Inhibitory impact of selected antibiotics on biodegradation characteristic and microbial population under aerobic conditions

Teknoloji, endüstri ve tarımsal aktivitelerdeki gelişmeler neticesinde sentetik ve genellikle toksik organik maddeler atıksulara girmeye başlamıştır. Çeşitli endüstriyel proseslerde ortaya çıkan kalıcı organik maddelerin ve mikrokirleticilerin varlığı, bu maddelerin gideriminin ve arıtma sistemlerine etkilerinin belirlenmesinin önemini arttırmıştır. Bu kalıcı organik maddelerden olan ve son yıllarda çevre için büyük tehlike arz etmeye başlayan zenobiyotikler, genellikle sentetik olarak üretilen ve organizmaya yabancı olan maddeler olarak tanımlanmaktadır. Antibiyotikler de doğada ayrışmadan kalabilen ve besin zincirinde biyoakümüle olan zenobiyotiklerden biridir. Günümüzde başta tıp alanında olmak üzere veterinerlik ve tarımda yaygın olarak uygulanan antibiyotiklerin, bilinçsiz kullanımı ile sularda ve toprakta miktarları her geçen gün artmaktadır. Günümüzde bu kontrolsüz kullanım sonucu birçok bakteri türünün, özellikle patojen türlerin, antibiyotik direnci kazanması söz konusudur. Antibiyotik direnci kazanan mikroorganizmaların doğal ekosistemlerde yaygın olarak bulunması, başta insanlar olmak üzere hayvanlar ve bitkiler açısından büyük bir risk oluşturmaktadır. Literatürde antibiyotiklerin atıksu arıtma tesislerinin giriş ve çıkışlarındaki konsantrasyon değerleri ve alıcı ortamlardaki konsantrasyonları ile ilgili birçok çalışma bulunmaktadır. Buna karşın bu maddelerin arıtma tesislerindeki ayrışma mekanizmaları ve sistemdeki mikrobiyal popülasyon üzerine olan etkilerin ayrıntılı olarak araştırılmadığı görülmüştür. Yapılan araştırmalarda ise sistemde ya sadece kollektif parametrelerin ölçüldüğü ya da sadece antibiyotik konsantrasyonlarının izlendiği görülmektedir. Mikrobiyal popülasyonun antibiyotiklere verdikleri tepkiler ve popülasyon dinamiği de incelenmemiştir. Ayrıca, literatürde antibiyotiklerin biyolojik ayrışmaları ile ilgili yapılan çalışmalarda birbirinden çok farklı sonuçlara ulaşılmış olduğu da görülmektedir. Sulfonamidler insanlarda toplam antibiyotik kullanımının % 16-21 kadarını kapsamaktadır, kullanım sonrasında genellikle metabolitleri ve bir kısmı da orijinal aktif madde olmak üzere idrar ile dışarı atılmaktadır. Bu grubu temsilen seçilen sulfametoksazol en yaygın görülen sulfonamid grubu antibiyotiktir. Literatürde yapılan çalışmalarda sulfametoksazolün giderimi ile ilgili olarak kesin bir bilgi bulunmamaktadır. Seçilen ikinci antibiyotik olan tetrasiklin ve türevi antibiyotikler, hayvancılık ve tarımda en yaygın kullanılan antibiyotiklerdendir. Tetrasiklin grubu antibiyotiklerinin %80'i fotokatalitik reaksiyonlar ile ayrışma özelliğine sahiptir. Tetrasiklin antibiyotiğinin, aktif çamur sistemlerinde çamura tutunma yolu ile giderildiği ve bunun tetrasiklinin kalsiyum ve benzeri iyonlar ile, çözünürlüğü çok düşük bileşikler oluşturma eğiliminin bir sonucu olabileceği belirtilmiştir. Makrolidler ise insanlarda toplam antibiyotik kullanımının % 9-12 kadarını kapsayan en önemli antibiyotik gruplarından biridir ve penisilinlere alternatif olarak kullanılmaktadırlar. Makrolidler genellikle metabolize edilememekte ve değişmeden dışkı ile atılmaktadır. Gerçekleştirilmiş olan çalışma, antibiyotik maddelerin pepton karışımına aklime edilmiş bir aerobik mikrobiyal kültürün substrat ayrıştırması üzerine olan etkilerini, mikrobiyal popülasyon üzerine olan etkilerini ve aynı zamanda sistemin direnç profilini incelemiştir. İki adet doldur-boşalt tipi reaktör ISO8192 prosedüründe belirlenmiş olan pepton karışımı ile beslenmiş ve iki farklı çamur yaşında (çamur yaşı 10 gün ve 2 gün) kararlı halde devam ettirilerek, çalışma boyunca biyokütle kaynağı olarak kullanılmıştır. Akut inhibisyon çalışmaları için, kontrol reaktörlerinden alınan kaynak çamur kullanılarak kurulan paralel kesikli reaktörlerde, toplamda her iki çamur yaşı için on bir set deneysel çalışma gerçekleştirilmiştir. 50 mg/L ve 200 mg/L olmak üzere ani Sulfamethoksazol, Tetrasiklin ve Eritromisin ilavesi yapılmıştır. Ayrıca, aktif çamur sistemlerinin antibiyotiklere kronik maruz kalmalarının etkilerinin incelenmesi amacıyla toplamda altı adet reaktör işletilmiş ve farklı günlerde deneysel çalışmalar gerçekleştirilmiştir. Substrat tüketimi, ilgili oksijen tüketim profillerinin gözlemlenmesi ile incelenmiş ve antibiyotik etkisi altında olmayan ilgili kontrol reaktörünün oksijen tüketim profili ile karşılaştırılmıştır. Serbest substratın temel stokiyometrisi ve kütle dengesi, inhibitörlerin etkisinin açıklanması açısından çok önemlidir, bunun nedeni ise substratın bloke edilmesinin göz ardı edilmesi ile elde edilen kinetik değerlendirmenin yanlış yönlerdici özelliğe sahip olmasıdır. Literatürdeki birçok çalışma substrat bağlanmasını göz ardı etmiştir ve sadece substrat profillerine dayalı incelemelerde bulunmuşlardır. Bu çalışmalarda biyokimyasal reaksiyonlara katılmayan bağlı substrat ayrıdedilmemiştir. Oksijen tüketim hızı profillerinin inhibisyon etkisi incelemelerinde kullanılmaları bu çalışmanın orijinalliğini oluşturmaktadır. Bu kapsamda seçilmiş olan antibiyotiklerin substrat bağlayıcı özellikleri unkompetitif inhibisyon yaklaşımı ile belirlenebilmiştir. Seçilmiş olan antibiyotik maddelerin pepton karışımının biyolojik olarak ayrışması üzerindeki akut ve kronik inhibisyon etkilerinin belirlenmesi amacıyla, bütün OTH profilleri temin eden respirometrik testler çalışmanın temelini oluşturmuşlardır. İnhibisyon etkisi, antibiyotik ilavesinin olmadığı kontrol testinde elde edilen orijinal OTH profilinin şeklindeki değişiklikler ile ortaya konmuştur. Antibiyotiklerin, peptonun piyolojik ayrışmasına en önemli etkisi, OTH testlerinde tüketilen oksijen miktarının azalmasıdır. Bu etki, maksimum büyüme hızını azaltarak ve/veya yarı doygunluk sabitini arttırarak biyolojik ayrışmayı etkileyen geleneksel inhibisyon kavramı ile açıklanamamaktadır. Bu iki etki de kinetik olarak substrat kullanımını yavaşlatma özelliğine sahiptir. Bu tür bir inhibisyon OTH eğrilerinin endojen solunum aşamasına ulaşma süresini uzatacak ancak OTH eğrisi altındaki alana tekbül eden oksijen tüketim miktarının sabit kalmasına neden olacaktır. Ancak, bu çalışmada elde edilen OTH profilleri farklı özelliklere sahiptir. Antibiyotik ilavesi ardından, biyolojik ayrışma süresi sabit kalmakta, buna karşın tüketilen oksijen miktarı kullanılan antibiyotik türü ve dozajına bağlı olarak azalmaktadır. Bu kapsamda, farklı oranlarda pepton karışımının antibiyotik tarafından bloke edildiği ve devam eden mikrobiyal büyüme reaksiyonlarına katılamadığı sonucu ortaya çıkmaktadır. Bu gözlem sadece unkompetitif inhibisyon mekanizması ile açıklanabilmektedir. Bu kapsamda, bütün gözlemler unkompetitif inhibisyon kavramı ile açıklanmıştır ancak inhibisyon etkisinin antibiyotik dozu ve türüne bağlı olarak değiştiği gözlemlenmiştir. Elde edilen deneysel data Aktif Çamur Model No.3 kullanılarak simüle edilmiştir. Sonuçlar, bütün dışsal substrat giderilirken, antibiyotik ilavesi ile oksijen tüketiminde önemli bir düşüş yaşandığını ortaya koymuştur. Bu durum, pepton karışımının değişken fraksiyonlarının antibiyotik madde tarafından bloke edildiğini ve biyolojik ayrışmaya girmediğini göstemiştir. Bu gözlem, enzim-inhibitör kompleksi oluşumu ile benzer bir substrat blokajına neden olan unkompetitif inhibisyon mekanizması ile örtüşmektedir. Ayrıca, kronik reaktörlerinde görülen direnç profili ve pirosekanslama yöntemi kullanılarak kronik sistemlerin mikrobiyal popülasyon dinamikleri incelenmiştir. Bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar sistemlerin dominant türlerinde kayma gerçekleştiğini ve sistemlerde antibiyotik etkisi altında canlılığını sürdürebilen organizmaların antibiyotik maddelere dirençli olma özelliklerini ortaya koymuştur. Çalışmalardan elde edilen sonuçlar çamur yaşının mikrobiyal popülasyona olan etkilerini de açığa çıkarmıştır. Elde edilen sonuçlara gore, yavaş büyüme özelliği olan Actinobacteria türlerinin hızlı büyüyen SRT2d sistemini domine etme özelliklerinin olmadığını göstermiştir. Buna karşın SRT2d sistemini Proteobacteria türlerinin domine ettiği görülmüştür. Ancak, çamur yaşı 10 gün sisteminde Actinobacteria yıkanmamış ve sistemi domine edebilmişlerdir. ERY etkisi altında ise SRT 10 gün sisteminde popülasyonda bir kayma geçeklemiş ve dominantlik Actinobacteria'dan Proteobacteria'ya geçmişştir. Bunun nedeni dirençli Proteobacteria'nın sistemde yaşamını sürdürebilmesidir. Sistemde Comamonas sp OTU# 293 en baskın canlılardan olmuştur. SRT2gün sisteminde ise ERY etkisi yok iken Proteobacteria baskın olmasına ragmen ERY etkisi altında kültüre alınamamış aday phylum olan TM7 türü (OTU#83) baskın hale gelmiştir. Ancak TET ve SMX'in etkilerinin popülasyonda bir kaymaya neden olmadığı görülmüştür. Buna karşın, TET SRT2d sisteminde Deinococcus-Thermus phylumu yok olurken, SMX SRT2d sisteminde OTU#1, Deinococcus-Thermus phylumu türünün en baskın organizmalardan biri haline geldiği görülmektedir. SMX SRT2d sisteminde Proteobacteria önemli derecede azalmiş ve Deinococcus-Thermus phylumu artmıştır. Ancak SRT0d sisteminde Bacteroidetes önemli derece azalmıştır. Bütün SMX ve TET sistemlerinde Arthrobacter türlerinin baskın oldukları belirlenmiştir (OTU#2, OTU# 55 ve OTU#4). Antibiyotik çalışmalarının devam ettirilmesi halinde, bu maddelerin giderilmesi ile ilgili çalışmaların gerçekleştirilmesi ve antibiyotikleri ayrıştırabilen organizmaların belirlenmesi üzerinde çalışılmasının faydalı olacağı düşünülmüştür. Ayrıca bu tür çalışmalarda da mutlaka modelleme simülasyon çalışmalarının devam ettirilmesi gerekmektedir. Böylece sistemin verdiği tepkinin doğru şekilde belirlenmesi mümkün olacaktır.