Bağlama (biyoloji)

Bağlama veya ligasyon, rekombinant DNA teknolojisinde klonlanacak geni taşıyan DNA parçaları ile vektörün bir enzim aracığılıyla birbirlerine bağlanması işlemine denir. Bu işlem için ligaz cinsi enzimler görev yapar. Örneğin, DNA Ligaz enzimi 1970'li yıllarda I. Robert Lehman ve ekibi tarafından saflaştırılmış ve karakterize edilmiştir.
DNA ligazları, tüm organizmalarda DNAnın onarımı ve kopyalanması için önemlidir. Lehman ve ekibi tarafından yapılan çalışmalarda, DNA ligazlarının hücre içindeki birçok temel reaksiyonda kullanıldığı sonucuna varılmıştır. DNA ligazları; Okazaki fragmanlarının birleştirilmesinde, DNA'nın nükleotid ve baz eksizyon onarımı sırasında, DNA zincirlerinin ve DNA segmentlerinin birleştirilmesinde rol almaktır. Tüm organizmalarda bulunmalarına rağmen, DNA ligazları çok çeşitli amino asit dizileri, moleküler boyutlar ve özellikler gösterir. DNA ligazları, ligaz-adenilat oluşumu için gerekli substrata göre ATP'ye bağımlı ligazlar ve NAD+'ya bağımlı ligazlar olarak iki gruba ayrılmaktadır. Bilinen tüm ökaryotik hücresel DNA ligazları ATP'ye bağımlı olup, NAD+ gerekli DNA ligazları yalnızca prokaryotik organizmalarda bulunmuştur.
DNA Ligaz türleri
E. coli DNA ligazları
E. coli DNA ligazı, 671 amino asitten oluşan ve ligA tarafından kodlanan temel bir enzimdir. Çoğu prokaryotta olduğu gibi E. coli'deki DNA ligaz da, fosfodiester bağı oluşturmak için Nikotinamid Adenin Dinükleotitin (NAD) parçalanmasından elde edilen enerjiyi kullanır. E. coli DNA ligazı, yapışkan uçlu DNA'daki iki bitişik DNA ipliğinin 5'-fosfat ve 3'-hidroksil arasında bir fosfodiester bağının oluşumunu katalize eder. Küt uçlu yüzeylerde çok fazla aktif değildir. E. coli DNA Ligaz, NAD'yi bir kofaktör olarak kullanır. E. coli DNA Ligazı, çeşitli sıcaklıklarda (4 C 37 C) aktiftir ve böylece ısıyla aktivasyonu bloklanabilir.
Bakteriofaj T4 DNA ligazları
Bakteriyofaj T4 DNA ligaz, moleküler biyoloji alanında rekombinant DNA moleküllerinin yapım sürecinde en yaygın olarak kullanılan ligaz türüdür. Genellikle bitişik nükleotitlerin 5'-fosfat ve 3'-hidroksil grupları arasında iki DNA sarmalının tamamlayıcı kohezif veya küt uçlara sahip DNA fragmanlarını birleştirebilir ve bir kofaktör olarak ATPye ihtiyaç duyar; NADa bağımlı değildir. In vivo, T4 DNA Ligaz, çift sarmallı DNA moleküllerindeki tek sarmallı çentiklerin sızdırmazlığını katalize eder. Enzim ayrıca, RNA'nın bir dubleks molekülde bir DNA veya RNA zincirine bağlanmasını da katalize eder ancak tek sarmallı nükleik asitleri bağlayamaz. T4 DNA ligaz inkübasyonu için en uygun sıcaklık ise 16 C'dir.
Termostabil DNA ligazları
Termostabil DNA Ligaz, çift sarmal DNA yapılarında bitişik 3'-hidroksil ve 5'-fosfat uçlarının NAD'ye bağlı ligasyonunu katalize eder. Termofilik bir bakteriden türetilen Ampligase DNA Ligaz, geleneksel DNA ligazlarından çok daha yüksek sıcaklıklarda stabil ve aktiftir.
Memeli DNA Ligazları
Memeli DNA ligazları, mRNA kapatma enzimlerini ve RNA ligazlarını da içeren nükleotidil transferaz ailesinin üyeleridir. İnsan hücrelerinde DNA ligazları LIG1, LIG3 ve LIG4 olmak üzere üç gen tarafından kodlanır. Bu ligazlar; DNA ligaz I, DNA ligaz III ve DNA ligaz IV şeklinde adlandırılmıştır. Memeli DNA ligazları ATP'yi kofaktör olarak kullanırlar. DNA ligaz-adenilat ara ürününün oluşumu sırasında açık bir oluşumda düzenlenirken, tek sarmal çentiklerde meydana gelebilecek bitişik 3' hidroksil ve 5' fosfat uçlarıyla birleştiklerinde bir C-kelepçe yapısını benimserler.
DNA ligazı I yalnızca çekirdekte işlev görür. Ligaz I, klasik bir nükleer lokalizasyon sinyaline sahiptir. Memeli DNA ligaz I, E. coli ve T4 DNA ligazları gibi belirgin asimetrik bir yapıya sahiptir.
DNA ligaz III hem çekirdekte hem de mitokondride işlev görür. DNA ligaz III, DNA'daki tek sarmal kırılmalarını verimli bir şekilde onarır, ancak küt uçlu birleştirme veya aşırı sarmal DNA'nın AMP'ye bağlı gevşemesini gerçekleştiremez.
DNA ligaz IV de tıpkı DNA ligaz I gibi yalnızca çekirdekte işlev görür. DNA ligaz IV, DNA çift sarmallı kırılmaları onarmak için gerekli olan, homolog olmayan uç birleştirme mekanizmasının bir parçasıdır.
DNA ligaz II, DNA ligaz III'ün proteolitik bozunmasıyla ortaya çıkan bir saflaştırma ürünüdür. DNA ligaz II, hücre çekirdeği ile sıkı bir şekilde ilişkilidir ve sadece tuz içeren tamponlar tarafından çözünür forma getirilir. DNA ligaz II genellikle memeli hücrelerinde ve dokularında DNA ligaz Ie kıyasla daha düşük bir aktivitasyon gösterir.
Uçların bağlanma yöntemleri
Bazen, vektörün yabancı DNA'ya bağlanması yerine kendi uçlarının birleşip halka şeklini kazanır. Bu sebeple, bağlama için uygun uçların bulunması ya da oluşturulması gerekir. Bu işlem değişik yollarla gerçekleştirilebilir:
Yapışkan Uçların Bağlanması
DNA parçalarının aynı cins enzimle kesilmiş olanları ve vektör bir araya getirildiğinde, kökenleri farklı olsa bile birbirlerini tamamlayıcı özellikteki yapışkan uçlara sahip olduklarından uçlar arasındaki baz eşleşmeleri ile moleküller bağlanır. Ardından, ligaz enzimi nükleotidler arasında fosfodiester bağları oluşturarak açık uçları kapatır. Bu, rDNA elde etmek için kullanılan basit ve etkili bir yöntemdir.
Bağlayıcı ya da Aracı Moleküller Kullanarak Bağlanma
Küt uçların bağlanmasında kullanılan bu yöntemde, aracı olarak yapay bağlayıcı moleküller kullanılmaktadır. Bu sentetik aracı moleküller 6-10 baz çiftinden oluşur ve bunlar oligonükleotidler. Oligonükleotidler, 5' uçları polinükleotid kinaz ile fosforlanma sonrası T4 DNA ligaz yardımıyla küt uçlara bağlanır ve bir restriksiyon enzimi yardımıyla yapışkan uçlar oluşturulur. Bu şekilde oluşturulmuş diğer bir taşıyıcıya bağlanma ve aralıkların ligaz ile kapanmasıyla bağlanma işlemi tamamlanır.
Homopolimerik Tek Zincirli Kuyruklar Kullanarak Bağlanma
Bu yöntemle de, bağlayıcı ya da aracı moleküller kullanarak bağlanmada olduğu gibi küt uçların bağlanması için kullanılır. Küt uçların 3' uçlarına terminal transferaz enzimi aracılığıyla homopolimerik tek zincirli kuyruklar eklenir. Bu yöntem, çoğunlukla ökaryotik genlerin replikasyonunda kullanılır.
Ligasyon (Bağlama) Reaksiyonu
DNA ligasyonu, birçok moleküler biyoloji ve rekombinant DNA uygulamaları için kritik bir adımdır. DNA Ligasyonu, iki DNA molekülünün DNA ligaz yoluyla birleştirilmesidir. DNA ligaz, ATP'ye bağlı bir reaksiyonda bir nükleotidin 3' hidroksil grubu ile diğerinin 5' fosfat grubu arasında iki kovalent fosfodiester bağının oluşumunu katalize eder.
3' hidroksil ve 5' fosfatı arasında bir fosfodiester bağının oluşumu üç aşamada olur
İlk olarak ligaz, serbest ATP ile reaksiyona girerek kendi kendine adenillenir.
Daha sonra adenil grubu, "verici" sarmalın 5'-fosforile edilmiş ucuna aktarılır.
Son olarak, fosfodiester bağının oluşumu, adenillenmiş verici ucunun bitişik 3' hidroksil akseptörü ile reaksiyonundan ve AMP'nin salınmasından sonra ilerler.
Ligasyon reaksiyonunun kendisini kurmadan önce, ligasyon reaksiyonu için kullanılacak kesici uç ve vektör miktarını belirlemek önemlidir.
"Yapışkan uçlar" olarak adlandırılan çıkıntılar, vektörün ve ekin birbirine bağlanmasına izin verir. Yapışkan uçta, molekülün her ipliği farklı pozisyonda kesilmiştir. Yapışkan uçlar uyumlu olduğu zaman iki DNA parçası birbirine bağlanabilir ve sonunda ligasyon reaksiyonu ile kaynaşır. Birbirleri ile H bağı yaparak enzim için uygun kararlı yapıyı oluşturmaları sebebiyle yapışkan uçların ligasyon verimi oldukça yüksektir.
Küt uçta; molekülün her iki ipliği de aynı noktadan kesilmiş olup, uçları düz ve nükleotidlerin her biri eşlenmiştir. Küt uçların ise ligasyonu daha zorlayıcıdır. Çünkü DNA ligazın doğru molekülü yakalaması zor olur. Küt uçla ligasyon, yüksek DNA yoğunluğunda gerçekleştirilirse, doğru birleşme şansı arttırılır. İki küt ucun bir araya getirildiği laboratuvar deneyleri çok verimli değildir. Çünkü ligaz, yapıştırılacak olan molekülü tutamamaktadır. Bu nedenle küt uç ligasyonu, yüksek DNA yoğunluğunda gerçekleştirilmelidir.
Ligasyonu Etkileyen Faktörler
Sıcaklık
Bir ligasyon reaksiyonunun sıcaklığını ayarlarken iki nokta dikkate alınmalıdır. Bunlardan biri DNA ligaz enziminin optimum aktivite sıcaklığı olan 37 C, diğeri ise DNA'nın erime sıcaklığı olan Tmdir. Tm ligasyona son verir. DNA'nın baz bileşimi ve uzunluğu, erime sıcaklığını belirler. Baz bileşimi, hidrojen bağları nedeniyle Tm'yi arttırır. G-C baz çifti üç hidrojen bağı, A-T baz çiftleri ise iki hidrojen bağı içerir. Yapılan bağ sayısı arttıkça erime noktası yükselir. Bir ligasyon reaksiyonunun etkinliği, DNA sarmalının uçlarının kararlı bir şekilde birleşmesi için gerekir. Genel olarak ligasyon deneylerinde Tm, 37 C'den çok daha düşüktür. Bununla birlikte, farklı restriksiyon enzimleri farklı uçlar üretir ve bu enzimler tarafından üretilen uçların baz bileşimi de farklı olabilir. Erime sıcaklığı ve dolayısıyla optimum sıcaklık, kullanılan restriksiyon enzimlerine bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir ve ligasyon için optimum sıcaklık değişebilir.
DNA Konsantrasyonu
Ligasyon karışımındaki genel DNA konsantrasyonu, reaksiyonun verimliliği üzerinde önemli bir etkiye sahiptir. Eğer bir ligasyon reaksiyonunda DNA konsantrasyonu yüksekse, bir DNA molekülünün bir ucunun başka bir DNA'nın ucuyla denk gelme ve böylece moleküller arası bir ligasyon oluşturma ihtimali daha yüksek olacaktır. Yani, konsantrasyon çok düşükse, ekleme fragmanı ile bir vektör fragmanı arasındaki ilk temasa daha az rastlanacaktır ve çok az bozulmamış plazmit ile sonuçlanacaktır. Konsantrasyon çok yüksekse, parçalar daha sık çarpışır ve birçok parçadan oluşan uzun moleküller oluşur. Genel bir kural olarak, toplam DNA konsantrasyonu 10 μg/ml'den az olmalıdır.
Ligaz Konsantrasyonu
Ligaz konsantrasyonu, ligasyon hızı ile doğru orantılıdır. Küt uçlu ligasyonun etkinliği her zaman yapışkan uç ligasyonundan çok daha az verimli olduğundan küt uçlu ligasyonlar için daha yüksek bir ligaz konsantrasyonu kullanılmalıdır. Yüksek DNA ligaz konsantrasyonu, daha hızlı bir ligasyon için PEG ile birlikte kullanılabilir.
Tampon Bileşimi
Tamponun iyonik gücü ligasyonu etkileyebilir. Mevcut katyonlar da ligasyon reaksiyonunu etkileyebilir. Örneğin Na+ miktarının fazla olması DNA'nın daha katı hale gelmesine neden olur. Bu, moleküller arası ligasyon olasılığını artırır. Yüksek tek değerlikli katyon konsantrasyonu (>200 mM) ligasyonu neredeyse tamamen engeller. Ligasyon için kullanılan standart tampon, iyonik etkileri en aza indirecek şekilde tasarlanacaktır.
Diğer Ligasyon Metotları
Ticari amaç güden DNA klonlama kitleri, var olan DNA ligazlarının kullanımını gerektirmeyen diğer ligasyon yöntemlerini kullanır. Bu yöntemler, klonlamanın çok daha hızlı yapılmasına izin vermekle birlikte, klonlanmış DNA ekinin farklı vektörlere daha basit bir şekilde aktarılmasına olanak sağlar.
Topoizomeraz Aracılı Ligasyon
TOPO klonlama, hem restriksiyon enzimi hem de ligaz olarak işlev gören DNA topoizomeraz I enzimi içerir. Biyolojik rolü, replikasyon sırasında DNA'yı hem parçalamak, hem de yeniden birleştirmektir. Vaccinia virüsü topoizomeraz I spesifik olarak 5'-(C/T)CCTT-3' pentamerik dizisini tanır ve 3' timidinine bağlı fosfat grubu ile kovalent bir bağ oluşturur. Bir DNA zincirini ayırarak DNA'nın gevşemesini sağlar. Enzim daha sonra bölünmüş sarmalın uçlarını taşır ve kendisini DNA'dan serbest bırakır. Topoizomerazın yeniden bağlanma aktivitesinden yararlanmak için TOPO vektörleri, her 3' fosfata kovalent olarak bağlı topoizomeraz I ile lineerleştirilmiş olarak sağlanır. Bu, vektörlerin DNA dizilerini uyumlu uçlarla kolayca bağlamasını sağlar. Ligasyon oda sıcaklığında sadece 5 dakikada tamamlanır.
Homolog Rekombinasyon
Faj lambdanın iyi karakterize edilmiş sahaya özel rekombinasyon sistemine dayanan Gateway teknolojisi, yönlendirmeyi ve okuma çerçevesini korurken DNA segmentlerinin yüksek verimli bir şekilde farklı ifade platformları arasında klonlanmasına, ilgilenilen parçanın veya parçaların birleştirilmesine ve aktarılmasına izin verir. Invitrogen Gateway rekombinasyon klonlaması; restriksiyon enzimleri, ligaz, alt klonlama adımları veya sayısız koloninin taranması olmaksızın bir saatlik tersinir rekombinasyon reaksiyonunu kullanır ve böylece zamandan, paradan ve emekten tasarruf etmeyi sağlar.