Methods for rapid biotyping of Vibrio cholerae based on toxin-coregulated Pilus-protein A (TcpA) variation | Ferreira | Suid-Afrikaanse Tydskrif vir Natuurwetenskap en Tegnologie
Metodes vir vinnige biotipering van Vibrio cholerae gebaseer op toksien-koreguleerde Pilus-proteïen A (TcpA) variasie
Authors: R.E.S. Ferreira1, T.G. Barnard1, G. Koorsen2
Affiliations: 1Department of Biochemistry, University of Johannesburg, South Africa, 2Water and Health Research Centre, University of Johannesburg, South Africa
Correspondence to: R. Ferreira
How to cite this abstract: Ferreira, R.E.S., Barnard, T.G. & Koorsen, G., 2014, ‘Metodes vir vinnige biotipering van Vibrio cholerae gebaseer op toksien-koreguleerde Pilus-proteïen A (TcpA) variasie’, Suid-Afrikaanse Tydskrif vir Natuurwetenskap en Tegnologie 33(1), Art. #1222, 1 page. http://dx.doi.org/10.4102/satnt.v33i1.1222
Methods for rapid biotyping of Vibrio cholerae based on toxin-coregulated Pilus-protein A (TcpA) variation. Cholera is a highly epidemic disease caused by Vibrio cholerae. Rapid and sensitive methods to identify pathogenic biotypes are imperative. Variation in TcpA at protein and gene level was investigated to differentiate between V. cholerae biotypes.
Cholera, ’n hoogs epidemiese diaretiese siekte veroorsaak deur Vibrio cholerae infeksie, affekteer steeds menige lande. ’n Vinnige en sensitiewe metode om patogeniese V. cholerae biotipes te identifiseer is dus noodsaaklik. Onlangse literatuur het die sensitiwiteit van matriks-gerugsteunde laser desorpsie ionisasie tyd-van-vlug massa-spektrometrie (MALDI-TOF MS) en hoë-resolusie smeltkurwe-analise (HRS) vir hierdie doel uitgelig. Beide hierdie tegnieke is sensitief genoeg om ’n enkele aminosuur of basispaarverskil op te tel. Die toksien-kogereguleerde pilus-proteïen A (TcpA) toon groot variasie op genetiese en proteïenvlak. MALDI-TOF MS analise van ru TcpA-ekstrakte uit Vibrio cholerae kan dus moontlik die onderskeidingsvermoë van MALDI-TOF MS verbreed om sub-spesie identifikasie van V. cholerae isolate moontlik te maak. Hier vergelyk ons metodes om pili, wat TcpA bevat, te isoleer. Verder kan variasie in die tcpA geen gebruik word vir vinnige V. cholerae biotipering deur middel van HRS. Ons bespreek ons vordering op hierdie gebied hieronder.
Ru TcpA-ekstraksie. Pili is geskei van die selliggaam deur verskeie meganiese sleurmetodes en gesuiwer deur middel van MgCl2-neerslag. Om die bakteriële membraan te isoleer is selle in hipotoniese oplossings of deur middel van sonikasie oopgebreek, en brokstukke is onderwerp aan ultrasentrifugasie. Die sukses van hierdie strategie om ru TcpA ekstraksies te lewer is ge-evalueer deur transmissie elektron mikroskopie (TEM) en proteïen jel elektroforese. HRS analise. Voor HRS analise uitgevoer was, is voorvoerderpare ontwerp om tcpA te amplifiseer uit alle V. cholerae stamme. Dit was bereik deur tcpA-sekwensies van die National Centre for Bioinformatics (NCBI, VSA) databasis te verkry. As gevolg van die hoë variasie van hierdie geen in V. cholerae was die gekonserveerde streke binne die geen beperk. Tien voorvoerderpare is ontwerp en die spesifisiteit van elk ge-evalueer deur middel van polimerase kettingreaksie (PKR), waarna die spesifieke voorvoerderpare in HRS-eksperimente gebruik is.
Alhoewel pili suksesvol geïsoleer is deur meganiese sleurmetodes, was die hoeveelhede onvoldoende vir opsporing van TcpA op proteïen-jels. Die bereiding van TcpA ekstrakte volgens die ge-evalueerde metodes is dus onprakties vir MALDI-TOF MS biotipering. Tans fokus ons ondersoeke dus op die gebruik van HRS vir sub-spesie identifikasie en onderskeiding van V. cholerae gebaseer op die variasie in die tcpA geen. Aanvanklike toetse op V. cholerae verwysingstamme lyk belowend. Drie voorvoerderpare was voldoende om onderskeid te tref tussen V. cholerae O1, V. cholerae O1 El Tor en V. cholerae O139. Een voorvoerder paar het verder onderskeid getred tussen the V. cholerae serogroepe O1 en O139. Ons is tans besig om die metode te verfyn en verder te ontwikkel om te onderskei tussen omgewingsisolate van V. cholerae patogene.