Development of effective molecular approach for determining of the biodegradation potential of petroleum contaminated soil

Yenilenebilir enerji üretimindeki artışa rağmen, petrol ürünleri hala sanayi ve yerel tüketim için enerjinin ana kaynağıdır. Dünyanın yıllık ham petrol üretim miktarı üç milyar tondan daha fazladır. En çok petrol tüketen ülkeler en büyük petrol üreticileri arasında olmadıklarından, üretilen petrolün büyük miktarı boru hattı ve su yolları vasıtasıyla aktarılmaktadır. Büyük miktarda petrolün arama, çıkarılma, üretim, taşıma, rafinaj ve depolama faaliyetleri esnasında çevreye girişim yapmaktadır. Petrol atıkları, sağlık sorunlarına ve insan hayatı ve ekosistemin düzenini bozmaya sebep olan toksik, mutajenik ve kanserojen bileşikler, içerir. Bu maddelerin çevreye bırakılması ilgili mevzuata göre kısıtlanmıştır. Petrol çamuru su, yağ emülsiyonu, metal, katran ve çok sayıda petrol hidrokarbon bileşiği içerir ve karmaşık bir yapıya sahiptir. Petrol çamurlarının yanlış bertarafı ciddi toprak, su ve yeraltı suyu kirliliğine neden olmaktadır. Toprak buhar ekstraksiyonu, toprak yıkama ve dispersiyon gibi bazı fizikokimyasal yöntemler yaygın olarak petrolle kirlenmiş ortamların ıslahı için kullanılmaktadır, fakat, bu yöntemler petrol kirliliğini tamamen bertaraf edemiyor aynı zamanda kirlenmiş bölgelerin toksikliğini artırabilir. Biyoremediasyon, ekonomik ve çevre dostu bir arıtma metodu olarak bu sorunları ortadan kaldırmaktadır. Bu işlem sırasında kirletici bileşikleri toksik olmayan materyallere dönüştürülür veya tamamen CO2 ve H2O'ya dönüşür. Biyoremediasyon uygulanan alanlarda yerli mikroorganizmalar veya aşılanmış olarak kullanılanları, oksijen veya başka bir ekleyici kullanılarak organik kirleticilerin metabolize olması için canlandırılabilir. Bioaugmentasyon, iyileştirilmiş biyoremediasyon tipi olarak, mikrobiyal suşların eklenmesiyle biyoremediasyon alanının biyolojik bozunma potansiyelinin gelişmesidir. Bu işlem çeşitli kirletici maddelerin indirgenmesinde önemli bir etkisi vardır. Ancak, genetik mühendisliği mikroorganizmalar kullanımı ile ilgili endişeler ve bu mikroorganizmaların çevre üzerindeki muhtemel etkileri yaygın olmaktadır. Biyostimülasyon, biyoaugmentasyon'a alternatif olarak ve sürdürülebilir bir biyoıslah yöntemi olarak biyoaugmentasyon'a göre toprak biyoremediasyonunda daha etkili bir yöntemdir. Kirlenmiş ortamda bu işlemin verimliliğin izlenmesi ve biyolojik bozunma durumunun değerlendirilmesi, biyostimülasyon uygulamasında önemli adımlardan biridir. Etkili bir izleme biyoremidasyon maliyetini ve ıslah süresini azaltabilir. Petrolle kirlenmiş toprakların biyoremediasyon işleminin değerlendirilmesi ve biyolojik bozunma potansiyelinin belirlenmesi için etkili bir moleküler izleme yaklaşımının geliştirilmesi bu tezin misyonudur. Ayrıca, biyoıslah işlemi sırasında mikrobiyal topluluğun yapısının ve fonksiyonel gen dinamiğinin değerlendirilmesinde, bu tezin bir misyonudur. Aerobik mikrokozmaları testi kurularak, biyostimülasyon sürecinde biyolojik bozunma durumu, mikrobiyal topluluğun yapısı, ve fonksiyonel gen dinamiği değerlendirilmiştir. Aynı zamanda mikrobiyal topluluğun içinde fonksiyonel genlerin horizontal geçiş oluşumu analiz edilmiştir. Bu amacı gerçekleştirmek için, petrolle kirlenmiş toprak örnekleri petrol depolama lagününden toplandı ve karakterize edildi. Alınan örneklerde dominant bakteri türleri Illumina Sekanslama yöntemini kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen petrolle kirlenmiş örnekler temiz orman toprağı örnekleri ile karıştırılıp farklı oranlarda ve ağırlıklarda cam kaplara konuldu. Elde edilen toprak karışımlarına farklı oranlarda N:P ekleyerek 90 gün boyunca 24 C'de yetiştirildi. Genomik DNA, toplam RNA, ve plazmidler çıkartıldı. Genomik DNA, toplam RNA, ve plazmidler ekstre edildi. TaqMan probu ile kantitatif gerçek zamanlı PCR alkan ve poliaromatik hidrokarbonlar degrade eden bakteriler, alkB, phnAc ve nah fonksiyonel genlerin ölçülmesi için kullanılmıştır. Bir son-arıtma yöntemi olarak Trametes versicolor ve Bjerkandera adusta fungus türleri kullanarak biyostimülasyon uygulaması ardından biyoaugmentasyon uygulandı. Söz konusu fungusların yerli mikrobiyal topluluğuna ve alkB, phnAc ve nah fonksiyonel genlere etkisi, 29 C'de 60 günlük bir sürede biyoaugmentasyon uygulanarak değerlendirildi. Biyodegradasyon testi boyunca, maksimum biyodegradasyon miktarı C:N:P oranı, 100 :15:1'e ayarlanan mikrokozmoslardan elde edildi. En çok toplam organik karbon giderim miktarı 18% ve başlangıç TOK miktarı 15% olan mikrokozmoslara ait idi. Petrolle kirlenmiş topraktan toplanan örneklerin mikrobiyal analizleri, gramnegatif bakterilerinin dominant bakteriyal grup olduklarını gösterdi: -proteobacteria, Chloroflexi, Firmicutes ve -proteobacteria dominant bakteri filumları oldukları belirlendi. Bu bakteri grupları, belirlenmiş bakteriyel suşların %65'inden fazlasını kapsamakta oldukları açıklandı. Biyostimülasyon bir sürdürülebilir biyoremediasyon yaklaşımı olarak, petrolle kirlenmiş toprağın biyodegradasyonun artırılabilmesi için yapılan biyodegradasyon testiyle açıkça ortaya koymuştur. Yapılan petrolle kirletilmiş toprağın biyostimülasyon sürecinde yerli mikrobiyal topluluğun miktari analizleri gramnegatif bakterilerin gram-pozitif bakteriler üzerinde bir rekabet avantajı olduğunu gösterdi. Petrolle kirlenmiş toprak örnekleri ve deneysel aşamada elde edilen örneklerde söz konusu bakteri grubunun dominant olması, kirlenmiş bölgedeki petrol hidrokarbonlarına uzun vadeli bir ortama alıştırma sürecinden dolayı bu bakteriler biyodegradasyon setlerindeki temiz orman toprağından alınan örneklerden kaynaklanan diğer yerli bakterilerin üstesinden gelebilmelerini gösteriyor. Bu bakterilerin istikrarında herhangi bir başarısızlık, alkan ve PAH biyodegradasyon işleminde bir düşüşe yol açacaktır. alkB ve phnAc genlerin başarılı horizontal geçişi tespit edildi. Biyostimülasyon işlemi sırasında horizontal gen geçişi oluşumunun tespit edilmesi, HGÇ biyoremidasyon sürecinin izlenmesi için yararlı bir biyolojik gösterge olduğunu göstermektedir. Ayrıca, kirli alanlarda HGÇ değerlendirilmesi biyoremidasyon potansiyelinin daha geniş bir şekilde tahmin edilmesini sunabilir ve petrolle kirlenmiş bölgede HGÇ oluşumu hakkında olumlu işaretlerin elde edilmesi, biyostimülasyon işleminin kirlenmiş bölgenin biyoremediasyonu için uygun bir yaklaşım olduğunu teşhir etmektedir. Son-arıtım fazından elde edilen sonuçlar, T. versicolor and B. adusta fungusları biyostimülasyon fazdan kalan petrol kalıntılarını önemli miktarda indirgeyemediklerini gösterdi. Ancak qPCR sonuçlarına göre T. versicolor, petrol kalıntılarının biyodegradasyonunda B. adusta'dan daha etkilidir. Son-arıtım fazı aşamasında, alkB, phnAc ve nah fonksiyonel genlerin ekspresyon miktarı sinerjik olarak artırılmıştır. Aktif bakteriyel hücreler, negatif gram ve gram-pozitif bakter miktarında kayda değer bir değişiklik gözlemlenmemiştir. İlerideki çalışmalarda, anaerobik mikroorganizmaların toksik bileşenlerin bozunması işleminde daha verimli olduklarından biyoremediasyon çalışmalarında kullanılması tavsiye edilir. Ayrıca, farklı anaerobik fungus türlerinin kombinasyonları ve anaerobik fungus ve bakteri türlerinin birleşimleri petrolle kirlenmiş toprakların maksimum biyodegradasyonu için önerilmektedir. Aynı zamanda, biyoaugmentasyon sürecinde inokulum mikroorganizmalar ve yerli olanlar arasındaki fonksiyonel genlerin horizontal geçişi, verimli bir biyomarker olarak biyoremediasyon yaklaşımının izlenmesi için test edilebilir.