Hemaglütinason deneyi

Hemaglütinasyon deneyi (HA) veya hemaglütinasyon inhibisyon deneyi (HI), 1941-42'de Amerikalı virolog George Hirst tarafından, virüslerin, bakterilerin (ve antijenlerin) veya antikorların nispi konsantrasyonunu ölçmek için geliştirilen deneydir.
Kırmızı kan hücrelerinin yüzeyindeki sialik asit reseptörlerinin influenza virüsünün (veya diğer antijenlerin) yüzeyinde bulunan hemaglütinin glikoproteinine bağlandığı ve birbirine bağlı alyuvarlar ve virüs parçacıklarının bir ağ (genellikle dantel benzetmesi yapılır) veya kafes yapısı oluşturduğu hemaglütinasyon süreciyle uygulanan bir deney. Dantel görünümü veya kafes görünümü, normalde dağınık kırmızımsı bir çözelti olarak görülen eritrositleri askıya alınmış bir düzende tutar. Kafes oluşumu, virüslerin ve alyuvarların konsantrasyonlarına bağlıdır ve bağıl virüs konsantrasyonu çok düşük olduğunda, alyuvarlar kafes tarafından tutulamazlar ve kuyunun dibine çökerler. Virüslerin eritrositlerin aglütinasyonuna neden olmak için kullandıkları mekanizmaya benzer şekilde, stafilokoklar, vibriolar ve diğer bakteri türlerinin varlığında da hemaglütinasyon gözlenir. HA ve HI testlerinde kullanılan alyuvarlar, hedeflenen virüs veya bakterinin seçiciliğine ve alyuvar üzerindeki ilişkili yüzey reseptörlerine bağlı olarak, tavuklar, hindiler, atlar, kobaylar veya insanlardan elde edilir.
Test prosedürü
HA için genel prosedür aşağıdaki gibidir, U veya V-tabanlı 96 kuyucuklu bir mikrotitre plakasında sıralar boyunca seri bir virüs seyreltmesi hazırlanır. İlk kuyudaki en konsantre numune genellikle stoğun 1/5x'i olacak şekilde seyreltilir ve sonraki kuyucuklar tipik olarak iki kat seyreltmelerdir (1/10, 1/20, 1/40, vb.). Son kuyucuk, virüssüz bir negatif kontrol görevi görür. Plakanın her sırası tipik olarak farklı bir örneğe ve aynı seyreltme modeline sahiptir. Seri seyreltmelerden sonra, her kuyucuğa standart bir alyuvar konsantrasyonu eklenir ve yavaşça karıştırılır. Plaka, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. İnkübasyon süresinin ardından, tahlil, aglütine ve aglütine olmayan kuyucuklar arasında ayrım yapmak için analiz edilebilir. İlk sıradaki görüntüler tipik olarak yüksek virüs konsantrasyonu ve dağınık kırmızımsı bir görünüme sahiptir. Düşük konsantrasyonlu kuyucuklar, virüs içermeyen negatif kontrol kuyucuğu ile neredeyse aynı görünmektedir. Düğme görünümü, alyuvarların aglütine kafes yapısında tutulmaması ve U veya V-tabanlı kuyucuğun alt noktasına çökelmesi nedeniyle oluşur. Aglütine edilmiş kuyulardan aglütine olmamış kuyucuklara geçiş, 1 ila 2 kuyucuk içinde belirgin bir şekilde gerçekleşir.
Avantajlar
HA ve HI deneyleri, tahlillerin basit olması, nispeten ucuz olması, halihazırda bulunan alet ve malzemelerin kullanması ve birkaç saat içinde sonuç vermesi gibi avantajlara sahiptir. Tahliller aynı zamanda dünya çapında pek çok laboratuvarda rutin olarak kullanılmaktadır, güvenilirlik, kıyaslama ve standardizasyon olanağı sunmaktadır.
Sınırlılıkları
Optimal ve güvenilir sonuçlar için, inkübasyon (kuluçka) süreleri, kırmızı kan hücresi konsantrasyonu ve kırmızı kan hücresi türü gibi çeşitli değişkenlerin kontrol edilmesi gerekir. Numunedeki spesifik olmayan faktörler karışıklığa ve hatalı titre (konsantrasyon) değerlerine yol açabilir. Örneğin, virüse özgü antikorlar dışındaki numunedeki moleküller, virüs ve alyuvarlar arasındaki aglütinasyonu engelleyebilir ve ayrıca antikorun virüse bağlanmasını potansiyel olarak bloke edebilir. Reseptörü yok eden enzimler, yanlış sonuçları önlemek için analizden önce yaygın olarak numunelere tatbik edilir. HA veya HI sonuçlarının analizi, plağın okunması ve titre değerlerinin belirlenmesi için kalifiye bir kişiye ihtiyaç duyulur. Manuel yorumlama yöntemlerinin kullanılıyor olması, insandan insana farklı yorumlamaların yapılabildiği için, belli tutarsızlıklara sebep olabilmektedir. Ayrıca, plak veya titre belirlemelerinin dijital kaydı bulunmadığından, ilk yorumlama zahmetlidir (kayıt işleri vs.) ve yaygın olarak tekrar edilir. Uzman okuyucular arasındaki potansiyel değişkenlerin aralığı ve farklılıklar, laboratuvarlar arası sonuçların karşılaştırılmasını zorlaştırabilir.