এনজাইম-লিংকড ইমিউনোসরবেন্ট অ্যাসে

এনজাইম-লিংকড ইমিউনোসরবেন্ট অ্যাসে (এলাইসা) (, ) হল বিশ্লেষণধর্মী জৈবরাসায়নিক অ্যাসের একটি বহুল ব্যবহৃত পদ্ধতি, যা প্রথম বর্ণনা করেন ইভা এংভাল ও পিটার পার্লম্যান ১৯৭১ সালে। এই অ্যাসটি হল এনজাইম ইমিউনোঅ্যাসের (EIA) একটি কঠিন পর্যায়ভিত্তিক পদ্ধতি, যা পরিমাপযোগ্য লিগ্যান্ডের (সাধারণত অ্যামিনো অ্যাসিড) বিরুদ্ধে নির্দেশিত অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে তরল নমুনায় লিগ্যান্ডের উপস্থিতি শনাক্ত করে। এলাইসা চিকিৎসাবিজ্ঞান, উদ্ভিদ রোগবিজ্ঞান এবং জৈবপ্রযুক্তিতে একটি নির্ণয়মূলক পদ্ধতি হিসাবে পাশাপাশি বিভিন্ন শিল্পে গুণমান নিয়ন্ত্রণ পরীক্ষা হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছে।

এলাইসার সবচেয়ে সরল রূপে, পরীক্ষার নমুনা থেকে অ্যান্টিজেনগুলি একটি পৃষ্ঠের সাথে সংযুক্ত করা হয়। তারপর, একটি সঙ্গতিপূর্ণ অ্যান্টিবডি পৃষ্ঠের উপর প্রয়োগ করা হয় যাতে এটি অ্যান্টিজেনের সাথে আবদ্ধ হতে পারে। এই অ্যান্টিবডিটি একটি এনজাইমের সাথে সংযুক্ত থাকে এবং তারপর যেকোনো অনাবদ্ধ অ্যান্টিবডি অপসারণ করা হয়। চূড়ান্ত ধাপে, এনজাইমের সাবস্ট্রেট সমৃদ্ধ একটি পদার্থ যোগ করা হয়। যদি আবদ্ধতা ঘটে থাকে, তবে পরবর্তী বিক্রিয়াটি একটি সনাক্তযোগ্য সংকেত উৎপন্ন করে, যা সাধারণত রঙের পরিবর্তন হিসাবে দেখা যায়।

একটি এলাইসা সম্পাদনের জন্য নির্দিষ্ট অ্যান্টিজেনের জন্য কমপক্ষে একটি অ্যান্টিবডি প্রয়োজন। অজানা পরিমাণ অ্যান্টিজেন সমৃদ্ধ নমুনাটি কঠিন অবলম্বনের (সাধারণত পলিস্টাইরিন মাইক্রোটিটার প্লেট) উপর স্থির করা হয় হয় অ-নির্দিষ্টভাবে (পৃষ্ঠে শোষণের মাধ্যমে) অথবা নির্দিষ্টভাবে (একই অ্যান্টিজেনের জন্য নির্দিষ্ট অন্য একটি অ্যান্টিবডি দ্বারা আটকানোর মাধ্যমে, "স্যান্ডউইচ" এলাইসাতে)। অ্যান্টিজেন স্থির হওয়ার পর, শনাক্তকারী অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়, যা অ্যান্টিজেনের সাথে একটি কমপ্লেক্স গঠন করে। শনাক্তকারী অ্যান্টিবডিটি সমযোজীভাবে একটি এনজাইমের সাথে সংযুক্ত থাকতে পারে বা এটি নিজেই একটি গৌণ অ্যান্টিবডি দ্বারা শনাক্ত হতে পারে যা বায়োকনজুগেশনের মাধ্যমে একটি এনজাইমের সাথে সংযুক্ত থাকে। প্রতিটি ধাপের মধ্যে, প্লেটটিকে সাধারণত একটি মৃদু ডিটারজেন্ট দ্রবণ দিয়ে ধোয়া হয় যাতে অ-নির্দিষ্টভাবে আবদ্ধ কোনো প্রোটিন বা অ্যান্টিবডি অপসারণ করা যায়। চূড়ান্ত ধোয়ার ধাপের পর, একটি এনজাইমেটিক সাবস্ট্রেট যোগ করে প্লেটটি ডেভেলপ করা হয় যা একটি দৃশ্যমান সংকেত উৎপন্ন করে, যা নমুনায় অ্যান্টিজেনের পরিমাণ নির্দেশ করে।

উল্লেখ্য, এলাইসা কঠোরভাবে "ইমিউনো" অ্যাসে ছাড়াও লিগ্যান্ড বাইন্ডিং অ্যাসের অন্যান্য রূপ সম্পাদন করতে পারে, যদিও এই পদ্ধতির সাধারণ ব্যবহার ও বিকাশের ইতিহাসের কারণে নামটি মূল "ইমিউনো" বহন করে। এই কৌশলটির মূলত প্রয়োজন এমন কোনো লিগেটিং বিকারক যা কঠিন পর্যায়ে স্থির করা যেতে পারে পাশাপাশি একটি শনাক্তকরণ বিকারক যা নির্দিষ্টভাবে আবদ্ধ হবে এবং একটি এনজাইম ব্যবহার করে একটি সংকেত তৈরি করবে যা সঠিকভাবে পরিমাপ করা যেতে পারে। ধোয়ার মধ্যে, শুধুমাত্র লিগ্যান্ড এবং এর নির্দিষ্ট বাইন্ডিং কাউন্টারপার্টগুলি অ্যান্টিজেন-অ্যান্টিবডি মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে কঠিন পর্যায়ের সাথে নির্দিষ্টভাবে আবদ্ধ বা "ইমিউনোসরবড" থাকে, যখন অ-নির্দিষ্ট বা অনাবদ্ধ উপাদানগুলি ধুয়ে ফেলা হয়। অন্যান্য স্পেকট্রোফটোমেট্রিক ওয়েট ল্যাব অ্যাসে বিন্যাসের থেকে ভিন্ন, যেখানে একই বিক্রিয়া কুয়েট (যেমন, কিউভেট) ধোয়ার পর পুনরায় ব্যবহার করা যেতে পারে, এলাইসা প্লেটগুলিতে বিক্রিয়া পণ্যগুলি কঠিন পর্যায়ে ইমিউনোসরবড থাকে, যা প্লেটের অংশ এবং তাই সহজে পুনরায় ব্যবহারযোগ্য নয়।

নীতিমালা
একটি বিশ্লেষণাত্মক জৈব রসায়ন অ্যাসে এবং "ওয়েট ল্যাব" কৌশল হিসাবে, এলাইসা একটি তরল নমুনায় বিশ্লেষ্যের (অর্থাৎ, সেই নির্দিষ্ট পদার্থ যার উপস্থিতি পরিমাণগত বা গুণগতভাবে বিশ্লেষণ করা হচ্ছে) সনাক্তকরণ জড়িত এমন একটি পদ্ধতির মাধ্যমে যা বিশ্লেষণের সময় তরল বিকারক ব্যবহার অব্যাহত রাখে (অর্থাৎ, জৈব রাসায়নিক বিক্রিয়ার একটি নিয়ন্ত্রিত ক্রম যা একটি সংকেত তৈরি করবে যা সহজেই পরিমাপযোগ্য এবং বিশ্লেষ্যের পরিমাণের পরিমাপ হিসাবে ব্যাখ্যা করা যেতে পারে) যা তরল থাকে এবং বিক্রিয়াকারীদের ধারণ করার জন্য প্রয়োজনীয় একটি বিক্রিয়া চেম্বার বা কুয়েতে ভিতরে থাকে। এটি "ড্রাই ল্যাব" কৌশলগুলির বিপরীতে যা শুষ্ক স্ট্রিপ ব্যবহার করে। এমনকি যদি নমুনাটি তরল হয় (যেমন, একটি পরিমাপ করা ছোট ফোঁটা), "শুষ্ক" বিশ্লেষণে চূড়ান্ত সনাক্তকরণ ধাপে রিফ্লেক্টোমেট্রির মতো পদ্ধতিতে একটি শুকনো স্ট্রিপ পড়া জড়িত এবং নমুনার মধ্যে স্পিলওভার বা মিশ্রণ রোধ করার জন্য একটি বিক্রিয়া ধারণকারী চেম্বারের প্রয়োজন হয় না।

একটি ভিন্নধর্মী অ্যাসে হিসাবে, এলাইসা বিশ্লেষণাত্মক বিক্রিয়া মিশ্রণের কিছু উপাদানকে শারীরিকভাবে স্থির একটি কঠিন পর্যায়ে শোষণ করে পৃথক করে। এলাইসাতে, একটি তরল নমুনা বিশেষ বাইন্ডিং বৈশিষ্ট্যযুক্ত একটি স্থির কঠিন পর্যায়ের উপর যোগ করা হয় এবং তারপরে একাধিক তরল বিকারক অনুক্রমিকভাবে যোগ করা হয়, ইনকিউবেট করা হয় এবং ধোয়া হয়, তারপরে কিছু অপটিক্যাল পরিবর্তন (যেমন, একটি এনজাইমেটিক বিক্রিয়ার পণ্য দ্বারা রঙের বিকাশ) ঘটে কুয়েতে চূড়ান্ত তরলে যেখান থেকে বিশ্লেষ্যের পরিমাণ পরিমাপ করা হয়। পরিমাণগত "রিডিং" সাধারণত স্পেকট্রোফটোমেট্রির মাধ্যমে প্রেরিত আলোর তীব্রতা সনাক্তকরণের উপর ভিত্তি করে তৈরি, যার মধ্যে তরলের মধ্য দিয়ে আলোর কিছু নির্দিষ্ট তরঙ্গদৈর্ঘ্য প্রেরণের পরিমাপ জড়িত (পাশাপাশি মাল্টি-ওয়েল প্লেট বিন্যাসে কুয়েটের স্বচ্ছ নীচের অংশ)। সনাক্তকরণের সংবেদনশীলতা বিশ্লেষণাত্মক বিক্রিয়াগুলির সময় সংকেতের প্রশস্ততার উপর নির্ভর করে। যেহেতু এনজাইম বিক্রিয়া খুব সুপরিচিত প্রশস্তকরণ প্রক্রিয়া, সংকেতটি এনজাইম দ্বারা তৈরি হয় যা সঠিক পরিমাপের জন্য নির্দিষ্ট অনুপাতে শনাক্তকরণ বিকারকের সাথে সংযুক্ত থাকে, এবং এইভাবে "এনজাইম-লিংকড" নামটি পাওয়া যায়।

বিশ্লেষ্যকে লিগ্যান্ডও বলা হয় কারণ এটি একটি শনাক্তকরণ বিকারকের সাথে নির্দিষ্টভাবে আবদ্ধ হবে বা লিগেট করবে, এইভাবে এলাইসা লিগ্যান্ড বাইন্ডিং অ্যাসের বৃহত্তর বিভাগের মধ্যে পড়ে। লিগ্যান্ড-নির্দিষ্ট বাইন্ডিং বিকারক "স্থির" করা হয়, অর্থাৎ, সাধারণত একটি কুয়েটের স্বচ্ছ নীচে এবং কখনও কখনও পার্শ্ব প্রাচীরেও লেপা এবং শুকানো হয় (স্থির "কঠিন পর্যায়"/"কঠিন সাবস্ট্রেট" এখানে কঠিন মাইক্রোপার্টিকল/বিডের বিপরীতে যা ধুয়ে ফেলা যেতে পারে), যা সাধারণত "এলাইসা প্লেট" নামে পরিচিত মাল্টি-ওয়েল প্লেট হিসাবে তৈরি করা হয়। প্রচলিতভাবে, ইমিউনোঅ্যাসের অন্যান্য রূপের মতো, অ্যান্টিজেন-অ্যান্টিবডি ধরণের বিক্রিয়ার নির্দিষ্টতা ব্যবহার করা হয় কারণ বাল্কে একটি বিকারক হিসাবে অ্যান্টিজেনের বিরুদ্ধে নির্দিষ্টভাবে একটি অ্যান্টিবডি বাড়ানো সহজ। বিকল্পভাবে, যদি বিশ্লেষ্য নিজেই একটি অ্যান্টিবডি হয়, তবে এর লক্ষ্য অ্যান্টিজেন বাইন্ডিং বিকারক হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।

ইতিহাস
এলাইসার বিকাশের আগে, একটি ইমিউনোঅ্যাসে পরিচালনার একমাত্র বিকল্প ছিল রেডিওইমিউনোঅ্যাসে, একটি কৌশল যা তেজস্ক্রিয়ভাবে লেবেলযুক্ত অ্যান্টিজেন বা অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে। রেডিওইমিউনোঅ্যাসেতে, তেজস্ক্রিয়তা সংকেত সরবরাহ করে, যা নির্দেশ করে যে একটি নির্দিষ্ট অ্যান্টিজেন বা অ্যান্টিবডি নমুনায় উপস্থিত আছে কিনা। রেডিওইমিউনোঅ্যাসে প্রথম বর্ণনা করেন রোজালিন সুসম্যান ইয়ালো এবং সলোমন বারসন ১৯৬০ সালে প্রকাশিত একটি বৈজ্ঞানিক গবেষণাপত্রে।

যেহেতু তেজস্ক্রিয়তা একটি সম্ভাব্য স্বাস্থ্য হুমকি, একটি নিরাপদ বিকল্প খোঁজা হয়েছিল। রেডিওইমিউনোঅ্যাসের একটি উপযুক্ত বিকল্প তেজস্ক্রিয় সংকেতের জায়গায় একটি অ-তেজস্ক্রিয় সংকেত প্রতিস্থাপন করবে। যখন এনজাইমগুলি (যেমন হর্সরাডিশ পারঅক্সিডেজ) উপযুক্ত সাবস্ট্রেটের (যেমন ABTS বা টিএমবি) সাথে বিক্রিয়া করে, তখন রঙের পরিবর্তন ঘটে, যা একটি সংকেত হিসাবে ব্যবহৃত হয়। তবে, সংকেতটিকে অ্যান্টিবডি বা অ্যান্টিজেনের উপস্থিতির সাথে যুক্ত করতে হবে, এই কারণে এনজাইমটিকে একটি উপযুক্ত অ্যান্টিবডির সাথে সংযুক্ত করতে হবে। এই সংযোগ প্রক্রিয়াটি স্বাধীনভাবে বিকাশ করেছিলেন স্ট্র্যাটিস আভ্রামিয়াস এবং জি. বি. পিয়ার্স। যেহেতু ধোয়ার মাধ্যমে যেকোনো অনাবদ্ধ অ্যান্টিবডি বা অ্যান্টিজেন অপসারণ করা প্রয়োজন, অ্যান্টিবডি বা অ্যান্টিজেনকে ধারকের পৃষ্ঠের সাথে স্থির করতে হবে; অর্থাৎ, ইমিউনোসরবেন্ট প্রস্তুত করতে হবে। এটি সম্পাদনের একটি কৌশল প্রকাশ করেছিলেন ওয়াইড এবং জের্কার পোরাথ ১৯৬৬ সালে।

১৯৭১ সালে, সুইডেনের স্টকহোম বিশ্ববিদ্যালয়ে পিটার পার্লম্যান এবং ইভা এংভাল, এবং নেদারল্যান্ডসের অ্যান্টন শুর্স এবং বাউকে ভ্যান উইমেন স্বাধীনভাবে গবেষণাপত্র প্রকাশ করেন যা এই জ্ঞানকে EIA/ELISA সম্পাদনের পদ্ধতিতে সংশ্লেষ করে।

প্রথাগত এলাইসা সাধারণত ক্রোমোজেনিক রিপোর্টার এবং সাবস্ট্রেট জড়িত যা অ্যান্টিজেন বা বিশ্লেষ্যের উপস্থিতি নির্দেশ করতে কিছু পর্যবেক্ষণযোগ্য রঙের পরিবর্তন উৎপন্ন করে। নতুন এলাইসা-সদৃশ কৌশলগুলি ফ্লুরোজেনিক, ইলেক্ট্রোকেমিলুমিনিসেন্ট এবং কোয়ান্টিটেটিভ পিসিআর রিপোর্টার ব্যবহার করে পরিমাপযোগ্য সংকেত তৈরি করে। এই নতুন রিপোর্টারগুলির বিভিন্ন সুবিধা থাকতে পারে, যার মধ্যে উচ্চতর সংবেদনশীলতা এবং মাল্টিপ্লেক্সিং অন্তর্ভুক্ত। প্রযুক্তিগত শর্তে, এই ধরণের নতুন অ্যাসেগুলি কঠোরভাবে এলাইসা নয়, কারণ সেগুলি "এনজাইম-লিংকড" নয়, বরং কিছু অ-এনজাইমেটিক রিপোর্টারের সাথে সংযুক্ত। তবে, এই অ্যাসেগুলিতে সাধারণ নীতিগুলি মূলত একই রকম হওয়ায়, সেগুলিকে প্রায়শই এলাইসার মতো একই বিভাগে শ্রেণীবদ্ধ করা হয়।

২০১২ সালে, ন্যানো পার্টিকল ব্যবহার করে একটি আল্ট্রাসেনসিটিভ, এনজাইম-ভিত্তিক এলাইসা পরীক্ষা নগ্ন-চোখে রঙের সংকেত দিতে সক্ষম হয়েছিল, মাত্র অ্যাটোগ্রাম বিশ্লেষ্য শনাক্ত করে। ইতিবাচক ফলাফলের জন্য নীল রঙ এবং নেতিবাচক ফলাফলের জন্য লাল রঙ দেখা যায়। মনে রাখবেন যে এই সনাক্তকরণ শুধুমাত্র বিশ্লেষ্যের উপস্থিতি বা অনুপস্থিতি নিশ্চিত করতে পারে, প্রকৃত ঘনত্ব নয়।

ধরণ
নির্দিষ্ট অণুর জন্য অনেক এলাইসা পরীক্ষা রয়েছে যা সঙ্গতিপূর্ণ অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে। এলাইসা পরীক্ষাগুলি বিশ্লেষ্য এবং অ্যান্টিবডিগুলি কীভাবে আবদ্ধ এবং ব্যবহার করা হয় তার উপর ভিত্তি করে বিভিন্ন ধরণের পরীক্ষায় বিভক্ত। প্রধান প্রকারগুলি এখানে বর্ণনা করা হয়েছে।

সরাসরি (Direct) 

সরাসরি এলাইসার ধাপগুলি নীচের প্রক্রিয়া অনুসরণ করে:
 পরীক্ষার জন্য অ্যান্টিজেনের একটি বাফারযুক্ত দ্রবণ প্রতিটি কুয়েতে (সাধারণত ৯৬-ওয়েল প্লেট) একটি মাইক্রোটিটার প্লেটে যোগ করা হয়, যেখানে চার্জ মিথস্ক্রিয়ার মাধ্যমে প্লাস্টিকের সাথে লেগে থাকার জন্য সময় দেওয়া হয়।
 একটি অ-প্রতিক্রিয়াশীল প্রোটিনের দ্রবণ, যেমন বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন বা ক্যাসেইন, প্রতিটি কুয়েতে যোগ করা হয় যাতে কুয়েতে যে কোনও প্লাস্টিকের পৃষ্ঠতল যা অ্যান্টিজেন দ্বারা আবৃত না থাকে তা ঢেকে দেয়।
 একটি সংযুক্ত (সংযুক্ত) এনজাইম সহ প্রাথমিক অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়, যা পরীক্ষার অ্যান্টিজেনের সাথে নির্দিষ্টভাবে আবদ্ধ হয় যা কুয়েটে লেপা থাকে।
 তারপরে এই এনজাইমের জন্য একটি সাবস্ট্রেট যোগ করা হয়। প্রায়শই, এই সাবস্ট্রেটটি এনজাইমের সাথে বিক্রিয়ায় রঙ পরিবর্তন করে। 
 সিরামে উপস্থিত প্রাথমিক অ্যান্টিবডির ঘনত্ব যত বেশি, রঙের পরিবর্তন তত শক্তিশালী। প্রায়শই, রঙের শক্তির পরিমাণগত মান দেওয়ার জন্য একটি স্পেকট্রোমিটার ব্যবহার করা হয়।

এনজাইমটি একটি প্রশস্তক হিসাবে কাজ করে; এমনকি যদি কয়েকটি এনজাইম-লিংকড অ্যান্টিবডি আবদ্ধ থাকে, তবুও এনজাইম অণুগুলি অনেকগুলি সংকেত অণু উৎপন্ন করবে। সাধারণ জ্ঞানের সীমার মধ্যে, এনজাইম অনির্দিষ্টকালের জন্য রঙ উৎপাদন করতে পারে, তবে যত বেশি অ্যান্টিবডি আবদ্ধ থাকে, রঙ তত দ্রুত বিকশিত হবে। সরাসরি এলাইসার একটি প্রধান অসুবিধা হল যে অ্যান্টিজেন স্থিরকরণের পদ্ধতিটি নির্দিষ্ট নয়; যখন সিরাম পরীক্ষার অ্যান্টিজেনের উৎস হিসাবে ব্যবহৃত হয়, নমুনার সমস্ত প্রোটিন মাইক্রোটিটার প্লেটের কুয়েতে লেগে থাকতে পারে, তাই সিরামে বিশ্লেষ্যের ছোট ঘনত্বকে কুয়েতে বাঁধার সময় অন্যান্য সিরাম প্রোটিনের সাথে প্রতিযোগিতা করতে হবে। স্যান্ডউইচ বা পরোক্ষ এলাইসা পরীক্ষার অ্যান্টিজেনটিকে সিরামের আণবিক মিশ্রণ থেকে বের করে আনার জন্য একটি "ক্যাপচার" অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে এই সমস্যার সমাধান করে।

এলাইসা একটি গুণগত বা পরিমাণগত বিন্যাসে চালানো যেতে পারে। গুণগত ফলাফল একটি নমুনার জন্য একটি সাধারণ ইতিবাচক বা নেতিবাচক ফলাফল (হ্যাঁ বা না) প্রদান করে। ইতিবাচক এবং নেতিবাচকের মধ্যে কাট-অফ বিশ্লেষক দ্বারা নির্ধারিত এবং পরিসংখ্যানগত হতে পারে। ইতিবাচক এবং নেতিবাচক নমুনা আলাদা করতে প্রায়শই স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন (একটি পরীক্ষায় অন্তর্নিহিত ত্রুটি) এর দুই বা তিন গুণ ব্যবহৃত হয়। পরিমাণগত এলাইসাতে, নমুনার অপটিক্যাল ঘনত্ব (OD) একটি স্ট্যান্ডার্ড কার্ভের সাথে তুলনা করা হয়, যা সাধারণত লক্ষ্য অণুর পরিচিত-ঘনত্বের দ্রবণের একটি ধারাবাহিক মিশ্রণ। উদাহরণস্বরূপ, যদি একটি পরীক্ষার নমুনা ১.০ OD প্রদান করে, তবে স্ট্যান্ডার্ড কার্ভে যে বিন্দুটি OD = ১.০ দিয়েছে তা অবশ্যই নমুনার মতো একই বিশ্লেষ্য ঘনত্বের হতে হবে।

"পরোক্ষ এলাইসা" এবং "সরাসরি এলাইসা" নামগুলির ব্যবহার এবং অর্থ পরীক্ষার প্রসঙ্গের উপর নির্ভর করে সাহিত্য এবং ওয়েবসাইটগুলিতে ভিন্ন। যখন একটি অ্যান্টিজেনের উপস্থিতি বিশ্লেষণ করা হয়, তখন "সরাসরি এলাইসা" নামটি এমন একটি এলাইসাকে বোঝায় যেখানে শুধুমাত্র একটি লেবেলযুক্ত প্রাথমিক অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়, এবং "পরোক্ষ এলাইসা" শব্দটি এমন একটি এলাইসাকে বোঝায় যেখানে অ্যান্টিজেন প্রাথমিক অ্যান্টিবডি দ্বারা আবদ্ধ থাকে যা তারপর একটি লেবেলযুক্ত গৌণ অ্যান্টিবডি দ্বারা শনাক্ত করা হয়। পরবর্তী ক্ষেত্রে, একটি স্যান্ডউইচ এলাইসা পরোক্ষ এলাইসা থেকে স্পষ্টতই আলাদা। যখন "প্রাথমিক" অ্যান্টিবডি আগ্রহের বিষয়, যেমন টিকাদান বিশ্লেষণের ক্ষেত্রে, এই অ্যান্টিবডিটি সরাসরি গৌণ অ্যান্টিবডি দ্বারা শনাক্ত করা হয় এবং "পরোক্ষ এলাইসা" শব্দটি দুটি অ্যান্টিবডি সহ একটি সেটিংয়ে প্রযোজ্য।

স্যান্ডউইচ (Sandwich) 

একটি "স্যান্ডউইচ" এলাইসা নমুনা অ্যান্টিজেন সনাক্ত করতে ব্যবহৃত হয়। ধাপগুলি হল:

 একটি পৃষ্ঠতল পরিচিত পরিমাণে ক্যাপচার অ্যান্টিবডি দিয়ে প্রস্তুত করা হয়।
 পৃষ্ঠতলে কোনো অ-নির্দিষ্ট বাইন্ডিং সাইট ব্লক করা হয়।
 অ্যান্টিজেন-সমৃদ্ধ নমুনাটি প্লেটে প্রয়োগ করা হয়, এবং অ্যান্টিবডি দ্বারা আটকানো হয়।
 অনাবদ্ধ অ্যান্টিজেন অপসারণের জন্য প্লেট ধোয়া হয়।
 একটি নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি যোগ করা হয়, এবং অ্যান্টিজেনের সাথে আবদ্ধ হয় (এইভাবে 'স্যান্ডউইচ': অ্যান্টিজেন দুটি অ্যান্টিবডির মধ্যে আটকা পড়ে)। এই প্রাথমিক অ্যান্টিবডিটি দাতার সিরামে থাকতে পারে, অ্যান্টিজেনের প্রতি প্রতিক্রিয়াশীলতার জন্য পরীক্ষা করা হবে।
 শনাক্তকারী অ্যান্টিবডি হিসাবে এনজাইম-লিংকড গৌণ অ্যান্টিবডি প্রয়োগ করা হয়, যা অ্যান্টিবডির Fc অঞ্চলে নির্দিষ্টভাবে আবদ্ধ হয় (অনির্দিষ্ট)।
 অনাবদ্ধ অ্যান্টিবডি-এনজাইম কনজুগেট অপসারণের জন্য প্লেট ধোয়া হয়।
 একটি রাসায়নিক যোগ করা হয় যা এনজাইম দ্বারা রঙ, ফ্লুরোসেন্ট বা ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সংকেতে রূপান্তরিত হয়।
 অ্যান্টিজেনের উপস্থিতি এবং পরিমাণ নির্ধারণের জন্য প্লেটের কুয়েতের শোষণ, ফ্লুরোসেন্স বা ইলেক্ট্রোকেমিক্যাল সংকেত (যেমন, কারেন্ট) পরিমাপ করা হয়।

ডানদিকের ছবিতে একটি গৌণ অ্যান্টিবডি একটি এনজাইমের সাথে সংযুক্ত ব্যবহার অন্তর্ভুক্ত, যদিও, প্রযুক্তিগত অর্থে, এটি প্রয়োজনীয় নয় যদি প্রাথমিক অ্যান্টিবডি একটি এনজাইমের সাথে সংযুক্ত থাকে (যা সরাসরি এলাইসা হবে)। যাইহোক, একটি গৌণ-অ্যান্টিবডি কনজুগেট ব্যবহার করা প্রতিটি অ্যান্টিজেনের জন্য এনজাইম-লিংকড অ্যান্টিবডি তৈরি করার ব্যয়বহুল প্রক্রিয়া এড়ায়। একটি এনজাইম-লিংকড অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে যা অন্যান্য অ্যান্টিবডির Fc অঞ্চলের সাথে আবদ্ধ হয়, এই একই এনজাইম-লিংকড অ্যান্টিবডি বিভিন্ন পরিস্থিতিতে ব্যবহার করা যেতে পারে। প্রথম স্তরের "ক্যাপচার" অ্যান্টিবডি ছাড়া, নমুনার যেকোনো প্রোটিন (সিরাম প্রোটিন সহ) প্রতিযোগিতামূলকভাবে প্লেটের পৃষ্ঠে শোষিত হতে পারে, স্থির অ্যান্টিজেনের পরিমাণ কমিয়ে দেয়। অ্যান্টিজেনটিকে প্লাস্টিকে সংযুক্ত করতে শুদ্ধ নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা পরিমাপের আগে জটিল মিশ্রণ থেকে অ্যান্টিজেন শুদ্ধ করার প্রয়োজনীয়তা দূর করে, অ্যাসেটিকে সরল করে এবং অ্যাসের নির্দিষ্টতা এবং সংবেদনশীলতা বাড়ায়। অতএব, গবেষণার জন্য ব্যবহৃত একটি স্যান্ডউইচ এলাইসার যাচাইকরণের প্রয়োজন হয়, মিথ্যা ইতিবাচক ফলাফলের ঝুঁকি কমাতে।

প্রতিযোগিতামূলক (Competitive) 
এলাইসার তৃতীয় ব্যবহার হল প্রতিযোগিতামূলক বাইন্ডিংয়ের মাধ্যমে। এই এলাইসার জন্য ধাপগুলি প্রথম দুটি উদাহরণ থেকে কিছুটা আলাদা:

অলেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি তার অ্যান্টিজেনের (নমুনা) উপস্থিতিতে ইনকিউবেট করা হয়।
 এই আবদ্ধ অ্যান্টিবডি/অ্যান্টিজেন কমপ্লেক্সগুলি তারপর একটি অ্যান্টিজেন-লেপা কুয়েতে যোগ করা হয়।
 প্লেট ধোয়া হয়, তাই অনাবদ্ধ অ্যান্টিবডিগুলি অপসারিত হয়। (নমুনায় যত বেশি অ্যান্টিজেন, তত বেশি Ag-Ab কমপ্লেক্স গঠিত হয় এবং তাই কুয়েতে অ্যান্টিজেনের সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য তত কম অনাবদ্ধ অ্যান্টিবডি উপলব্ধ থাকে, তাই "প্রতিযোগিতা"।)
 গৌণ অ্যান্টিবডি, প্রাথমিক অ্যান্টিবডির জন্য নির্দিষ্ট, যোগ করা হয়। এই দ্বিতীয় অ্যান্টিবডিটি এনজাইমের সাথে যুক্ত।
 একটি সাবস্ট্রেট যোগ করা হয়, এবং অবশিষ্ট এনজাইমগুলি একটি ক্রোমোজেনিক বা ফ্লুরোসেন্ট সংকেত প্রকাশ করে।
 সম্ভাব্য সম্পৃক্ততা রোধ করতে বিক্রিয়া বন্ধ করা হয়।

কিছু প্রতিযোগিতামূলক এলাইসা কিটে এনজাইম-লিংকড অ্যান্টিবডির পরিবর্তে এনজাইম-লিংকড অ্যান্টিজেন থাকে। লেবেলযুক্ত অ্যান্টিজেন নমুনা অ্যান্টিজেনের (অলেবেলযুক্ত) সাথে প্রাথমিক অ্যান্টিবডি বাইন্ডিং সাইটগুলির জন্য প্রতিযোগিতা করে। নমুনায় যত কম অ্যান্টিজেন, তত বেশি লেবেলযুক্ত অ্যান্টিজেন কুয়েতে ধরে রাখা হয় এবং সংকেত তত শক্তিশালী।

সাধারণত, অ্যান্টিজেন প্রথমে কুয়েতে স্থাপন করা হয় না।

এইচআইভি অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণের জন্য, মাইক্রোটিটার প্লেটের কুয়েগুলি এইচআইভি অ্যান্টিজেন দিয়ে লেপা হয়। দুটি নির্দিষ্ট অ্যান্টিবডি ব্যবহার করা হয়, একটি এনজাইমের সাথে সংযুক্ত এবং অন্যটি সিরামে উপস্থিত (যদি সিরাম অ্যান্টিবডির জন্য ইতিবাচক হয়)। একই অ্যান্টিজেনের জন্য দুটি অ্যান্টিবডির মধ্যে ক্রমবর্ধমান প্রতিযোগিতা ঘটে, যার ফলে একটি শক্তিশালী সংকেত দেখা যায়। পরীক্ষার জন্য সিরা এই কুয়েগুলিতে যোগ করা হয় এবং ৩৭° সে তাপমাত্রায় ইনকিউবেট করা হয়, এবং তারপর ধোয়া হয়। যদি অ্যান্টিবডি উপস্থিত থাকে, অ্যান্টিজেন-অ্যান্টিবডি বিক্রিয়া ঘটে। এনজাইম-লেবেলযুক্ত নির্দিষ্ট এইচআইভি অ্যান্টিবডির জন্য কোনো অ্যান্টিজেন অবশিষ্ট থাকে না। এই অ্যান্টিবডিগুলি যোগ করার সময় মুক্ত থাকে এবং ধোয়ার সময় ধুয়ে যায়। সাবস্ট্রেট যোগ করা হয়, কিন্তু এটির উপর কাজ করার জন্য কোনো এনজাইম থাকে না, তাই ইতিবাচক ফলাফলে কোনো রঙের পরিবর্তন দেখা যায় না।

পরোক্ষ (Indirect) 
চতুর্থ এলাইসা পরীক্ষা প্রচলিত কুয়েত ব্যবহার করে না, বরং অ্যান্টিজেনগুলিকে পরীক্ষার তরলে নিলম্বিত অবস্থায় ছেড়ে দেয়।

 অলেবেলযুক্ত অ্যান্টিবডি তার অ্যান্টিজেনের (নমুনা) উপস্থিতিতে ইনকিউবেট করা হয়।
 অ্যান্টিবডিগুলিকে অ্যান্টিজেনের সাথে আবদ্ধ হওয়ার জন্য পর্যাপ্ত ইনকিউবেশন সময় দেওয়া হয়।
 তারপর নমুনাটি স্ক্যাভেঞ্জার ধারকের মধ্য দিয়ে পাঠানো হয়। এটি একটি টেস্ট টিউব বা একটি বিশেষভাবে ডিজাইন করা প্রবাহ চ্যানেল হতে পারে। স্ক্যাভেঞ্জার ধারক বা চ্যানেলের পৃষ্ঠে "স্ক্যাভেঞ্জার অ্যান্টিজেন" আবদ্ধ থাকে। এগুলি প্রাথমিক অ্যান্টিজেনের সাথে অভিন্ন বা পর্যাপ্তভাবে সাদৃশ্যপূর্ণ হতে পারে যাতে মুক্ত অ্যান্টিবডিগুলি আবদ্ধ হবে।
 স্ক্যাভেঞ্জার ধারকটিতে পর্যাপ্ত পৃষ্ঠের ক্ষেত্রফল এবং পর্যাপ্ত সময় থাকতে হবে যাতে নমুনায় প্রবর্তিত সমস্ত অতিরিক্ত অ্যান্টিবডির সাথে স্ক্যাভেঞ্জার অ্যান্টিজেনগুলির আবদ্ধ হওয়ার অনুমতি দেওয়া যায়।
 নমুনাটি, যেটিতে এখন ট্যাগযুক্ত এবং আবদ্ধ অ্যান্টিবডি রয়েছে, একটি ডিটেক্টরের মধ্য দিয়ে প্রেরণ করা হয়। এই ডিভাইসটি একটি ফ্লো সাইটোমিটার বা অন্য ডিভাইস হতে পারে যা ট্যাগগুলি আলোকিত করে এবং প্রতিক্রিয়া রেজিস্টার করে।

এই পরীক্ষাটি একই সময়ে একাধিক অ্যান্টিজেনকে ট্যাগ এবং গণনা করতে দেয়। এটি নির্দিষ্ট প্রজাতির ব্যাকটেরিয়াকে দুই (বা ততোধিক) ভিন্ন রঙের ট্যাগ দ্বারা শনাক্ত করতে দেয়। যদি একটি কোষে উভয় ট্যাগ উপস্থিত থাকে, তাহলে কোষটি সেই নির্দিষ্ট প্রজাতি। যদি শুধুমাত্র একটি উপস্থিত থাকে, তাহলে তা নয়।

এই পরীক্ষাটি সাধারণত একবারে একটি পরীক্ষা করা হয় এবং মাইক্রোটিটার প্লেট দিয়ে করা যায় না। প্রয়োজনীয় সরঞ্জাম সাধারণত কম জটিল এবং মাঠে ব্যবহার করা যেতে পারে।

সাধারণত ব্যবহৃত এনজাইমেটিক মার্কার 
নিম্নলিখিত সারণীটি এলাইসা অ্যাসেতে সাধারণত ব্যবহৃত এনজাইমেটিক মার্কারগুলি তালিকাভুক্ত করে, যা অ্যাসে সম্পূর্ণ হলে ফলাফল পরিমাপ করতে দেয়।
 OPD (o-ফিনাইলিনডায়ামিন ডাইহাইড্রোক্লোরাইড) HRP (হর্সরাডিশ পারঅক্সিডেজ) সনাক্ত করতে অ্যাম্বার রঙ ধারণ করে, যা প্রায়শই একটি সংযোজিত প্রোটিন হিসাবে ব্যবহৃত হয়।
 TMB (3,3',5,5'-টেট্রামিথাইলবেনজিডিন) HRP সনাক্ত করার সময় নীল রঙ ধারণ করে এবং সালফিউরিক বা ফসফরিক অ্যাসিড যোগ করার পর হলুদ রঙে পরিণত হয়।
 ABTS (2,2'-আজিনোবিস [3-ইথাইলবেনজোথিয়াজোলিন-6-সালফোনিক অ্যাসিড]-ডাইঅ্যামোনিয়াম লবণ) HRP সনাক্ত করার সময় সবুজ রঙ ধারণ করে।
 PNPP (p-নাইট্রোফিনাইল ফসফেট, ডাইসোডিয়াম লবণ) ক্ষারীয় ফসফাটেজ সনাক্ত করার সময় হলুদ রঙ ধারণ করে।

প্রয়োগ

কারণ এলাইসা একটি নমুনায় অ্যান্টিজেন বা অ্যান্টিবডির উপস্থিতি মূল্যায়ন করতে সম্পাদন করা যেতে পারে, এটি সিরাম অ্যান্টিবডি ঘনত্ব নির্ধারণের জন্য একটি দরকারী হাতিয়ার (যেমন এইচআইভি পরীক্ষার বা ওয়েস্ট নাইল ভাইরাসের সাথে)। এটি সম্ভাব্য খাদ্য অ্যালার্জেন সনাক্তকরণে খাদ্য শিল্পে প্রয়োগ খুঁজে পেয়েছে, যেমন দুধ, চিনাবাদাম, আখরোট, বাদাম এবং ডিম এবং সিলিয়াক রোগের জন্য সেরোলজিকাল রক্ত পরীক্ষা হিসাবে। এলাইসা টক্সিকোলজিতে নির্দিষ্ট শ্রেণীর ওষুধের জন্য একটি দ্রুত প্রাক-পরীক্ষামূলক স্ক্রিন হিসাবেও ব্যবহার করা যেতে পারে।

এলাইসা ছিল এইচআইভির জন্য ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত প্রথম স্ক্রিনিং পরীক্ষা কারণ এর উচ্চ সংবেদনশীলতা। একটি এলাইসাতে, একজন ব্যক্তির সিরাম ৪০০ গুণ মিশ্রিত করা হয় এবং একটি প্লেটে প্রয়োগ করা হয় যার সাথে এইচআইভি অ্যান্টিজেন সংযুক্ত থাকে। যদি সিরামে এইচআইভির অ্যান্টিবডি উপস্থিত থাকে, তবে তারা এই এইচআইভি অ্যান্টিজেনের সাথে আবদ্ধ হতে পারে। তারপরে প্লেটটি ধোয়া হয় যাতে সিরামের অন্যান্য সমস্ত উপাদান অপসারণ করা যায়। একটি বিশেষভাবে প্রস্তুত "গৌণ অ্যান্টিবডি" — একটি অ্যান্টিবডি যা অন্যান্য অ্যান্টিবডির সাথে আবদ্ধ হয় — তারপরে প্লেটে প্রয়োগ করা হয়, তারপর আরেকটি ধোয়া হয়। এই গৌণ অ্যান্টিবডিটি আগে থেকেই একটি এনজাইমের সাথে রাসায়নিকভাবে সংযুক্ত থাকে।

এইভাবে, প্লেটটি গৌণ অ্যান্টিবডির পরিমাণের সমানুপাতিকভাবে এনজাইম ধারণ করবে। এনজাইমের জন্য একটি সাবস্ট্রেট প্রয়োগ করা হয়, এবং এনজাইম দ্বারা অনুঘটক রঙ বা ফ্লুরোসেন্সের পরিবর্তন ঘটায়। এলাইসার ফলাফল একটি সংখ্যা হিসাবে রিপোর্ট করা হয়; এই পরীক্ষার সবচেয়ে বিতর্কিত দিকটি হল ইতিবাচক এবং নেতিবাচক ফলাফলের মধ্যে "কাট-অফ" বিন্দু নির্ধারণ করা।

একটি পরিচিত মানের সাথে তুলনা করে একটি কাট-অফ পয়েন্ট নির্ধারণ করা যেতে পারে। যদি একটি এলাইসা পরীক্ষা কর্মক্ষেত্রে ওষুধের স্ক্রিনিংয়ের জন্য ব্যবহৃত হয়, একটি কাট-অফ ঘনত্ব, উদাহরণস্বরূপ ৫০ ng/ml, প্রতিষ্ঠিত হয়, এবং বিশ্লেষ্যের প্রমিত ঘনত্ব সমৃদ্ধ একটি নমুনা প্রস্তুত করা হবে। পরিচিত নমুনার চেয়ে শক্তিশালী সংকেত তৈরি করে এমন অজানা নমুনাগুলি "ইতিবাচক"। যেগুলি দুর্বল সংকেত তৈরি করে সেগুলি "নেতিবাচক"।

বিভিন্ন ধরনের রোগ সনাক্ত করার জন্য এলাইসা পরীক্ষা রয়েছে, যেমন ডেঙ্গু, ম্যালেরিয়া, চাগাস রোগ, জোহনের রোগ এবং অন্যান্য। এলাইসা পরীক্ষাগুলি ইন ভিট্রো ডায়াগনস্টিকসের জন্য চিকিৎসা পরীক্ষাগারেও ব্যাপকভাবে নিযুক্ত করা হয়। এলাইসার অন্যান্য ব্যবহারের মধ্যে রয়েছে:

 রক্তের নমুনায় SARS-CoV-2 অ্যান্টিবডি সনাক্তকরণ

এলাইসা ২০২৩ সাল পর্যন্ত বিশ্বব্যাপী উদ্ভিদ রোগজীবাণু সনাক্তকরণের প্রাথমিক পদ্ধতি।

এনজাইম-লিংকড সিঙ্গল মলিকিউল অ্যারে (eSimoa)
eSimoa (এনজাইম-লিংকড সিঙ্গল মলিকিউল অ্যারে) ঐতিহ্যগত এলাইসা (এনজাইম-লিংকড ইমিউনোসরবেন্ট অ্যাসে) কৌশলের একটি উল্লেখযোগ্য বিবর্তনকে উপস্থাপন করে, যা ক্লিনিক্যাল ডায়াগনস্টিক্স এবং গবেষণায় ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়। বায়োমলিকিউলার সনাক্তকরণের সংবেদনশীলতা এবং রেজোলিউশন উল্লেখযোগ্যভাবে বাড়িয়ে, eSimoa এলাইসার ক্ষমতাগুলিকে প্রসারিত করে, স্ট্যান্ডার্ড অ্যাসের সাথে পূর্বে অপ্রাপ্ত ঘনত্বে বায়োমলিকিউল সনাক্ত করতে সক্ষম করে।

প্রযুক্তি
এলাইসার মৌলিক নীতিগুলির উপর ভিত্তি করে, eSimoa প্যারাম্যাগনেটিক বিড ব্যবহার করে বায়োমলিকিউল বা এনজাইমগুলিকে আলাদা করে এলাইসার প্লেট-ভিত্তিক সনাক্তকরণের অনুরূপভাবে। যাইহোক, eSimoa এই ধারণাটিকে এগিয়ে নিয়ে যায় একক-অণু স্তরে এনজাইমেটিক বিক্রিয়া পরিমাপ সক্ষম করে, যা বিভিন্ন এনজাইম এবং বায়োমলিকিউলের জন্য সনাক্তকরণ সীমা নাটকীয়ভাবে উন্নত করে। এই পদ্ধতিটি নিম্ন-প্রাচুর্য প্রোটিনের সঠিক পরিমাপ এবং প্রোটিন কিনেজ এবং টেলোমেরেজের মতো গুরুত্বপূর্ণ এনজাইমের ক্রিয়াকলাপের অনুমতি দেয়, যা প্রায়শই প্রচলিত এলাইসার সনাক্তকরণ থ্রেশহোল্ডের নিচে থাকে।

প্রয়োগ
ক্লিনিক্যাল ডায়াগনস্টিক্সে প্রাথমিক এবং সঠিক বায়োমার্কার সনাক্তকরণের জন্য eSimoa-এর উন্নত সংবেদনশীলতা অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ, যা রোগ নিরীক্ষণ ও ব্যবস্থাপনাকে উন্নত করতে সাহায্য করে। ওষুধ আবিষ্কারে, এনজাইম ইনহিবিশন মেকানিজম সম্পর্কে বিস্তারিত অন্তর্দৃষ্টি প্রদান করে এনজাইম ক্রিয়াকলাপে সূক্ষ্ম পরিবর্তন ট্র্যাক করার ক্ষমতা আরও কার্যকর ফার্মাসিউটিক্যালস উন্নয়নে সাহায্য করে।

উৎপত্তি ও বিতর্ক
ন্যাশনাল তাইওয়ান ইউনিভার্সিটির (NTU) চি-আন চেং দাবি করেছেন যে তার দল এই উদ্ভাবনী প্রযুক্তিটি তৈরি করেছে। যাইহোক, হার্ভার্ড বিশ্ববিদ্যালয়ে ডেভিড আর. ওয়াল্টের দলের পূর্ববর্তী প্রকাশনার অস্তিত্ব দ্বারা এই দাবি চ্যালেঞ্জ করা হয়েছে, যারা ২০২০ সালে eSimoa-তে তাদের কাজ প্রকাশ করেছিলেন। ওয়াল্টের দলের এই পূর্ববর্তী ডকুমেন্টেশন প্রযুক্তির বিকাশে একটি পূর্ববর্তী অবদানের ইঙ্গিত দেয়।

আরও দেখুন

 অ্যাগ্লুটিনেশন-পিসিআর
 ইমিউনোস্ক্রিনিং
 ল্যাটেরাল ফ্লো টেস্ট
 ম্যাগনেটিক ইমিউনোঅ্যাসে
 মাইক্রোটিটার প্লেট
 নেফেলোমেট্রি
 প্লাক রিডাকশন নিউট্রালাইজেশন টেস্ট
 প্লেট রিডার
 সিক্রেশন অ্যাসে

টীকা ও তথ্যসূত্র

বহিঃসংযোগ
 
 "Introduction to ELISA Activity"—এইচআইভি সনাক্ত করতে ব্যবহৃত এলাইসার জন্য নবীনদের ওয়াক-থ্রু, ইউনিভার্সিটি অফ অ্যারিজোনায় অ্যানিমেশন সহ
 "ELISA Assay Principle" - একটি এলাইসার নীতির একটি ওভারভিউ এবং অ্যাসে জিনিতে বিশ্লেষ্য সনাক্ত করার জন্য টুলস

রোগনির্ণয়মূলক ভাইরাসবিজ্ঞান
ইমিউনোলজিক পরীক্ষা