Mikrosatelit

Mikrosatelitler (mikro uydu), Basit dizi tekrarları (İngilizce Simple Sequence Repeats veya SSR), veya Kısa Bitişik Tekrarlar (İng. Short Tandem Repeats) DNA'da bulunan, 1-6 baz çifti uzunluğundaki tekrar eden dizilerdir.
Mikrosatelitler genetik anlamda nötral ve eş-baskındır (codominant). Genetikte bunlar akrabalık ve topluluk araştırmaları için moleküler belirteç (marker) olarak kullanılır. Ayrıca gen duplikasyonu (ikilemesi) ve delesyonlarının (eksilmelerinin) araştırılmasında kullanılırlar.
Mikrosatelitlerin yaygın bir örneği (CA)n tekrarıdır, burada n, aleller arasında farklılık gösterir. Bu belirteçler genelde hem bir canlı türündeki farklı bireyler arasında, hem de farklı türler arasında yüksek derecede polimorfizm (çok biçimlilik) gösterir, özellikle bitişik tekrarların sayısı 10'un üstünde olursa. Tekrar eden dizi genelde basittir, iki, üç veya dört nükleotitten oluşur (bunlara, sırasıyla, di-, tri-, ve tetranükleotit tekrarları denir) ve bunlar 10 - 100 kere terar edilebilirler. CA nükleotit tekrarları insan ve diğer canlıların genomlarında oldukça sık görülür ve birkaç bin baz çiftinde bir bulunurlar. Belli bir mikrosatelit lokusunda (genetik konumunda) pek çok alel olduğu için, pedigrelerin genotipleri genelde tamamen ayırt edilebilir, yani belli bir alelin hangi ebeveynden geldiğini tespit etmek mümkündür. Bu yüzden, babalık tespiti, popülasyon genetiği araştırmaları ve rekombinasyon haritalaması için mikrosatelitler idealdir. Ayrıca, bunlar hangi alellerin evrimsel olarak birbiriyle yakın ilişkili olduğu hakkında ipucu verebilen bir moleküler belirteçtir.
Mikrosatelitlerin çeşitliliğinin nedeni, DNA'nın diğer nötür bölgelerine kıyasla daha yüksek bir mutasyon oranına sahip olmalarıdır. Bu yüksek mutasyon oranının başlıca açıklaması, DNA ikileşmesi sırasında bir DNA ipliğinin kayıp öbürüyle yanlış baz eşleşmesi yapmasıdır (kaymış iplikle eşleşme hatası, İng. slipped strand mispairing). Mayoz sırasında rekombinasyon yoluyla da bu mutasyonlar meydana gelebilir. Kaymaktan kaynaklanan hatalar biyoloji prova okuma ile düzeltilebilir ama bazı hatalar tamir sürecini atlatabilirler. Tekrarlayan birimin büyüklüğü, tekrarların sayısı ve varyant tekrarların varlığı, ayrıca DNA tekrarlarının olduğu bölgedeki transkripsiyonun sıklığı, hata oluşma oranını etkiler. Mikrosatelitlerin bir insersiyon sonucu aralanması polimorfizmin azalmasına yol açabilir.
Mikrosatelitlerin amplifikasyonu
Mikrosatelitler polimeraz zincir tepkimesi (PCR) ile çoğaltılarak teşhis edilebilir, bunun için iki yanındaki eşsiz (unique) diziler primer olarak olarak kullanılır. Bu yöntemle çok ufak miktarda DNA üssel şekilde çoğaltılarak sonunda jel elektroforezi ile görülebilecek kadar çok miktarda elde edilebilir. PCR teknolojisinin yaygınlaşması sayesinde bu yöntemi uygulamak kolaydır ama belli bir mikrosatelit bölgesini çoğaltmak için gerekli primerler bilinmiyorsa bunların tasarlanması zahmetli ve masraflı bir işlemdir.
Mikrosatelit primerlerinin tasarımı
Genomun belli bir bölgesine (örneğin bir genin eksonuna) ait mikrosatelit belirteçleri (markerleri) için kullanılacak primerler elle tasarlanabilir. Bunun için önce genomik DNA'da mikrosatelitler aranır, bu işlem gözle veya otomatik araçlar ile (repeat masker gibi) yapılabilir. Tekrarlı bölge içinde rastgele insersiyonlar içerenler faydalı değildir. Faydalı olabilecek mikrosatelitler belirlendikten sonra bunların böğüründeki (iki yanındaki) diziler, PCR yoluyla bu mikrosatelitin çoğaltılması için kullanılabilecek oligonükleotit primerlerin tasarlanmasında kullanılır.
Bir diğer yol, rastgele mikrosatelit primerleri bulmaktır. Bunun için söz konusu türe ait rastgele DNA parçaları uygun bir plazmid veya bakteriyofaj vektör içine klonlanır, ve Escherichia coli bakterisi içine yerleştirilir. Koloniler büyütülür ve mikrosatelit tekrar dizisine spesifik şekilde hibridize olacak, fluoresan işaretli oligonükleotitler kullanılarak taranır. Eğer klonlanmış DNA parçasından bu mikrosatelit varsa onu taşıyan koloniler fluoresan görünürler. Bu yolla pozitif klonlar elde edilebilirse klonlanmış DNA dizilenir ve mikrosatelit bölgesinin böğüründeki dizilerden PCR primerleri seçilir. Bu yöntem epeyce deneme yanılma gerektirir çünkü, birincisi, mikrosatelit tipinin doğru tahmini gerekir ve ikincisi, bulunan mikrosatelit bölge işe yarar derecede polimorfizm göstermiyebilir. Mikrosatelit lokusları genomda yaygın şekilde bulunurlar ve PCR ile çoğaltılabilecek uygun bir substratın varlığı onların tespiti için yeterlidir. Bu yüzden, eski numunelerde bulunan yarı bozunmuş DNA'daki mikrosatelit alelleri dahi PCR sayesinde teşhis edilebilirler.
Daha yeni tekniklerde, mikrosatelit tekrarlarına komplemanter oligonükleotitler kullanılarak özütlenen DNA "zenginleştirilir". Oligonükleotit prob, mikrosatelitin tekrar dizisi ile hibridize olur ve sonra bu prob/mikrosatelit kompleksi çözeltiden çıkarılır. Zenginleştirilmiş DNA sonra normal yolla klonlanır ama başarı oranı çok daha yüksektir ve kullanılacak bölge için PCR primer tasarımı için gereken zaman önemli derecede azaltılabilir. Ancak, kullanılacak probun seçimi gene de deneme yanılmaya dayanır.
ISSR-PCR
ISSR (İngilizce inter-simple sequence repeat, "kısa dizi tekrarları arası") mikrosatelit lokusları arasındaki genom bölgeleri için kullanılan bir genel terimdir. İki komşu mikrosatelitin komplementer dizileri PCR primerleri olarak kullanılır ve aralarındaki değişken bölge çoğaltılır. PCR programında uzatma bölümünün kısa süreli tutulması nedeniyle çok uzun DNA dizileri çoğalmaz, elde edilen ürün genelde kısa ama çeşitli uzunluklarda olan DNA parçalarından oluşur.
ISSR-PCR ile çoğaltılan diziler DNA parmakizlemesinde kullanılabilir. ISSR bölgesindeki dizinin evrimsel olarak korunmuş olma olasılığı vardır, bu yüzden kişileri ayırt etmekte kullanılmaz, onun yerine filo-coğrafi analizlerde veya biyolojik türleri ayırt etmede kullanılır. Bu bölgelerdeki dizi çeşitliliği mikrosatelitlerdekinden daha düşüktür ama belli bir genin dizisindekinden daha fazladır. Mikrosatelit dizilemesi ve ISSR dizilemesi birbirini destekler çünkü birinin sağladığı bilgi ile öbürünün gerek duyduğu primerler üretilebilir.
Mikrosatelitlerin yetersizlikleri
Mikrosatelitler, özellikle popülasyon analizlerinde, moleküler belirteç olarak fayda göstermiş olmalarına rağmen belli yetersizlikleri de bulunmaktadır. Belli canlı türleri için geliştirilmiş olan mikrosatelitler genelde yakın ilişkili türlerde de kullanılabilir ama genetik uzaklık arttıkça başarılı şekilde çoğaltılabilen lokusların oranı azalabilir. Primerin hibridize olduğu yerdeki noktasal mutasyonlar sonucu mikrosatelit PCR ile çoğaltılamayabilir ve bir eksik alelden (İng. null allele) ayırdedilemeyebilir. Eksik aleller çeşitli olguların sonu olabilir. Böğür (iki yandaki) dizilerdeki evrimsel ıraksama yetersiz primer bağlanmasına neden olabilir, özellikle genin 3' bölgesinde, çünkü PCR reaksiyonun uzatma kısmı buradan başlar. PCR reaskiyonunun yarışmacı özelliğinden dolayı, belli uzunlukta alellerin tercihli çoğaltılması, heterozigot kişilerin homozigot (kısmi eksik) olarak kaydedilmesine
neden olabilir. Belli aleller çoğalmayabilir, diğer alleler ise daha hızlı çoğalırsa reaksiyon ürünleri bir jelde homozigot gibi görünebilir, genomda gerçekten heterozigot olmalarına rağmen. Eksik aleller mikrosatelit alel sıklıklarının yorumlanmasını zorlaştırır ve akrabalık çıkarımlarının hatalı olmasına yol açabilir. Ayrıca, üreme sırasında meydana gelen rassal (stokastik) örneklem etkilerinin neden olduğu alel sıklıkları, yani Hardy-Weinberg denge beklentisinden sapmaya yol açan aşırı bir homozigot sıklığı, eksik alellerin etkisine çok benzer şekilde kendini gösterebilir. Eksik aleller teknik bir sorun iken, üreme sırasındaki örneklem etkileri bir topluluğun gerçek bir biyolojik özelliği olduğu için, aşırı sayıda homozigot bulununca bu iki olasılığın ayırt edilmesi çok önemlidir.
Mikrosatelitler kullanarak türler karşılıştırılınca, homozigot lokuslar ilişkili türlerde kolayca çoğaltılabilir ama söz konusu türler arasındaki genetik uzaklık arttıkça başarılı olarak çoğaltılabilen lokusların sayısı azalabilir. Mikrosatelitlerdeki mutasyonlar tarafgirdir (biased) çünkü büyük allelerde daha çok nükleotit vardır ve bunların DNA ikileşmesi sırasında hatalı kopyalanması daha olasıdır. Küçük aleller büyüme eğilimi gösterir, büyük alellere ise bir üst sınır etkisine maruz olap için kısalabilirler. Aleller arasında büyüklük farkı çoksa, mayoz sırasındaki rekombinasyonda instabilite olasılığı artabilir. Hücre bölünme kontrollerinin bozulmuş olduğu tümör hücrelerinde, mikrosatelitler her mitozda normal hücrelere kıyasla daha sık olarak uzayabilir veya kısalabilirler. Dolayısıyla bir tümör hücresi konak dokununkiden farklı bir genetik parmakizi gösterebilir.
Değişiklik mekanizması
Kısa tekrar dizileri genomun her tarafına dağılmışlardır. Kısa dizi tekrarlarında uzunluk değişimlerinin en yaygın iki nedeni, 1) ikileşme kayması, yani mayoz sırasında DNA ikileşirken DNA iplikleri arasında hatalı eşleşmeler ve 2) rekombinasyondur. Tipik olarak, her bir mikrosatelitte yeni bir kayma olayı, yaklaşık 1000 nesilde bir meydana gelir. Genomun diğer bölgelerindeki noktasal mutasyonlara kıyasla kayma olayları bir mertebe (10 kat) daha sık olur. Çoğu kayma olayı tek bir tekrar biriminde bir değişikliğe yol açar, farklı tekrar birimi uzunlukları için kayma hızları farklıdır ve farklı biyolojik türlerde bu oranlar farklıdır.
Proteinlerde
Memelilerde proteinlerin %20-40'ı, kısa dizi tekrarlarından kaynaklanan amino asit dizi tekrarları içerir. Genomun protein kodlayıcı bölgelerindeki kısa dizi tekrarlarının tekrar edici birimlerinin çoğu üç nükleotitten oluşur, çünkü bu uzunluk çerçeve kayması mutasyonlarına neden olmaz. Her bir trinükleotit tekrarlı dizi, aynı amino asitten oluşan bir tekrarlı dizi olarak çevrilir. Mayada en yaygın tekrar eden amino asitler glutamin, glutamik asit, asparajin, aspartik asit ve serindir. Bu tekrar eden bölgeler proteinlerin fiziksel ve kimyasal özelliklerine etki edebilir, bazı durumlarda protein etkinliğinde dereceli ve öngörülebilir etkilere neden olabilirler.
Örneğin, Runx2 geninin bitişik tekrarlı bölgelerindeki uzunluk değişimleri, evcil köpeklerin (Canis familiaris) yüz uzunluğunda değişikliklere yol açar, daha uzun dizilerin daha uzun yüzlerle ilişkili olduğu bulunmuştur. Bu ilişki başka Carnivora türlerinde de geçerlidir. HoxA13 genindeki polialanin dizilerindek uzunluk farklılıkları ise, insanlarda bir gelişimsel bozukluk olan el-ayak-genital sendromu ile bağlantılıdır. X25 geninin ilk intronundaki GAA üçlü genişlemesi, genin transkripsiyonuna etki etmekte ve Friedreich Ataksisi bozukluğuna neden olmaktadır. Asparajin sentetaz geninin ilk intronundaki bitişik tekrarlar akut limfoblastik lösemi ile ilişkilendirilmiştir (Akagi 2008). NOS3 geninin dördüncü intronundaki bir tekrar polimorfizmi bir Tunus toluluuğunda hipertansyon ile ilişkili bulunmuştur. EGFR geninde azalan tekrar uzunlukları osteosarkoma ile ilişkili olduğu bulunmuştur. Başka amino asit üçlü uzunluk değişkliklerinin insanlarda 40'tan fazla nörolojik bozuklukla bağlantılıdır.
İkileşme kaymasından kaynaklanan evrimsel değişiklikler daha basit organizmalarda da meydana gelir. Örneğin, mikrosatelit uzunluk değişimleri mayanın membran proteinlerinde yaygındır, bunlar hücre özelliklerinde hızlı evrimleşmeye olanak verir. Örneğin, FLO1 genindeki uzunluk değişiklikleri, hücrenin bir yüzeye yapışma derecesini etkiler. Kısa dizi tekrarları patojenik bakterilerin yüzey proteinlerinde hızlı evrimsel değişikliklere yol açar, bir olasılıkla bunun nedeni konaktaki bağışıklık değişikliklerine ayak uydurmalarını sağlamasıdır. Bir mantar türünde (Neurospora crassa) görülen kısa dizi tekrarlarının uzunluk değişimleri onun sirkadyen saat döngüsünün süresini kontrol etmektedir.
Gen düzenlemesi
Promotör ve diğer gen düzenleyici bölgelerdeki mikrosatelitlerde uzunluk değişimleri gen ifadesini değiştirebilir. İnsan genomu düzenleyici bölgelerde pek çok (>16,000) kısa dizi tekrarlarına sahiptir, bunlar gen ifadesine evrimsel düzeyde etki eden "ayar düğmelerine" benzetilmiştir. Ökaryotların promotör bölgeleri genomun diğer bölgelerine kıyasla mikrosatelit zenginidir ve bu genlerdeki mikrosatelit sayısındaki farklılıklar gen ifade hızını ve oradaki nükleozom dağılımını etkilemektedir. Bunun sonucunda meydana gelen gen ifadesindeki çeşitlilikler, organizmanın evrimine etki edecek fenotipik değişikliklere yol açmaktadır. Örneğin, Haemophilus influenza bakterisindeki mikrosatelit değişimleri, promotör uzaklığını değiştirerek fimbria oluşumunu etkilemektedir. Kır sıçanlarında (Microtus ochrogaster) Vasopressin 1a reseptör geninin kontrol bölgesindeki mikrosatelitler onların sosyal davranışlarını ve tek eşlilik derecesini etkilediği gösterilmiştir.