Nükleaz

Nükleaz, nükleik asitleri kısmen veya tamamen parçalayan bir enzim tipidir. Bu enzimler gerek sindirim sisteminde, gerek de hücre içinde, örneğin hata tamiri, gen regülasyonu, viral savunma gibi önemli işlevlerin gerçekleşmesinde rol oynarlar. Nükleazlar, tiplerine bağlı olarak, DNA ve RNA zincirlerini çeşitli biçimlerde kesebilirler. Gen mühendisliğinde farklı nükleazlar DNA moleküllerinin arzu edilen biçime sokulmasında, ayrıca DNA ve RNA moleküllerinin yapılarının anlaşılmasında birer araç olarak kullanılır.
Sınıflandırma kıstasları
Nükleazların çeşitli özellikleri onların sınıflandırılmasında kullanılır.
Enzimin substratı: RNA (kesen enzimlere ribonükleaz denir), DNA (deoksiribonükleaz), RNA ve DNA (bu tür enzimlerin özel bir adı yoktur)
Substratın ikincil yapısı: tek iplikli, çift iplikli, hem tek hem çift iplikli.
Kesim yeri: uçlardan kesme (eksonükleaz), dahili kesme (endonükleaz), hem uçtan hem dahili kesim.
Şeker-fosfat zincirde kesim yeri: şekerin 5' konumu ve fosfat arasında kesim, şekerin 3' konumu ve fosfat arasında kesim.
Baz dizisinin rolü: Diziye spesifik (restriksiyon endonüklazları), diziye nonspesifik.
Orijin: Doğal nükleazlar, rekombinant (yapay) nükleazlar.
Nükleazlar genelde kaynaklarına göre adlandırılırlar. Özellikle restriksiyon endonüklazlarında, elde edildikleri organizma ve izolasyon ve karakterizasyon sırasına göre bir adlandırma sistemi kullanılır. Örneğin, EcoRI, Escherichia coli R bakteri suşundan elde edilmiş ilk restriksiyon endonükleazıdır.
Adlandırma sistemi
Uluslararası Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Birliği'nin Adlandırma Komitesi'ne göre nükleazların çok büyük çoğunluğu hidrolaz (EC 3) ailesine aittir ve ester bağlarına etki ederler (EC 3.1). Nükleik asitleri sindiren esterazlar, yukarıda belirtilen kıstasların çeşitli kombinezonlarına göre EC 3.1.11 ile 3.1.31 arasındaki numaralara sahiptir.
Doğal işlevleri
Nükleazların bir kısmı beslenmek amaçlı olarak vücuda alınan nükleik asitlerin sindirilmesine yarar. Bazı bakteriler (örneğin Staphylococcus aureus) de tahrip ettikleri dokularda meydan gelen cerahattaki DNA'yı sindirmek için deoksiribonükleaz salgılarlar.
Nükleazlar hücrenin çalışmasında önemli rol oynarlar. DNA polimerazın DNA zincirine uzatmanın yanı sıra eksonükleaz aktivitesine sahiptir, bu sayede hatalı eklenmiş bazları zincirin ucundan çıkarabilir. Bazı endonükleazlar kimyasal zarar görmüş (örneğin oksidasyon sonucu) DNA parçalarını kesip çıkarırlar. Baz-eksizyon tamirinde görev alan DNAz III, bunun bir örneğidir. RNaz H, DNA ikileşmesinde kullanılan RNA primerini sonradan yok etmeye yarar. Dicer adlı endoribonükleaz, iki iplikli RNA'ları parçalar, bunun hem gen ifadesi düzenlenmesinde, hem de çift iplikli RNA virüslerine karşı korunmada rolü vardır. Mesajcı RNA'ların 3' uçlarından bir eksonükleaz tarafından sindirilmeleri onların kısa ömürlü olmasına neden olur, bu yüzden belli bir mRNA'ya gerek kalmayıp üretimi durunca kısa sürede o mRNA tükenir. Hatalı sentezlemiş mRNA'lar (bitiş kodonu olmayan veya çok erken gelen) ise anlamsızlık aracılıklı mRNA yıkımı (İng nonsense medıated mRNA decay) yolu ile özel endoribonükleazlar tarafından parçalanırlar.
Biyoteknolojide pek çok uygulaması olan restriksiyon enzimleri, bakterilerin kendilerini virüslerden korumak için evrimleştirmiş oldukları restriksiyon-modifikasyon sistemine ait birer savunma aracıdır. Bu enzimler belli DNA dizilerini tanıyıp DNA'yı o noktada keserler ama o tanıma dizisi kimyasal bir modifikasyona uğramışsa kesmezler. Bakterinin kendi DNA'sı modifiye olmuştur ve dolayısıyla kesilmez, ama bakterinin içine giren bir virüs DNA'sı bu modifikasyonu taşımadığı için kesilir.
Uygulama
Laboratuvarda
Rekombinant DNA işlemlerinde çeşitli nükleazlar birer araç olarak kullanılırlar. Bunların başlıcaları ve kullanım amaçları aşağıda belirtilmiştir.
Restriksiyon endonükleazları (çeşitli bakterilerden elde edilir), DNA'ya belli bir baz dizisinde bağlanıp o noktada veya oraya çok yakın bir noktada keserler. Bu özelliğe sahip olan ve farklı kesim dizileri tanıyan yüzlerce restriksiyon endonüklezı vardır, bunlardan uygun birini seçerek bir DNA'yı genelde uygun bir yerinden kesmek mümkündür. Bu yolla elde edilen DNA parçalarının sonradan birleştirilmesi amacıyla yeni DNA moleküllerinin elde edilmesi gen mühendisliğinin (rekombinant DNA teknolojisinin) temel yöntemlerinden biridir.
Deoksiribonükleaz I (pankreastan elde edilir) çift ve tek zincili DNA'yı keser. RNA veya protein saflaştırmasında DNA'yı yok etmek için, DNA-protein bağlanma yerlerini haritalamak (DNAse I footprinting) ve DNA'nın nick translatıon yöntemiyle radyokatif işaretlenmesi amacıyla DNA'nın tek zincirinde kesikler yaratmakta kullanılır.
Ribonükleaz A (pankreas), RNA'yı pirimidin bazlarında keser. DNA izolasyonunda RNA'yı yok etmek amacıyla, ve DNA/RNA hibritlerinde eşleşmemiş bazların olduğu noktalarda RNA'yı keserek mutasyonlarının haritalanması için kullanılır.
Eksonükleaz III (E. coli), çift iplikli (dupleks) DNA'nın 3' uçlarından nükleotitler çıkarır. Genelde lineer DNA moleküllerinin uşlarından farklı miktarlarda kısaltmalar elde etmek için kullanılır.
Mung fasulye nükleazı (Mung fasulya filizleri), tek iplikli DNA'yı sindirir. Yapışkan uçlu DNA moleküllerinin uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır.
Nükleaz BAL 31 (Alteromonas) çift iplikli DNA'nın hem 5' hem 3' ucundan sindiren bir eksonükleazdır. DNA parçalarının uçlarının kısaltılmasında kullanılır.
Nükleaz S1 (Aspergillus) düşük konsantrasyonda kullanılınca hem DNA hem RNA'nın tek iplikli halini keser. Yüksek konsantrasyonda çift iplikli nükleik asitleri (DNA:DNA, DNA:RNA, RNA:RNA) keser. Uygulamada, DNA:RNA komplekslerinin haritalanmasında ve tek iplikli uç uzantıları olan DNA parşalarının uçlarının düzleştirilmesi için kullanılır.
Ribonükleaz T1 (Aspergillus), RNA'yı guanin bazlarının 5' tarafından keser. DNA:RNA hibritlerinde tavlanmamış bölgelerin yok edilmesinde kullanılır.
Tıpta
Kistik fibroziste akciğerlerde biriken akyuvarlar parçalanınca açığa çıkan DNA, meydana gelen mukus tabakasının çok daha kıvamlı olmasına neden olur. Deoksiribonükleaz verilmesi ile bu DNA parçalanır ve hasta daha rahat nefes alabilir.