Comparative evaluation of microbial diversity and pha storage ability of activated sludge under different operating conditions

Biyolojik olarak üretilen ve biyolojik olarak tümüyle ayrışabilir nitelikte poliesterler olan Polihidroksialkanoatlar daha sürdürülebilir olduklarından, plastik dediğimiz sentetik polimerlerin yerini almaya adaydırlar. Biyoloplastiklerin yaygın olarak üretilmelerinin önündeki en büyük engel yüksek üretim maliyetleridir. Aktif çamur gibi karışık mikrobiyal kültürlere dayalı sistemler sterilizasyon gerektirmemeleri ve bakterilerin atıksu gibi karışık ve ucuz besinlere kolayca uyum sağlamaları nedeni ile bu sistemlere dayalı PHA üretimi düşük maliyetli bir olasılık olarak belirmekte ve bu konudaki araştırmalar sürmektedir. Yüksek depolama özelliğine sahip mikroorganizmaların seçilmesi, rekabet şansı yüksek bir PHA üretim sisteminin geliştirilmesi açısından hayati olduğundan, farklı zenginleştirme stratejilerinin PHA üretimine ve popülasyon dinamiklerine etkisinin anlaşılması bir zorunluluktur. Bu çalışmada, biyokütle zenginleştirmek amacıyla aerobik dinamik besleme koşullarında üç ardışık kesikli reaktör işletilmiş ve AKR çevrimi süresince azot varlığının popülasyon dinamiklerine ve seçilen biyokütlenin depolama yeteneğine etkisi araştırılmıştır. Reaktörlerden birinde azot daima mevcutken, diğer reaktöre beslenen sentetik atıksudaki azot konsantrasyonu, bolluk fazının sonunda karbon ile birlikte bitecek şekilde ayarlanmıştır. Üçüncü reaktör ilk defa bu çalışmada önerilen ve gecikmiş azot besleme olarak adlandırılan bir yöntemle beslenmiştir. Azot ve karbonun bir arada bulunmalarının engellenmek istendiği bu besleme rejiminde, azot içermeyen bir sentetik atıksu reaktöre beslenmiş ve azot çözeltisi ancak reaktördeki bütün karbon kaynağı tüketildikten sonra sisteme beslenmiştir. Reaktör işletimleri sırasında biyokütlelerin polimer depolama yeteneğindeki değişimler spesifik polimer depolama hızı, substratın polimere dönüşüm oranı, depolanan polimer miktarı ve biyokütlenin polimer içeriği göz önünde bulundurularak değerlendirilmiştir. ADB koşullarında seçilen biyokütlelerin polimer depolama yeteneklerinin aşı çamurununkine göre oldukça yüksek olduğu tespit edildi. Sisteme beslenen tek karbon kaynağı asetat olduğu için beslenen substrat polihidroksibütirat biçiminde depolanmıştır. Deney sonuçları göstermiştir ki, biyokütle zenginleştirilirken, substrat alımı sırasında reaktördeki azotun sınırlandırılması polimer depolanmasını olumlu yönde etkilemiştir. Dolayısıyla GAB'nin uygulandığı dinamik şartlarda zenginleştirilmiş olan biyokütlenin polimer içeriğinin, bu biyokütle için elde edilen dönüşüm oranı ve polimer depolama hızının azot kısıtlamalı olarak zenginleştirilen biyokütle için elde edilen değerlerden daha yüksek, azot kısıtlamasız olarak zenginleştirilen biyokütle için elde edilen değerlerden de çok daha yüksek olduğu tespit edilmiştir. Biyokütlenin türsel yapısı klon kütüphanesi ve sekans analizi ile belirlenmiştir. Farklı işletme koşullarında zenginleştirilen biyokütlenin bakteriyel popülasyonundaki değişimler ise 16S rRNA üzerine kurulu denaturan gradyent jel elektroforezi analizi yöntemi ile izlenmiştir. Klon kütüphanesinde mevcut türlerin %94'ünün temsil edildiği belirlenmiştir. Aşı çamurunu oluşturan bakteriyel topluluk, farklı türleri içerisinde barındıran zenginlikte ve heterojen bir yapıdadır. Proteobacteria aşı çamuru içerisindeki en baskın şubedir. Klon kütüphanesinin %14,5'i ?-proteobacteria ve %53'ü de ß-proteobacteria sınıflarından oluşmaktadır. Çamurda tespit edilen bakteriyel türlerin %14,5'inin Verrucomicrobiae, %13,3'ünün Bacteroidetes ve %4,8'inin de Planctomycetes şubelerine ait olduğu belirlenmiştir. Klonların %42,2'sinin en baskın şube olan ß-proteobacteria'ya bağlı Rhodocyclaceae ailesinden oldukları tespit edilmiştir. AKR işletimi sırasında türlerin bağıl çokluğundaki değişimler yarı niceliksel bir yöntem olan DGJE ile belirlenmiştir. DGJE sonuçlarının istatistiksel analizi göstermiştir ki; her bir türün bağıl çokluğundaki değişiklikler önemli olmakla birlikte, tespit edilen türlerin sayısında önemi bir değişiklik gözlenmemiştir. Her bir AKR'deki bakteriyel çeşitlilikte gözlenen değişim farklılık gösterse de ß-proteobacteria'nın Rhodocyclaceae ailesin'e bağlı türler özellikle de Zoogloae her üç reaktörde de sürekli baskın olmuştur. Bakteriyel topluluğun yapısındaki değişiklikler ile biyokütlenin depolama yeteneğindeki değişim arasındaki ilgileşim istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Planctomycetes ve Bacteroidetes şubelerine bağlı türlerin PHA depolamasına katkısının önemsiz olduğu tahmin edilmektedir. Gecikmiş azot beslemenin uygulandığı AKR için elde edilen ilgileşim değerleri diğer iki reaktör için elde edilenlerden daha küçüktür. Seçilen biyokütlelerin farklı şartlar altındaki tepkilerini gözlemek amacıyla farklı substratların, substrat yüklemelerinin ve karbon/azot oranlarının denendiği çeşitli kesikli deneyler gerçekleştirilmiştir. Farklı azot besleme rejimleri ile zenginleştirilmiş üç biyokütle tarafından depolanan polimer konsantrasyonu da artan substrat yüklemesine bağlı olarak artmış fakat en yüksek konsantrasyon, gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş biyokütle için elde edilmiştir. Elde edilen en yüksek biyokütle polimer içeriği %47, 1 olup bu değer de gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş biyokütle için elde edilmiştir. Polimer depolama hızı ile yüklenen substrat arasındaki ilişkinin, kesikli deney sırasında reaktörde azot bulunup bulunmadığına yakından bağlı olduğu tespit edilmiştir. Azotsuz olarak gerçekleştirilen deneylerde artan substrat yüklemeleri spesifik polimer depolama hızında artışa yol açarken, azotla gerçekleştirilen deneylerde bu durum depolama hızında düşüşe yol açmıştır. Substratın polimere dönüşüm oranı her üç biyokütle için de artan substrat yüklemesine bağlı olarak düşmüştür. En yüksek dönüşüm oranı (0,71), gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş olan çamur için ve en düşük substrat yüklemesinin uygulandığı deneyde elde edilmiştir. Reaktöre beslenen substrat konsantrasyonunun arttırılması, azot konsantrasyonu sabit tutulması durumunda dönüşüm oranında bir artışa, C/N oranının sabit tutulması durumunda da dönüşüm oranında azalmaya yol açmıştır. AKR işletimi sırasında ve bu reaktörden alınan çamur ile gerçekleştirilen deneyler sırasında uygulanan koşullar arasındaki uyumun polimer depolamasına olumlu yönde etki eden bir etken olduğu belirlenmiştir. Substrat olarak asetat propiyonat karışımının kullanıldığı deneylerde polimer daha çok hidroksibütirat ve hidroksivalerat kopolimeri şeklinde depolanmıştır. Aynı şartlar altında gecikmiş azot beslemesi yöntemiyle zenginleştirilmiş biyokütle tarafından depolanan PHV, azot kısıtlı olarak zenginleştirilen biyokütlenin depoladığından daha fazla, azot kısıtsız olarak zenginleştirilen biyokütlenin depoladığından ise çok daha fazladır. Genel olarak, ilk defa bu çalışmada önerilen bir proses olan gecikmiş azot besleme ile zenginleştirilmiş biyokütlenin polimer depolama yeteneğinin, azot kısıtlı ve azot kısıtsız şartlarda gerçekleştirilen aerobik dinamik besleme ile zenginleştirilmiş biyokütlelerin depolama yeteneğinden daha üstün olduğu belirlendi. Eğer bu proses optimize edilirse ve çözünmüş oksijen kontrollü besleme gibi yöntemlerle kombine edilirse, saf kültürler kullanılarak gerçekleştirilen endüstriyel PHA üretimi karşısında güçlü bir alternatif olabilir. Nütrient yönünden fakir organik atıklar fermentasyondan sonra bu proseste ucuz karbon kaynağı olarak kullanılabilirler.