Western blot

Western blot (diğer adı protein immünoblot) immünogenetik, moleküler biyoloji ve diğer moleküler biyoloji dallarında bir doku homojenatı veya ekstraktı numunesi içerisinde spesifik proteinlerin tanımlanmasında yaygın olarak kullanılan bir analitik teknik.
Hedef proteinle etkileşmesi amacı ile sentetik veya hayvan kökenli antikorlar oluşturulur. Numune proteinleri denature edilir ve jel elektroforez uygulanır. Ardından, elektroforez membranı spesifik antikorlar içeren çözeltide yıkanır. Hedef proteine bağlanamamış antikorlaradan kurtulmak için ikinci yıkama işlemi gerçekleştirillir ve takiben birincil antikorlar etkileşecek olan ikincil antikorlar solusyona eklenir. Boyama, immünofloresan ve radyoaktivite gibi çeşitli metotlar ile ikincil antikor proteinleri görselleştirebilir.
Uygulama
Western blot yaygın olarak kullanıldığı biyokimyada amaç tek bir proteinin ve protein modifikasyonunun (post translasyonel modifikasyon gibi) kalitatif analizini gerçekleştirmektir. Genel kullanımı bir karışımda bir tek proteinin varlığının veya yokluğunun anlaşılması üzerinedir. Sonuçta görülen protein bandının renk yoğunluğu ve ölçüye göre yarı kantatif yorum yapılabilir. Western blot rutin olarak klonlama işleminin aradından klonlamanın başarı olup olmadığını onaylamak için kullanılır. HIV testinde veya BSE-Testinde medikal teşhis koyma için de kullanımı mevcuttur.
Prosedür
Western blot metodu jel elektroforezi, elektroforezde denature olmuş proteinlerin bir membran (genelde PVDF veya Nitroselluloz) üzerine elektroforetik aktarımını ve takiben görselleştirme amaçlı immünoboyama adımını içerir. Boyama işlemi blot membranı üzerinde yapılır. SDS-PAGE' te SDS kullanımı sebebi ile bütün proteinler negatif yüklenir ve yük faktörü hemen hemen ortadan kalkar. SDS-PAGE' in ardından proteinler bir membrana aktarılır. Yağsız süt yardımı ile membranın üstü süt proteinleri ile kaplanır. Yüzeyin kapanması ile birincil antikorların membran ile bağ kurması engellenirken aynı zamanda süt proteinlerine de bağlanma gerçekleşmez. Yani antikorların sadece hedef moleküllerine bağlanması sağlanır. Bu işleme bloklanma denir. Bloklanan faktör membrandır. Son olarak ikincil antikorlar eklenir. İkincil antikorun birincillere bağlanması ile boyanma gerçekleşir. Boyanma renk veya floresan ışık olarak gözlenebilir ve çeşitli araçlarla belirlenebilir.
Doku hazırlanışı
Numuneler bütün dokudan veya hücre kültüründen elde edilebilir. Katı dokular, blender homojenize edici veya yüksek ses ile, önce mekanik olarak parçalanır. Western blot sadece hücrelerle çalışmakla kısıtlı değildir, farzı misal, virüsler ve viral proteinler.
Hücre çözülmesini sağlamak ve proteinleri çözünür hale getirmek amacı ile çeşitli deterjanlar, tuzlar ve tampon çözeltiler kullanılabilir. Proteaz ve fosfataz inhibitörleri hücrenin kendi enzimleri tarafından gene hücrenin kendi proteinlerini engellemek amacı ile sıkça kullanılır. Protein denaturasyonu ve parçalanmasından kaçınmak için numune soğukta hazırlanır.
Jel elektroforez
Proteinlerin ayrımında kullanılan jel elektroforez izoelektrik noktasını (pI), moleküler ağırlığı, elektrik yükünü veya bu faktörlerin bir kombinasyonunu temel alarak çalışır.
Aktarım
Proteinleri antikor ile bağlanmaya açık hale getirmek amaçlı proteinler nitrosellüloz veya PVDF' den yapılma membrana aktarılır. Jelden membrana doğru akım verilerek proteinlerin hareketinin sağlanmasına elektroblotlama denir. Geçiş sırasında proteinlerin jeldeki sırası ve organizasyonları korunur. Daha ilkel olan havlu metodu ise kapiler etkiden faydalanarak geçiş işlemini gerçekleştirir. Fkata havlu metodu çok zaman gerektirir. Nitroselluloz membranlar PVDF' den daha ucuz olmasına karşın çok daha kırılgan ve tekrar kullanıma uygun değildir.
Boyama ve tanımlama
Aktarımından ardından Total protein boyama adımı ile görselleştirme ve onun ardından bu görselliğin yoğunluğunun tespiti vardır.