Respiration inhibition test: A Modified method for priority pollutants

San 10-20 yıl içerisinde biyolojik aktif çamur sistemlerine toksik etki araştırmalarına giderek artan bir ilgi olduğu açıktır. Eğer biyolojik arıtma tesisine giren atıksu, prosesin aktif biotasma zararlı maddeler içeriyorsa, prosesin verimi olumsuz yönde etkilenecektir. Bu etkiyi oluşturan maddelere toksik veya inhibitor maddeler adı verilir. Genellikle bu toksik maddeler endüstri kaynaklıdırlar. Endüstriyel ve evsel atıksuların birleştirilmesi sonucunda biyolojik arıtmaya toksik madde girdisi söz konusu olacaktır. Çevre Koruma Teşkilatı, MPA, 129 adet öncelikli kirletici tanımlamıştır. Bu öncelikli kirleticiler, kanserojenik, mutojenik, teratojenik ve yüksek akut toksik etkileri baz alınarak seçilmiştir. EPA tarafından tanımlanan liste 13 metal, 114 organik, siyanür ve asbesti kapsar. Gelecekte de bu maddelerin sayısının artacağı sanılmaktadır. Biyolojik sistemlerde inhibitor etkileri, azalan arıtma verimi, zayıf çökelme karakteristiği ve biyolojik aktivitenin azalması sonucu sistemin tümüyle inhibisyonu şeklinde ortaya çıkabilir. Bu yüzden toksisite ve inhibisyonun önemi göz ardı edilemez. İnhibisyon ve toksisite ölçümleri genellikle mikroorganizmaların aktivitelerinin çeşitli yollarla ölçümü yoluyla yapılır. Bu aktivitenin miktarı azalan organik madde giderimi, solunum aktivitesindeki değişiklikler veya belirli biyokimyasal ajanların hücre metabolizması içindeki konsantrasyonlarının kimyasal testlerle ölçümü yoluyla yapılabilir. Toksik etkilerin, biyolojik aşının ve inhibitor maddenin karışım halinde bulunduğu kesikli bir aktif çamur reaktöründe de izlenmesi mümkündür. Oksijen kullanımı, organik madde giderimi veya enzimatik aktivitenin periyodik ölçümleri farklı şartlarda biyolojik tavrın belirlenmesinde kullanılabilir. Mikroorganizmanın solunumuna inhibisyon etkisine dayalı bir prosedür 1984 yılında OECD yönergesince benimsenmiştir. OECD Metod 209 'Solunum inhibisyon testi' olarak adlandırılan bu prosedürde, hızlı biyolojik degredasyona uğrayabilen bir maddeyle birlikte inhibitor bir maddeye maruz kalan mikrobiyal kültürün oksijen tüketim hızı ölçülür. Oksijen tüketim hızlarının ölçümleri farklı konsantrasyonlarda inhibitor içeren reaktörlerde 30 dk ya da 3 saatlik maruz kalma süreleri sonunda ölçülebilir. Herhangi bir konsantrasyondaki inhibitor etkisi kontrolün yüzdesi olarak ifade edilir. Ancak bu yöntemin yaygın kullanımına karşın mikroorganizmal inhibisyon için veya inhibisyonun türlerini -XI-belirlemede ve dolayısıyla eldeki kinetiklere uygulanabilirliği konusunda sorular mevcuttur. Bu yöntemde inhibisyon belirlemesi aşağıdaki formüle göre yapılır. Test reaktörünün oksijen tüketim hızı (1) 100 = % inhibisyon Kontrol reaktörünün oksijen tüketim hızı OECD 209 Metodun esasını oluşturan iki ifade vardır ve bu ifadelerin tanımları yönergedeki şekliyle aşağıdadır. Respirasyon hızı: Atıksu mikroorganizmalarının veya aerobik bir çamurun birim zamandaki oksijen tüketimidir. Genellikle mg02/lt. dk veya mg02/lt. saat şeklinde ifade edilir. EC50: Yönergede tarif edilen prosedür uygulandığında kontrol reaktörüne göre respirasyon hızını 50 % azaltan inhibitor konsantrasyonudur. Metodda çıkan sonuçların değerlendirmesi sadece EC50 değerlerinin bulunması ile sona erer. Bu değerin bulunuşu farklı inhibitor konsantrasyonlarına karşılık gelen. respirasyon hızlarının hesabından sonra bu noktaların log-normal bir kağıda işaretlenmesinden ibarettir. Volskay ve Grady (1988) OECD 209 metodunun kendileri tarafından modifiye edilmiş formunu kullanmışlardır. Volskay ve Grady bu testin modifikasyonunu prosedürün uygulanışı sırasında meydana gelebilecek uçucu organik madde kaybını önlemekle sağlamışlardır. Bunun yanında çalışma inhibisyon türlerini belirlemede olumlu görünen bir düşünceyi de içermektedir ve bu düşünce genel olarak IC50 veya EC50 gibi eşik değerlerin anlamı üzerinde yoğunlaşmıştır. Oysa bu çerçevede test yönteminin bu düşünceye uygunluğu tartışılabilirdir. Çünkü testin önerdiği maruz kalma süresi ile inhibisyon türleri arasında gerek fizyolojik gerekse matematik olarak çelişkiler vardır. Volskay ve Grady'nin (1988) önerdiği bir parametre olan boyutsuz inhibitor konsantrasyonu inhibisyon tiplerinin saptanmasında olduğu kadar öncelikli kirleticilerin eşik değerlerinin de belirlenmesinde kullanılabilecek bir parametredir. Yapılan çalışmalarda, özellikle nonkompetitiv davranan inhibitörler için toksisite değerlendirmeleri doğru yapıldığı taktirde bu inhibisyon tipinin bazı kabullerle birlikte belirlenmesinin mümkün olduğu görülmüştür. Bu çalışmanın birinci derecede amacı bazı öncelikli kirleticilerin aktif çamur mikroorganizmalarına etkilerinin belirlenmesidir. Bu etkilerin belirlenmesi için OECD 209'da önerilen 'Solunum inhibisyon testi' nin bir modifikasyonu üzerinde çalışılmış ve bu metodun inhibisyon testleri açısından anlamlılığı araştırılmıştır. Çalışma iki kısımdan oluşmaktadır. Birinci kısımda, inhibitor madde hemen ölçüm öncesinde verilerek mikroorganizmaların inhibitöre karşı ani tavrının belirlenmesine çalışılmıştır. İkinci kısımda ise birinci kısımda görülen bazı eksiklikler ortadan kaldırılmış ve inhibitor maddelerin belirli bir inkübasyon periyodu sonrasında etkileri araştırılmıştır. Çalışmada, Çevre Koruma Teşkilatı, EPA tarafından listelenen öncelikli kirleticilerden 6 organik (fenol, tetrahidrofuran, karbon tetraklorür, 2 ,4-dimetilfenol, furfural, siklohegzanon) ve 3 inorganik seçilmiş ve IC50 değerleri araştırılmıştır. Bu maddeler mikroorganizmal ayrışmaya uğramayan veya yavaş ayrışabilen maddeler olduğundan dolayı inhibitor davranışlarının belirlenmesi için hızlı ayrışabilen bir sübstrat asıl karbon kaynağı olarak kullanılmıştır. Ayrıca mikroorganizmanın hem glükoz hem de inhibitor madde olarak fenol içeren çoklu substrata aklimasyonu üzerinde çalışılmıştır. Aklimasyon süreci 30 gün sürdürülmüş ve mikroorganizmanın aklimasyon süresi sonunda fenole tepkisinin değiştiği ancak halen esas karbon kaynağı olarak glükozu kullanmasına rağmen, içinde fenolün de bulunmadığı ortamdan olumsuz yönde etkilenmeler olabileceği görüldü. Bu farklılığın sebebinin fenolün bulunmadığı ortamın aklimasyona uğramış hücrelerin metabolizmasında değişime yol açması olabileceği öne sürülmüştür. King ve Painter (1985) 6 organik kimyasalın üç ay süresince aklimasyonu üzerinde bir araştırma yapmışlardır. Bu çalışmada EC50 değerleri üç farklı metotla farklı zaman periyotlarında saptanmıştır. Yapılan araştırmalar sonucu, mikroorganizmal solunumdan gidilerek elde edilen EC50 değerlerinin, çoğalma inhibisyonuyla bulunan EC50 değerlerinden daha yüksek oldukları belirlenmiştir. Mikroorganizmal çoğalmanın, hücre aktivitesini, solunuma dayalı testlerden daha iyi yansıttığı söylenebilir. Yapılan çalışmalarda, inhibitor maddeye mikroorganizmanın tavrının, özellikle solunuma olan etkinin birdenbire ortaya çıkmadığı, bu etkinin belirlenebilmesi için belli bir zaman periyodunun bırakılması gerekliliği ortaya çıkarılmıştır. Inhibitor maddenin hemen ölçüm öncesinde verildiği durumlarda inhibisyon eğrileri monoton bir inişle ancak çok yüksek konsantrasyonlarda mikroorganizma solunumuna inhibisyon göstermişlerdir. Bu yüzden ölçüm öncesi mikroorganizmanın inhibitörle maruz kalma süresi artırılıp 3 ve 18 saatlik inkübasyonlar çalışılmıştır. 18 saatlik inkübasyon sonuçlarının inhibisyon tipi değerlendirmesi açısından daha anlamlı sonuçlar verebileceği ortaya çıkarılmıştır. Ancak böyle yüksek bir -XIII-inkubasyon süresinin de bir çoğalma meydana getireceği ve bu sefer olcum yönteminin de oksijen tüketim hızı değil, çoğalma olması gerektiği şeklinde şüpheler mevcuttur. Yukarıdaki açıklamalara göre mikroorganizma aşısı için belirli bir inkubasyon periyodu tanındığında mikroorganizma seçilen sübstratı kullanarak çoğalır. İnkubasyon sonrasında toksisite eşikleri belirlenebilmesine rağmen oksijen tüketim hızı ölçümleri güvenilir olmayan sonuçlar verebilmektedir. inkübasyonu takiben mikroorganizma tarafından seçilen sübstratın tükenmesi üzerine mikroorganizma içsel solunuma geçmek üzeredir. Kısaca solunum inhibisyon testi çoklu sübstrat kullanılarak uzun inkübasyonlarda mikroorganizmanın tavrını doğru yansıtmayabilir. Ancak, inkübasyonu takiben yapılacak bir bakteriyel çoğalma inhibisyon testinin daha makul değerlendirmeler yapılmasını sağlayabileceği düşünülebilir. Ayrıca, solunum inhibisyon testlerinde önemi göz ardı edilemeyecek diğer bir faktörün de çamur yaşı olduğu görülmüştür. Yapılan çalışmalarda çamur yaşı 5 günden büyük olan sistemlerde sistemdeki canlılığın % 40 lara indiği ortaya çıkarılmıştır. Çamur yaşının artması, solunumun cansız hücreden kaynaklanan kısmını da artırır. Çoğalma kabiliyetinin yitirilmesinin yani hücrenin mikrobiyolojik olarak cansız olmasının, biyokimyasal aktivitesini yitirdiği anlamına gelmemesinden dolayı biyolojik olarak daha aktif sistemler solunum inhibisyon testine daha hassas olacaklardır. Ancak bu durumda da gerçek sistemler açısından değerlendirme yapmak zor olacaktır. Inhibitor maddelerin, inhibisyon tiplerinin belirlenmesinin pratikte büyük önemi vardır. Dört ana inhibisyon tipini hücre içinde inhibitörle enzimin verdiği reaksiyonlar belirler. Bu inhibisyon tiplerinden nonkompetitiv davranış sistemdeki sübstrat konsantrasyonundan etkilenmez ve tek bir inhibisyon eğrisi oluşturur. Ankompetitiv ve karışım inhibisyonlar ise artan sübstrat konsantrasyonundan bir miktar etkilenir ancak bu etkileşim inhibisyonu engellemeyecektir. Kompetitiv inhibisyon davranışında ise artan sübstrat konsantrasyonu inhibitor maddenin etkisini azaltır ve bu durumda ancak çok yüksek inhibitor konsantrasyonları aktif çamur sistemini inhibe eder. Bu noktada inhibisyon tipi önem kazanmaktadır. Çünkü inhibisyonu belirlemeye yönelik laboratuar çalışmaları genellikle yüksek sübstrat konsantrasyonu kullanırlar. Ancak gerçek sistemlerde sübstrat konsantrasyonu daha düşük olduğundan laboratuar çalışmalarında elde edilen sonuçların gerçek sistemlere uyarlanması sırasında yanılgılara düşülebilir. Bu yüzden inhibitor maddelerin inhibisyon davranışlarının belirlenmesi ileri çalışmalar gerektirir. Ele alınması gereken konulardan birisinin de organik bir inhibit örün mikroorganizma için tekil karbon kaynağı -XIV-olamayacağıdır. Bakteriyel çoğalma diğer bir kolay ayrışan sübstrat tarafından desteklendiğinde, bu organik inhibitor 1 erin birçoğu mikroorganizma tarafından ayrıştırılabilmektedir. Çoklu bir sübstratın sistemde bulunmasının organik bir inhibi t örün davranışına etkisi tam anlamıyla açıklanamamaktadır.