Vektör (moleküler biyoloji)

Moleküler klonlamada vektör, yabancı bir nükleik diziyi (genellikle DNA) yapay olarak çoğaltılabileceği ve/veya ifade edilebileceği başka bir hücreye taşımak için bir araç olarak kullanılan herhangi bir parçacıktır (örneğin plazmidler, kozmidler, Lambda fajları). Yabancı DNA içeren bir vektör rekombinant DNA olarak adlandırılır. Dört ana vektör türü plazmidler, viral vektörler, kozmidler ve yapay kromozomlardır. Bunlar arasında en yaygın kullanılan vektörler plazmidlerdir. Tüm tasarlanmış vektörlerde ortak olan bir replikasyon orijini, bir çoklu klonlama bölgesi ve seçilebilir bir işaretleyicidir.
Vektörün kendisi genellikle bir ekten (bu durumda transgen) ve vektörün "omurgası" olarak hizmet eden daha büyük bir diziden oluşan bir DNA dizisi taşır. Genetik bilgiyi başka bir hücreye aktaran bir vektörün amacı tipik olarak hedef hücredeki eklentiyi izole etmek, çoğaltmak veya ifade etmektir. Tüm vektörler klonlama için kullanılabilir ve bu nedenle klonlama vektörleridir, ancak klonlama için özel olarak tasarlanmış vektörler de vardır, diğerleri ise transkripsiyon ve protein ekspresyonu gibi diğer amaçlar için özel olarak tasarlanmış olabilir. Hedef hücrede transgenin ifadesi için özel olarak tasarlanan vektörlere ifade vektörleri denir ve genellikle transgenin ifadesini yönlendiren bir promotör dizisine sahiptir. Transkripsiyon vektörleri olarak adlandırılan daha basit vektörler yalnızca transkribe edilebilir ancak transle edilemez: ifade vektörlerinin aksine, bir hedef hücrede çoğaltılabilirler ancak ifade edilemezler. Transkripsiyon vektörleri eklerini çoğaltmak için kullanılır.
DNA'nın manipülasyonu normalde E. coli'de muhafaza edilmeleri için gerekli unsurları içeren E. coli vektörleri üzerinde gerçekleştirilir. Bununla birlikte, vektörler maya, bitki veya memeli hücreleri gibi başka bir organizmada muhafaza edilmelerini sağlayan unsurlara da sahip olabilir ve bu vektörlere mekik vektörler denir. Bu tür vektörler, bakteriyel olmayan konakçı organizmaya aktarılabilen bakteriyel veya viral unsurlara sahiptir, ancak yabancı bir türden herhangi bir genetik materyalin aktarılmasını önlemek için intragenik vektörler olarak adlandırılan diğer vektörler de geliştirilmiştir.
Bir vektörün hedef hücreye yerleştirilmesi genellikle bakteriyel hücreler için transformasyon, ökaryotik hücreler için transfeksiyon olarak adlandırılır, ancak viral bir vektörün yerleştirilmesi genellikle transdüksiyon olarak adlandırılır.
Özellikler
Plazmitler
Plazmidler çift sarmallı ekstra kromozomal ve genellikle dairesel DNA dizileridir ve konak hücrenin replikasyon mekanizmasını kullanarak replikasyon yapabilirler. Plazmid vektörleri minimalist olarak, konakçıda plazmidin yarı bağımsız replikasyonuna izin veren bir replikasyon orijininden oluşur. Plazmidler birçok bakteride, örneğin Escherichia coli'de yaygın olarak bulunur, ancak Saccharomyces cerevisiae gibi mayalarda olduğu gibi birkaç ökaryotta da bulunabilir. Bakteriyel plazmidler konjugatif/transmissible ve konjugatif olmayan olabilir:
konjugatif - konjugasyon yoluyla DNA aktarımına aracılık eder ve bu nedenle bir popülasyonun bakteri hücreleri arasında hızla yayılır; örneğin F plazmidi, birçok R ve bazı col plazmidleri.
konjugatif olmayan - konjugasyon yoluyla DNA aktarımına aracılık etmez, örneğin birçok R ve col plazmidleri.
Özel olarak yapılandırılmış özelliklere sahip plazmidler laboratuvarda klonlama amacıyla yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu plazmidler genellikle konjugatif değildir, ancak özellikle birden fazla restriksiyon enzimi bölünme bölgesinin bir transgen ekinin yerleştirilmesine izin verdiği bir "çoklu klonlama bölgesi" gibi daha birçok özelliğe sahip olabilir. Plazmidleri içeren bakteriler saatler içinde bakteri içinde vektörün milyonlarca kopyasını üretebilir ve çoğaltılmış vektörler daha fazla manipülasyon için bakterilerden çıkarılabilir. Plazmidler özellikle transkripsiyon vektörleri olarak kullanılabilir ve bu tür plazmidler protein ifadesi için önemli dizilerden yoksun olabilir. Protein ekspresyonu için kullanılan ve ekspresyon vektörleri olarak adlandırılan plazmidler, ribozom bağlanma bölgesi, başlama ve durma kodonları gibi protein translasyonu için gerekli unsurları içerir.
Viral vektörler
Viral vektörler genellikle enfeksiyöz olmayan hale getirilmiş modifiye viral DNA veya RNA taşıyan genetik olarak tasarlanmış virüslerdir, ancak yine de viral promotörleri ve ayrıca transgeni içerir, böylece transgenin viral bir promotör aracılığıyla çevrilmesine izin verir. Bununla birlikte, viral vektörler sıklıkla bulaşıcı sekanslardan yoksun olduğundan, büyük ölçekli transfeksiyon için yardımcı virüslere veya paketleme hatlarına ihtiyaç duyarlar. Viral vektörler genellikle insertin konak genomuna kalıcı olarak dahil edilmesi için tasarlanır ve böylece transgeni dahil ettikten sonra konak genomunda farklı genetik işaretler bırakır. Örneğin, retrovirüsler eklendikten sonra tespit edilebilen ve viral vektörün konak genomuna dahil olduğunu gösteren karakteristik bir retroviral entegrasyon modeli bırakır.
Yapay kromozomlar
Yapay kromozomlar, maya yapay kromozomları (YAC'ler), bakteriyel yapay kromozomlar (BAC'ler) veya insan yapay kromozomları (HAC'ler) bağlamında üretilmiş kromozomlardır. Yapay bir kromozom diğer vektörlere göre çok daha büyük bir DNA parçası taşıyabilir. YAC'ler ve BAC'ler 300.000 nükleotide kadar uzunlukta bir DNA parçası taşıyabilir. Yapay bir kromozomun üç yapısal gerekliliği arasında bir replikasyon orijini, bir sentromer ve telomerik uç dizileri bulunur.
Transkripsiyon
Klonlanmış genin transkripsiyonu, genin ifadesi gerektiğinde vektörün gerekli bir bileşenidir: bir gen, translasyon yoluyla proteinin üretilebileceği şablon olan mRNA'ların birden fazla kopyasını oluşturmak için transkripsiyon yoluyla çoğaltılabilir. Daha fazla sayıda mRNA daha fazla miktarda protein ifade eder ve kaç mRNA kopyasının üretileceği vektörde kullanılan promotöre bağlıdır. İfade, proteinin arka planda sürekli olarak üretildiği anlamına gelen yapısal olabilir veya proteinin yalnızca belirli koşullar altında, örneğin kimyasal bir indükleyici eklendiğinde ifade edildiği indüklenebilir olabilir. Bu iki farklı ifade türü, kullanılan promotör ve operatör türlerine bağlıdır.
Viral promotörler genellikle plazmidlerde ve viral vektörlerde konstitütif ekspresyon için kullanılır çünkü normalde birçok hücre hattı ve tipinde sabit transkripsiyonu güvenilir bir şekilde zorlarlar. İndüklenebilir ifade, indüksiyon koşullarına yanıt veren promotörlere bağlıdır: örneğin, murin meme tümörü virüsü promotörü yalnızca deksametazon uygulamasından sonra transkripsiyonu başlatır ve Drosophila ısı şoku promotörü yalnızca yüksek sıcaklıklardan sonra başlar.
Bazı vektörler sadece transkripsiyon için, örneğin in vitro mRNA üretimi için tasarlanmıştır. Bu vektörlere transkripsiyon vektörleri denir. Poliadenilasyon ve sonlandırma için gerekli dizilerden yoksun olabilirler, bu nedenle protein üretimi için kullanılamazlar.
İfade
İfade vektörleri, vektörün ekinin transkripsiyonu ve ardından üretilen mRNA'nın translasyonu yoluyla protein üretir, bu nedenle daha basit olan sadece transkripsiyon vektörlerinden daha fazla bileşene ihtiyaç duyarlar. Farklı konakçı organizmalardaki ifade, transkripsiyonun başlatılması için bir promotör, translasyonun başlatılması için bir ribozomal bağlanma bölgesi ve sonlandırma sinyalleri gibi benzer gereksinimleri paylaşmalarına rağmen farklı unsurlar gerektirecektir.
Prokaryot ifade vektörü
Promotör - yaygın olarak kullanılan indüklenebilir promotörler, lac operonundan ve T7 promotöründen türetilen promotörlerdir. Kullanılan diğer güçlü promotörler arasında Trp promotörü ve hem Trp hem de Lac Operon promotörlerinin bir melezi olan Tac-Promotörü bulunur.
Ribozom bağlanma bölgesi (RBS) - promotörü takip eder ve ilgili proteinin verimli bir şekilde translasyonunu sağlar.
Translasyon başlatma bölgesi - AUG başlangıç kodonunun 8 baz çifti yukarısında, RBS içinde yer alan Shine-Dalgarno dizisi.
Ökaryot ifade vektörü
Ökaryot ifade vektörleri aşağıdakileri kodlayan diziler gerektirir:
Poliadenilasyon kuyruğu: Transkripsiyon öncesi pre-mRNA'nın sonunda mRNA'yı eksonükleazlardan koruyan ve transkripsiyonel ve translasyonel sonlandırmayı sağlayan bir poliadenilasyon kuyruğu oluşturur: mRNA üretimini stabilize eder.
Minimal UTR uzunluğu: UTR'ler transkripsiyon veya translasyonu engelleyebilecek spesifik özellikler içerir ve bu nedenle optimal ifade vektörlerinde en kısa UTR'ler kodlanır veya hiç kodlanmaz.
Kozak dizisi: Vektörler, mRNA'nın translasyonu için ribozomu bir araya getiren mRNA'daki bir Kozak dizisini kodlamalıdır.
Özellikleri
Yapay olarak oluşturulmuş modern vektörler, tüm vektörlerde bulunan temel bileşenleri içerir ve yalnızca bazı vektörlerde bulunan diğer ek özellikleri de içerebilir:
Replikasyon orijini: Konak hücrede vektörün replikasyonu ve bakımı için gereklidir.
Promotör: Promotörler, vektörün transgeninin yanı sıra antibiyotik direnç geni gibi vektördeki diğer genlerin transkripsiyonunu yönlendirmek için kullanılır. Bazı klonlama vektörlerinin klonlanmış ek için bir promotöre sahip olması gerekmez, ancak klonlanmış ürünün ifade edilebilmesi için ifade vektörlerinin temel bir bileşenidir.
Klonlama bölgesi: Bu, çoklu bir klonlama bölgesi veya yabancı DNA'nın ligasyon yoluyla vektöre eklenmesine izin veren diğer özellikler olabilir.
Genetik belirteçler: Viral vektörler için genetik belirteçler, vektörün konak genomik DNA ile entegre olduğunun doğrulanmasını sağlar.
Antibiyotik direnci: Antibiyotik dirençli açık okuma çerçevelerine sahip vektörler, antibiyotik seçimi yoluyla antibiyotik içeren büyüme ortamında vektörü alan hücrelerin hayatta kalmasını sağlar.
Epitop: Bazı vektörler, ifade edilen proteine dahil edilebilen belirli bir epitop için bir dizi içerebilir. Hedef proteini ifade eden hücrelerin antikorla tanımlanmasını sağlar.
Reportör genler: Bazı vektörler, eklenen DNA dizisini içeren plazmidin tanımlanmasına izin veren bir raportör gen içerebilir. Bir örnek, galaktozu sindiren bir enzim olan β-galaktosidazın N-terminus parçasını kodlayan lacZ-α'dır. LacZ-α içinde çoklu bir klonlama bölgesi bulunur ve vektöre başarıyla bağlanan bir ekleme gen dizisini bozarak inaktif bir β-galaktosidaz ile sonuçlanır. Bir ek ile vektör içeren hücreler, galaktoz (X-gal) analoğu içeren ortamda hücreleri büyüterek mavi/beyaz elek kullanılarak tanımlanabilir. β-galaktosidaz ifade eden (dolayısıyla ek içermeyen) hücreler mavi koloniler olarak görünür. Beyaz koloniler, bir ek içerebilecek olanlar olarak seçilecektir. Yaygın olarak kullanılan diğer raportörler arasında yeşil floresan protein ve lusiferaz bulunur.
Hedefleme dizisi: İfade vektörleri, ifade edilen proteini hücredeki belirli bir organele veya bakterilerin periplazmik alanı gibi belirli bir yere yönlendiren bitmiş proteinde bir hedefleme dizisi için kodlama içerebilir.
Protein saflaştırma etiketleri: Bazı ifade vektörleri, ifade edilen proteinin daha kolay saflaştırılmasını sağlayan proteinler veya peptit dizileri içerir. Örnekler arasında polihistidin etiketi, glutatyon S-transferaz ve maltoz bağlayıcı protein yer alır. Bu etiketlerden bazıları hedef proteinin çözünürlüğünün artmasını da sağlayabilir. Hedef protein, protein etiketine kaynaştırılır, ancak protein ve etiket arasındaki polipeptit bağlayıcı bölgeye yerleştirilen bir proteaz bölünme bölgesi, etiketin daha sonra çıkarılmasına izin verir.