Anaerobic biodegradation potential of petroleum derived wastes under nitrate and iron reducing conditions

Petrol, günümüzde en yaygın enerji ve hammadde kaynağıdır. Petrol tüketimi konusunda yapılan modellemeler 2015 ve 2040 yılları arasında toplam enerji ihtiyacının %28 oranında artacağını öngörmektedir. Yenilenebilir enerji endüstrisi en hızlı büyüyen enerji sektörü olsa da modellemelere göre 2040 yılında petrol, tüm enerji kaynakları arasında en büyük kullanım oranına sahip olmaya devam edecektir. Petrol kirliliğinin ana sebepleri insan kaynaklı aktivitelerdir. Petrol endüstrisinin her adımı doğada pertol kirliliği yaratma riskini taşımaktadır. Ham petrolün kimyasal yapısının ana bileşimi hidrokarbon molekülleridir. Ham petrol numunelerinin biyolojik, kimyasal ve fiziksel reaktiviteleri kimyasal kompozisyonları üzerinden belirlenmektedir. Petrol kirliliği hava, su, toprak gibi çeşitli ortamlarda görülmektedir. Petrol hidrokarbonlarının farklı organizmlar üzerindeki toksik, karsinojenik ve mutajenik etkileri farklı çalışmalarla gösterilmiştir. Bu etkilerden dolayı hidrokarbon kirliliğine karşı etkili ve ekolojik arıtım uygulamalarının geliştirilmesi dünya çapında büyük önem taşımaktadır. Petrol kirliliğinin giderilmesinde fiziksel, kimyasal veya biyolojik arıtım çeşitleri uygulanabilmektedir. Biyolojik arıtım ekolojik ve ekonomik yönlerden avantajlı bir ıslah metodudur. Biyolojik degredasyon, hidrokarbonların doğada aşınmasında en önemli süreçtir. Hidrokarbonların parçalanabilirlikleri kimyasal yapıları ile tanımlanmaktadır. Farklı bölgelerden alınan numunelerin kimyasal bileşimleri alındıkları yere bağlı olarak değişmektedir. Mikroorganizmalar hidrokarbon moleküllerini parçalayabilme özelliğine sahip olsalar da saf kültürler hidrokarbonların karışık kimyasal yapısındaki her molekülü parçalamak için yeterli değildir. Biyolojik ıslah çalışmalarında mikrobiyal konsorsiyum bölgedeki PHKlarının yapısına ve bölgenin fiziksel özelliklerine göre belirlenmelidir. Bu sebeplerden, etkili bir biyoıslah çalışması kontamine olmuş alanın fiziksel, kimyasal, coğrafik özellikleri ve mikrobiyal dinamikleri göz önünde bulundurularak tasarlanmalıdır. Bu çalışma ile toprakta petrol kontaminasyonunun yaşandığı Adana, Türkiye bölgesinin anaerobik hidrokarbon degredasyon potansiyelinin belirlenmesi amaçlanmıştır. İkincil amaç ise petrol hidrokarbonlarını parçalama özelliğine sahip zenginleştirilmiş komunitenin elde edilmesidir. Bu amaçları gerçekleştirmek için demir ve nitrat indirgeyici ortamlarda anaerobik mikrokozmoz deneyleri kurulmuştur. İnkübasyon koşulları için 12 C, 25 C, 37 C ve 55 C olmak üzere dört farklı sıcaklık seçilmiştir. Substrat olarak Adana'dan temin edilen kontamine toprak örneği kullanılmıştır. Mikrobiyal aşı kaynağı olarak kullanılmak üzere Leuna, Almanya'da bir kirlilik bölgesinden akifer örneği temin edilmiştir. Kontamine toprağın yapısındaki hidrokarbonları biyolojik parçalanmaya daha uygun bir içeriğe dönüştürmek amacıyla bir deney grubuna kimyasal ön arıtma olarak persülfat oksidasyonu uygulanmıştır. Akifer ve toprak numunelerinin karakterizasyonu için toplam organik karbon, toplam petrol hidrokabonları, C/N oranı, pH, toplam katı madde, toplam Kjeldahl nitrojeni, çözünmüş organik karbon, poliaromatik hidroarbonlar, aromatik ve alifatik hidrokarbon fraksiyonları standard metotlar yardımı ile belirlenmiştir. TKN değerleri literatürle uyumlu olarak akifer, toprak ve ön arıtım uygulanmış toprak için 340 mg/kg, 280 mg/kg ve 320 mg/kg olarak bulunmuştur. Akifer örneğinin pH değeri nötr bulunurken toprak için ön arıtım uygulanmadan önce 5, uygulandıktan sonra 4 olarak bulunmuştur. Toprak örnekleri için pH değeri asidik olsa da topraktaki mikrobiyal büyümeye imkan verecek aralıktadır. Beklendiği üzere C/N oranı, TPH ve TOC değerleri özellikle toprak numunesi için kontamine olmamış numunelere oranla yüksek bulunmuştur. Uzun süreli kirliliğin etkisi akifer ve toprak numunelerinin detaylı hidrokarbon analizine bakıldığında hidrokarbon kompozisyonunda görülmektedir. Yapısında daha az sayıda karbon içeren hidrokarbon molekülleri buharlaşma, çözünme, biyolojik dönüşüm, foto oksidasyon gibi aşındırma süreçleri ile parçalanmaya daha yatkındırlar. Çalışılan kirlilikler uzun süreli kontaminasyon alanlarından örneklendiğinden, C5-C 9 sayılı hidrokarbonların hem alifatik hem aromatik fraksiyonlarda düşük konsantrasyonda olduğu görülmüştür. Detaylı hidrokarbon analizine bakıldığında, kimyasal ön arıtmanın hem alifatik hem aromatik fraksiyonlarda, özellikle C16-C 35 aralığındaki hidrokarbon konsantrasyonunu artırdığı görülmektedir. Daha yüksek sayıda karbon içeren hidrokarbonların persülfat oksidayonu ile C35 ve altına düşürülmesi biyolojik parçalanabilirliği artırmaktadır. C8-C 16 hidrokarbon aralığının konsantrasyonu da her iki fraksiyonda persülfat oksidasyonu sonrasında artmıştır. Anaerobik mikrokozmoz testleri yaklaşık 290 gün boyunca işletilmiştir. Mikrobiyal konsorsiyumdaki değişim kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu, yüksek çözünürlüklü erime analizi ve Illumina MiSeq tabanlı yeni nesil dizileme yöntemi ile takip edilmiştir. Mikrokozmozların aktiviteleri nitrat iyonu konsantrasyonu değişimi, toplam gaz üretimi ve gaz kompozisyonu ile iki ayda bir yapılan analizler ile takip edilmiştir. Degredasyon verimliliğinin belirlenmesi için toplam organik karbon giderimi ölçülmüştür. Demir indirgeyici ortamda en yüksek gaz üretimi ön arıtım uygulanmış numune ile 55 C'de, ikinci en yüksek ise ön arıtım uygulanmamış numune ile yine 55 C'de elde edilmiştir. Demir indirgeyici ortam için toplam gaz üretimi verisi baz alındığında en düşük aktivite 12 C'de, ön arıtım uygulanmış toprak düzeneğinde görülmüştür. Nitrat indirgeyici ortam için toplam gaz üretiminin en yüksek değerde ölçüldüğü düzenekler 25 C'de ön arıtım uygulanmış toprak ve ön arıtım uygulanmamış toprak setleridir. Demir indirgeyici ortamda olduğu gibi nitrat indirgeyici ortamda da en düşük gaz üretimi aktivitesi 12 C'de görülmüştür. Toplam gaz üretimi verisine bakıldığında akifer ve toprak numunelerinin birlikte kullanıldığı düzeneklerde gaz üretim aktivitesinin daha yüksek olduğu görülmektedir. İnkübasyon süresi boyunda GC analizi ile takip edilen CO2 üretimi toplam gaz üretimi verisi ile paralellik göstermektedir. İkisinde de gaz üretim aktivitesinde 150. günden itibaren durulma görülmektedir. Anaerobik ortamda nitrat (NO3-) iyonunun elektron alıcısı olarak kullanırak nitrat indirgenmesi gerçekleşir. Bu redoks tepkimesi sonucunda NO3- iyonu indirgenirken nitrit iyonu (NO2-) ve N2 gazı oluşur. Nitrat indirgeyici ortam için CO2'e ek olarak üretilen N2 gazı takibi de yapılmıştır. Kontrol gruplarının, 55 C persülfat oksidasyonu uygulanmış set haricindeki tüm setlerde daha az N2 gazı ürettiği görüşmüştür. İnkübasyon süresi boyunca NO3- iyonu konsantrasyonu takip edilmiştir. Nitrat, inkübasyon süresi sonunda 25 C, 37 C ve 55 C'de akifer kontrol gruplarında ve 12 C ön arıtılmış toprak setinde tamamen tüketilmiştir. Tüm sıcaklıklar karşılaştırıldığında akifer gruplarının %98, ön arıtılmış toprak grubunun %94 giderimle en yüksek nitrat giderimini sağladıkları görülmüştür. En düşük nitrat giderimi %40 oranla 12 C, konrol toprak örneğinde elde edilmiştir. Mikrokozmoz deneylerindeki degredasyon verimliliğinin belirlenmesi için TOK değerleri başta ve sonda ölçülmüştür. Hem nitrat hem de demir indirgeyici ortam için en yüksek TOK gideriminin 37 C'de ön arıtılmış toprak düzeneğinde olduğu tespit edilmiştir. Nitrat indirgeyici ortamda %40, demir indirgeyici ortamda %26 oranında TOK giderimi görülmüştür. Tüm kontrol gruplarında TOK gideriminin %10'dan düşük olduğu tespit edilmiştir. Mikrokozmoz çalışmalarına ek olarak Bushnell-Haas besi yeri kullanılarak anaerobik ortamda topraktaki ve akiferdeki petrol parçalayabilen türlerin zenginleştirme çalışması yapılmıştır. Zenginleştirme çalışmasında mikrobiyal büyümenin takibi 660 nm'de optik yoğunluk ölçülerek yapılmıştır. Mikrobiyal konsorsiyum dinamikleri qPCR ve metagenomik analizler kullanılarak takip edilmiştir. 16S rRNA bazlı Illumina dizileme yöntemi ile bakteriyel bolluk belirlenmiştir. HRM analizi kullanılarak mikrobiyal profil belirlenmiştir. Toprak ve akifere ait filogenetik sonuçlar iki numunede de alifatik hidrokarbon degredasyonuna ilişkin enzime sahip olduğu bilinen Actinomycetales takımının baskın olduğunu göstermektedir. Toprak ve akiferde bulunan diğer ortak türler Pseudomonadales, Rhodobacterales gibi alkan parçalayıcılar, Burkholderiales, Rhizobiales gibi aromatic hidrokarbon parçalayıcılar, Lactobacillales ve Selenomonadales gibi ham petrol parçalayıcılardır. Bushnell-Haas zenginleştirmesi uygulanmış akifer örneğinin mikrobiyal popülasyonunda önemli değişiklikler tespit edilmiştir. Pseudomonadales takımının akifer örneğindeki oranı BH zenginleştirme çalışmasından önce %11 iken zenginleştirmeden sonra %96'ya çıktığı görülmüştür. Toprak örneğinde BH zenginleştirmesinin en büyük etkisi Bacillales ve Burkholderiales takımlarında görülmüştür. Bacillales'in önceki değeri 0 .5'den küçükken zenginleştirmeden sonra baskın türlerden biri haline gelmiştir (%42.5). Burkholderiales'in baskınlığı ise %10'dan %30'a yükselmiştir. Demir indirgeyici ortamın dizileme sonuçları hem ön arıtma uygulamasının hem de sıcaklık farkının mikrobiyal komünite dinamikleri üzerinde etkili olduğunu göstermiştir. Actinomycetales, Bacillales, Clostridiales, ve Rhizobiales 25 C ve 37 C' demir indirgeyici setlerde bulunmuştur. Nitrat indirgeyici mikrokozmoz örneklerinin çevresel değişimlerden demir indirgeyicilere kıyasla daha az etkilendiği görülmüştür. Bacillales, Burkholderiales, Enterobacteriales, Lactobacillales tüm nitrat indirgeyici düzeneklerde tespit edilen takımlardır. Lactobacillales 37 C' de ön arıtım uygulanmamış toprak düzeneğinde %34.5, 25 C ön arıtım uygulanmamış toprak düzeneğinde %25, 4 ve 25 C persülfat oksidasyonu uygulanmış toprak düzeneğinde %40 baskınlık oranları ile tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre anaerobik ortamda hidrokabon parçalayabilen türlerin zenginleştirildiği görülmüştür. Akifer ve toprak örneğinin birlikte kullanıldığı setlerin kontrol gruplarına göre mikrobiyolojik olarak daha aktif olduğu tespit edilmiştir. İstatistiksel analizlere göre nitrat indirgeyici ortamda 37 C'de bağıl bakteri aktivitesi ile CO2 ve N2 üretimi arasında korelasyon tespit edilmiştir. Nitrat indirgeyici ortamda 25 C'de ise TOK giderimi ve bağıl bakteri aktivitesi arasında anlamlı bir korelasyon vardır. Yapılan bu çalışmaya göre persülfat oksidasyonu, hidrokarbon içeriğini yüksek sayıda karbon içeren bileşikleri parçalayarak ve çözünmüş organik karbon değerini artırarak hedeflenen yönde değiştirmiştir. Akifer ve toprak örneklerinin bir arada kullanıldığı düzeneklerin aktivitelerinin yüksek olması olası bir mikrobiyal işbirliğine işaret etmektedir.