Kolomchromatografie - Soektogte - 2022
Daar chromatografie (van die Grieks χρῶμα, getranslitereer in khrôma, 'kleur'), ​​is 'n tegniek om die komponente van 'n homogene mengsel te skei, gebaseer op die verdeling van die komponente tussen twee fases, een stilstaande en een wat in 'n gedefinieerde rigting beweeg. Inkolomchromatografiedie rigting gaan van bo na onder en word gedikteer deur 'n glasbuis (die kolom).
Daar kolomchromatografie is 'n bepaalde chromatografiese tegniek gebaseer op die eienskap dat sommige stowwe, sodra hulle in geskikte oplossings opgelos is, interaksie met 'n geskikte vaste matriks het. Ek sal probeer om beter te verduidelik wat dit beteken wat ek so pas geskryf het!
Kolomchromatografie: wat dit is
Dit is niks anders as 'n chromatografiese skeidingsmetode wat in 'n glaskolom plaasvind nie. Hierdie tegniek benut die verskil in lading, grootte, bindingsaffiniteit of ander eienskappe van die komponent wat geïsoleer moet word om bande met verskillende eienskappe te skep.
Op die foto's op hierdie bladsy wys ons die rye van diekolomchromatografieen veral die ekstraksie van die eluaat, dit is die "gedeeltelik gesuiwerde" stof wat uit die eindpunt van die glaskolom kom.
Daarkolomchromatografiedit is baie nuttig vir die suiwering van proteïene en vir die skeiding van 'n groot aantal stowwe wat individueel ondersoek moet word. Soms word stowwe geïsoleer metkolomchromatografie hulle verloor die eienskappe wat hulle in die mengsel gehad het. Dit hang alles af van die tegniek vankolomchromatografieen van die stof wat u wil suiwer.
Kolomchromatografie: hoe dit werk
'N Glasbuis is gevul met 'n poreuse vaste materiaal, gedefinieer as'stilstaande fase". Die stilstaande fase het geskikte chemiese eienskappe wat gekies word op grond van die stof wat gesuiwer / geskei moet word van die mengsel. Die kolom word dan gevul met 'n bufferoplossing, ook toepaslik geformuleer. Die bufferoplossing word "mobiele fase"En bevat die mengsel wat u wil skei.
Die mengsel wat geskei moet word, word opgelosmobiele fase. Die mobiele fase kom dangelaagdop die top van diekolomen deurtrek deur diestilstaande fase(die soliede matriks). Op hierdie manier versprei die oplossing langs diekolomen vorm 'n deurlopende band gedurende die hele stilstaande fase. Die stowwe wat die kolom elueer (verlaat) het spesifieke eienskappe gebaseer op die volgorde van vermyding.
Om beter te verstaan, neem ons die voorbeeld van proteïensuiwering, alhoewel die mobiele fase deur enige mengsel voorgestel kan word. Ons sal die individuele proteïene van die kolom min of meer vinnig volgens hul eienskappe.
Volgens die tipe stilstaande fase het ons verskillende tegnieke vankolomchromatografie, Watter:
Daar is ook 'n duurder tegniek wat hoë druk gebruik, naamlik diehoëdruk vloeistofchromatografieof HPLC.
In ioonuitruilchromatografiedie vaste matriks (stilstaande fase) is ryk aan positiewe of negatiewe ladings. Dit spreek vanself dat dieioonuitruilchromatografiemaak gebruik van die verskille in die tipe en intensiteit vannetto elektriese ladingby 'n sekere pH.
In hierdie geval is diestilstaande faseis 'n sintetiese polimeer (hars) wat negatief gelaaide groepe bevat (ons praat dus daarvankatioon-uitruilers) of positief gelaaide groepe (ons praat vananioenskurwers).
Terug na die voorbeeld van proteïensuiwering, is die verskil in lading gekoppel aan die teenwoordigheid van aminosure met sekere funksionele groepe. Die affiniteit van elke proteïen vir die gelaaide groepe vankolomdit hang af van die pH wat weer die ionisasietoestand van die funksionele groepe van die samestellende aminosure beïnvloed.
Inkolomchromatografiedie oplossing wat vir die mobiele fase voorberei word, is van kritieke belang. In ons voorbeeld met proteïene kan die soutkonsentrasie en pH 'n gradiënt skep wat die ekstrusie van sekere proteïene kan bevoordeel.
In die geval van die ioonchromatografiemet katioonuitruilmatriks, het die vaste matriks negatief gelaaide groepe, dus proteïene met netto positiewe lading sal die laaste uit die kolom wees. Die eerste verbindings wat uit diekolomdit is diegene met 'n sterk netto negatiewe lading (deur die matriks af te stoot), dan sal stowwe met 'n gedeeltelike negatiewe lading uitkom. Die stowwe wat geëlueer moet word, beweeg deur diekolommet 'n tarief wat afhanklik is van hul netto heffing in die gebruikte oplossing.
In hierdie geval word die mengsel (mobiele fase) in een bygevoegkolomwat 'n bevatpolimeermet kruisbande en molekules vanisoleerhulle sal volgens grootte geskei word. Instinktief dink 'n mens dat die kleinste molekules eers uit die kolom sal kom, maar in werklikheid is dit presies die teenoorgestelde.
Die groter molekules sal gedwing word om die kortste pad na die einde van die kolom te beweeg. Deur diffusie kan die kleiner molekules die porieë van die vaste matriks binnedring, wat langer neem om te elueer. Die eerste eluaat wat versamel is, is die een wat die grootste molekules bevat.
'N Ligand is in die stilstaande fase aanwesig. Aangesien die oplossing wat geskei moet word deur die kolom gaan, sal molekules wat affiniteit vir daardie ligand het, 'n spesifieke binding vorm. Die stowwe wat van belang is, word in die eerste of laaste fraksie gehou, afhangende van die tipe ligand wat gebruik word.
Hoë druk vloeistofchromatografie
Die tegnieke vankolomchromatografiepas beskryf kan 'n diskrete resolusie van die bande hê. Die rede? Elke stof is geneig om na 'n sekere tyd te versprei.
Deur hoëdrukpompe te gebruik, neem die spoed toe en neem die tyd wat die molekules neem om die kolom te beweeg, af. In hierdie konteks is chromatografiese matrikse nodig wat sterk druk kan weerstaan.
Deur die transittyd deur die kolom te verminder, word diehoëdruk vloeistofchromatografie(HPLC) beperk die verspreiding van die bande en verbeter die resolusie van die versamelde eluaat aansienlik.