KMR spektroskopie opsporing metodes vir proteïene - Inligting - 2022
KMR-spektroskopie-opsporingsmetodes vir proteïene
Ek het op 'n tabel afgekom wat die sensitiwiteite van verskillende opsporingsmetodes in KMR-spektroskopie vergelyk: "Direk", "DEPT" en "Inverse", waar "Inverse" blykbaar die sensitiefste is.
Wat presies is daardie verskillende metodes en hoe verskil hulle?
In die meeste gevalle, wanneer jy KMR-eksperimente op proteïene uitvoer, bespeur jy die sein op die protone. Selfs as jy na ander kerne kyk, dra jy uiteindelik die magnetisering na 'n proton oor en bespeur daardie sein. Dit is eenvoudig die mees sensitiewe metode as gevolg van die hoë gyromagnetiese verhouding van 1H, en dit is die metode wat in jou figuur as "omgekeerd" gemerk word. Dit is amper die verstek manier om heteronukleêre spektra te meet.
Direkte opsporing beteken dat jy direk die minder sensitiewe kern waarneem 13C. Dit hou sekere voordele in veral vir groot proteïene waar jy dikwels die protone moet deutereer om enigiets nuttigs te kan meet.
DEPT is 'n tipe eksperiment waar magnetisering vanaf die direk aangehegte protone na die heteronukleus oorgedra word. Dit verhoog die sensitiwiteit en laat CH en CH onderskei3 groepe van CH2 groepe
Strukturele biologie van ysterbindende proteïene deur KMR-spektroskopie
Hierin verskaf ons 'n oorsig van die KMR-strategieë wat in ons laboratorium ontwerp is om by te dra tot die beantwoording van 'n paar basiese vrae in anorganiese strukturele biologie, wat strek vanaf die aanvanklike ontginning van paramagnetiese KMR-beperkings vir die bepaling van die strukturele en dinamiese eienskappe van klein geïsoleerde metalloproteïene, tot die studie van ultra-swak proteïen-proteïen-interaksie tot die studie van heem- en ysterhandel. Die hersiene voorbeelde behandel die rol van sommige metalloproteïene of metaalbindende proteïene in fundamentele biologiese prosesse. Die voorbeelde handel oor makromolekulêre samestellings wat veral uitdagend is vir KMR-toepassings met betrekking tot hul kompleksiteit.
'n Verskeidenheid KMR-strategieë word ontgin om 'n paar ysterbindende makromolekulêre samestellings van toenemende grootte en kompleksiteit te ondersoek. Die voorbeelde wat verskaf word is relevant vir sommige sleutel biologiese prosesse soos sitochroom c-afhanklike apoptose, heem-verkryging as 'n ysterbron van mikroörganismes, en ferritien- bemiddelde ysterbiomineralisering.
Twee metodes vir die opsporing van proteïen-proteïen-interaksies in oplossing deur gebruik te maak van eendimensionele (1D) KMR-spektroskopie word beskryf. Beide metodes maak staat op die meting van die intensiteit van die sterkste metielresonansie (SMR), wat vir die meeste proteïene by 0,8-0,9 ppm waargeneem word. Die ernstige resonansie-oorvleueling in hierdie streek vergemaklik opsporing van die SMR by lae mikromolêre en selfs sub-mikromolêre proteïenkonsentrasies. 'n Verminderde SMR-intensiteit in die 1H KMR-spektrum van 'n proteïenmengsel in vergelyking met die bygevoegde SMR-intensiteite van die geïsoleerde proteïene meld dat die proteïene interaksie het (SMR-metode). Verminderde SMR-intensiteite in 1D 13 C-geredigeerde 1 H KMR-spektra van 13 C-gemerkte proteïene by toevoeging van ongemerkte proteïene of makromolekules demonstreer ook binding (SMRC-metode). Ontleding van die interaksie tussen XIAP en Smac, twee proteïene betrokke by apoptose, illustreer beide metodes. 'n Studie wat toon dat fosfolipiede meeding met die neuronale kernkompleks vir Ca 2+ -afhanklike binding aan die presinaptiese Ca 2+ -sensor sinaptotagmin 1 illustreer die bruikbaarheid van die SMRC metode in die bestudering van multikomponent sisteme.
Hierdie werk is ondersteun deur 'n toekenning van die Welch Foundation en deur NIH Grant NS40944.
Aan wie korrespondensie gerig moet word. Telefoon: (214) 648-9026. Faks: (214) 648-8673. E-pos: [epos beskermd]
KMR-spektroskopie-opsporingsmetodes vir proteïene - Biologie
KMR-spektroskopie speel 'n deurslaggewende rol in die geneesmiddelontdekking en -ontwikkelingsproses. Hier bespreek ons ​​huidige KMR-gebaseerde siftingstrategieë wat gebruik word om treffers te vind, gevolg deur hul validering en verdere verbetering om te lei optimalisering. KMR-siftingseksperimente is baie doeltreffend en veelsydig om hoë-affiniteit-ligande vir biologies relevante makromolekules te ontdek, ligand-bindingsplekke toe te lig, klein molekules met wye reekse bindingsaffiniteit te identifiseer en sodoende 'n waardevolle en robuuste hulpmiddel in die struktuurgebaseerde geneesmiddel te wees. ontwerp. Hierdie KMR-siftingsmetodologieë is gebaseer op die waarneming van teiken- en ligand-resonansies as 'n metode van opsporing vir die identifisering van swak-bindende verbindings en help om hul bevordering tot kragtige dwelm-agtige inhibeerders vir gebruik as hoofverbindings in geneesmiddelontdekking.
Moderne ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddels is 'n multi-stap benadering, van die vind van treffers tot die optimalisering van leidrade. Hierdie benadering begin met die identifisering van 'n "dwelmbare" teiken vir 'n bepaalde siekte en die toetsing van die geldigheid daarvan. Sodra die teiken gekies is, word die aanvanklike sifting op 'n biblioteek van verbindings gedoen om die treffers te identifiseer wat aan die teiken kan bind. Daarna word die gekose loodverbindings uit die voorlopige ondersoek onderworpe aan verdere optimalisering gebaseer op die verbetering van die eienskappe van hierdie loodverbindings ten opsigte van beter sterkte, metaboliese stabiliteit, affiniteit, selektiwiteit, orale biobeskikbaarheid en verminderde newe -effekte. Die hoofverbindings wat op die kortlys is deur die bereiking van hierdie eienskappe, word verder aan kliniese proewe onderwerp.
Vir die verkenning van die geneesmiddelontdekking en -ontwikkelingsproses, is begrip van die struktuur van biologiese molekules op atoomvlak noodsaaklik om daardie kennis te gebruik om geneesmiddelkandidate te ontwerp wat hulle kan teiken. Kernmagnetiese resonansie (NMR) spektroskopie speel 'n belangrike rol in die bereiking van die gewenste doelwit, met 'n hoë suksessyfer in die ondersoek van verbindings wat as potensiële geneesmiddelkandidate vir die genesing van siektes gebruik kan word. Gedurende die afgelope dekade was NMR -spektroskopie 'n baie doeltreffende en veelsydige instrument vir die ontdekking en ontwikkeling van geneesmiddels, aangesien dit lig kan werp op die molekulêre struktuur van die biomolekules, die struktuur van die geneesmiddels kan toelig en verifieer en strukturele inligting kan verskaf oor die interaksie van die biomolekules (teiken) met klein molekule verbindings (ligande) dus bewys KMR spektroskopie 'n uitstekende hulpmiddel in farmaseutiese navorsing , byvoorbeeld, biokatalitiese vervaardiging van dwelm islatravir . Aangesien die klinies gebruikte middels tipies natuurlike of sintetiese verbindings is, is kwantitatiewe ontleding deur oplossing-toestand KMR baie nuttig om die kontaminasieprofiel van die middels te skat, die samestelling van dwelmprodukte te beskryf en die metaboliete van dwelms in liggaamsvloeistowwe te ondersoek, of te bestudeer. die dinamika en kinetika van proteïene op vaste oppervlaktes [3, 4], of ensiem allosterie . Vaste-toestand NMR-metodes kan kennis bied oor polimorfisme van geneesmiddels in poeiervorm en die konformasie daarvan in tablette of die aktiewe plek van tryptofansintase , of die strukturele eienskappe van die toksiese en nie-toksiese tipes α-synuclein oligomere [7 ]. Mikrobeelding is nuttig om die oplos van tablette te bestudeer .
Hierdie oorsig sal hoofsaaklik fokus op die oplossingstoestand KMR-metodes wat geïmplementeer is vir teikenmedikasiebaarheid, trefidentifikasie en validering gevolg deur loodoptimalisering in die veld van geneesmiddelontdekking en -ontwikkeling. In die onlangse verlede is baie nuwe KMR-gebaseerde strategieë ingestel om die sensitiwiteit van die metodes te verhoog om hoër deurset te kry in trefferidentifikasie, validering en loodoptimalisering sowel as in die evaluering van teiken-medikasiebaarheid. 'n Oorsig van KMR-siftingsmetodes wat in geneesmiddelontdekking en -ontwikkeling geïmplementeer is, word in figuur 1 getoon. Die KMR-gebaseerde siftingsmetodes behels hoofsaaklik twee maniere van opsporing gebaseer op óf teikenresonansies of ligand resonansies.
NMR-siftingsmetodes is 'n baie betroubare en waardevolle hulpmiddel vir die identifisering van klein molekules en tref-tot-lood-optimalisering. 'n Biblioteek van verbindings word gekeur vir die vind van die treffers wat aan 'n spesifieke teiken kan bind, gevolg deur hul validering, waarvoor KMR-bindingstoetse van hoë doeltreffendheid kan wees. Hierdie metodes sluit die volgende in.
In chemiese verskuiwingversteuringsbenadering , kan die inligting oor die intermolekulêre interaksie tussen die verbinding (ligand) en die proteïen (teiken), onttrek word op grond van die chemiese verskuiwingsverskille tussen die vrye en gebonde proteïen. Hierdie chemiese verskuiwingsverskil word gegenereer as gevolg van die binding van die verbinding aan die teikenproteïen, wat versteuring in die chemiese verskuiwing van die magnetiese kerne by die bindingsplek veroorsaak. Vir hierdie metode moet die teikenproteïen gemerk word met stabiele isotope, 15 N en/of 13 C, vir die verkryging van die 15 N/ 1 H en 13 C/ 1 H tweedimensionele hetero-kernkorrelasie KMR-spektra van die vrye en die gebonde vorms van die proteïen [10, 11]. Die eenvormige isotoop-etikettering van die proteïen is noodsaaklik om die sensitiwiteit en resolusie te verhoog asook om die kompleksiteit van die KMR-spektra te verminder. Boonop help dit ook om die opeenvolgende resonansie-toewysing te verskaf deur die multidimensionele drievoudige resonansie-eksperimente  te gebruik, wat saam met chemiese verskuiwingsanalise ondubbelsinnige identifikasie van die ligging van die bindingsplek van die ligand op die teikenproteïen kan verskaf.
So hierdie metode het baie voordele. Behalwe dat dit baie betroubaar en reproduceerbaar is, kan dit belangrike strukturele inligting oor die ligand-bindingsplek verskaf. Dit kan verbindings met lae tot hoë affiniteite vir die teiken opspoor (gewoonlik verbindings met dissosiasie konstantes op die mM tot nM reeks), selfs 'n uiters swak binding kan ondersoek word. Die dissosiasiekonstante (Kd) kan gemeet word deur die resonansie van die teiken as 'n funksie van die ligandkonsentrasie in titrasie-eksperimente te volg en die fraksionele chemiese verskuiwingverandering met die totale ligandkonsentrasie te korreleer . As die struktuur van die teiken met behulp van NMR-metodes toegelig is, kan die ligand-proteïenafstand afgelei word deur kern-Overhauser-effek (NOE)-tipe eksperimente  wat meer akkurate bindingsmodusbepaling van die ligand sal toelaat.
Daar is nog 'n KMR-teikenresonansie-gebaseerde benadering wat deur Fesik en sy medewerkers  ingestel is om die kompleksiteit van KMR-siftingsmetodes te verminder en die doeltreffendheid van hoë-deurset-sifting te verhoog. In hierdie KMR-sifting, metielgroep chemiese verskuiwing veranderinge word waargeneem. Die metielgroepe in individuele aminosure word selektief gemerk met 13 C en gemonitor deur 13 C/ 1 H chemiese verskuiwingsveranderings van die metielresonansies in 2D 13 C- 1 H HSQC spektra . Hierdie benadering is voordelig in terme van die verhoging van die sensitiwiteit met drievoudig in vergelyking met eksperimente gebaseer op 15 N/1 H chemiese verskuiwing verandering en bied 'n komplementêre benadering tot sulke eksperimente veral wanneer die ligande naby valien, leucine of isoleucien metielgroepe geleë is. Verder, sifting van hoë molekulêre gewig proteïen teikens (MW > 50 kDa) is haalbaar met selektiewe metielgroep etikettering in 'n geperdeutereerde oplosmiddel.
Die ligand-resonansie-gebaseerde KMR-siftingsmetodes is meer divers as teikengebaseerde benaderings en het dus bykomende voordele, byvoorbeeld, hierdie eksperimente vereis nie isotoop-gemerkte proteïene nie, slegs 'n klein hoeveelheid proteïene is nodig, minder verkrygingstyd word benodig vir die eksperimente aangesien dit oor die algemeen eendimensioneel is en nie die tweedimensionele eksperimente wat vereis word vir 'n teikengebaseerde benadering nie, en daar is geen boonste limiet op die grootte van die teiken vir sifting nie. Fluoor-KMR-spektroskopie het egter 'n reproduceerbaarheidsprobleem as gevolg van die spektrometerontwerp en die skaalstelsel vir die kalibrasie van heteronukleêre KMR-spektra sonder interne verwysing .
Saturasie-oordragverskil (STD) KMR-eksperiment behels selektiewe bestraling van protonresonansies van proteïen deur gebruik te maak van 'n Gaussiese polstrein. Die versadiging word vinnig oor die hele proteïen gepropageer as gevolg van die spindiffusie-effek. As ligand aan 'n proteïen bind, word versadiging ook oorgedra na die gebonde ligand deur kruisverslapping by die ligand-proteïen-koppelvlak, wat lei tot die verswakking in die intensiteit van die ligandsein. Die STD-spektra wat seine van die bindingsligande bevat word verkry deur die resulterende spektrum van die verwysingspektrum af te trek sonder versadiging . Hierdie metode help met epitoopkartering (bepaling van die farmakoforiese groepe) van die direkte bindende segmente van die ligand en identifikasie van 'n ligand direk vanaf 'n mengsel van verbindings.
Water-ligand waargeneem via gradiëntspektroskopie (WaterLOGSY) is 'n waardevolle metode vir die identifikasie van ligand wat aan 'n teikenbiomolekule bind. In hierdie KMR-eksperiment word die magnetisering van grootmaatwater via die proteïen-ligand-kompleks na vrye ligand oorgedra. Die resonansies van die gebonde ligand verskyn met die teenoorgestelde teken as dié van die nie-gebonde ligande, en is dus baie nuttig vir primêre KMR-sifting . Hierdie metode het egter 'n paar nadele, byvoorbeeld, dit verskaf nie inligting oor die ligand-bindingsplek nie. Dit is ook nie in staat om ligande te identifiseer met 'n sterk bindingsaffiniteit vir die doelwit en 'n stadige dissosiasie tempo nie. Om hierdie probleem te oorkom, word nog 'n bindende eksperiment ontwerp, m.a.w., Kompetisie Water-ligand waargeneem via gradiëntspektroskopie (c-WaterLOGSY)  wat die opsporing van sterk bindmiddels moontlik maak. Hierdie eksperiment is van toepassing op die identifisering van potensiële sterk remmers met geringe oplosbaarheid, aangesien dit 'n lae ligandkonsentrasie vereis. Die tegniek is hoofsaaklik geskik vir vinnige sifting van chemiese mengsels en plant- of swamme-ekstrakte. Dit is opmerklik dat soortgelyke kompetisie-gebaseerde benadering toegepas kan word op baie ander ligand-bespeurde KMR-siftingsmetodes. Die basiese beginsel vir die kompetisie-gebaseerde eksperimente  behels aanvanklik die identifikasie van 'n verwysingsverbinding met medium tot lae affiniteit vir die teiken wat aan die teikenproteïen bind, gevolg deur die verplasing daarvan met 'n ander toetsligand wat aan dieselfde teiken bind. met 'n hoër affiniteit. Hierdie kompetisie-gebaseerde siftingsmetodes het dus bykomende voordele met betrekking tot konvensionele metodes, soos om te help met die identifisering van hoë-affiniteit-ligande wat nie deur konvensionele metodes opgespoor word nie, die opsporing van ligande wat aan die aktiewe plek van die proteïen bind en dus nie-spesifieke binding te vermy. ligande.
Spin-etikette wat aan Proteïen-sykettings geheg is as 'n hulpmiddel om interaksieverbindings te identifiseer (SLAPSTIC) is nuttig en sensitief vir primêre sifting van verbindings deur KMR aangesien die intermolekulêre interaksie tussen die ligand en die proteïen geïdentifiseer en gekenmerk kan word deur spin-etikette . Die draai etikette (bv., 'n paramagnetiese organiese nitroksiedradikaal TEMPO) is kovalent aan die proteïen geheg en veroorsaak die paramagnetiese ontspanningsversterking (PRE) van ligandresonansies as hulle naby (in die algemeen tot 15-20 Å afstand) aan spin-etiketgroepe is. Byvoorbeeld, 'n klein ligand in oplossing het gewoonlik skerp KMR-resonansies. Wanneer dit bind aan die paramagnetiese spin-gemerkte proteïen teiken, ervaar dit 'n beduidende vermindering in die resonansie intensiteit as gevolg van PRE effek deur die spin etiket op die ligand .
Target Immobilized KMR Screening (TINS) proses is vinnig, sensitief en identies vir elke teiken, ongeag hul grootte en chemiese samestelling. In hierdie metode word die ligande gekeur op grond van hul bindingsvermoë aan die geïmmobiliseerde proteïen-teiken. Die mengsel van verbindings uit 'n chemiese biblioteek word op die geïmmobiliseerde proteïen-teiken toegedien, en binding word opgespoor deur die resulterende 1D KMR-spektrum te vergelyk met dié van 'n geskikte kontrolemonster . Hierdie metode is bekragtig vir 'n verskeidenheid ligande wat proteïene en nukleïensure met 'n K teikenD van 60 tot 5000 μM. Vir vinnige karakterisering van die ligand-bindingsplek, kan TINS ​​in kompetisiemodus gebruik word. Hierdie metode het verskeie voordele. Dit vereis 'n kleiner hoeveelheid teikenproteïen in vergelyking met ander fragment-gebaseerde benaderings, aangesien die proteïen hergebruik kan word om die biblioteek van verbindings te sift. Dit is sensitief vir die binding van 'n ligand aan die teiken met 'n wye reeks affiniteite en sal dus waarskynlik nie nuwe treffers miskyk nie. Daarbenewens kan swak bindingsinteraksie en binding van die ligande aan ander allosteriese plekke met 'n lae affiniteit uitgeroei word. 'n Baie hoë vlak van spesifisiteit kan bereik word deur die kontrolemonster versigtig te kies. Dit kan ook nuttig wees vir die sifting van harde teikens soos membraanproteïene, wat moeilik is om te produseer of onoplosbaar is.
Ontspanning-geredigeerde KMR-eksperimente is instrumenteel in die monitering van 'n wye reeks ligand-affiniteit. Aangesien binding van 'n ligand aan teikenproteïen die ontspanningstyd verander, laat dit 'n skatting van die affiniteit toe en die interaksie funksionele groepe word deur die opboukrommes geïdentifiseer. Hierdie ontspannings-geredigeerde KMR-benadering  sluit roterende raam kernspin longitudinale ontspanningstyd in (T1ρ) en Transversale kernspin-ontspanningstyd (T2) metings as 'n manier van opsporing. Byvoorbeeld, 'n teiken (proteïen) molekule is oor die algemeen groot, en het dus stadige translasie diffusie, stadige tuimel, vinnige ontspanning, korter T2, breë lynwydtes en negatiewe NOE, terwyl ligande klein molekules is en vinnige translasiediffusie het, vinnige tuimering, stadige ontspanning, langer T2, smal lynwydtes en positiewe NOE. Wanneer 'n ligand met die proteïen in vinnige uitruiling bind, minder vinnig diffundeer en vinnig ontspan, sal negatiewe NOE vir die ligand waargeneem word, aangesien dit KMR-eienskappe soortgelyk aan dié van die teiken verkry, en die resonansielyne sal verbreed word, wat 'n duidelike aanduiding van binding.
Diffusie-geredigeerde KMR-eksperimente behels die meting van diffusietempo's vir ligande in die gebonde en vrye toestand. Aangesien ligand in die vrye vorm vinniger as gebonde vorm diffundeer as gevolg van hul grootte verskille, kan hierdie kenmerk ontgin word in die sifting van die ligande wat aan die teiken kan bind. Vir hierdie tipe eksperiment word diffusiefilters gebaseer op gepulseerde veldgradiënt (PEG)-gestimuleerde eggo (STE) eksperimente  gebruik. BT Falk et al het byvoorbeeld 1D- en diffusieprofielmetodes gebruik om ultra-vinnigwerkende insulienformulering  te optimaliseer.
Oorgeplaasde Nuclear Overhauser-effek (Tr-NOE's) is 'n nuttige siftingsinstrument om ligande te onderskei van 'n mengsel van verbindings wat aan 'n gegewe teikenproteïen kan bind, of om pare molekules te identifiseer wat gelyktydig aan 'n proteïen bind op allosteriese terreine (interligand NOE's). As die ligand lae-affiniteitsbinding of swak interaksies met die teikenproteïen het, kan oorgedra NOE (trNOE) spektroskopiemetode  'n uitstekende alternatief bied. TrNOE lewer inligting oor die oriëntasie van die ligand by die proteïenbindingsplek. Twee van die bogenoemde tegnieke, STD en Water-LOGSY, is gebaseer op oordrag-NOE tipe eksperimente.
NOE Pumping kan betroubare kennis gee oor die proteïen-ligand-interaksies sonder die behoefte aan isotoop-etikettering of chemiese skeiding. In hierdie eksperimente word die magnetisering van proteïen na die gebonde ligande oorgedra of omgekeerd, en die inligting oor proteïen-ligand-interaksies word verkry deur die dipool-dipool-interaksies tussen hulle. Magnetisering wat van die proteïen oorgedra word, word in die vrye ligande opgehoop as gevolg van vinnige uitruiling tussen vrye (stadige ontspanning) en gebonde (vinnige ontspanning) ligande, wat lei tot 'n pompeffek vir die NOE . Hierdie metode het egter 'n paar beperkings, soos dat 'n beduidende verskil in transversale ontspanningstye of diffusiekoëffisiënte tussen die teiken en ligande noodsaaklik is, en die bindende interaksie tussen die vrye en gebonde toestande van die ligand moet in die vinnige uitruilregime plaasvind KMR tydskaal.
Affiniteitsetikette KMR-bindingstoets kan proteïen-proteïeninteraksie opspoor deur die gebruik van affiniteitsetikette . In hierdie benadering word een van die proteïenbindende vennote geheg aan 'n ligand-bindende domein met 'n medium affiniteit vir die ligand. Die interaksie tussen die proteïen en sy potensiële bindingsvennoot word ondersoek deur veranderinge in die ontspanningstempo van die ligand, wat omkeerbaar gebind is aan die ligandbindende domein. Die verandering in die ontspanningstempo van die ligand word bepaal deur die molekulêre gewig en molêre verhouding van die ternêre proteïen-proteïen-ligandkompleks. Die grootste voordeel van hierdie metode is die relatief lae hoeveelheid ongemerkte proteïene wat benodig word.
Fluoor chemiese verskuiwing Anisotropie en ruil vir Sifting (FAXS) is betroubare, hoogs reproduceerbare, groot dinamiese reeks, ligand-gebaseerde 19 F KMR siftingsmetode . Die basiese beginsel van hierdie metode is dat wanneer die kompeterende ligand aan die teikenproteïen bind, dit die gefluoreerde spioenmolekule wat reeds daaraan gebind is, verplaas. Die sein van die gefluoreerde spioenmolekule wat breed was, word aanvanklik skerp as gevolg van die verplasing van die reseptorproteïene en word opgespoor deur 19 F NMR. Hierdie metode het aansienlike voordele bo die oorspronklike kompetisie-gebaseerde benaderings wat 1H KMR gebruik. Byvoorbeeld, die sifting van 'n mengsel van verbindings word makliker as gevolg van die afwesigheid van spektrale oorvleueling en vereis lae verbruik van proteïen. 'n Groot chemiese skuif-anisotropie van fluoor en 'n beduidende uitruilbydrae help om 'n swak-affiniteit-spioenmolekule te kies, wat dus 'n laer bindingsaffiniteitsdrempel vir die geïdentifiseerde KMR-treffers tot gevolg het.
Drie Fluoor Atome vir Biochemiese Sifting (3-FABS) is 'n substraat-gebaseerde 19 F KMR metode  wat hoofsaaklik gebruik word vir funksionele sifting van ensiem inhibisie reaksies. In hierdie metode, 'n CF3-gemerkte substraat word gebruik om die ensiematiese reaksie uit te voer waarin 'n CF3 deel word as 'n sensorgroep gebruik. Die chemiese modifikasie van die substraat deur die ensiem veroorsaak 'n verandering in die elektroniese wolk van die CF3 deel van die substraat, wat lei tot duidelike 19 F chemiese verskuiwings vir die substraat en die ensiematies-gemodifiseerde reaksieproduk. Hierdie tegniek word hoofsaaklik gebruik vir die monitering van ensiematiese reaksies. Dit laat vinnige en betroubare funksionele sifting van saamgestelde biblioteke en akkurate meting van IC50-waardes toe .
KMR-siftingsmetodes het wye toepassing tydens die loodoptimeringsproses om die farmakokinetiese eienskappe van die ligand te verbeter. Aangesien treffers wat verkry word oor die algemeen swak bindmiddels is, is hul optimalisering noodsaaklik, dit kan bereik word deur die ligande te laat groei, saam te voeg of te koppel. KMR-metodes kan strukturele inligting van hoë gehalte verskaf vir komplekse van swak gebonde ligande, en word ook gebruik om die proteïene wat nie kristalliseer nie, te karakteriseer. NMR -metodes vir loodoptimalisering het ook twee opsporingsmetodes, teikenresonansies en ligandresonansies.
Targetresonansie-gebaseerde insluit Structure-Activity Relationship (SAR) deur NMR [32, 33] is 'n gekoppel-fragment benadering om die bindingsaffiniteit van die ligand te verhoog. In hierdie metode word ligande uit 'n biblioteek van verbindings geïdentifiseer deur 1 H- 15 N HSQC eksperiment, gebaseer op hul bindingsaffiniteit vir die teiken, en word dan geoptimaliseer deur chemiese modifikasie. In die teenwoordigheid van versadigende hoeveelhede van die voorheen geoptimaliseerde eerste ligand, word identifikasie van die tweede ligand uitgevoer saam met die optimalisering daarvan vir die tweede plek. Laastens word die twee ligande kovalent gekoppel om die hoë-affiniteitsligand te kry wat aan twee naburige terreine kan bind, en die ligandbinding word getoets deur chemiese verskuiwingskartering. Hierdie tegniek het wye toepassing, aangesien die strukturele inligting wat vir die twee loodverbindings verkry word, baie nuttig is in die chemiese sintese van 'n tweetandige ligand met hoër affiniteit.
H2O/D2O-wisselkoersmeting is nuttig om die bindende epitoop te identifiseer . In hierdie metode word die uitruiltempo van 'n kovalent-gebinde waterstofatoom (amiedproton van die proteïenruggraat) met 'n deuteriumatoom, of omgekeerd, gemeet. Vir hierdie doel word die uitruilreaksie vir die vrye proteïen en sy kompleks met sy ligand uitgevoer. As die ligand aan die teikenproteïen bind, sal die amiedprotone by die bindingsplek in die kompleks beskerm word en stadig uitruil. Die uitruilstreke word dus vergelyk en die wisselkoers kan gemeet word.
Vir die optimalisering van 'n loodverbinding deur 'n koppelingsproses, is dit nodig dat twee ligande binne die nabyheid van mekaar moet bind. Oor die algemeen heg ligande maklik aan die primêre bindingsplek van die proteïen. Tweedeplekbinders het egter baie swakker affiniteit as die eersteplekbinders vir die teiken, en daarom word hul opsporing moeilik. Daar is 'n paar KMR-gebaseerde metodes, wat hieronder bespreek word, wat hierdie swak interaksies sterk kan opspoor, (ii) Ligand-resonansie-gebaseerde benadering sluit in:
SLAPSTIC met 'n spin-gemerkte ligandmetode op die eerste plek maak gebruik van paramagnetiese ontspanningsverbetering (PRE) -effek en is baie handig om die binders op die tweede plek te identifiseer deur middel van paramagnetiese spinetikette op die ligand. In hierdie metode word 'n eerste-plek ligand gemerk met 'n paramagnetiese middel, bv., TEMPO, en word gebruik as 'n sonde vir die sifting van die tweedeplekbinders. Ligande wat aan die tweede plek bind is naby aan die eerste plek ligand, dus word lynverbreding in KMR-seine waargeneem as gevolg van paramagnetiese ontspanningsversterking. Hierdie metode is robuust omdat PRE-effek slegs waarneembaar is as beide die ligande aan hul onderskeie plekke bind, gelyktydig of naby aan mekaar, wat die sifting meer betroubaar maak .
Nog 'n metode om tweede-plek binders te identifiseer is gebaseer op inter-ligand NOE (ILOE) . In hierdie metode, by 'n hoë konsentrasie van eerste-plek binders, word sifting gedoen vir die tweede-plek binders, en NOESY-tipe eksperimente bespeur intermolekulêre ligand-ligand NOE's. ILOE's word slegs waargeneem as binders van die eerste en tweede plek naby is (
5 Å). Hierdie metode het egter 'n nadeel, deurdat swak ILOE's waargeneem word aangesien tweedeplekligande met lae affiniteit bind, en eersteplekbinders het dikwels swak oplosbaarheid wat die versadiging van die bindingsplek verhoed. Hoë konsentrasies tweedeplekligande en NOESY met langer mengtyd (200-600 ms) word aanbeveel.
SAR deur ILOEs bespeur die interaksie tussen twee ligande wat aan dieselfde proteïen bind, maar aan aangrensende plekke . Dit identifiseer eerste swak treffers wat verbeter word deur chemiese modifikasie-benaderings in bi-dentate ligande met hoër affiniteit, deur inligting van die proteïen-gemedieerde ligand-ligand NOE's (ILOE's) in komplekse mengsels te gebruik. Deur hierdie metode kan inligting oor beide die ligande wat saambind en oor die dele van die ligande wat proksimaal aan mekaar bind uit 'n enkele NOESY eksperiment verkry word. Hierdie eksperiment verg egter 'n langer mengtyd (300-800 ms) om die opsporing van ILOE te maksimeer.
Pharmacophore deur ILOEs bespeur ook proteïen-gemedieerde ligand-ligand interaksie en gebruik inligting vir die farmakofore-gebaseerde soektog van moontlike gekoppelde molekules uit groot databasisse van kommersieel beskikbare verbindings . Hierdie farmakofor-gebaseerde soektog gerig deur eksperimentele bindingsdata van swak interaksie ligande kan van hoë doeltreffendheid wees in die identifisering of sintetisering van die hoë-affiniteit, selektiewe ligande.
INTEr-ligand NOE's vir PHARmacophore MApping (INPHARMA) bespeur proteïen-gemedieerde ligand-ligand interaksie gebaseer op die kompetisie tussen die twee ligande vir dieselfde bindingsplek . In hierdie metode word interligand NOE's waargeneem tussen twee kompeterende ligande A en B wat aan dieselfde teiken bind. Sulke inter-ligand NOE-effekte word bemiddel deur spindiffusie vanaf die eersteplekligand deur proteïenprotone en terug na ligande wat met die eersteplekligand kompeteer vir dieselfde bindingsplek. Hierdie inligting kan gebruik word om die relatiewe oriëntasie van kompeterende ligande in die bindingsak van die teikenproteïen te bepaal.
Benewens die bogenoemde KMR-siftingsmetodes, is daar 'n paar addisionele metodes wat effens verskillende benaderings vir loodoptimering toepas. Dit sluit in
SHAPES Sifting: In onlangse jare was hierdie siftingsmetode algemeen in farmaseutiese navorsing. Hierdie strategie kombineer KMR-sifting van 'n biblioteek van klein dwelm-agtige molekules met verskeie komplementêre tegnieke, soos virtuele sifting, hoë deurset ensiematiese toetse, kombinatoriese chemie, X-straal kristallografie, en molekulêre modellering in die soeke na nuwe leidrade. In hierdie benadering word binding van klein maar diverse geneesmiddelagtige molekules aan die teiken geassesseer om 'n leidraad te vind. Die steier vir klein molekules is hoofsaaklik afgelei van vorms of raamwerke wat algemeen in suksesvolle dwelms aangetref word .
NMR Structureel Orientated Library Valency Engineering (NMR SOLVE) metode behels 'n fragmentkoppelingsbenadering om ligande vir ensiemfamilies te identifiseer . Dit is gebaseer op selektiewe isotoop-etikettering op spesifieke aminosure van die proteïen om slegs 'n paar kritieke protone in 'n bindingsplek waar te neem en toe te ken. Daarom maak hierdie benadering makliker die afleiding van die strukturele inligting van die proteïen-ligand kompleks selfs in die afwesigheid van 'n volledige opdrag. Hierdie tegniek kan toegepas word op 'n groot familie proteïene met 'n gemeenskaplike bindingsplek, aangrensend aan die veranderlike bindingsplek, wat deur die hele gesin bewaar word. 'n Verteenwoordigende lid van die proteïenfamilie word geselekteer, en selektiewe isotoop-etikettering word uitgevoer op spesifieke aminosure teenwoordig in die gemeenskaplike bindingsplek van daardie proteïen. Die bindingsplek van hierdie proteïen word gekarteer met 'n gemeenskaplike verwysingsligand om resonansietoewysings vir gemerkte residue in die bindingsplek te verkry, veral dié by die raakvlak tussen die gemeenskaplike ligandbindingsplek en die substraatplek. 'N Skakelaar is ontwerp op grond van die oriëntasie van 'n standaard naslaanligand wat in die bindingsplek van die proteïen naboots. Hierdie skakelaar word na die aangrensende substraatbindingsplek gerig, en 'n objekgeoriënteerde bi-ligand biblioteek word gekonstrueer. Hierdie resulterende biblioteek is geskik vir gebruik op alle lede van die ensiemfamilie. Die tegniek is nuttig in die sintese van 'n kombinatoriese bi-ligand-biblioteek, wat gekeur kan word om spesifieke hoë-affiniteit bi-ligand-remmers te identifiseer.
NOVEL NMR BENADERINGS VIR NAVORSING OOR IDP's/IDRS
Tot onlangs was die meerderheid van die eksperimente vir biomolekulêre KMR-studies gebaseer op 1 H direkte opsporing, danksy die hoë 1 H sensitiwiteit as gevolg van die groot proton gyromagnetiese verhouding (24, 25). Protone is egter dié wat gekenmerk word deur die intrinsiek laer chemiese verskuiwingverspreiding, wat toeneem na 13 C en na 15 N (Fig. 1). Dit is veral waar vir die ruggraatkerne, wat meer beïnvloed word deur die bydraes tot die chemiese verskuiwing van naburige aminosure, wat die verspreiding van chemiese verskuiwing verbeter ook in die afwesigheid van 'n stabiele 3D-struktuur. Die gebruik van isotopiese verryking in 13 C en 15 N, wat nou gereeld gebruik word, is dus veral belangrik vir die studie van GOP's. The presence of solvent exposed conformations typical of IDP states also affect to a smaller extent the nonexchangeable heteronuclei compared to exchangeable protons, the latter being more prone to exchange broadening.