tomron87/hebrew-wikipedia-sentences-corpus huggingface dataset:
ב-2017 זכה בפרס נובל לכלכלה על תרומתו לכלכלה התנהגותית.
ריצ'רד ת'יילר נולד למשפחה יהודית.
אמו, רוזְלין (לבית מֶלניקוב), הייתה מורה, ואביו, אלן מ' ת'יילר, היה אקטואר.
הוא גדל עם שני אחים צעירים ממנו.
נשוי לפראנס לקלרק, פרופסור לשיווק, נישואין שניים ויש לו שלושה ילדים מנישואיו הראשונים.
ככה לא מתנהגים: לידתה והתפתחותה של הכלכלה ההתנהגותית (Misbehaving) עורכת: מיה בר-הלל, הוצאת מטר, 2019.
דחיפות קלות Nudge (עם קאס סאנסטיין), הוצאת מטר, 2020
ריצה היא צורת התנועה המהירה ביותר של בעלי רגליים.
ההבדל בין ריצה להליכה הוא שבריצה יש נקודת זמן בה אף רגל אינה נוגעת בקרקע, בעוד שבהליכה נוגעת לפחות רגל אחת בקרקע בכל רגע נתון.
הבדל נוסף הוא שבריצה שורפים יותר קלוריות מבכל הליכה.
ריצה היא אחד מענפי האתלטיקה המרכזיים, הנחשב לאחד מענפי הספורט העתיקים ביותר.
תחרויות ריצה התקיימו כבר בהעת העתיקה, בין היתר ביוון העתיקה ובמצרים העתיקה.
במשחקים האולימפיים העתיקים, הייתה הריצה התחרות המרכזית והראשונה שהתקיימה.
הריצה התחרותית כוללת מגוון רחב של מרחקים, החל מריצות קצרות (ספרינט) ועד למרתון ואולטרה מרתון.
מהירות הריצה משתנה בהתאם למרחק ולפרמטרים פיזיולוגיים שונים, כגון סיבולת לב-ריאה, מבנה הגוף, הרכב השרירים וטכניקת הריצה.
מעט מאוד רצים הצליחו לרדת מ-10 שניות בריצת 100 מטר, כלומר לרוץ במהירות העולה על 10 מטרים לשנייה (36 קמ"ש).
ככל שהמרחק גדל, המהירות הממוצעת פוחתת משמעותית.
לדוגמה, שיא העולם בריצת מרתון לגברים עומד על מהירות ממוצעת של כ-5.67 מטרים לשנייה (20.4 קמ"ש).
לשם המחשה, אדם בוגר ללא רקע ספורטיבי מיוחד ירוץ מרחק של 100 מטרים בכ-16–20 שניות בממוצע.
הריצה בישראל החלה להתפתח בשנות ה-30 של המאה ה-20, עם קיום תחרויות במסגרת כינוס הפועל והמכביה.
ריצת המרתון הראשונה התקיימה בינואר 1934, מתל אביב לנס ציונה וחזרה, ובה השתתפו שבעה רצים, מתוכם שלושה סיימו את המרוץ.
במהלך השנים השיגו אתלטים ישראלים הישגים מרשימים בזירה הבינלאומית.
בין הבולטים שבהם הם לונה צ'מטאי-סלפטר, שזכתה במדליית זהב בריצת 10,000 מטר באליפות אירופה באתלטיקה 2018, ומארו טפרי, שזכה במדליית כסף בריצת מרתון באליפות אירופה באתלטיקה 2022.
בישראל מתקיימים מרוצים רבים, ביניהם מרתון תל אביב, מרתון ירושלים, מרתון טבריה ומרתון המדבר.
ריצה היא ספורט זמין וניתן לבצע אותה בכל מקום שנמצאים ובכל זמן.
לסוגים שונים של ריצה השפעות שונות ומגוונות, הן פיזיות והן נפשיות.
הריצה מפעילה קבוצת שרירי גוף שונים וחשובים בצורה משמעותית והיא אף מייצבת את מפרק האגן.
לעומת פעילויות ספורטיביות אחרות, ריצה היא בעלת השפעה גבוהה יותר על שרירי הגוף מכיוון שבדרך כלל היא נפעלת בעצימות גבוהה יותר ולא מתאפיינת בהפסקות.
בנוסף, בזמן ריצה מספר הקלוריות שנשרפות גבוהות (בממוצע 40%) וההשפעה על המבנה הגופני וסיבולת לב ריאה גבוהה גם כן.
לריצה יש תועלת גדולה גם בפן הנפשי, מחקרים הצביעו על כך שריצה תורמת למצב הרוח, מפחיתה את החרדה ומשפרת את ההערכה העצמית.
נוסף על כך, ניתן לראות שכאשר רצים נמנעו מלרוץ בגלל מחלה או פציעה, אז מצוקתם הפסיכולוגית גדלה ואף גם הדיכאון וההפרעה במצב הרוח.
כמו כן, גם ההערכה העצמית והדימוי גוף יורדים.
רוב האנשים העוסקים בריצה נפצעים כתוצאה ממנה במהלך חייהם, פציעות אלו הן דבר שכיח שנובע מאימונים אינטנסיביים.
אצל חלק מהמתאמנים הריצה עלולה להסב נזק למפרקים שנושאי משקל גוף.
פציעות אלו קורות מעומס תת-מרביים ברקמות תקינות כלומר, השימוש בגוף מתבצע באופן לא נכון.
שברי מאמץ - פציעה זו בדרך כלל קורית בעצמות כף הרגל ועצם השוק, הכאב הוא במקום השבר שמתגבר בזמן פעילות ועומס על אזור זה.
על מנת לטפל בפציעה זו, צריך לנוח ולהימנע מריצה עד למעבר הכאב.
דלקות גידים - דלקות גידים הם דבר אופייני בכל גידי הגף התחתון שמאובחן בכאב מקומי וכמו כן בתנועה.
על מנת לטפל בפציעה זו, צריך לקרר את אזור הפציעה, לעשות מתיחות ולנוח.
שין ספלינט - זהו כאב בעצם השוק, הכאב מתבטא באזור קדמי או האחורי של השוק.
נגרם בעקבות חזרה מאומצת על תהליך הריצה.
דומה לכאב של שברי מאמץ והכאב עצמו עולה בתחילת הריצה בדרך כלל.
על מנת לטפל בפציעה זו, צריך מנוחה וקירור באזור הפגוע וחזרה הדרגתית לאימונים.
ריצה זו פחות נפוצה כיום מריצה עם נעלי ספורט.
יש הרואים בריצה כזו טבעית יותר ובריאה יותר עבור האדם, אולם לא קיים קונצנזוס ברור בעולם המדעי לגבי הסיכונים או היתרונות של הריצה היחפה.
ריצה היא אחת מדרכי התנועה של בעלי חיים ביבשה.
בעל החיים היבשתי המהיר ביותר הוא הברדלס, המסוגל להגיע למהירות של 110 ק"מ לשעה, אם כי לזמן קצר בלבד שאחריו הוא חייב לנוח במשך זמן ממושך על מנת להוריד את חום גופו.
ריצוף צבעני אילומינה , היא שיטת ריצוף וצביעה של חברת אילומינה, המשמשת לריצוף דנ"א כלומר לקביעת הרצף של זוגות בסיסים ב-DNA.
השיטה פותחה על ידי חוקרים בחברת Manteia Predictive Medicine, שנרכשה על ידי חברת סולקסה (Solexa) ב-2004. הפיתוח המשיך בחברת סולקסה, ובהמשך סולקסה נרכשה על ידי חברת אילומינה.
שיטה זו מבוססת על חוסמי שעתוק מסומנים בצבע, וניתנים להסרה, שמאפשרים לזהות בסיסים בודדים בעת שהם מצורפים לרצף ה-DNA.
שיטה זו מיושמת לרוב לריצוף אזורים מסובכים, כגון הומו-פולימרים ורצפים חוזרים.
היא יכולה לשמש לריצוף של גנום שלם או אזור מסוים בתוכו, לניתוח של כלל ה-RNA בתא או קבוצת תאים, למטא-גנומיקה, לגילוי רצפי RNA קצרים, להכנת פרופיל מתילציה, ולניתוח אינטראקציות בין חלבונים לחומצות גרעין בכל הגנום.
השיטה כוללת שלושה שלבים בסיסיים: הגברה, ריצוף וניתוח.
בתחילה, מחלקים את ה-DNA שמעוניינים לרצף למקטעים, מחברים אותם לפריימרים על משטח, במרחק מסוים זה מזה, ומגבירים אותם כך שנוצרים אגדים; כל אגד מכיל כ-1,000 עותקים של אותו מקטע DNA.
טכניקה זו של יצירת אגדים יוצרה ופותחה בסוף שנת 96 ב-Glaxo-Welcome's Geneva Biomedical Research Institute (GBRI), על ידי ד"ר פסקל מאייר וד"ר לורנט פארינלי והוצגה לציבור לראשונה בשנת 98'.
לאחר מכן, מוסיפים למבחנה ארבעה סוגים של בסיסים (אדנין, תימין, ציטוזין וגואנין), שכל אחד מהם מחובר לחוסם-שעתוק שמסומן פלואורסצנטית בצבע אחר.
ארבעת סוגי הבסיסים מתחרים על אתרי הקישור בגדילי ה-DNA המשלימים ההולכים ונבנים על גבי גדילי המקור.
חוסמי השעתוק המחוברים לבסיסים מבטיחים שלא יתווספו לאותו גדיל בבת אחת מספר בסיסים שונים וגם לא חזרות של אותו בסיס אלא רק בסיס אחד בכל פעם.
הצבע של חוסם השעתוק מאפשר לזהות את סוג הבסיס שהתווסף לכל אגד של גדילים, באמצעות מצלמה, לצורך ריצוף.
לאחר זיהוי סוג הבסיס שהתווסף, מסירים את חוסם השעתוק בתהליך כימי (ואיתו את הצבע), ומתאפשרת הוספת הבסיס הבא.
התהליך חוזר על עצמו עד שמקטעי ה-DNA מרוצפים בשלמותם.
מדובר בתהליך ארוך שיכול להימשך שבועיים.
לטכניקה זו מספר יתרונות על פני שיטות ריצוף מסורתיות כגון ריצוף סנגר.
בזכות אוטומטיות התהליך, ניתן לרצף מספר גדילים במקביל בתוך אותה מבחנה ולקבל את המידע במהירות.
בנוסף, שיטה זו זקוקה רק לדנ"א פולימראז בניגוד לשיטות אחרות (כגון פירוסיקוונסינג) שזקוקות למספר אנזימים יקרים.
שיטה זו שימשה לריצוף ה-RNA של בטטות ולניתוח הסיווג הטקסונומי של עצי הטקסוס.
ריצוף RNA או RNA-seq (קיצור של RNA Sequencing) הוא שיטת ריצוף שעושה שימוש בטכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה כדי לגלות את קיומו וכמותו של RNA בדגימה ביולוגית ברגע נתון, וכך לנתח את הטרנסקיפטום המשתנה מרגע לרגע.
ספציפית, ריצוף RNA מאפשר לצפות במקטעים שעברו שחבור חליפי, בעריכת רנ"א, באיחוי גנים, במוטציות/SNPs, ובשינויים בביטוי הגנים לאורך זמן, או הבדלים בביטוי הגנים בין קבוצות שונות או כתוצאה מטיפול שונה.
בנוסף למולקולות mRNA, ריצוף RNA יכול לבחון את שכיחותן של מולקולות RNA מגדלים ומסוגים שונים, כגון RNA כולל ו-RNA קטן, שכולל microRNA ו-tRNA, וכן לאפשר Ribosome profiling.
ריצוף RNA יכול גם לשמש לקביעת הגבולות בין אקסונים לאינטרונים, ולאמת או לתקן את האנוטציות של גבולות הגנים, קצה ה-5' וקצה ה-3'.
הפיתוחים החדשים בריצוף RNA כוללים ריצוף של תא בודד, ריצוף של רקמה מקובעת באתרה, וריצוף של מולקולות RNA מקוריות באמצעות ריצוף מולקולות בודדות בזמן אמיתי.
דוגמאות נוספות ליישומים שצצים בזכות התקדמות האלגוריתמים בתחום הביואינפורמטיקה הן גילוי שינויים במספר החזרות, זיהום חיידקים, טרנספוזונים, סוג התא (התמיינות), ובדיקה לנוכחות נאואנטיגנים (אנטיגנים שמייחדים תאים סרטניים).
לפני שפותח ריצוף ה-RNA, מחקרים על ביטוי גנים התבצעו בעזרת מערכי DNA.
בטכנולוגיה הזאת היו מספר בעיות: תוצאות שגויות כתוצאה מצימוד שגוי של רצפים (cross-hybridization artifacts), מדידה לא מדויקת של רמת הביטוי של גנים בעלי רמת ביטוי גבוהה ונמוכה, והצורך לדעת את הרצף מראש.
בגלל הבעיות הטכניות הללו, הטרנסקריפטומיקה עברה לשיטות מבוססות-ריצוף.
שיטות אלה הלכו והתקדמו מריצוף בשיטת סנגר תוך שימוש בספריות של תת-רצפים של cDNA (Expressed sequence tags), לשיטות מבוססות תיוג כימי (לדוגמה, ניתוח סדרתי של ביטוי גנים ), ולבסוף לטכנולוגיה הנוכחית, טכנולוגיית ריצוף מתקדמת (הדור הבא) של DNA משלים (cDNA), הידועה כריצוף RNA.
השלבים הכלליים של הכנת ספריית DNA משלים (cDNA) לצורך ריצוף מתוארים להלן, אם כי לעיתים קרובות יש הבדלים בין פלטפורמות.
בידוד ה-RNA – מבודדים את ה-RNA מרקמות ומערבבים אותו עם דאוקסירובונוקלאז (DNase).
DNase מפחית את כמות ה-DNA הגנומי.
כמות ה-RNA שהתפרק נמדדת באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ובנימיות , ומשמשת לחישוב 'מספר שלמוּת ה-RNA' של הדגימה.
מדד איכות זה של ה-RNA והכמות ההתחלתית הכוללת של ה-RNA נלקחים בחשבון במהלך השלבים הבאים: הכנת הספרייה, הריצוף והניתוח.
בחירה או הסרה של RNA – כדי לנתח את האותות שמעוניינים לבדוק, ניתן להשאיר את ה-RNA שבודַד כפי שהוא, לסנן מתוכו RNA בעל זנבות 3' שעברו פוליאדנילציה (poly(A)) כדי לקבל mRNA בלבד, עם כמה שפחות RNA ריבוזומלי (rRNA), ו/או לסנן מתוכו RNA שנקשר לרצפים ספציפיים .
RNA עם זנבות poly(A) 3' כולל בעיקר רצפים בוגרים, מעובדים, מקודדים.
בחירה של poly(A) מתבצעת על ידי ערבוב ה-RNA עם אוליגומרים של poly(T) המחוברים באופן קוולנטי למצע, בדרך כלל חרוזים מגנטיים.
לבחירה של poly(A) יש מגבלות חשובות בזיהוי ביוטיפים של RNA.
יש הרבה ביוטיפים של RNA שזנבותיהם לא עברו פוליאדנילציה, כולל הרבה תעתוקים של RNA שאינו מקודד ושל RNA שמקודד חלבוני ליבת היסטון, או שהבקרה שלהם היא באמצעות אורך זנב ה-poly(A) שלהם (למשל, ציטוקינים), ולכן הם עלולים לא להתגלות לאחר הבחירה של poly(A).
יתר על כן, בחירה של poly(A) עלולה לגרום להטיה מוגברת כלפי 3', במיוחד עם RNA באיכות נמוכה יותר.
ניתן להימנע ממגבלות אלו באמצעות הסרה של RNA ריבוזומלי (rRNA), המהווה בדרך כלל למעלה מ-90% מה-RNA בתא.
הן השלב של העשרת ה-poly(A) והן השלב של הסרת ה-RNA הריבוזומלי הם עתירי עבודה ועלולים להכניס הטיות, ולכן פותחו גישות פשוטות יותר כדי להימנע מהשלבים הללו.
כאשר מעוניינים לבדוק רצפי RNA קטנים, כגון miRNA, ניתן להמשיך ולבודד אותם על בסיס גודל בעזרת ג'לים לסינון (exclusion gels), חרוזים מגנטיים או ערכות מסחריות.
סינתוז cDNA – מבצעים תעתוק לאחור של ה-RNA ל-cDNA, הן מכיוון ש-DNA הוא יציב יותר והן כדי לאפשר הגברה (תוך שימוש ב-DNA פולימראז) ולמנף טכנולוגיית ריצוף DNA בוגרת יותר.
הגברה לאחר תעתוק לאחור גורמת לאובדן הגדיליוּת (strandedness) של הרצפים, כלומר אובדן המידע האם מקורה של מולקולת ה-cDNA הוא בגדיל הקָרִיא או בגדיל המוּל-קָרִיא של ה-DNA.
ניתן להימנע מאובדן הגדיליות באמצעות תיוג כימי או באמצעות ריצוף מולקולה בודדת.
מבצעים חלוקה למקטעים ובחירה לפי גודל כדי להגיע למצב שכל הרצפים הם באורך המתאים למכונת הריצוף.
ה-RNA, ה-cDNA, או שניהם מחולקים למקטעים בעזרת אנזימים, סוניקציה או נבולייזרים (nebulizers).
חלוקת ה-RNA למקטעים מפחיתה את הטיית ה-5' של תעתוק לאחור באופן אקראי ואת ההשפעה של אתרי ההיקשרות של התחלים, אך יש לה חיסרון – קצוות ה-5' וה-3' מומרים ל-DNA בצורה פחות יעילה.
לאחר החלוקה למקטעים מבצעים בחירה לפי גודל, שבה או שמסירים רצפים קטנים או שבוחרים טווח צר של אורכי מקטעים.
מכיוון שמולקולות RNA קטנות כמו miRNA הולכות לאיבוד, מנתחים אותן באופן עצמאי.
ניתן לאנדקס את ה-cDNA של כל ניסוי באמצעות הקסאמר או אוקטמר שישמש כברקוד, כדי שיהיה אפשר לאגד את הניסויים הללו לנתיב אחד של ריצוף מרובה (multiplexed sequencing).
ריצוף DNA משלים (ריצוף cDNA)
בשלב זה מרצפים את ספריית ה-cDNA שנוצרה מביוטיפים של RNA ושומרים את המידע בפורמט קריא במחשב.
קיימות טכנולוגיות ריצוף רבות בתפוקה גבוהה לריצוף cDNA, כולל פלטפורמות שפותחו על ידי אילומינה, תרמו פישר , BGI/MGI , פסיפיק ביוסיינסז ואוקספורד ננופור טכנולוג'יז .
הבחירה בפלטפורמת ריצוף ובפרמטרים נעשית לפי מבנה הניסוי והעלות.
השיקולים הנפוצים בתכנון הניסוי כוללים החלטה על אורך הריצוף, עומק הריצוף, שימוש בקריאה חד-כיוונית או דו-כיוונית (single-end or paired-end reads), מספר העותקים, ריבוי (multiplexing), רנדומיזציה ו-.
כשמרצפים RNA שאינו mRNA, מכינים את הספרייה בצורה שונה.
בוחרים את ה-RNA של התאים לפי טווח הגדלים הרצוי.
כשרוצים לרצף RNA קטן, כגון miRNA, מבודדים את ה-RNA באמצעות בחירת גודל.
ניתן לבצע זאת באמצעות ג'ל לסינון לפי גודל, באמצעות חרוזים מגנטיים לבחירת גודל, או בעזרת ערכה שפותחה באופן מסחרי.
לאחר הבידוד, מוסיפים מקשרים (linkers) לקצות ה-3' וה-5' ואז מטהרים אותם.
השלב האחרון הוא יצירת cDNA באמצעות תעתוק הפוך.
מכיוון שהוכח שהמרה של RNA ל-cDNA, ליגציה, הגברה, ועיבודים נוספים של הדגימות מכניסים הטיות וממצאי שווא שעלולים להפריע הן לאפיון הנכון והן לכימות של התעתיקים, חברות שונות כגון Helicos (פשטה רגל), ו-Oxford Nanopore Technologies עסקו בפיתוח ריצוף ישיר של מולקולת RNA בודדת.
טכנולוגיה זו מרצפת מולקולות RNA באופן ישיר בשיטת הריצוף המסיבי-המקביל.
ריצוף בזמן אמת של מולקולת RNA בודדת
ריצוף ישיר של מולקולת RNA בודדת באופן מסיבי ומקביל נחקר כחלופה לריצוף ה-RNA המסורתי, שבו המרת ה-RNA ל-cDNA, הליגציה, ההגברה ושלבי עיבוד אחרים של הדגימות עלולים להכניס הטיות וממצאי שווא.
פלטפורמות טכנולוגיות שמבצעות ריצוף של מולקולת RNA בודדת בזמן אמת כוללות את ריצוף Nanopore של חברת Oxford Nanopore Technologies (ONT), את ריצוף IsoSeq של חברת PacBio ואת חברת Helicos (פשטה רגל).
ריצוף RNA בצורתו הטבעית משמר שינויים כמו מתילציה, ומאפשר לחקור אותם באופן ישיר ובו-זמני.
יתרון נוסף של ריצוף מולקולת RNA בודדת הוא שניתן לכסות את התעתיקים באורך מלא, מה שמאפשר לזהות ולכמת איזופורמים בוודאות גבוהה יותר בהשוואה לריצוף בקריאות קצרות.
בעבר, לשיטות ריצוף מולקולת RNA בודדת היו שיעורי שגיאה גבוהים יותר בהשוואה לריצוף בקריאות קצרות, אך שיטות חדשות יותר כמו שיטת ONT לריצוף ישיר של RNA מגבילות את כמות השגיאות בכך שהן נמנעות מחלוקה למקטעים ומהמרה ל-cDNA.
השימוש שנעשה לאחרונה בשיטת ONT לבדיקת הביטוי הדיפרנציאלי באוכלוסיות תאים אנושיים הוכיח שהטכנולוגיה הזו יכולה להתגבר על מגבלות רבות של ריצוף cDNA קצר וארוך.
ריצוף RNA של תא בודד
שיטות סטנדרטיות כגון מיקרו-מערכים וניתוח סטנדרטי של RNA שרוצף בכמויות גדולות, מנתחות את ביטוי ה-RNA באוכלוסיות גדולות של תאים.
באוכלוסיות מעורבות של תאים מסוגים שונים, המדידות הללו עלולות לטשטש הבדלים קריטיים בין תאים אינדיבידואליים בתוך האוכלוסיות.
ריצוף RNA של תא בודד (scRNA-Seq) מספק את פרופילי הביטוי של תאים בודדים.
אף על פי שלא ניתן לקבל מידע מלא על כל RNA שמבוטא על ידי כל תא, בשל הכמות הקטנה של החומר הזמין, ניתן לזהות דפוסים של ביטוי גנים באמצעות ניתוח אשכולות של הגנים.
זה יכול לחשוף את קיומם של סוגים נדירים של תאים שאולי לא נראו מעולם.
לדוגמה, תאים מתמחים נדירים בריאות הנקראים יונוציטים ריאתיים המבטאים את מווסת ההולכה הטרנסממברנית של ציסטיק פיברוזיס זוהו בשנת 2018 על ידי שתי קבוצות שביצעו ריצוף RNA של תא בודד על תאי אפיתל של דרכי הנשימה בריאות.
ריצוף RNA של תא בודד נכנס לשימוש רחב במגוון דיסציפלינות ביולוגיות כגון התפתחות העובר והאורגניזם, נוירולוגיה, אונקולוגיה, מחלות אוטואימוניות, ומחלות זיהומיות.
הריצוף בדרך זו סיפק תובנות חשובות לגבי התפתחותם של עוברים ואורגניזמים, כולל התולעת Caenorhabditis elegans, והתולעת השטוחה שמסוגלת להתחדש Schmidtea mediterranea .
בעלי החוליות הראשונים שמופו בדרך זו היו דג הזברה והצפרדע האפריקאית Xenopus laevis .
בכל אחד מהמקרים נחקרו שלבים רבים של העובר, שאפשרו למפות את תהליך ההתפתחות במלואו על בסיס תא-אחר-תא.
כתב העת Science הכיר בהישגים אלו כפריצת הדרך של השנה ב-2018.
בתכנון ובביצוע ניסויי ריצוף RNA יש לקחת בחשבון מגוון פרמטרים:
ספציפיות של רקמות – ביטוי הגנים משתנה בתוך כל רקמה ובין רקמות שונות, וריצוף RNA מודד תערובת של סוגי תאים.
זה עלול להקשות על בידוד המנגנון הביולוגי שמעוניינים לבחון.
ניתן להשתמש בריצוף תא בודד כדי לבחון כל תא בנפרד, וכך להתגבר על בעיה זו.
תלות בזמן – ביטוי הגנים משתנה על ציר הזמן, וריצוף RNA רק מצלם תמונת מצב.
ניתן לבצע סדרת בדיקות לאורך זמן כדי לצפות בשינויים בטרנסקריפטום.
כיסוי (מכונה גם 'עומק') – RNA מכיל את אותן מוטציות שנצפו ב-DNA, וכדי לגלות אותן נדרש כיסוי עמוק יותר.
אם הכיסוי גבוה מספיק, ניתן להשתמש בריצוף RNA כדי להעריך את הביטוי של כל אלל.
זה יכול לספק תובנות לגבי תופעות כמו החתמה או השפעה של אזורי בקרה שצמודים לגנים .
את עומק הריצוף הנדרש עבור יישומים ספציפיים ניתן להסיק מניסויי פיילוט.
ממצאי שווא בהפקת המידע (מכונים גם 'שונות טכנית') – הריאגנטים (למשל, ערכת הכנה לספרייה), אנשי הצוות שמבצעים את הניסוי, וסוג טכנולוגיית הריצוף (למשל, אילומינה, Pacific Biosciences) עלולים ליצור ממצאי שווא טכניים שעלולים להתפרש בטעות כתוצאות בעלות משמעות.
כמו בכל ניסוי מדעי, רצוי לבצע ריצוף RNA בסביבה מבוקרת היטב.
אם זה בלתי אפשרי או שהמחקר הוא מטא-אנליזה, פתרון אחר הוא לזהות ממצאי שווא טכניים על ידי הסקת משתנים חבויים (לרוב באמצעות ניתוח גורמים ראשיים או ניתוח גורמים) ולאחר מכן לשלוט במשתנים הללו.
ניהול נתונים – ניסוי אחד של ריצוף RNA בבני אדם לרוב כולל 1–5 Gb של נתונים (לאחר דחיסה), ואפילו יותר אם כוללים גם את קובצי הביניים.
נפח הנתונים הגדול יכול ליצור בעיות אחסון.
פתרון אחד הוא לדחוס את הנתונים בשיטות דחיסה רב-תכליתיות (למשל, Gzip) או בשיטות דחיסה ספציפיות לגנומיקה.
השיטות הספציפיות יכולות להיות מבוססות על רצף ייחוס או דה נובו.
פתרון נוסף הוא לבצע ניסויי מיקרו-מערך, שעשויים להספיק למחקרים שעוסקים בבחינת השערות או למחקרי שכפול (בניגוד למחקרי גישוש ).
ישנן שתי שיטות לשיוך קריאות רצף גולמיות לאזורים ספציפיים בגנום (כלומר, להרכבת הטרנסקיפטום):
הרכבה מאפס (דה נובו) – גישה זו אינה דורשת גנום ייחוס כדי לשחזר את התעתיק, ולרוב משתמשים בה כשהגנום אינו ידוע, אינו שלם או כשהתעתיק עבר שינויים מהותיים בהשוואה לגנום הייחוס.
בשימוש בקריאות קצרות לצורך הרכבה מאפס מתעוררים מספר קשיים: 1. כיצד לקבוע אילו קריאות יש לחבר יחד לרצפים בלתי מופסקים ; 2. כיצד להתגבר על שגיאות ריצוף וממצאי שווא אחרים; ו-3. יעילות חישובית.
בעבר האלגוריתם העיקרי ששימש להרכבה מאפס היה גרף חפיפה, שמצריך לבדוק אם יש חפיפה בין כל שתי קריאות.
כיום האלגוריתם העיקרי הוא גרף De Bruijn , שמפרק את הקריאה לרצפים באורך k ומכווץ את כל ה-k-mers לתוך טבלת גיבוב.
בעבר נהגו להשתמש בגרף חפיפה יחד עם ריצוף בשיטת סנגר, אך השימוש בגרף חפיפה אינו מתמודד היטב עם מיליוני קריאות שנוצרות בריצוף RNA.
דוגמאות לתוכנות הרכבה שמשתמשות בגרף De Bruijn הן Trinity, Oases (שמקורה בתוכנת הרכבת הגנום Velvet ), Bridger, ו-rnaSPAdes.
ריצוף של אותה דגימה בקריאות דו-כיווניות ובקריאות ארוכות יכול לשמש כתבנית או שלד ולהשלים חלק מהפערים בריצוף של קריאות קצרות.
מדדים להערכת האיכות של הרכבה מאפס כוללים את האורך החציוני של הרצפים הבלתי מופסקים (Contigs), את מספרם, ו-N50 .
הרכבה מונחית-גנום – גישה זו מסתמכת על אותן שיטות המשמשות לעימוד רצפי DNA, אך עליה להתמודד עם מורכבות נוספת: עימוד קריאות שמכסות חלקים לא רציפים של גנום הייחוס.
הקריאות הלא רציפות הן תוצאה של ריצוף תעתיקים שעברו שחבור.
בדרך כלל, לאלגוריתמים של עימוד יש שני שלבים: 1. עימוד חלקים קצרים מהקריאה (כלומר, זריעה של הגנום), ו-2. שימוש בתכנון דינמי כדי למצוא עימוד אופטימלי, לפעמים בשילוב עם אנוטציות ידועות.
כלי תוכנה שמשתמשים בעימוד מונחה גנום כוללים את Bowtie, TopHat (המתבסס על התוצאות של BowTie לעימוד צומתי שחבור), Subread, STAR, HISAT2, ו-GMAP.
לאחר השימוש בכלים לעימוד (מיפוי) מונחה גנום, ניתן להעביר את הפלט שלהם לכלים כגון Cufflinks או StringTie כדי לשחזר רצפי תעתיק בלתי מופסקים (כלומר, קובץ FASTA).
ניתן למדוד את האיכות של הרכבה מונחית גנום באמצעות: 1. מדדי הרכבה מאפס (למשל, N50) ו-2. השוואה לתעתיק ידוע, צומת שחבור ידוע, גנום ידוע או חלבונים ידועים באמצעות האלגוריתמים Precision, Recall או שילוב שלהם (למשל, ציון F1).
בנוסף, ניתן לבצע הערכה ממוחשבת (in silico) תוך שימוש בקריאות מדומות.
הערה על איכות ההרכבה – הקונצנזוס הנוכחי הוא ש-1. איכות ההרכבה יכולה להשתנות בהתאם למדד שמשתמשים בו, 2. כלי הרכבה שקיבלו ציון טוב במין אחד של אורגניזמים אינם בהכרח מתפקדים היטב במינים אחרים, ו-3. ייתכן ששילוב של גישות שונות הוא הכי אמין.
ביטוי הגנים מכומת כדי לחקור שינויים בתא בתגובה לגירויים חיצוניים, כדי לחקור הבדלים בין מצב בריא ומצב מחלה, ושאלות מחקר אחרות.
רמת התעתוק משמשת לעיתים קרובות כפרוקסי לכמות החלבון, אך לעיתים קרובות הן אינן שקולות זו לזו עקב אירועים שלאחר התעתוק כגון הפרעות ל-RNA (RNAi) ו-Nonsense-mediated decay (NMD).
ניתן לכמת את רמת הביטוי על ידי ספירת מספר הקריאות שמופו לכל לוקוס בשלב הרכבת הטרנסקריפטום.
ניתן לכמת את מידת הביטוי של אקסונים או גנים באמצעות קונטיגים או באמצעות אנוטציות של תעתיק ייחוס.
השוואות שנערכו בין ספירת הקריאות במהלך ריצוף RNA ובין טכנולוגיות ישנות יותר, כולל מיקרו-מערכי ביטוי ו-PCR בזמן אמת, מצאו שספירת הקריאות אמינה מאוד.
כלים אלה מפיקים נתוני קריאות מנתוני ריצוף RNA מעומדים, אך ניתן גם להפיק נתוני קריאות ללא עימוד באמצעות Sailfish ו-Kallisto.
לאחר מכן, ממירים את נתוני הקריאות למדדים מתאימים לצורך בדיקת השערות, עריכת רגרסיות, וניתוחים אחרים.
העומק (או הכיסוי) של הריצוף – למרות שהעומק מוגדר מראש כשמבצעים ניסויי ריצוף RNA מרובים, הוא בכל זאת משתנה במידה רבה בין ניסויים.
לכן, המספר הכולל של קריאות שנוצרו בניסוי בודד מנורמל בדרך כלל על ידי המרת מספר הקריאות למקטעים, קריאות או ספירות למיליון קריאות ממופות (FPM, RPM או CPM).
היסטורית, ההבדל בין RPM ל-FPM נוצר במהלך ההתפתחות מריצוף יחיד של מקטעים לריצוף דו-כיווני.
בריצוף יחיד, יש רק קריאה אחת לכל מקטע (כלומר, RPM = FPM).
בריצוף דו-כיווני, יש שתי קריאות לכל מקטע (כלומר, RPM = 2 x FPM).
עומק הרצף מכונה לפעמים 'גודל הספרייה' – מספר מולקולות הביניים מסוג cDNA שיש בניסוי.
אורך הגן – לגנים ארוכים יותר יהיו יותר מקטעים/קריאות/ספירות מאשר לגנים קצרים יותר, אם מידת הביטוי של התעתיק היא זהה.
לוקחים זאת בחשבון ידי חלוקת ה-FPM באורך התכונה (גן, תעתיק או אקסון), והתוצאה היא מקטעים מטריים ל-Kbp של התכונה למיליון קריאות ממופות (FPKM).
כאשר מסתכלים על קבוצות של תכונות בדגימות שונות, ממירים את FPKM לתעתיקים למיליון (TPM) על ידי חלוקת כל FPKM במספר הכולל של ה-FPKM בתוך דגימה.
הפלט הכולל של דגימת ה-RNA – מכיוון שאותה כמות של RNA מופקת מכל דגימה, בדגימות עם RNA כולל גבוה יותר יהיה פחות RNA לכל גן.
הגנים האלה נראים כאילו יש ירידה בביטוי שלהם, וכתוצאה מכך עלולות להתקבל תוצאות חיוביות שגויות בניתוחי ההמשך.
אסטרטגיות נורמליזציה הכוללות quantile, DESeq2, TMM ו-Median Ratio מנסות לתקן את ההבדל הזה על ידי השוואת קבוצה של גנים שאין הבדל במידת הביטוי שלהם בין הדגימות השונות, ושינוי קנה המידה בהתאם.
שונות במידת הביטוי של כל גן – נלקחת בחשבון כדי לתקן שגיאות דגימה (זה חשוב עבור גנים בעלי מספר קריאות נמוך), כדי להגדיל את העוצמה, וכדי להפחית את התוצאות החיוביות השגויות.
ניתן להעריך את השונות כהתפלגות נורמלית, כהתפלגות פואסון או כהתפלגות בינומית שלילית, והיא מפורקת לעיתים קרובות לשונות טכנית ולשונות ביולוגית.
שימוש ב-Spike-ins לכימות מוחלט ולזיהוי השפעות רוחביות על הגנום
RNA Spike-ins הם דגימות של RNA בריכוזים ידועים שיכולות לשמש כתקן זהב בתכנון ניסויים ובניתוח תוצאותיהם לשם כימות מוחלט וזיהוי של השפעות רוחביות על הגנום.
כימות מוחלט – כימות מוחלט של ביטוי גנים אינו אפשרי ברוב ניסויי ריצוף ה-RNA, שמכמתים את הביטוי ביחס לכל התעתיקים.
כימות מוחלט אפשרי על ידי ביצוע ריצוף RNA עם Spike-ins, דגימות של RNA בריכוזים ידועים.
לאחר הריצוף, משתמשים בנתוני הקריאות של רצפי ה-Spike-in כדי לקבוע את הקשר בין נתוני הקריאות של כל גן לבין הכמות המוחלטת של מקטעים ביולוגיים.
לדוגמה, טכניקה זו שימשה כדי לקבוע את הקינטיקה של התעתוק בעוברים של הצפרדע Xenopus tropicalis .
זיהוי השפעות רוחביות על הגנום – שינויים במנגנוני בקרה גלובליים, כולל מעצבי כרומטין, גורמי תעתוק (למשל, Myc), קומפלקסים של אצטילטרנספראז , ועמדת הנוקלאוזומים – אינם תואמים להנחות הנרמול, ושימוש ב-Spike-ins כביקורת יכול להציע פרשנות מדויקת לכך.
לפני המצאת ריצוף הרנ"א, דנ"א מיקרו-אריי (DNA microarrays) הייתה השיטה המחקרית השולטת לאנליזת הטרנסקריפטום על ידי יצירת פרופילים של רמות ביטוי גנים.
למרות שגם כיום מחקרים לא מעטים משתמשים במיקרו-אריי ומייצרים תוצאות מלהיבות במעט זמן יחסית, מגבלות ניסויות פנימיות של שיטה זו גורמות לריצוף הרנ"א להיות השיטה המועדפת.
ככל שהמחקר בתחום ריצוף הרנ"א גדל ומתרחב ומניב תוצאות מבטיחות וקבועות, נשאלת השאלה "האם זהו תחילתו של סוף עידן המיקרו-אריי?".
אף על פי כן, עדיין ליישומים רבים, מיקרו-אריי היא השיטה המועדפת.
לא רק ששיטה זו זולה פי 10–100 בהשוואה לאותה רזולוציית דיוק בריצוף רנ"א, אלה שגם פרוטוקולי העבודה של ריצוף הרנ"א עדיין לוקים בחסר בכל הקשור לשלבי הליגציה הנחוצים.
מגבלה נוספת לכימות פרופיל ביטוי גנים באמצעות ריצוף רנ"א היא שתעתיקים שכיחים (כמו אלה של גנים "שומרי-בית") אחראים לעיקר האינפורמציה המרוצפת.
כך למשל בדגימה טיפוסית, 5% מהגנים מהווים כ-75% מהקריאות המרוצפות.
כתוצאה מכך קשה למדוד את שכיחות התעתיקים הנותרים בצורה אמינה ולכן רוב המדידות מושפעות מ"רעש" רב.
רמות ביטוי יכולות להיות מחולצות באמצעות ריצוף רנ"א רק בהתאם ליכולת שליפה של רצף נתון.
מחקרי טרנסקריפטומיקה בשמרים למשל, הראו שנדרש כיסוי של פי-4 (Fourfold coverage) לאמפליקונים (amplicons) על מנת שאלו יהיו מאופיינים ומוגדרים כגן מבוטא.
כאשר הטרנסקריפטום מקוטע לפני הפיכתו לדנ"א משלים, מספר הקריאות המיוחסות לאקסון מסוים, מנורמל לאורכו בחיה (in vivo), מניב רמות ביטוי לגן שהם בקורולציה לאלו המושגים באמצעות qPCR.
גילוי שונות ברמת הנוקליאוטיד הבודד
שונות ברמת הנוקליאוטיד הבודד בטרנסקריפטום נחקרה בתירס באמצעות פלטפורמת רוצ'ה 454 (Roche 454 sequencing).
באמצעות טכנולוגיה זו חולצו בערך 7,000 פולימורפיזמים חד-בסיסיים (SNPs) שונים.
לאחר אימות בעזרת שיטת סנגר, אושרו כמעט 5,000 פולימורפיזמים חד-בסיסיים שונים המשתרעים על פני למעלה מ-2,400 גנים בתירס.
כיסוי ועומק יכולים להשפיע על המוטציות שמתגלות במהלך הריצוף.
בהתחשב שדינמיקת התא היא תלוית ביטוי, אלל מסוים עשוי לא להתגלות הן מפני שאינו מצוי בגנום והן מפני שהגן אינו מבוטא בזמן המדידה.
ריצוף רנ"א יכול להניב אינפורמציה נוספת אודות רמות הביטוי של כל אלל של גן מסוים וע"י כך לנסות ולכמת את אופי ההטרוזיגוטיות של גן נתון.
במחקרים אסוציאתיבים, גנוטיפים מיוחסים למחלה, ורמות ביטוי עשויות להיות מיוחסות למחלה גם כן.
באמצעות ריצוף רנ"א ניתן למדוד את הקשר בין שני משתנים מיוחסים אלה, כלומר מהו טיב הקשר לרמות ביטוי של אלל מסוים.
עומק הריצוף הנחוץ לאפליקציה מסוימת יכול להיות מחולץ מניסוי מקדים קטן יותר (Pilot experiment).
השוואת רמות ביטוי אללים לתאי הרבייה
הדרך היחידה להיות בטוח בוודאות במוטציות של פרט מסוים, היא על ידי השוואת רצפי הטרנסקיפטום של הפרט לרצפי הדנ"א הגנומי בתאי הרבייה של אותו פרט.
תהליך זה מאפשר להבדיל בין גנים הומוזיגוטים לבין שונות בביטוי של אחד מהאללים.
כמו גם, תהליך זה יכול לספק מידע אודות גנים שלא התבטאו כלל במהלך לקיחת הדגימה לניסוי.
באמצעות השוואת רצפי הטרנסקריפטום לגנום של פרט מסוים ניתן לזהות עריכות שלאחר-שיעתוק.
כך למשל, במקרה שפרט מסוים הוא הומוזיגוט לגן מסוים, אך כל תעתיקי הרנ"א שהתגלו היו מטיפוס של אלל אחר שלא תואם לגרסה הגנומית, ניתן לקבוע שאכן התרחש אירוע עריכה שלאחר-שיעתוק.
באופן כללי וריאציות ברמת הבסיס הבודד ב-mRNA אינן נחשבות כמשפיעות על שונות פונקצינאלית בין תאים.
הסיבה לכך היא מפני ששינויים אלה נעלמים עם דגרגציית מולקולת הרנ"א ואינם תמידיים, אולם הם בהחלט עשויים להשפיע על תהליכי התרגום והשיחבור של אותו תעתיק.
כמו כן מכיוון שמנגנוני תיקון הדנ"א היעילים אינם פועלים על מולקולות רנ"א ניתן לזהות וריאציות כאלה בתדירות גבוה יחסית, ואף הוצע לקשור הליך זה למחלות פריון (חלקיק חלבוני זיהומי) כמו TSE) Transmissible Spongiform Encephalopathies).
גנים מאוחים, הנוצרים בעקבות מודיפיקציות מבניות שונות בגנום, זכו לאחרונה להרבה תשומת לב עקב הקשרם לסרטן.
היכולת של שיטת ריצוף הרנ"א לנתח טרנסקיפטום שלם מדגימה בצורה רנדומלית, הפכה את השיטה לכלי שימושי לגילוי אירועים שכיחים אלו בסרטן.
הרעיון מתבסס על אותו הליך של יישור קריאות טרנסקריפטומיות קצרות לגנום מקור.
רוב הקריאות הקצרות יותאמו לאזורי אקסונים או לצמתים בין אקסונים בלוקוס נתון, אך ייתכן מצב בו יהיו קריאות אשר יותאמו לקטעי אקסונים משני גנים שונים.
מצב כזה יוכיח איחוי אפשרי בין גנים, אך עקב אורכן הקצר של הקריאות יהיה הרבה "רעש" במדידה.
גישה אחרת היא שימוש בקריאות צמד-סוף (Paired end), כאשר מספר רב של קריאות כאלה יותאמו לקצוותם של שני אקסונים שונים, ברמת כיסוי גבוה, יהיה ניתן לגלות אירועי איחוי חדשים.
איסוף מידע על ידי ריצוף הטרנסקריפטום, נתון לאותן המגבלות המשויכות לאנליזות ביטוי רנ"א אחרות:
ביטוי תלוי-רקמה: ביטוי הגנים אינו אחיד בכל התאים של אורגניזם ותלוי רבות בסוג הרקמה ממנה נלקחו התאים הנחקרים.
ביטוי תלוי-זמן: בזמן מחזור חייו של תא, פרופיל ביטוי הגנים משתנה בהתאם לזמן ביום, גירויים מהסביבה וכו'.
עקב כך, יש להיזהר מהסקת מסקנות מתוצאות מחקרי ריצוף שכן חלק מהמידע שנאסף אולי לא משקף את הפרט עצמו.
דוגמה לכך היא גילוי וריאציות ברמת הבסיס הבודד ברנ"א שמתבטא, שלא בהכרח משקפות את הגנוטיפ של אותו הפרט.
ייתכן ואלל המקור פשוט לא מתבטא באותה רקמה או זמן, ומודיפיקציות תלויות רקמה/זמן שינו את התעתיק בדגימה הספציפית הנחקרת.
הופעתן של טכנולוגיות ריצוף מתקדמות בעלות תפוקה גבוהה פתחה אפשרויות חדשות בתחום ריצוף הדנ"א, וככל שהשימוש בכלים החדשים הפך נפוץ יותר, נוצרו גם שיטות חדשניות להשתמש בהם.
הדרישות הנמוכות של טכנולוגיות הריצוף בתפוקה גבוהה מרֶצֶף הנוקליאוטידים המשמש כקֶלֶט, יחד עם הכיסוי העמוק, והרזולוציה ברמת הבסיס הבודד – אפשרו לשימוש בטכנולוגיות האלה להתרחב לתחום הטרנסקריפטומיקה (Transcriptomics).
טרנסקריפטומיקה היא תחום מחקר העוסק באפיון הרנ"א המתועתק מגנום מסוים שמעוניינים לחקור.
אף על פי שהטרנסקריפטומים דינמיים יותר מדנ"א גנומי, הם מספקים גישה ישירה לבקרת גנים ומידע על חלבונים.
ריצוף טרנסקריפטומים אינו רעיון חדש; פותחו בעבר שיטות שונות לפיענוח ישיר של רצפי דנ"א משלים (cDNA), רובן מבוססות על שיטת סנגר המסורתית (והיקרה יותר), ואחרות משתמשות במתודולוגיות כגון SAGE (Serial analysis of gene expression), CAGE (Cap analysis of gene expression) ו-MPSS (Massively parallel signature sequencing).
ריצוף טרנסקריפטום (ריצוף רנ"א) יכול להתבצע במגוון פלטפורמות כדי לבחון הרבה רעיונות והשערות.
לדוגמה, פלטפורמת האנליזה הגנומית של אילומינה (Genome AnalyzerIllumina) שימשה בין היתר לריצוף טרנסקריפטומים של יונקים, ריצוף SOLiD של חברת ABI שימש לקבלת פרופיל ביטוי של תאי גזע, ו"ריצוף 454" של חברת Roche שימש לקבלת מפת הפולימורפיזמים החד-בסיסיים (SNPs) בתירס.
למרות ההבדלים הטכניים בין פלטפורמה לפלטפורמה, האינפורמציה הנאספת מכל אחת מהן זהה במהותה.
רבינו יצחק בן אברהם משאנץ (נפטר בשנת 1199, או לפי מקורות אחרים ב-1210), הריצב"א (מכונה לפעמים גם ר"י הבחור, ריב"א, ר"י מדנפירא ור' יצחק מטרניאל), היה מחשובי בעלי התוספות במאה ה-12, תלמידם של רבנו תם ור"י הזקן, ואחיו הגדול של הר"ש משאנץ.
רבינו יצחק נולד בצרפת למשפחה רבת יחס: אביו היה רבי אברהם החסיד משאנץ (Sens), נדיב ידוע ובנו או חתנו של רבי שמשון הזקן מפלייזא (Falaise), שהיה מגדולי בעלי התוספות וגיסו (אחיה של מרים, אשתו) של רבינו תם.
אחיו הצעיר של רבי יצחק היה רבי שמשון משאנץ.
שני האחים כיבדו והעריכו מאוד זה את זה, והיו נמלכים זה בזה בקשר לפסקי הוראה שונים.
נמצא גם חיבור "קיצור לתוספות שאנץ" למסכת בכורות שקיצרו ר"י הבחור, והוא הריצב"א שטרח לערוך את פירושי אחיו.
הריצב"א ואחיו הר"ש משאנץ למדו שניהם בצעירותם בטרוייש (Troyes) אצל רבינו תם, אחי סבתם, עד לפטירתו זמן קצר לאחר מכן; אז עברו האחים אל ישיבתו של ר"י הזקן בדנפירא (Dampierre-Sur-Aube), והיו מגדולי התלמידים שם.
נמצא אף מקרה בו העידו לר"י אודות מעשה שאירע בטרוייש עם רבינו תם (שהיה דודו ורבו של ר"י) בעת שהייתם שם.
ר"י הזקן (שהיה גם הוא קרוב מרוחק שלהם), היה רבם המובהק.
עוד נראה כי הריצב"א למד תורה גם מפי רבינו אליהו מפאריס, מגדולי דורם של רבינו תם ורשב"ם.
לאחר מות ר"י הזקן הפכו האחים ליורשיו התורניים, כאשר הריצב"א ממלא מקומו בראשות בית המדרש של דנפירא ואילו אחיו חוזר אל שאנץ, עיר הולדתם, והופך שם למקור הוראה ופלפול עיקרי.
כדי להבדילו מרבו ר"י הזקן, כונה הריצב"א לפעמים ר"י הבחור (=הצעיר).
יש הטוענים שהריצב"א היה חי ברמרו (Ramerupt), ולא בשאנץ או דנפירא.
אז שלח הרמ"ה את כל האיגרות יחד לריצב"א ואחיו הש"ר משאנץ ולעוד מחכמי צפון צרפת כדי שיכריעו ביניהם באשר לספר.
לגבי הנקודות ההלכתיות הספציפיות הר"ש בגדול הסכים עם השגות הרמ"ה, אם כי הוסיף פירושים לרמב"ם עליהם דנו הוא והרמ"ה בהמשך בחליפת מכתבים ארוכה.
ואולם, באשר למעמדו וסמכותו האישית של הרמב"ם, הר"ש נקט עמדה ברורה כנגד הרמ"ה, באומרו על הרמב"ם: "ולא להשיב את הארי הגדול לאחר מיתה באתי, הרב משה אשכול הכפר, ממנו פנה ממנו יתד; שמענו שמעו כי נגלו לו שערי בינה, ותורה היא וללמוד אני צריך" (כתאב אל-ראסיל, צד קלא).
באיגרתו המצורפת לכתאב אל-רסאיל כתב הרמ"ה על רבני וזקני צרפת, שבראשם ניצבים
ממקור אחר נראה כי גם הריצב"א חלק לרמב"ם כבוד גדול.
הריצב"א נפטר עוד קודם שעלה אחיו לארץ ישראל, ובשעת פטירתו באו לחלוק לו כבוד רבים מגאוני צרפת, כמו שכותב רבינו פרץ: ר' יעקב מפרובינץ זה היה תלמיד הריצב"א, וכן אחיינו מדרגה שנייה (בנו של בן דודו של הריצב"א), כדלהלן.
הריצב"א נודע בבקיאותו העצומה ובהתמדתו המופלגת; המרדכי מספר עליו כי הייתה הלכה מסוימת אשר נאמר שמקורה הוא בירושלמי, הריטב"א כותב בשם תלמיד הריצב"א רבי יעקב מקינון שמנהגו של הריצב"א היה להשכים קודם עמוד השחר וללמוד תורה, וגם תלמיד נוסף שלו, ר' יחיאל מפאריס, מעיד על מנהגי חסידותו.
יחד עם חכמי אשכנז (ר' דוד בן שאלתיאל, ר' משולם בן דוד ור' יהודה הכהן) חתום הריצב"א על תקנות המופיעות בתשובות מהר"ם.
הריצב"א העמיד תלמידים רבים, מגדולי הדור.
מזקני תלמידיו היו אלו אשר למדו עוד אצל ר"י הזקן ואחר פטירתו עברו ללמוד אצל הריצב"א, ומהם:
רבינו ברוך בעל ספר התרומה.
האחים ר' משה ור' שמואל מאייברא, מגדולי צרפת המצטטים הלכות בתוספותיהם משמו של הריצב"א.
ר' מנחם בן וורדימס (או וורדינוס) מפריז.
ר' יעקב בן מאיר מפרובאנס, שהיה אחיין הריצב"א מדרגה שנייה.
תלמידיו האחרים היו רבני הדור הבא בצרפת ובספרד, מהם:
ר' נתן ב"ר מאיר מטראנטקילה שבספרד, רבם של הרמב"ן ור' שמואל הסרדי בעל ספר התרומות.
ר' יהודה בר יקר, רבו של הרמב"ן בנגלה ובנסתר.
ר' יחיאל מפאריס שאף העיד על מנהגיו.
ר' יעקב מקינון, נקרא גם רבינו תם מקינון, רבו של רבינו פרץ מקורביל.
ר' יהודה הכהן מפרידבורג, מרבותיו של המהר"ם מרוטנברג.
ר' שמואל מפלייזא, תלמיד ר' יהודה שירליאון ורבם של רבינו פרץ והמהר"ם מרוטנבורג.
ר' אהרן מרגנשבורג, רבו של ר' אליעזר מטוך.
ר' משה בן ר' יום טוב מלונדריש (לונדון).
ר' שמואל ב"ר אלחנן, בנו של רבי אלחנן הקדוש שהיה בנו של ר"י הזקן; בעל התוספות למסכת מועד קטן.
תלמידי תלמידיו של הריצב"א היו עמוד התורה וההוראה באירופה כולה: ר' אליעזר מטוך ומהר"ם מרוטנבורג בגרמניה, ר' משה בן ר' יום טוב באנגליה, רבינו פרץ ור' שמואל מפלייזא בצרפת, והרמב"ן ובעל ספר התרומות בספרד.
רבים מרבני הדור נמלכו בעצתו, בהם:
ר' יהונתן מלוניל (שגם לפני עלייתו לארץ ישראל שאל את הריצב"א כמה שאלות לגבי המצוות התלויות בארץ, אשר מובאות בראשונים - כגון באור זרוע ועוד).
רבי יצחק מאנגליה, בנו של ר' יום טוב מיואני שנהרג במהלך הטבח ביהודי יורק.
ר' שמחה משפיירא, מגדולי הדור (רבם של רבי יצחק מווינה בעל ה"אור זרוע", ר' ישעיה די טראני בעל תוספות רי"ד, הרוקח ועוד).
רבינו יוסף בכור שור מאורליאנש.
הריצב"א חיבר תוספות על הש"ס כדרכו של אחיו, אשר קוצרו והוכנסו לתוספות המאוחרים שעל הגמרא לר' אליעזר מטוך; תוספותיו בפני עצמם נתפרסמו פחות, אולי עקב שיטתם הייחודית.
עוד חיבר הריצב"א ספר העוסק בהלכות סדר ליל פסח, ואף נודע שו"ת ממנו.
דברים משמו מובאים גם בספרי בעלי התוספות על התורה, ואחרים, ולכן משערים כי חיבר גם פירוש על התורה.
גם חיבר את "לוח ס"א ראשים" - לוח בן 61 שורות, המאפשר לדעת את קביעות 19 שנים רצופות (מחזור מטוני) בלוח העברי, באמצעות חישוב מולד אחד בלבד.
דבריו מובאים פעמים רבות בתוספות על כל הש"ס, בעיקר בתוספות טוך (או גיליון תוספות), ופסקיו מובאים בכל ספרות הפסקים התורנית וכבר אצל גדולי הראשונים, כראבי"ה, האור זרוע, הסמ"ג, הגהות מיימוניות, הרא"ש, המרדכי ועוד.
אף על פי שאחר פטירת ר"י הזקן הלכו בדרכו רוב חכמי צרפת, ובראשם הר"ש משאנץ, ועיקר עסקם היה לפלפל בדבריו – שונה מכלל זה היה הריצב"א, אשר פעמים מרובות חלק על דברי רבו וחידש שיטות חדשות המנוגדות להם, ובדרכו זו הלכו אף חלק מחכמי איוורא שהיו תלמידיו.
ריצוף בשיטת Ion היא שיטה לריצוף DNA המבוססת על זיהוי יוני מימן (פרוטונים) שמשתחררים בזמן פולימריזציית DNA.
אל מיקרו-בְּאֵרִיּוֹת, המכילות את גדיל המקור של ה-DNA שאותו מעוניינים לרצף, מוזרמים לסירוגין בסיסי DNA – דאוקסיריבונוקלאוטיד פוספט, סוג אחד של בסיס בכל מחזור פעולה.
אם הבסיס שהוזרם משלים לבסיס הפנוי הבא בגדיל המקור, הוא מצורף אל הגדיל המשלים ההולך ונבנה, תוך כדי פליטת יון מימן, המאותת לחיישן יונים וזה מזהה כי התגובה התרחשה.
אם ישנן חזרות ברצף המקור, מספר בסיסים מצורפים במחזור אחד.
התרחשות זו גוררת אחריה פליטת יוני מימן בהתאם וכן עלייה פרופורציונית בעוצמת האיתות החשמלי.
שיטה זו נבדלת משאר שיטות הריצוף בכך שאינה מצריכה נוקלאוטידים מיוחדים או שימוש באופטיקה.
שיטת ריצוף Ion מכונה גם בשמות: ריצוף Ion Torrent, ריצוף באמצעות pH, ריצוף סיליקוני או ריצוף באמצעות מוליכים למחצה (מל"מ).
הטכנולוגיה נרשמה על ידי DNA Electronicd Ltd, פותחה על ידי Ion Torrent Systems Inc ושוחררה בפברואר 2010. Ion Torrent מיתגה את המוצר שלה כמכונת ריצוף מהירה, קומפקטית וחסכונית, שיכולה לשמש מעבדות רבות.
Roshe's 454 Life Sciences משתפת פעולה עם DNA Electronics במאמצים לפתח על בסיס שיטה זו פלטפורמת ריצוף בעלת צפיפות גבוהה (המאפשרת מספר רב יותר של קריאות במקביל) ויכולת לקרוא מקטעים ארוכים.
בטבע, הוספת בסיס של חומצת גרעין לקצהו של גדיל DNA שהולך ונבנה (על גבי גדיל קיים ובהשלמה לו) גורמת ליצירת קשר קוולנטי ולשחרור יון מימן טעון חיובית ויון פירופוספט טעון שלילית.
הבסיס מתווסף אך ורק אם הוא משלים לבסיס הפנוי הבא בגדיל הקיים.
שיטת הריצוף Ion מזהה האם נפלט יון מימן בעקבות הזרמת סוג אחד של בסיס לתוך התגובה.
אל תוך מיקרו-בְּאֵרִיּוֹת, המכילות עותקים רבים של מולקולת DNA חד-גדילית אחת שאותה מעוניינים לרצף, וכן DNA פולימראז, מוזרמים לסירוגין בסיסי חומצת גרעין A, C, G או T.
אם הבסיס שהוזרם הוא הבסיס המשלים לבסיס הפנוי הבא בגדיל המקור, הוא מתווסף לקצהו של הגדיל שהולך ונבנה, על ידי DNA פולימראז.
אם הבסיס אינו משלים – אין הוספה ואין תגובה ביוכימית.
יון המימן המשוחרר משנה את ה-pH של התמיסה, והדבר מזוהה על ידי חיישן יונים.
בסיסים שלא חוברו לגדיל נשטפים לפני מחזור הפעולה הבא, שבו יוזרמו בסיסים מסוג שונה.
מתחת לשכבה של מיקרו-בְּאֵרִיּוֹת ממוקמת שכבה שרגישה ליונים, ותחתיה חיישן יונים.
כל השכבות מאוגדות בתוך שבב CMOS, כזה שמשתמשים בו בתעשיית האלקטרוניקה.
כל שבב מכיל מערך של מיקרו-באריות עם חיישני יונים תואמים.
כל יון מימן המשוחרר בעת תגובה מגרה את חיישן היונים.
סדרת האותות החשמליים שמועברת מהצ'יפ למחשב מתורגמת לרצף DNA, ללא צורך בעיבוד ביניים של האותות לפני העברתם למחשב.
מכיוון שאירועים של הרכבת נוקלאוטיד על גבי גדיל המקור נמדדים ישירות באמצעות האלקטרוניקה, השיטה נמנעת מלהשתמש בנוקלאוטידים מסומנים ובמדידות אופטיות.
עיבוד האות וחישוב הרצף המתקבל מתבצעים לאחר מכן על ידי תוכנה.
מידת הדיוק שעובדי חברת Ion Torrent הצליחו להשיג באמצעות מכונת ריצוף מסוג Ion Torrent Ion semiconductor בפברואר 2011, הייתה 99.6% לבסיס – חישוב המבוסס על קריאות באורך 50 בסיסים, עם 100 מגה בסיסים להרצה.
מידת הדיוק בריצוף הומופולימר (פולימר המורכב מחזרות של אותה יחידה בסיסית) באורך של 5 חזרות עמדה על 98%.
גרסאות מאוחרות יותר מציגות קריאות מקטעים באורך 400 בסיסים.
המספרים הללו טרם אומתו על ידי גורמים בלתי תלויים מחוץ לחברה.
היתרונות העיקריים של ריצוף בשיטת Ion הם מהירות הריצוף הגבוהה, והעלויות הנמוכות של המכשור והתפעול.
העלויות הנמוכות מתאפשרות בזכות ההימנעות משימוש בנוקלאוטידים מסומנים ובמדידות אופטיות.
מכיוון שהמערכת מקבלת אותות מאירועי צירוף של נוקלאוטידים באמצעות DNA פולימראז המתרחשים בזמן אמת, גם הריצוף יכול להתבצע בזמן אמת.
בפועל תדירות הריצוף מוגבלת על ידי מהירות מיחזור הנוקלאוטידים במערכת.
מפתחת השיטה Ion Torrent Systems Inc טוענת כי מדידת כל אירוע ריצוף מצריכה 4 שניות וכל הרצה לוקחת כשעה, שבמהלכה מרוצפים 100–200 נוקלאוטידים.
אם שבבי המל"מ ישתפרו (כפי שחוזה חוק מור), מספר הקריאות לרכיב (ולפיכך להרצה) אמור לעלות.
המחיר לצרכן של מכונת ריצוף בשיטה זו בזמן יציאתה לשוק הוערך בכ-50,000 דולר, לא כולל ציוד להכנת הדגימה ושרת לעיבוד מידע.
העלות להרצה גם היא נמוכה משמעותית מזו של שיטות ריצוף אוטומטיות אחרות, וההפרש מוערך בכ-1,000 דולר.
אם בגדיל המקור (הגדיל המרוצף) מופיעות חזרות של אותו הנוקלאוטיד (כגון GGGGG), אז יותר נוקלאוטידים מהתמיסה מצורפים לגדיל המסונטז ויותר יוני מימן נפלטים במהלך אותו מחזור פעולה.
הדבר גורם לשינוי גדול יותר ב-pH ולעלייה פרופורציונית בעוצמת האות.
עלייה זו איננה ליניארית ולכן קשה לבצע קריאה מדויקת של חזרות ארוכות.
מגבלה זו קיימת גם בשיטות אחרות שמזהות הוספה של נוקלאוטיד בודד, כגון שיטת ה-pyrosequencing.
קשה להבחין בין אות שנובע ממספר רב של חזרות של אותו נוקלאוטיד ובין אות שנובע ממספר דומה אבל אחר של חזרות; לדוגמה, קשה להבחין בין 7 ל-8 מופעים של אותו הבסיס.
מגבלה אחרת של השיטה היא אורך קריאה קצר יותר לעומת שיטות אחרות, כמו ריצוף בשיטת Sanger או pyrosequencing.
היכולת לקרוא מקטעים ארוכים מהווה יתרון בהרכבת גנום מחדש (שלא מול גנום היחוס).
שיטת ריצוף Ion מפיקה בממוצע כ-400 נוקלאוטידים לקריאה.
נכון לעכשיו תפוקתה של השיטה נמוכה מזו של שיטות ריצוף אחרות בעלות תפוקה גבוהה, אך המפתחים מקווים לשנות זאת על ידי העלאת צפיפות השבב.
מפתחי שיטת הריצוף Ion מיתגו אותה כשיטת ריצוף מהירה, חסכונית וקומפקטית, שיכולה להיות בשימוש רחב במעבדות.
החברה מקווה כי המערכת אותה פיתחה תוציא את מלאכת הריצוף מידיהם של המרכזים הייעודיים ותעביר אותה להישג ידם של בתי חולים ומעבדות קטנות יותר.
בינואר 2011 פורסמה בעיתון New York Times כתבה "ריצוף DNA – לנחלת הכלל", שמדגישה שאיפות אלו.
מכיוון שהשיטות המתחרות לריצוף DNA מגיעות לאורך קריאה גבוה יותר (ולפיכך מתאימות יותר לריצוף הגנום השלם), הטכנולוגיה הזו יכולה להתאים במיוחד לשימוש בקנה מידה קטן, כמו ריצוף גנומים של מיקרואורגניזמים, ריצוף תוצרי תעתוק של מיקרואורגניזמים, ריצוף אמפליקונים, או לצורך בקרת איכות של ספריות גנומיות שנבנו בשיטות אחרות.
ריצ'רד ארל תומאס הוא שחקן אמריקאי.
תפקידו הידוע ביותר הוא בדמות ג'ון-בוי וולטון בסדרת הדרמה "משפחת וולטון" של רשת CBS.
על הופעתו בסדרה זכה תומאס בפרס אמי, והיה מועמד לפרס אמי נוסף ולשני פרסי גלובוס הזהב.
מ-2013 עד 2016 כיכב תומאס בסדרה "האמריקאים" של רשת הכבלים FX.
תומאס נולד ב-1951 במנהטן, בנם של ברברה וריצ'רד ס.
הוריו היו רקדנים בניו יורק סיטי בלט ובבעלותם היה בית ספר לבלט בניו יורק.
תומאס למד בבית הספר אלן סטיבנסון ובבית הספר מקבורני במנהטן.
ב-1958 בגיל שבע הופיע לראשונה בברודוויי במחזה "Sunrise at Campobello" וגילם את ג'ון רוזוולט, בנו של הנשיא לעתיד פרנקלין דלאנו רוזוולט.
הקריירה הטלוויזיונית של תומאס החלה ב-1959 בהפקה של "בית הבובות" מאת הנריק איבסן בכיכובם של ג'ולי האריס, כריסטופר פלאמר ויום קרונין.
הוא התחיל להופיע בטלוויזיה בשעות היום באופרות סבון כגון "The Edge of Night" בתפקיד בן שולץ ב-1961, ובסדרה "כשהעולם מסתובב" בדמות טום יוז בשנים 1966 ו-1967, ששודרה מעיר הולדתו מנהטן.
התפקידים החשובים הראשונים של תומאס בקולנוע היו ב-1969 בסרט "ניצחון" בכיכובו של פול ניומן על אודות מרוצי מכוניות, ובסרט "קיץ אחרון" גם מ-1969, יחד עם ברוס דוויסון וברברה הרשי.
ב-1971 כיכב תומאס בסרט "Red Sky at Morning" שנכשל מבחינה מסחרית.
תומאס זכה להכרה ברחבי המדינה כשגילם את ג'ון-בוי וולטון בסדרת הדרמה משנות השבעים של המאה העשרים "משפחת וולטון", שהייתה מבוססת על חייו של כותב הסדרה ארל האמר ג'וניור.
באותה שנה נרשם תומאס לקולומביה קולג' אבל עזב אחרי שנה אחת.
ב-1972 שיחק תומאס בתפקיד המנוגד לתדמית שלו בדמות רוצח ואנס בשם קנת' קינסולבינג במותחן האימה "You'll Like My Mother" לצדה של פטי דיוק.
ב-1974 הופיע בסרט הטלוויזיה "The Red Badge of Courage" בתפקיד הטוראי הנרי פלמינג, וב-1979 שיחק בתפקיד פול באומר בסרט הטלוויזיה "במערב אין כל חדש".
ב-1980 חזר תומאס להופיע בברודוויי אחרי 12 שנים כשחקן מחליף במחזה "Fifth of July" מאת לנפורד וילסון.
ב-1987 הופיע על הבמות בפילדלפיה ובוושינגטון בהצגת יחיד "Citizen Tom Paine".
ב-1993 שיחק בתפקיד הראשי בהפקה בימתית של המחזה "ריצ'רד השני".
ב-1981 יצא לאור ספר שירים שכתב תומאס בשם "Glass".
הספר יצא לאור במהדורה מוגבלת בהוצאת "Kenward Elmslie's Z Press".
ב-1990 שיחק תומאס בעיבוד הטלוויזיוני של הספר "זה" מאת סטיבן קינג בדמות ביל המבוגר.
ב-1995 כיכב תומאס יחד עם מורין או'הרה ואנט אוטול בסרט "The Christmas Box" של ערוץ הולמרק.
אוטול ותומאס הופיעו יחד בסרט "זה" חמש שנים לפני כן בתפקידי בוורלי מארש וביל דנברו.
ב-1997 וב-1998 הופיע תומאס בסדרת הדרמה "מגע של מלאכים".
בתחילת שנות האלפיים הופיע תומאס במחזה "אמנות" מאת יסמינה רזה יחד עם ג'אד הירש (2001); בהפקה של תיאטרון פאבליק בניו יורק של המחזה "כטוב בעיניכם" (2005); במחזה "Democracy on Broadway" מאת מייקל פריין (2004); ובמחזה "The Stendhal Syndrome" מאת טרנס מקנלי (2004).
ב-2006 החל תומאס לשחק בסיבוב הופעות לאומי במחזה "שנים עשר המושבעים" בעיבודו של רג'ינלד רוז, יחד עם ג'ורג' ונדט בתיאטרון שוברט בניו הייבן קונטיקט, בתפקיד מושבע מספר שמונה.
תומאס סיפק את קולו בפרסומות עבור חברות מרצדס-בנץ, BB&T, ו-Aleve.
בקיץ 2008 השתתף תומאס בפרסומות עבור רשת המסעדות Zaxby's.
בשנים 2009 ו-2010 שיחק תומאס בברודוויי במחזה "Race" מאת דייוויד מאמט.
את ההצגה ביים מאמט ובין המשתתפים היו ג'יימס ספיידר, דייוויד אלן גריר וקרי וושינגטון.
בפברואר ובמרץ 2011 כיכב תומאס במחזה "טימון איש אתונה" בתיאטרון ניו יורק פאבליק.
תומאס משחק בתפקיד משנה בסדרת הדרמה "האמריקאים" של רשת FX שעלתה לשידור בינואר 2013. הוא מגלם את דמותו של פרנק גאד מה-FBI החוקר את הסוכנים הרדומים של ה-KGB בתחילת שנות השמונים בארצות הברית.
ב-14 בפברואר 1975 התחתן תומאס עם אלמה גונזלס.
לבני הזוג נולד בן אחד, ריצ'רד פרנסיסקו יליד 1976, ושלישיית בנות, ברברה איילה, גווינית' גונזלס ופילאר אלמה, שנולדו ב-26 באוגוסט 1981. בני הזוג התגרשו ב-1993.
ב-20 בנובמבר 1994 התחתן תומאס עם ג'ורג'ינה בישוף.
ב-28 ביולי 1996 נולד בנם המשותף, מונטנה ג'יימס תומאס.
לפני נישואיה לתומאס היו לבישוף שתי בנות מנישואים קודמים.
שנה שם שם באנגלית תפקיד הערות 1959 בית הבובות A Doll's House איבור סרט טלוויזיה 1961 The Defenders ג'וני רמינגטון בפרק "The Boy Between" 1961 Great Ghost Tales קונרדין בפרק "Srendhi Vashtar" 1961 Way Out ג'רמי קילר בפרק "The Croaker" 1961 1, 2, 3 Go!
הכומר בובי ג'ו סרט טלוויזיה 1990 Andre's Mother קאל פורטר 1990 Common Ground קולין דייבר סרט טלוויזיה 1990 אגדות מעולם המסתורין Tales from the Crypt ד"ר טראסק בפרק "Mute Witness to Murder" 1990 It ביל דנברו מיני-סדרה 1991 Mission of the Shark: The Saga of the U.S.S.
ריצוף ברמת התא הבודד בוחן את רצף הנוקלאוטידים מתאים בודדים תוך שימוש בטכנולוגיות ריצוף הדור הבא (NGS,
Next Generation Sequencing), טכנולוגיות המאפשרות הבחנה בדקויות ההבדלים בין תאים בודדים שונים בתוך רקמה ולאפיין תתי אוכלוסיות פונקציונליות של תאים המאפשרת הבנה טובה יותר של התפקוד של תא בודד בהקשר של מיקרו-סביבה שלה.
התא הוא היחידה הבסיסית של החיים.
החומר התורשתי בתא האנושי נמצא בגרעין וארוז ב-דנ"א ומורכב מכ-3.3 מיליארד זוגות של בסיסים - נוקלאוטידים ומ-600 מיליון בסיסים של mRNA.
לפי הדוגמה המרכזית של הביולוגיה המולקולרית המידע התורשתי משועתק מדנ"א לרנ"א ואז מתורגם לחלבון.
כמויות אלו של נוקלאוטידים יקרות לריצוף בשיטות הישנות של ריצוף סנגר.
שיטות NGS (ריצוף הדור הבא) משמשות לריצוף ברמת התא הבודד ומורכבות מהשלבים הבאים:
שבירת הרקמה הביולוגית לתאים בודדים
שבירת התא ומיצוי החומר הביולוגי (דנ"א או רנ"א לפי הצורך).
הכנת ספרייה - הכנסת מקטעים ברצפים ידועים לצורך זיהוי
בניתוח ברמת התא הבודד כמויות החומר הביולוגי ההתחלתי מכל תא הן בסדרי גודל של פיקוגרמים ולכן נדרשת הגברה גבוהה מה שגורם לרעש גדול בתוצאות.
ניתוח ברמת התא הבודד מאפשר ללמוד על ההטרוגניות של רקמה ביולוגית ועל תתי האוכלוסיות המרכיבות רקמה הנראית מבחוץ כאחידה וכן לזהות תתי אוכלוסיות כולל תתי אוכלוסיות נדירות כאוכלוסיית תאי אב סרטניים.
ניתן ללמוד על תפקודים תאיים בהרחבה.
ריצוף ברמת התא הבודד התפתח לאחרונה בשל מספר חידושים והוא מאפשר לחקור בעיות כגון: הטרוגניות של רקמות, אוכלוסיות נדירות של תאים, קשר בין אוכלוסיות של תאים ורקמות מוזאיקה.
ריצוף ברמת התא הבודד נבחר על ידי קבוצת Nature לשיטה הנבחרת לשנת 2013.
ריצוף דנ"א ברמת תא בודד
ריצוף ברמת התא הבודד מערב הפרדה לתאים בודדים, ביצוע הגברה לכל הגנום (WGA), בניית ספריות לריצוף המתאימות לטכנולוגיית הריצוף שבשימוש ולבסוף ריצוף הספרייה שנתקבלה במערכות ריצוף הדור הבא NGS (למשל מתוצרת אילומינה או איון-טורנט).
ניתן להשתמש בריצוף ברמת התא הבודד במחקרי מטהגנומיקה (Metagenomics) ובריצוף אורגניזמים חדשים.
ניתן לשלב ריצוף ברמת התא הבודד עם שיטות למיון תאים בתפוקה גבוהה של מיקרואורגניזמים ושל סרטן.
בריצוף ברמת התא הבודד נפוצה שיטת הגברה שאינה PCR הנקראת הגברה בריבוי העתקות (Multiple Displacement Amplification), אשר מאפשרת מחקר בגנטיקה של חיידקים, אקולוגיה ומחלות מידבקות.
נוסף לכך, מידע שהופק ממיקרואורגניזמים יכול לבסס תהליך של גידולם בתרבית בעתיד.
כמה כלים שיכולים לשמש עבור ריצוף גנום ברמת תא בודד כוללים: SPAdes, IDBA-UD, ואת Cortex ו-HyDA.
הגברה בשיטת ריבוי העתקות (Multiple displacement amplification) מאפשרת הגברה של חומר גנטי מרמות של פמטו-גרמים בודדים למיקרוגרמים לצורך שימוש בתהליכי ריצוף.
החומרים הנדרשים לביצוע הריאקציה הזו הם פריימרים אקראיים ואנזים DNA פולימראז המופק מבקטריופאג' phi29. בשונה מריאקציית PCR להגברה, הריאקצית MDS מתרחשת בטמפרטורה קבועה של 30 מעלות.
כשהפולימראז מבצע העתקה של גדיל התבנית ומייצר גדיל חדש, נוצרים מספר עותקים כאשר העותקים שנוצרו במחזור הקודם מוצאים החוצה מהתבנית.
התוצרים של ריאקציית MDS הן באורך של כ-12 אלף נוקליאוטידים ויכולים להגיע לאורך של 100 אלף כך שיוכלו לשמש בריצוף דנ"א.
שיטות אחרות המשמשות להגברה MALBAC.
לשיטת MDA יש הטיות בתהליך ההגברה בהשוואה לשיטת PCR הכוללות ייצוג-יתר או ייצוג חסר של חלקים מגדיל התבנית.
כתוצאה מכך רצפים מסוימים אובדים ואותה הטיה נגררת למחזורי ההגברה הבאים.
שתי שיטות להתגבר על ההטיות הן איגום של ריאקציות תא-בודד השייכות לתאים מאותו הסוג ואיגום לפני ביצוע הריאקציה.
השיטות הנפוצות לזיהוי תאים מאותו סוג כוללות FISH ו-conformation characteristics.
רב צורניות של נוקלאוטיד בודד, סניפ SNPs, המהווה חלק משמעותי מהשונות הגנטית בגנום האנושי ושונות במספר העותקים CNV מהווים בעיה בריצוף ברמת התא הבודד.
כך גם הכמות המזערית של חומר גנטי הנמצאת בתא בודד.
לכן למרות ההגברה קשה לנתח באופן מדויק את כמויות הדנ"א מתא בודד משום שהכיסוי נמוך ורגיש לשגיאות.
להגברה בשיטת ריבוי העתקות MDS הכיסוי הממוצע לגנום הוא 80% וסניפים שאינם מכוסים על ידי קריאות ייעלמו.
בנוסף, בשיטה זו יש אחוז גבוה של השמטת אללים כלומר היעדר זיהוי של אללים מדוגמאות הטרוזיגוטיות.
מספר אלגוריתמים לזיהוי סניפים נמצאים בשימוש אך אף אחד מהם אינו ספציפי לריצוף ברמת התא הבודד.
בהגברה בשיטת ריבוי העתקות והשוניות במספר העותקים CNV קיימת בעיה של זיהוי שגוי של CNVs, ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות אלגוריתמים לזיהוי והורדת ה"רעש" והפקה נכונה של variants.
המיקרוביוטה היא מטרה עיקרית של ריצוף בתא בודד בשל הקושי לגדל את הדוגמאות בתרבית.
ריצוף ברמת התא הבודד היא אחת הדרכים לזיהוי של המיקרוביוטה והגנום שלה.
המיקרואורגניזם הראשון שהיה בשימוש בטכנולוגיות ריצוף תא בודד היה החיידק.
לכשיושלם תהליך המחקר ואיסוף הנתונים של אורגניזמים אלו יתגלו תפקידים חדשים אשר ישליכו על בריאות האדם.
ריצוף סרטן הוא אחד היישומים המתפתחים של ריצוף ברמת התא הבודד.
ניתוח וקטגוריזציה של רקמת גידול סרטנית ברמת, מציאת ארגון מחדש של קטעי דנ"א, שונות ברמת נוקלאוטיד בודד SNV, וריצוף גנום מלא ברמת תא בודד.
ריצוף ברמת תא בודד של ה-Methylome
ריצוף ברמת התא הבודד לכימות המתילציה של הדנ"א.
השיטה דומה לריצוף דנ"א ברמת התא הבודד עם תוספת טיפול בביסולפיט לפני הריצוף.
ריצוף רנ"א ברמת התא הבודד scRNA-seq
השיטות הנוכחיות לכימות המצב המולקולארי של התאים (פרופיל ביטוי הגנים דרך ריכוזי רנ"א-שליח) בין אם במערך-דנ"א (microarray) או RNA-seq מבצעות מיצוע של הסיגנאל על פני אלפי או מיליוני תאים.
בהינתן השונות של אוכלוסיית תאים, שיטות אלו מתעלמות מאינטראקציות בין תאים ומהשונות באוכלוסייה ההכרחית לשמירת תפקוד תקין של הרקמה ולהתפתחות של מחלות.
לכן, מיצוע של תאים מספק מידע חלקי בלבד על המצב המולקולארי של המערכת.
ריצוף רנ"א ברמת התא הבודד מספק פרופיל ביטוי גנים של תאים בודדים.
ניתן לזהות אוכלוסיות נדירות של סוגי תאים באמצעות ניתוח אשכולות ובכך לאפשר אפיון וזיהוי תתי-אוכלוסיות בתוך אוכלוסייה הטרוגנית.
שונות באוכלוסייה של תאים סרטניים ניתן לייחס למוטציות נרכשות אך גם תאים הזהים גנטית ובאותה סביבה מראים שונות בפרופיל התבטאות הגנים והחלבונים שלהם.
בנוסף, רנ"א במספר עותקים נמוך אשר יכול להפעיל פונקציות חשובות בתא הוא בדרך כלל קשה לאיתור או נחשב לרעש בשיטות המסורתיות למיצוע מספר תאים.
ריצוף ברמת התא הבודד של מספר תאים רב יכול לזהות רנ"א לא-נפוץ שכזה ולגלות את הפיזור במספר העותקים באוכלוסייה.
הידע לגבי צורת התפלגות הביטוי יכול לשמש להבנת מנגנוני בקרת השעתוק לדוגמה בשיטות של Perturb-seq.
למרות ההתקדמות בטכנולוגיות הריצוף, עדיין לא ניתן לרצף רנ"א באופן ישיר מתאים בודדים.
לכן בפרוטוקולי scRNA-seq הקיימים נדרש להמיר את רנ"א ל-דנ"א-משלים (cDNA) לצורכי ריצוף.
השיטות הקיימות ל-scRNA-seq כוללות את השלבים הבאים: הפרדה של הרקמה לתאים בודדים ומיצוי רנ"א מכל תא, שיעתוק-הפוך (reverse transcription), הגברה, הכנת ספרייה וריצוף.
באופן מושלם, scRNA-seq אמור לשמר ולכמת את השכיחות היחסית של מולקולות רנ"א-שליח בתא, מכסה באופן מלא לכל אורך התעתיק ובייצוג שווה לכל נקודה ושומר על מידע לגבי הגדיל.
למרות זאת, בשלבים של scRNA-seq נכנסים מספר הטיות ורעשים.