Phương pháp thấm northern

Phương pháp thấm Northern, hay RNA blot (thấm RNA), là một kỹ thuật được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử để xác định mức độ biểu hiện gen bằng cách đo lượng RNA (hoặc mRNA đã cô lập) xuất hiện trong mẫu thử.

Phương pháp này đã cho phép người ta đã quan sát sự kiểm soát của tế bào lên cấu trúc và chức năng của nó bằng việc xác định mức độ biểu hiện của một vài gen nhất định trong quá trình phân hoá tế bào và tạo hình cơ thể, hoặc khi có bệnh lí và dị thường.

Phương pháp này sử dụng gel điện di để phân tán mẫu RNA theo kích thước, sau đó "thấm" RNA từ gel điện di lên màng thấm (như cách "thấm" mực từ con dấu lên tờ giấy) rồi dùng đoạn dò (là mạch bổ sung) lên một phần hoặc toàn bộ mạch RNA cần nghiên cứu. Thuật ngữ "Northern blot" thực ra chỉ bao gồm bước thứ hai (thấm RNA), nhưng hiện nay đang được sử dụng để chỉ toàn bộ quá trình.

Kĩ thuật thấm Northern được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine, David Kemp và Gerge Stark ở đại học Stanford
Điện di để phân tán mRNA.
Chuyển mRNA sang màng thấm bằng hiện tượng mao dẫn hoặc thấm chân không.

Lí do phải chuyển mRNA sang màng thấm là vì gel điện di cứng, đoạn dò không thể thâm nhập vào mà kết hợp với mRNA trong mẫu thử. Màng nylon mang điện dương là hiệu quả nhất để thấm Northern vì nó dính với axit nucleic mang điện âm.
để thấm RNA từ gel điện di sang màng thấm.]]

Gắn chặt RNA lên màng bằng tia UV hoặc nhiệt để tạo liên kết hoá trị.
Lai RNA trên màng với các đoạn dò đã được đánh dấu sẵn

Phản ứng đoạn dò-RNA cần xúc tác nhiệt độ cao - thứ có thể làm biến tính RNA, vì vậy trong chất nền thường chứa formamide để giảm nhiệt độ cần thiết cho phản ứng này. Sau khi RNA đã được thấm vào màng, nó được cố định bằng tia UV hay nhiệt để tạo các liên kết hoá trị. Những đoạn dò được đánh dấu sẵn sẽ được cho lai với RNA trên màng. Một số điều kiện thí nghiệm có thể làm ánh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của phép lai bao gồm lực ion, độ nhớt, độ dài của mạch kép, số cặp nu không tương thích và thành phần nu. Màng thấm sẽ được rửa để chỉ những đoạn dò đã liên kết với RNA sẽ còn lại trên màng nhằm chống tín hiệu nhiễu. Tín hiệu lai sẽ được dò bởi tia X-ray hoặc phép đo tỉ trọng. Để tạo kiểm soát cho sự so sánh của thấm Northern, những mẫu thử không thể hiện gene đang thử có thể được kiểm tra lại bằng vi dãy (microarrays) hoặc RT-PCR. gel có thể được nhuộm với ethidium bromide (EtBr) và được quan sát dưới đèn UV để xem chất lượng và số lượng của RNA trước khi thấm. Một thang RNA (những mảnh RNA biết trước kích thước) thường được chạy điện di ngay kế bên để dễ quan sát kích thước của những đoạn đang thu;

Đoạn dò (Probe)
Đoạn dò cho thấm northern là các đoạn acid nucleic bổ sung với toàn bộ RNA cần xét. Đó có thể là DNA, RNA hoặc oligonucleotides có ít nhất 25 cặp base bổ sung. Đoạn dò cần được đánh dấu với đồng vị phóng xạ (32P) hoặc chất phát quang (trong cách này, hóa chất đó sẽ được alkaline phosphatase (ALP) hoặc peroxidase cải ngựa (HRP) phân hủy để giải phóng năng lượng ở dạng ánh sáng có thể dò ra). Có thể đánh dấu bằng chất huỳnh quang theo hai cách: đoạn dò gắn với enzyme; hoặc đoạn dò gắng với ligand (vd: biotin) để ligand (vd: avidin, streptavidin) gắn với enzyme (vd: HRP). Các kĩ thuật này đã được sử dụng để chỉ ra sự biểu hiện quá mức của gen sinh ung (gen ung thư) và giảm biểu hiện của gen ức chế khối u trong các tế bào ung thư so với tế bào bình thường; Nếu phát hiện một gen tăng biểu hiện (khi thấy nhiều mRNA trong northern blot), mẫu thử có thể được đem đi xác định trình tự để biết đó là gen đã biết hay gen mới. Ưu điểm của microarrays so với thấm northern là nó có thể kiểm tra hàng nghìn gen cũng lúc, trong khi thấm northern chỉ có thể làm được một hoặc một số ít gen.

Thấm northern ngược
Các nhà nghiên cứu thỉnh thoảng sẽ dùng một biến thể của phương pháp này: thấm northern ngược. Trong phương pháp thấm northern ngược, chất acid nucleic (đã được cố định vào màng) là một bộ những đoạn DNA đã được cô lập, và đoạn dò sẽ là RNA chiết xuất từ mô được đánh dấu phóng xạ. Kĩ thuật DNA microarray phổ biến vào cuối những năm 1990 và đầu những năm 2000s giống với phương pháp này hơn, cũng sử dụng DNA dán sẵn vào cơ chất, rồi đem lai với đoạn dò RNA của tế bào. Cho nên phương pháp thấm northern ngược, dù trước đó không phổ biến, đã cho phép phân tích northern tiến hóa lên thành "lập hồ sơ biểu hiện gen". Trong đó, biểu hiện của nhiều (có thể là tất cả) gen của một sinh vật đã được theo dõi.

Xem thêm

Phương pháp thấm western
Phương pháp thấm eastern
Phương pháp thấm northwestern
Phương pháp thấm far-eastern
Phương pháp thấm far-western
DDRT-PCR

Tham khảo

Liên kết ngoài

OpenWetWare