EcoRV

Escherichia coli' den elde edilen bir kısıtlama enzimi olan EcoRV ("eco R beş" olarak telaffuz edilir), en iyi karakterize edilen endonükleazlardan biri olup palindromik (simetrik) dna dizilerini tanıyan ve genellikle homodimerler veya homotetramerler gibi davranan Tip IIP alt sınıfındadır.
EcoRV enzimi, GATATC hedef bölgesini TA adımında merkezden ve kör uçlu bir şekilde bölen, Mg2 + ' ya bağımlı bir reaksiyonda 5′-fosfat grupları oluşturan dimerik bir tip II kısıtlama endonükleazdır.
EcoRV, DNA boyunca gerçekleşen translokasyonda ATP'ye ihtiyaç duymayan tip II ailesinin en iyi çalışılmış restriksiyon enzimlerden biridir. Kataliz ve özgüllük bakımından bu enzim, DNA bükülmesi öneminin keşfedilmesinde model olarak kullanılmıştır.
EcoRV' nin izoşizomerleri, BstRI, CeqI, Eco32I, Ecol78I, HjaI, NanI, NflAI, NsiCI şeklindedir.
Yapı
EcoRV endonükleaz, 244 amino asit içerir ve dimerizasyon alt alan adı verilen küçük alt alan ile DNA bağlanma alt alanı adı verilen alanın da bulunduğu daha büyük bir alt alandan oluşan bir dimerdir. EcoRV, normalde kestiği diziyi içeren bir DNA molekülü ile beraber kristalleştirilmiştir. Bu kristal kullanılarak bu protein-DNA kompleksinin yapısı çözülmüştür. Enzimin çekirdek kısmı beş tane beta yaprak, bunların iki yanında da alfa sarmallar bulunmaktadır. Bu çekirdek bölge diğer tip II restriksiyon endonükleazlarına benzer. N-ucunda bir ikilenme (dimerizasyon) bölgesi vardır, bu bölge kısa bir α-sarmal, iki antiparalel β yaprak ve bir uzun α-sarmaldan oluşur. Bu bölge sadece EcoRV ve PvuII'de görülür.
EcoRV, serbest enzim, bir spesifik olmayan ve iki spesifik kompleksle birlikte bir enzim-ürün kompleksinin yapı analizlerinin bulunduğu tek kısıtlama enzimidir.
Etki mekanizması
EcoRI gibi EcoRV de bir homodimer (ikili) oluşturduktan sonra DNA'ya bağlanır ve tanıma dizisini keser. Enzim önce DNA'da herhangi bir yere zayıf şekilde bağlanır, sonra DNA üzerinde rastgele yürür, spesifik tanıma dizisini bulana kadar. Proteindeki rastgele bağlanma yeri ile kesme yeri farklıdır. EcoRV kendi tanıma dizisi için yüksek bir spesifiteye sahiptir. Enzim DNA üzerinde kayarken önce tanıma dizisinin dıştaki iki bazını (GAxxTC) tanır ve DNA'ya daha sıkı bağlanır, sonra eğer dizinin ortasındaki bazlar da doğruysa DNA eğrilir, proteinin bağlanması daha da sıkılaşır ve kesme meydana gelir.
Enzimin dizisine bağlanması DNA'da şekilsel bir değişime yol açar, DNA 50 bükülür. Proteinin C -ucundaki pozitif yükler bu bükülmeyi sağlamaktadır. DNA bölgesinde meydana gelen keskin bir bükülme ile fosfat, katalitik yan zincir (Asp90, Asp74, Lys92) ve iki değerlikli metal iyonların uygun bir şekilde yan yana gelmesi kolaylaşır. Aynı zamanda bükülmeyle DNA' nın TA aşamasındaki ana oluğun daralmasına sebep olarak enzimin fonksiyonel gruplarının bazlarla hidrojen bağları yapmasını engeller. DNA'nın bükülmesi bazların istiflenmesini bozar, küçük oluk açılır, büyük oluk sıkışır. Bu durum kesilecek fosfodiester bağını enzimin aktif bölgesine yaklaştırıp orada kesilmesini sağlar. Kesilme tanıma dizisi içinde gerçekleşir ve ATP gerektirmez.
Enzimin aktif bölgesinde üç tane divalent metal iyonu bulunur. Bunlardan ikisi nükleofilik bir hidroksit iyonunu oluşturmaya yarar.
EcoRV, protein etkisiyle DNA'da şekilsel bir değişiklik yapan tek tip II restriksiyon endonükleazdır.
EcoRI ve EcoRV' nin spesifik komplekslerinin kristalografik analizi, bu iki enzimin katalitik bölgelerini tanımladı. Analiz sonucunda katalitik bölgeleri karşılaştırıldığında, yapı ve davranış açısından iki enzimin benzer olduğu bulundu.
Kullanım
EcoRV çoğunlukla gen klonlaması sırasında bir plazmid vektörü kesip içine araştırma konusu olan bir geni yerleştirmek için kullanılır.
Moleküler klonlama, Restriksiyon bölgesi haritalama, Genotipleme, Southern lekeleme tekniği, Restriksiyon fragman uzunluğu polimorfizmi (RFLP), SNP (Tek nükleotid polimorfizm) analizi uygulamalarında kullanılır.
EcoRV, DNA' nın GAT^ATC bölgelerini uygun bir tamponda 37 C 'de keser. Bu enzim, pek çok imalatçı tarafından temin edilir, gerektiği biçimde çalışması için, enzimin stabilitesini artıran ve DNA preparasyonlarında bulunabilecek kontaminantları bağlayan inek serum albümini (BSA) ile birlikte kullanılır. BSA tampon yerine Rekombinant Albümin (rAlbumin) içeren tamponla birlikte de kullanılmaktadır.
Bu enzim temin edildikten sonra saklama koşulları oldukça önemlidir. -20 C sıcaklığında donmayan dondurucularda saklanması gerekir.
Genetik
EcoRV endonükleazının geni ve EcoRV ile aynı DNA dizisini tanıyan EcoRV metilazın genleri kromozomda birbirine bitişiktir, transkripsiyonları aynı bölgeden zıt yönlere doğru yapılır.