.2
            Preston antibiotica oplossing
          
          
            
              5.2.2.1
              Samenstelling
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Polymyxine-B
                    
                    
                      5000
                    
                    
                      IU
                    
                  
                  
                    
                      Rifampicine
                    
                    
                      0,01
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Trimethoprim lactaat
                    
                    
                      0,01
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Amphotericine-B
                    
                    
                      0,01
                    
                    
                      g
                    
                  
                  
                    
                      Water
                    
                    
                      4
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
              
                OPMERKING
                Deze antibiotica zijn ook tezamen verkrijgbaar als Preston supplement. Let op, ook het “vroeger” gebruikte Preston supplement, met cycloheximide in plaats van amphotericine-B, is nog steeds verkrijgbaar. De voorkeur wordt echter gegeven aan gebruik van supplement met amphotericine-B.
              
            
          
          
            
              5.2.2.2
              Bereiding
            
            Los de antibiotica op in het water en steriliseer door middel van filtratie (0,22 μm filter).
          
        
        
          
            5.2.3
            Compleet Preston ophopingsmedium
          
          
            
              5.2.3.1
              Samenstelling compleet Preston ophopingsmedium
            
            
              
                
                
                
                
                  
                    
                      Basismedium
                    
                    
                      1000
                    
                    
                      ml
                    
                  
                  
                    
                      Antibiotica oplossing
                    
                    
                      4
                    
                    
                      ml
                    
                  
                
              
            
          
          
            
              5.2.3.2
              Bereiding compleet Preston ophopingsmedium
            
            Koel het basismedium af tot onder de 45ºC.
            Voeg op aseptische wijze de antibiotica oplossing toe en meng zorgvuldig.
            OPMERKING
            In de originele beschrijving van Preston ophopingsmedium (en in daarop volgende beschrijvingen in bijvoorbeeld ISO) wordt paardenbloed gebruikt. In dit NEN voorschrift wordt echter geen paardenbloed toegepast, omdat uit recent onderzoek is gebleken dat dat voor onderhavige monstermatrix niet noodzakelijk is (Jacobs-Reitsma et al ., 2003).
          
        
      
    
    
      
        6
        Toestellen, glaswerk en hulpmiddelen
      
      Gebruikelijke toestellen en steriel glaswerk voor microbiologische laboratoria (zie ook NEN- ISO 7218) en in het bijzonder de onderstaande:
      
        
          6.1
        
        Broedstoof voor het bebroeden bij (41,5 ± 1) ° C.
      
      
        
          6.4
        
        Suspendeertoestel, Stomacher
      
      
        
          6.3
        
        Geschikte apparatuur en hulpmiddelen om te bebroeden in een micro-aërobe atmosfeer (ca. 6% zuurstof, 10% kooldioxide en 84% stikstof). Voor het verkrijgen van micro-aëroob milieu kan gebruik gemaakt worden van commerciële systemen (‘gas- zakjes’), bijvoorbeeld:
         GenBox micro-aërofiel (10 zakjes, ref. 96125, bioMérieux).
      
      
        
          6.4
        
        VIDAS of mini VIDAS analyser (bioMérieux).
      
      
        
          6.5
        
        VIDAS CAM assay (30 testen, ref. 30111, bioMérieux)
      
      OPMERKING
      Gesteriliseerde materialen voor éénmalig gebruik mogen worden toegepast.
    
    
      
        7
        Monstername
      
      Monstername is geen onderdeel van de methode zoals beschreven in deze norm. PVE heeft de procedure voor de monstername in een apart besluit vastgelegd.
      Bederfelijke pluimveeproducten zoals borstvellen en filet dienen gekoeld (1-4° C) te worden aangeleverd. Zie voor de acceptatie criteria voor monstermateriaal bijlage IX van het gewijzigde Besluit Protocollen Hygiënevoorschriften Pluimveehouderij (PVE, 2004-I). Indien bij het aanleveren van de monsters afwijkingen worden geconstateerd in de wijze waarop de monsters aangeleverd moeten worden, dan dient het laboratorium hierover schriftelijk een opmerking te maken richting opdrachtgever.
      Campylobacter is zeer gevoelig voor invriezen en daarom is het invriezen van monsters niet toegestaan.
      Monsters dienen binnen 48 uur na monstername te worden ingezet.
    
    
      
        8
        Werkwijze
      
      
        
          8.1
          Monstervoorbehandeling
        
        Breng 25 gram ± 1 gram van het monster, bijvoorbeeld een stuk huid van de borstkap of filet, in een stomacherzak en voeg 100 ml Preston bouillon toe. Stomacher gedurende 1 minuut en scheidt het monstermateriaal van de ophopingsbouillon (bijvoorbeeld door het verwijderen van de binnenzak van de stomacherzak met daarin het monstermateriaal of door overschenken van de ophopingsvloeistof in een schoon steriel flesje).
      
      
        
          8.2
          Ophoping
        
        Incubeer de ophopingsbouillon (48 ± 2) uur bij (41,5 ± 1)°C in micro-aëroob milieu.
        Indien geïncubeerd wordt in flesjes of (stomacher)-zakken met weinig kopruimte (d.w.z. = 2 cm), kan zonder eisen aan het milieu geïncubeerd worden.
        OPMERKING
        In tegenstelling tot de branchemethode is de incubatietijd in dit voorschrift 48 uur.
      
      
        
          8.3
          Detectie
        
        Meng het ophopingsmedium na incubatie en breng 2 ml over in een eppendorfbuisje. Sluit de buisjes en verhit gedurende 15 minuten in een kokend waterbad. Voer vervolgens de VIDAS CAM test uit volgens de gebruiksaanwijzing. Runtime VIDAS CAM test bedraagt ongeveer 70 minuten.
        OPMERKING
        Indien de VIDAS CAM test niet direct kan worden uitgevoerd is het mogelijk de ophoping (of een deel ervan) in te vriezen voor maximaal 48 uur. Na ontdooien moet de ophoping opgekookt worden en kan bovenstaande werkwijze worden gevolgd.
      
      
        
          8.4
          Beoordeling van VIDAS CAM resultaten
        
        Resultaten worden beoordeeld conform de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test. Deze zijn gebaseerd op metingen van de fluorescentie en worden gestandaardiseerd naar een zogenaamde Test Value (TV). Resultaten met een TV onder de 0,1 betreffen monsters waarin Campylobacter antigenen niet aantoonbaar waren. Resultaten met een TV = 0,1 worden als Campylobacter -positief gerapporteerd.
      
    
    
      
        9
        Bevestiging
      
      De in dit voorschrift beschreven VIDAS CAM methode is een detectie methode. Verdere confirmaties zijn niet nodig.
    
    
      
        10
        Controle
      
      De VIDAS CAM test kit bevat een positieve en een negatieve VIDAS reagens controle en een bijbehorende standaard. Deze worden meegenomen in de bepalingen zoals omschreven in de gebruiksaanwijzing van de VIDAS CAM test.
      Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen [bijlage ]:
      
        
          Blanco controle
        
        
          Positieve controle
        
        
          Negatieve controle (indien een ingangscontrole per batch wordt toegepast, kan deze negatieve controle komen te vervallen)
        
      
    
    
      
        11
        Opgave van het resultaat
      
      Geef het resultaat op als ‘aan- of afwezigheid van Campylobacter in het betreffende monstermateriaal’ als Campylobacter al dan niet is aangetoond volgens 8 (werkwijze).
    
    
      
        12
        Precisie
      
      Prestatiekenmerken zijn vooralsnog niet voorhanden.
    
    
      
        13
        Verslag
      
      Vermeld in het verslag:
      
        
          de gevolgde methode;
        
        
          de gegevens die noodzakelijk zijn voor de identificatie van het monster;
        
        
          de gevolgde methode van monsterneming, indien bekend;
        
        
          het resultaat volgens hoofdstuk 8;
        
        
          eventuele bijzonderheden die tijdens de bepaling zijn waargenomen die het resultaat kunnen hebben beïnvloed.
        
      
    
    
      
        14
        Bronvermelding
      
      PVE Branchemethode voor het aantonen van thermotolerante Campylobacter. Bijlage VI van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties).
      PVE Acceptatie criteria, Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwijkende monsters, Bijlage IX van het Besluit tot wijziging van het besluit protocollen hygiënevoorschriften pluimveehouderij 1999 (2004-I) (Verordeningenblad Bedrijfsorganisaties).
      Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, E. Samuëls and J. Wagenaar. Evaluation of the VIDAS Campylobacter Assay for detection of Campylobacter in fresh poultry products after various enrichment methods. Posterpresentation A-18 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. International Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p. 6.
      Jacobs-Reitsma, W., M. van der Wal, R. Achterberg, J. Wagenaar. Comparative studies on Campylobacter isolation methods from fresh poultry products. Posterpresentation A-21 at 12th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and Related Organisms, september 2003, Aarhus, Denmark. Ìnternational Journal of Medical Microbiology, Vol. 293 Suppl. 35, p. 6-7.
      Samuëls, E.L.A.M. en W. Jacobs-Reitsma, Validatierapport van de Campylobacter bepaling in de matrix pluimveevlees met behulp van de VIDAS CAM methode. (Onderzoek in het kader van het PVE Plan van Aanpak/Actieplan 2000+ Salmonella en Campylobacter in de pluimveesector), april 2004.
    
    
      
        15
        Bijlagen
      
      
        
          1.
          Eerstelijnscontrole van de methode
        
      
    
    
      
        Bijlage
         1
        : Eerstelijnscontrole van de methode
      
      Voor de eerstelijnscontrole van de methode dienen te worden meegenomen:
      
        
          - Blanco controle
        
        Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden opgehoopt in Preston bouillon, dan wordt een ongeënte Preston-buis (of -zakje) gebruikt als blanco controle. Deze controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn
      
      
        
          - Positieve controle
        
        Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van C. jejuni (bijvoorbeeld ATCC 29428).
        Indien op het laboratorium monsters eindproduct worden ingezet, dan wordt een Preston- buis (of -zakje) aangeënt met de referentiestam en gebruikt als positieve controle. Deze positieve controle wordt getest met de VIDAS CAM test en dient positief te zijn
        Voor de ingangscontrole van een batch dienen te worden meegenomen:
        
          
            Positieve controle zie boven
          
          
            Negatieve controle
          
        
        Hiervoor wordt gebruik gemaakt van een referentiestam van E. coli (bijvoorbeeld ATCC 25922). Deze negatieve controlestam wordt getest met de VIDAS CAM test en dient negatief te zijn.
        Indien geen ingangscontrole wordt uitgevoerd, maar alleen eerstelijnscontrole, dan moet bij deze eerstelijnscontrole altijd een blanco, een positieve én een negatieve controle meegenomen worden.
        Alleen indien de controles een juiste uitslag geven mag de uitslag van de monsters afgegeven worden.
      
    
  
20046108-10-200409-09-2004PPE 4220046108-10-200409-09-2004PPE 4210-10-2004
    
  
    Bijlage
    III
    : Vermeldingswijze van de resultaten van salmonella onderzoeken
  
  Monsters die in de pluimveevlees- en eiersector worden genomen voor bacteriologisch onderzoek:
  
    
      A
      inlegvellen (opfokbedrijven, opfokvermeerderingsbedrijven en vleeskuikenbedrijven):
    
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in inlegvellen’.
  
  
    
      B
      mest (cloacaswabs) (opfokbedrijven, fokbedrijven, opfokvermeerderingsbedrijven)
    
    Cloacaswabs 4 weken:
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.
  
  
    
      C
      cloacaswabs vanaf 16 weken:
    
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.
  
  
    
      C
      dons (broederijen)
    
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in dons’.
  
  
    
      D
      mest (swabs of overschoentjes) (vleeskuikenbedrijven)
    
    Swabs:
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.
    Overschoentjes:
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in overschoentjes’.
  
  
    
      E
      blindedarm (slachterijen)
    
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in blindedarmmest’.
  
  
    
      F
      vellen (slachterijen)
    
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in vellen’.
  
  
    
      G
      eindproducten (slachterijen/uitsnijderijen)
    
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in eindproduct’.
  
  
    
      H
      swabs (broederijen/pluimveestallen)
    
    Het laboratorium bepaalt of Salmonella aan- dan wel afwezig is. Indien Salmonella is aangetoond dan is de uitslag ‘aanwezigheid van Salmonella in swabs’.
  
20041127-02-200412-02-2004PPE 2220041127-02-200412-02-2004PPE 2229-02-2004
    
  
    Bijlage
     IV
    : Serologische bevestiging en serotypering
  
  
    
      3.1
      Serologische bevestiging.
    
    
      
        Onderzoek op auto-agglutinatie:
      
      
        
          =&gt; Breng op een objectglas een druppel zoutoplossing (0,85% NaCl).
        
        
          =&gt; Breng met een steriele entnaald een beetje materiaal van de te onderzoeken kolonie in de druppel zodat een troebeling ontstaat.
        
        
          =&gt; Beweeg gedurende 30-60 seconden het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken).
        
        
          =&gt; Beoordeel het resultaat tegen een donkere achtergrond (met een vergrootglas). De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op auto-agglutinatie van de onderzochte stam. De stammen die auto-agglutinatie vertonen worden niet onderzocht met polyvalent O-serum.
        
      
    
    
      
        Agglutinatie methode:
      
      Agglutineer van Salmonella-verdachte kolonies met polyvalent serum A t/m E of A t/m G; indien negatief vervolgen met polyvalent serum A t/m S.
      
        
          =&gt; Breng op een objectglas een druppel antiserum.
        
        
          =&gt; Breng met een steriele entnaald een beetje materiaal van de te onderzoeken kolonie in de druppel zodat een lichte troebeling ontstaat.
        
        
          =&gt; Beweeg gedurende 30-60 seconden het objectglas heen-en-weer (druppel laten zwenken).
        
        
          =&gt; Beoordeel het resultaat tegen een donkere achtergrond (met een vergrootglas). De aanwezigheid van klontjes in het preparaat duidt op een positieve reactie van de onderzochte stam.
        
      
    
  
  
    
      3.2
      Serotypering.
    
    Agglutineer van Salmonella-verdachte kolonies eerst met serum A t/m E of A t/m G; indien negatief vervolgen met polyvalent serum A t/m S.
    Bij een positieve agglutinatie met polyvalent A t/m G wordt geagglutineerd met de groepssera B, C (C1 en C2), D en E (1 t/m 5).
    Indien positief met B, dan wordt vervolgens geagglutineerd met flagellair antiserum H-i. Hiertoe wordt een schuine agar (bijvoorbeeld nutriëntenagar) beënt (middels ladderen) met de te agglutineren Salmonella en wordt 1 druppel fysiologisch zout (0,85% NaCl) aan deze buis toegevoegd. Na 24 ± 2 uur incuberen bij 37 ° C wordt cultuur van de vochtige schuine zijde genomen voor de agglutinatie met H-i serum.
    Indien H-i positief dan heeft men een Salmonella typhimurium. Indien H-i negatief dan is het een Salmonella B groep.
    Indien positief met D, dan wordt vervolgens geagglutineerd met flagellair antiserum H-m.
    Indien H-m positief dan heeft men een Salmonella enteritidis.
    Indien H-m negatief dan heeft men Salmonella D groep.
    Salmonella die alleen met polyvalent A t/m S agglutineren, kunnen, indien gewenst, voor typering opgestuurd worden naar het RIVM, t.a.v. Infectieziekten, Diagnostiek en Screening laboratorium. Dit geldt tevens voor alle niet-serotypeerbare Salmonella.
  
20041127-02-200412-02-2004PPE 2220041127-02-200412-02-2004PPE 2229-02-2004
    
  
    Bijlage
    V
    : Opmerkingen opdrachtgever bij aanleveren afwijkende monsters, acceptatie criteria
  
  Indien afwijkingen in de voorgeschreven kwaliteit en wijze van aanleveren van monsters zijn geconstateerd, moet in ieder geval bij de volgende punten richting de opdrachtgever een opmerking worden gemaakt, waaruit blijkt dat er in de procedure van monstername en inzenden een afwijking is geconstateerd en om welke afwijking het gaat.
  Ten algemene.
  
    
      =&gt; Indien er tussen de datum van monstername en de datum van ontvangst op het laboratorium meer dan 48 uur is verstreken.
    
    
      =&gt; Indien bij de inzending één van de volgende gegevens ontbreekt: monsterdatum, stalnummer en KIP-nummer.
    
    
      =&gt; Indien monsters zodanig zijn verpakt dat lekkage is opgetreden en zodanig zijn geadresseerd dat voor transporteur en laboratorium verwarring kan ontstaan.
    
  
  Monsters.
  
    
      Inlegvellen (opfokbedrijven, opfokvermeerderingsbedrijven en vleeskuikenbedrijven:
    
    
      
        a)
        Indien onvoldoende inlegvellen worden aangeleverd.
      
      
        b)
        Indien de monsters inlegvellen onvoldoende groot zijn.
      
      
        c)
        Indien de monsters inlegvellen niet duidelijk met mest zijn besmeurd.
      
      
        d)
        Indien de monsters inlegvellen niet worden aangeleverd in een plastic monsterpot of -zak.
      
    
  
  
    
      Dons (broederijen):
    
    
      
        a)
        Indien het monster niet minimaal 25 gram dons bevat.
      
      
        b)
        Indien het monster geen natte dons bevat.
      
      
        c)
        Indien het monster niet in een monsterpot of -zak wordt aangeleverd.
      
    
  
  
    
      Mest (swabs of overschoentjes) (vleeskuikenbedrijven):
    
    Swabs:
    
      
        a)
        Indien onvoldoende swabs worden aangeleverd.
      
      
        b)
        Indien de swabs onvoldoende met mest zijn besmeurd.
      
      
        c)
        Indien de swabs niet tot twee mengmonsters zijn gepoold (tenzij de swabs individueel zijn verpakt).
      
      
        d)
        Indien de swabs niet in monsterpotten worden aangeleverd.
      
    
    Overschoentjes:
    
      
        a)
        Indien onvoldoende paar overschoentjes zijn aangeleverd.
      
      
        b)
        Indien de overschoentjes niet duidelijk met mest zijn besmeurd.
      
      
        c)
        Indien de overschoentjes niet in monsterzakken worden aangeleverd.
      
      
        d)
        Indien elk paar overschoentjes niet in een aparte monsterzak is verpakt.
      
    
  
  
    
      Blindedarmmest (slachterijen):
    
    
      
        a)
        Indien onvoldoende blindedarm monsters zijn genomen.
      
      
        b)
        Indien de blindedarm monsters van onvoldoende formaat zijn.
      
      
        c)
        Indien de blindedarm monsters niet in kunststofbakjes zijn aangeleverd.
      
    
  
  
    
      Vellen (slachterijen):
    
    
      
        a)
        Indien het monster vel van de borstkap niet minimaal 25 gram weegt.
      
      
        b)
        Indien het monster niet gekoeld ( 0 – 4 °C) getransporteerd en bewaard is.
      
    
  
  
    
      Eindproducten (slachterijen/uitsnijderijen):
    
    
      
        a)
        Indien het monster eindproduct niet minimaal 25 gram weegt.
      
      
        b)
        Indien het monster niet gekoeld ( 0 – 4 °C) getransporteerd en bewaard is.
      
    
  
20041127-02-200412-02-2004PPE 2220041127-02-200412-02-2004PPE 2229-02-2004
  
20013120-07-200131-05-2000PPE 5020013120-07-200131-05-2000PPE 5021-07-2001