Die Tweede bloeitydperk het met die Teenreformasie gekom. In 1566 is 'n Jesuïete-akademie in Olomouc gevestig wat elf jaar later tot 'n universiteit verhef is. Vanaf 1855 is hierdie tersiêre instelling egter beperk tot 'n teologiese fakulteit, en eers in 1946 het dit sy vroeëre status as universiteit herwin.