tomron87/hebrew-wikipedia-sentences-corpus huggingface dataset:
כיום, חברות רבות ברחבי העולם מייצרות את המיקרופור; בישראל אין חברה המיצרת מיקרופור והכל מיובא מִחוץ לארץ.
שם המוצר באנגלית הוא: Microporous surgical tape (תרגום מילולי: סרט מיקרופור כירורגי) ומכאן בקיצור: surgical tape.
וכן ידוע בשם medical tape (סרט הדבקה רפואי).
לעומת זאת, בישראל עדיין לא התגבש למוצר זה שם מדויק, ורבים קוראים לו בקיצור על שם תכונתו: "מיקרופור".
אך עדיין שכיח שמשתמשים כלפיו בשמות: נייר דבק רפואי; גליל פלסטר; גליל פלסטר בד; נייר מיקרופור; פלסטר מיקרופור; ועוד.
צוותים רפואיים קוראים לו בטעות לויקופלסט אך בטפסים הרשמיים של מד"א ומשרד הבריאות, הוא נקרא "מיקרופור".
מיקרופיברילות - מיקרופיברילות צלולוז, מהוות את האלמנט המבני הבסיסי של דופן התא הצמחי.
צלולוז הוא המרכיב השכיח ביותר (מהווה בין 15-30% ממסת החומר היבש בדופן הראשונית של הצמח).
הצלולוז הוא פולימר של D-glucose (בטא- 1,4).
קשר בטא יוצר זווית של 180 מעלות בין טבעות הגלוקוז, וכתוצאה מכך, נוצרות שרשראות ישרות, המתאימות ליצירת מבנים חוטיים ארוכים- מיקרופיברילות.
המיקרופיברילות מהוות חוטים יציבים מאוד.
צבר מיקרופיברילות יוצר מאקרופיברילה, שכאשר שזורה כאריג, מהווה את ה"שלד" של דופן התא הצמחי.
בתא צמחי צעיר, סידור המיקרופיברילות גמיש ומאפשר לתא לגדול ולהתפתח.
לעומת זאת, בתא בוגר אשר לא צריך לעבור עוד שינויים מסודרות המיקרופיברילות כמבנה מאורגן, אחיד וקשיח.
המיקרופיברילות תופחות במגע עם מים.
כיוון התפיחה ניצב לציר האורך של המיקרופיברילה.
במיקרופיברילה אזורים גבישיים צפופים המכונים מיצלות, ואזורים בלתי גבישיים.
ביולוגיה של התא: מולקולה, אברון ותא - אלי זמסקי, 2002.
מיקרוסטלייט הוא אזור גנומי המורכב מחזרות רבות של רצף קצר בן 2–6 נוקלאוטידים.
המיקרוסטלייטים משמשים כמרקרים גנטיים הודות לגיוון הרב הקיים בהם באוכלוסייה.
הגיוון הזה נובע ממספר החזרות המשתנה של המיקרוסטלייטים באנשים שונים.
דוגמה נפוצה למיקרוסטלייט היא (CA(n כש-n הוא מספר הפעמים שהרצף CA חוזר על עצמו והוא משתנה באללים שונים.
מספר הנוקלאוטידים של הרצף החוזרני הוא לרוב 1 עד 4, אם כי גם 5 ו-6 קיימים ומספר הפעמים שהרצף חוזר על עצמו נע בין 3 ל-100 חזרות.
החזרה CA נפוצה מאוד אצל בני אדם וביצורים אחרים והיא מופיעה כל כמה אלפי בסיסים.
הסיבה לפולימורפיזם הרב במיקרוסטלייטים היא הקצב הגבוה של אירועי המוטציות (שינויים ב-DNA) באזורים אלו, שנובע מהנטייה של רצפים מסוג זה ליצור לולאה בזמן הכפלתם, המובילה לאירוע של הַחְדׇּרׇה (insertion – הוספת נוקלאוטיד או מספר נוקלאוטידים אל תוך רצף DNA קיים).
מיקרוסטלייט יכול לעבור הגברה בתגובת PCR על ידי שימוש ברצפים הצדדיים של המיקרוסטלייט כתחלים.
תהליך זה יכול ליצור מספיק DNA כדי לראותו לאחר הרצה בג'ל אלקטרופורזה וצביעתו בעזרת צבען DNA כגון אתידיום ברומיד.
הודות לכך פותחה שיטת אבחון גנטי המשתמשת במיקרוסטלייטים כדי להבדיל בין פרטים שונים מאותו המין, תוך השוואת דגימות הDNA שלהם.
הפללת חשוד על פי דגימת דם, שיער, רוק, זרע שנמצאו בזירת האירוע.
לאחר הרצה בג'ל מתקבלים 2 בנדים (פסים של DNA באורך מסוים המתקבלים לאחר הרצתו בג'ל) עבור כל אדם (לכל כרומוזום 2 עותקים – אחד מהאם ואחד מהאב ולכן מתקבלים 2 בנדים בסוף הבדיקה).
על ידי השוואת תוצרי ההרצה בג'ל של בדיקה זו ניתן לאמת או להפריך קשר בין 2 דגימות, למשל – מציאת התאמה בין DNA של חשוד בפשע ובין DNA שנמצא בזירת הפשע: אם 2 הבנדים של ה-DNA מזירת הפשע ושל החשוד יוצאים זהים – יש התאמה.
על אף שהסיכוי שלשני אנשים זרים יהיו אללים זהים במיקרוסטלייט מסוים הוא מאוד נמוך, כדי לצמצם את האפשרות הזו למינימום האפשרי מבצעים את הבדיקה על מספר מיקרוסטלייטים במקביל.
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר (Transmission Electron Microscope, TEM) הוא מיקרוסקופ המבוסס על קרן אלקטרונים החודרת דרך דגמים דקים מאוד.
המיקרוסקופ שייך למשפחת מיקרוסקופי האלקטרונים.
קרן האלקטרונים החודרת את הדגם עוברת אינטראקציות שונות בעודה עוברת דרכו.
ניתן למקד את קרני האלקטרונים שעברו דרך הדגם, להגדיל את הדמות המתקבלת ולהקרין אותה על אמצעי דימות, כגון מסך פלורסצנטי, סרט צילום, או חיישן כגון CCD או CMOS.
צילום מרובה מזוויות שונות מאפשר להגיע לתמונה תלת־ממדית.
לצורך שיפור תמונה זו משתמשים במשפט ההיטל המרכזי.
מיקרוסקופ אלקטרונים חודר מסוגל להגיע לרזולוציה גבוהה משמעותית ביחס למיקרוסקופ אור (מיקרוסקופ אופטי), וזאת בזכות אורך גל דה ברויי של אלקטרונים בעלי אנרגיה גבוהה.
במיקרוסקופ אלקטרונים חודר משתמשים לרוב באלקטרונים בעלי אנרגיה של עשרות עד מאות קילו אלקטרון וולט.
עובדה זו מאפשרת למיקרוסקופ האלקטרונים החודר להגיע לרזולוציה אטומית, בערך פי אלף יותר מאשר הרזולוציה הגבוהה ביותר המתאפשרת במיקרוסקופ אופטי.
למיקרוסקופ האלקטרונים החודר תרומה מכרעת בתחומים שונים של מדע ושל טכנולוגיה, ובהם חקר הסרטן, וירולוגיה מדע והנדסה של חומרים, מוליכים למחצה, מטלורגיה וננוטכנולוגיה.
הקונטרסט המתקבל בתמונה של מיקרוסקופ אלקטרונים חודר יכול לנבוע מכמה סוגים שונים של אינטראקציות בין האלקטרונים לבין הדגם הדק.
לעיתים קרובות פועל יותר ממנגנון אינטראקציה אחד בו-זמנית.
סוגי הקונטרסט העיקריים הם קונטרסט עובי-מסה הנובע מבליעה של אלקטרונים בחומר, קונטרסט דיפרקציה הנובע מעקיפה (דיפרקציה) של אלקטרונים בסריג וקונטרסט פאזה.
בנוסף, קיימת אפשרות לאסוף אותות נוספים הנוצרים בזמן שקרני האלקטרונים עוברים דרך החומר ולקבל שפע רב של מידע על הפיזיקה והכימיה שבדגם.
שיטות פופולריות הן ספקטרוסקופיה של דיספרסיית קרני X (המכונה גם EDX, EDS או EDAX), וספקטרוסקופיה של אובדן אנרגיית אלקטרונים (EELS).
שיטות הדימות במיקרוסקופ האלקטרונים החודר עושות שימוש במידע שמכילים גלי האלקטרונים היוצאים מהדגם על מנת ליצור תמונה.
האופטיקה שנמצאת אחרי הדגם מאפשרת למקם את גלי האלקטרונים היוצאים מהדגם אל-תוך מערכת הצפייה.
ניתן לקרב את התפלגות העוצמה של הדמות, המסומנת באות I, באמצעות ממוצע בזמן של האמפליטודה של פונקציות הגל של האלקטרונים, כאשר פונקציית הגל של האלקטרונים היוצאים מהדגם מסומנת באות :
כאשר k הוא אורך הגל ו-x הוא וקטור המקום.
מהמשוואה לעיל ניתן להסיק שהדמות המתקבלת אינה תלויה רק באמפליטודה של הדגם, אלא גם בפאזה של פונקציית הגל של האלקטרונים.
עבור דגמים מספיק דקים ואלקטרונים מספיק אנרגטיים, בליעת האלקטרונים בדגם קטנה מספיק כך שהשינויים באמפליטודה של האלקטרונים אינם גדולים.
במצב כזה, ההשפעה של הדגם על הפאזה של גלי האלקטרונים יכולה להיות משמעותית יותר מהשפעתו על האמפליטודה, ומצב כזה נקרא מנגנון קונטרסט פאזה.
ניגודיות, או קונטרסט, היא הבסיס לדימות באמצעות מיקרוסקופ.
מנגנוני הקונטרסט במיקרוסקופ האלקטרונים החודר מורכבים ומגוונים ביחס למיקרוסקופ אלקטרונים סורק, ומורכבים משמעותית ביחס למיקרוסקופ אור.
האפשרות לשנות את אורך המוקד בעדשות האלקטרומגנטיות של מיקרוסקופ האלקטרונים מעניקה גמישות המאפשרת לעבור בין מנגנוני קונטרסט שונים.
תכונה זו של מיקרוסקופ האלקטרונים החודר מאפשרת קבלה של מידע רב מאותו דגם, כמו למשל שינויים במבנה ובכיווניוּת הגבישית, שינויים בצפיפות ובעובי הדגם, וכדומה.
קונטרסט עובי מסה-מבוסס על שינוי באמפליטודת פונקציית הגל של האלקטרונים בגלל בליעה בדגם, לפי חוק Beer-Lambert.
לפי חוק זה, דעיכה של גלים בתוך תווך תלויה אקספוננציאלית בעובי התווך ובצפיפותו.
כלומר, אזורים צפופים יותר בדגם יבלעו יותר אלקטרונים - בליעה שמתבטאת בדעיכה חזקה יותר של האמפליטודה של פונקציית הגל ביחס לאזורים צפופים פחות.
בתמונת הדמות האזורים שבולעים יותר אלקטרונים באופן יחסי יהיו כהים יותר ביחס לאלה שבולעים פחות.
באותו אופן אזורים עבים יותר בדגם, יבלעו יותר אלקטרונים בהשוואה לאזורים דקים יותר - גם אם הם בעלי אותה צפיפות.
הבדלי קונטרסט הנובעים מהבדלי עובי נפוצים מעט פחות, ולרוב הם מלמדים על חוסר אחידות בהכנת הדגם.
מנגנון קונטרסט עובי-מסה הוא המנגנון הפשוט והאינטואיטיבי ביותר, והוא גם המנגנון הנפוץ ביותר במיקרוסקופ אור.
לעיתים קרובות ניתן להבחין בתרומה של מנגנון זה גם כשמנגנוני קונטרסט אחרים הם הדומיננטיים.
זהו המנגנון היחיד שפועל בדגמים אמורפיים, משום שהוא היחיד שאינו מתבסס על אינטראקציה של אלקטרונים עם המחזוריות של אטומי סריג.
מסיבות אלה, המנגנון שימושי במיוחד בדגמים ביולוגיים, אשר להם לעיתים קרובות מבנה אמורפי.
מנגנון קונטרסט זה מתבסס על הבדלים בין קרני אלקטרונים שעברו דיפרקציה בדגם לבין אלו שלא עברו דיפרקציה.
דימות המתבסס על קרני האלקטרונים שלא עברו דיפרקציה נקרא שדה בהיר (Bright field) ודימות המתבסס על קרני אלקטרונים שעברו דיפרקציה נקרא שדה חשוך (Dark field, ובתרגום פחות נפוץ "שדה כהה" או "שדה אפל").
מנגנון קונטרסט זה, אשר שימוש בו מכונה לפעמים גם מיקרוסקופיית אלקטרונים ברזולוציה גבוהה (HRTEM), מתבסס על שינויי פאזה של פונקציית הגל של האלקטרונים הנובעים מאינטראקציה עם המחזוריות של הסריג דרכו עוברים האלקטרונים.
קבלת קונטרסט זה דורשת עבודה בהגדלות גבוהות (מסדר גודל של 200,000-1,000,000) עם דגמים דקים במיוחד (לרוב עשרות בודדות של ננומטר) ומקור אלקטרונים בהיר (מקור מסוג field emission הוא הנפוץ ביותר לשימוש זה, אולם בדגמים מתאימים הוא אינו הכרחי).
מנגנון קונטרסט זה הוא המסובך ביותר לפענוח ולהבנה אינטואיטיבית.
כאשר מבצעים דימות נכון בקונטרסט פאזה מתקבלות תמונות ברזולוציה תת-אטומית, אולם הפענוח של תמונות קונטרסט פאזה איננו ישיר.
על מנת להפיק את מלוא המידע מתמונות אלה, ובפרט, לפענח את המיקום המדויק של עמודות האטומים בדגם, יש צורך בשיטת רכישה מורכבת של תמונות (focal series) והשוואתן לסימולציה של האינטראקציה של גלי האלקטרונים עם הסריג הספציפי אותו מנסים לדמות, בתנאי הדימות הספציפיים (כגון אוריינטציה, אופטיקה ועוד).
שגיאה נפוצה בפענוח קונטרסט פאזה היא להסיק שמיקום הנקודות הבהירות בתמונה חופף למיקום עמודות האטומים בדגם.
מַיְקְרוֹסוֹפְט קורטנה היא עוזרת אישית וירטואלית, המורכבת ממערכת בינה מלאכותית שפותחה בידי מיקרוסופט, עבור מערכות ההפעלה לטלפונים הסלולריים Windows Phone 8.1, Windows Phone 10 ושולבה גם בשעון החכם Microsoft Band ובמערכות ההפעלה השולחניות שלה - Windows 10 ו- Windows 11.
מקור השם קורטנה הוא בדמות בינה מלאכותית מסדרת משחקי הווידאו Halo של מיקרוסופט.
ג'ן טיילור, המדבבת של הדמות במשחק, היא גם זו שמדבבת את קורטנה בגרסה האמריקאית של התוכנה.
המערכת הוצגה לראשונה ב־2014 בכנס המפתחים השנתי של מיקרוסופט "Build 2014" בסן פרנסיסקו ותויגה כ"מהפך" במערכות ההפעלה Windows Phone ו־Windows.
נכון לנובמבר 2025, קורטנה אינה זמינה לשימוש בשפה העברית.
בשנת 2020 יצאה גרסת חדשה של קורטנה.
בגרסה החדשה היא דומה לאפליקציה רגילה של המחשב ויכולה לשנות צבעים.
מִיקְרוֹפִילָרְיָה (Microfilaria) הוא שלב מוקדם במחזור החיים של תולעים נימיות טפילות ממשפחת Onchocercidae.
במינים בהם יש מיקרופילריה, התולעים הבוגרות חיות ברקמת תאים או מחזור הדם של בעלי חוליות המשמשים כפונדקאי.
התולעים הבוגרות משחררות את המיקרופילריה למחזור הדם של הפונדקאי.
המיקרופילריה נמצצים על ידי פרוקי-רגליים מוצצי דם המשמשים כווקטור המעביר את התולעים.
בתוך הווקטור, המיקרופילריה מתפתחת לפגית המועברת לפונדקאי אחר.
הודות לממדים הזעירים שלהם, יכולים המיקרופילריה להגיע דרך נימי דם קטנים אל מתחת לעור של הפונדקאי ולהמצץ בשלמותם על ידי הווקטור.
השיטה הרווחת לצמצום התפוצה של מחלות הנגרמות על ידי תולעים נימיות, דוגמת אלפנטיאזיס טרופית ועיוורון הנהרות, היא תקיפת המיקרופילריה בתרופות ממוקדות הניתנות מספר פעמים בשנה.
הורדת רמת המיקרופילריה בדם הפונדקאי אל מתחת לסף מסוים מונעת את העברת המחלה לפונדקאים אחרים.
ב-Loa loa, המיקרופילריה הם באורך של 250-300 מיקרון.
הם נמצאים בסמיכות לעור הפונדקאי רק במהלך היום.
ב-Wuchereria bancrofti, המיקרופילריה הם באורך של 224-296 מיקרון.
גרעיני תאי הגוף של המיקרופיליה מאורגנים באופן רפוי ואינם מגיעים לקצה הזנב.
המיקרופילריה נמצאים במהלך היום בורידים עמוקים ובלילה בנימי הדם מתחת לעור, כשהריכוז הגבוה ביותר הוא בין השעות 10-4.
ב-Enterobius vermicularis, המיקרופילריה הם באורך 250-200 מיקרון ורוחבם 7-5 מיקרון.
ב-Onchocerca volvulus, הגורם לעיוורון הנהרות, המיקרופיליה הם באורך 300 מיקרון ורוחבם 8 מיקרון.
הם יכולים לחיות עד כשנה בתוך הפונדקאי.
המיקרופליה אינו מתפתח לפגית בתוך גוף האדם אלא רק בזבוב ממשפחת הישחוריים המשמש כווקטור.
מיקרוסקופיה ברזולוציית-על היא שם כולל לטכניקות המאפשרות קבלת תמונה של מבנים ברזולוציה הגבוהה מהרזולוציה של מיקרוסקופיית אור, אשר מוגבלת על ידי דיפרקציה.
המיפוי העדין של מבנים תאיים חושף מידע ביולוגי רב יותר כאשר המבנים אינם מוגבלים על ידי דיפרקציה, ועל כן ניתן לקבל תמונה חדה וברורה יותר, ברמת תתי האברונים.
מיקרוסקופיה ברזולוציית-על מציעה טכניקות שונות כדי להגיע לרזולוציות שבעבר רק מיקרוסקופ אלקטרוני יכול היה להגיע אליהם, תוך כדי יישום של היתרונות השונים בשיטות במערכות ביולוגיות.
ב-2014 קיבלו אריק בציג, ויליאם מורנר ושטפן הל פרס נובל עבור פיתוח שיטות לעקיפת מגבלת דיפרקציית האור למיקרוסקופיה ברזולוציית-על.
חלק גדול מהידע של תהליכים ביולוגים ברמת התאים ותתי-התאים נבע מהיכולת לתאר אותם בצורה ישירה.
בין הטכניקות המיקרוסקופיות השונות, מיקרוסקופיה פלואורוסצנטית היא טכניקה נפוצה בגלל שני יתרונות עיקריים: ניתן לצפות בחלקים ספציפיים של התא בעזרת ניתוח המבנה המולקולרי שלו, ומיקרוסקופיית אור מאפשרת לצפות במבנים תאיים בזמן אמת.
בהשוואה לטכניקות הדמיה אחרות כגון מיקרוסקופ אלקטרוני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי מוגבל על ידי רזולוציה מרחבית נמוכה יחסית, בשל אינטראקציות בין האור הנראה לבין הסביבה הקרובה והעקיפה של האור.
אפשר להסתכל על מיקרוסקופ אופטי כעל מערכת של עדשות המייצרות תמונה מוגדלת של עצם קטן.
בתהליך זה, קרני אור היוצאות מכל הנקודות בעצם מתכנסות לנקודה אחת במישור התמונה.
עם זאת, דיפרקציה של האור מונעת את ההתכנסות המדויקת של הקרניים, מה שגורם לנקודה באובייקט להיות מתורגמת לנקודה מטושטשת בגודל סופי בתמונה.
ההתפלגות התלת־ממדית של עוצמת התמונה של עצם נקודתי נקראת פונקציית פיזור הנקודות (PSF).
הגודל של ה-PSF קובע את הרזולוציה של המיקרוסקופ: כאשר המרחק בין שתי נקודות קטן יותר מהרוחב חצי מקסימום (FWHM) של ה-PSF, תתקבל חפיפה בין תמונות שתי הנקודות הגורמת לאיבוד מידע בתמונה.
ה-PSF בכיוון הרוחבי (מישור XY) גדול פי 2–3 מהכיוון הצירי (ציר Z) עבור עצמים עם מפתח נומרי רגיל.
כאשר עורכים הדמיה בטווח האור הנראה (λ ≈ 550 ננומטר), עבור מטרה קטנה בעלת מפתח נומרי NA = 1.40 יתקבל PSF בגודל רוחבי שקרוב ל-200 ננומטר וגודל צירי הקרוב ל ל-500 ננומטר.
עבור עצמים הגדולים מרזולוציה זו, למשל האיברים והרקמות, מגבלת הדיפרקציה אינה משמעותית, עם זאת, כאשר מתמקדים בתאים, אשר בהם מספר רב של מבנים תת-תאיים הקטנים מאורך הגל של האור ויכולים להגיע למספר ננומטרים, מגבלת הדיפרקציה הופכת להיות מכשול להבנת מבנים אלו.
מכאן נבע הצורך לפיתוח טכניקות חדשות המאשרות צפייה ברזולוציה גבוהה יותר.
ישנן שתי קבוצות עיקריות של שיטות להשיג רזולוציה מעבר לגבול הדיפרקציה:
רזולוציית-על דטרמיניסטית (Deterministic super-resolution): פלורופור – הכימיקל הנפוץ ביותר בשימושים של מיקרוסקופ ביולוגי, מגיב בצורה לא ליניארית לעירור, וניתן לנצל תגובה זו כדי לשפר את הרזולוציה.
חלק משיטות אלו כוללות את STED ,SSIM,GSD, ו-RESOLFT.
רזולוציית-על סטוכסטית (Stochastic super-resolution): ההרכב הכימי של מקורות אור מולקולריים רבים מאופיינת בהתנהגות מורכבת, וניתן להשתמש בהם כדי לגרום לפלורופורים שונים לפלוט אור בזמנים שונים, ועל ידי כך להבין את המבנה הפנימי של הדגימה.
שיטות אלה כוללות תנודות אופטיות ברזולוציה גבוהה (SOFI), שיטות מיקום מולקולה יחידה (SMLM) – כגון SPDM,PALM,FPALM,STORM ו-dSTORM.
מיקרוסקופיה ברזולוציית-על באמצעות תבנית עירור מרחבית
בשיטה זו, כדי להגיע לרזולוציה גבוהה יותר מהרזלוציה שמוגבלת על ידי דיפרקציה, משתמשים במאפיינים השונים של תבנית העירור כדי שניתן יהיה לחלץ מהם מידע בסדר גודל קטן שמתורגם לרזולוציית-על.
גישה זו נקראת "תבנית עירור מרחבית", הכוללת חלק מהשיטות הבאות:
מיקרוסקופיה בשיטת דיכוי באמצעות פליטה מאולצת
עקרון הפעולה של STED הוצע לראשונה בשנת 1994, ולאחר מכן הוכח בניסוי.
עקרון הפעולה הכללי הוא שימוש בלייזר (לייזר STED) כדי לדכא את הזהירה של פלורופורים הממוקמים מחוץ למרכז הפוקוס.
דיכוי הזהירה מושג על ידי פליטה מאולצת: כאשר פלורופור מעורר נפגש עם פוטון המתאים להפרשי האנרגיה בין מצב היסוד למצב המעורר, הוא יכול לחזור לרמת היסוד בעקבות הפליטה המאולצת, לפני שמתבצעת פליטה פלואורסצנטית ספונטנית.
תהליך זה גורם לדיכוי הזהירה של הפלורופורים.
כדי לחדד את התמונה בעזרת שימוש ב-STED, הלייזר צריך להיות בעל תבנית של עוצמה המתאפסת במרכז הפוקוס, ועוצמה גדולה יותר ביתר האזורים.
למרות זאת, תבנית זו מוגבלת גם היא על ידי דיפרקציית האור, לכן האפקט של STED לבדו אינו מספיק.
המפתח להשגת רזולוציית-על הוא התלות הלא ליניארית של דילול הזהירה בעוצמה של לייזר ה-STED, קרוב למצב הרוויה של הלייזר.
אם העוצמה המקומית של לייזר ה-STED גבוהה מרמה מסוימת, תדוכא הזהירה.
על ידי הגברת עצמת הלייזר, גדל האזור בו הזהירה מדוכאת, ללא השפעה משמעותית על הזהירה בנקודת הפוקוס, כיוון שבנקודה זו עצמת לייזר ה-STED קרובה ל-0. כתוצאה מכך, ניתן להבחין בזהירה רק באזור קטן סביב נקודות הפוקוס, דבר המשפר את רזולוציית התמונה.
גודלו של אזור זה מוגבל על ידי עצמת לייזר ה־STED, במקום להיות מוגבל על ידי דיפרקציית האור.
בדרך זו ניתן לקבל תמונות ברזולוציות גבוהות, ורמת הטשטוש קטנה.
בשיטה זו מופעלת תבנית הארה על הדגימה, כאשר התדרים המרחביים של תבנית ההארה מתערבבים עם אלה של הדגימה, וכך תדירויות גבוהות מתורגמות לתדירות נמוכות, אשר ניתנות להבחנה במיקרוסקופ.
ניתן לקבל תבנית ההארה מחזורית על ידי התאבכות של מקורות אור בכיוון הרוחבי, הצירי, או שילוב של שניהם.
לאחר קבלת מספר רב של תמונות באמצעות סריקה וסיבוב של תבניות ההארה, ניתן לשחזר את מבנה הדגימה ולקבל תמונה ברזולוציית-על.
משום שתבנית ההארה עצמה מוגבלת אף היא על ידי דיפרקציית האור, שיפור הרזולוציה במיקרוסקופיית SIM מוגבל לעד פי 2, על ידי שילוב של שני מקורות אור המוגבלים על ידי דיפרקציה.
רזולוציה רוחבית של ~ 100 ננומטר ורזולוציה צירית של ~ 300 ננומטר הושגה בשיטה זו.
עיקרון פעולתה הוא הבאת העצמה הפלואורסצנטית לרוויה, כאשר פלורופור מואר בעצמה גבוה של אור מערר.
תחת תנאים אלו, בכל פעם שהפלורופור מגיע לרמת היסוד, הוא מייד קופץ לרמה המעוררת.
כתוצאה מכך, כאשר העצמה הפלואורסצנטית של הפלורופור מתקרבת לרוויה, היא כבר לא פרופורציונלית לעצמת האור המערר.
ב-SSIM, הדגימה מוארת באור מערר ועצמתי בעל תבנית סינוסיאלית, כך ששיאי תבנית העירור "משוטחים" בעקבות ההגעה לרוויה, כך שבאזורים אילו אין זהירה.
לעומת זאת בנקודות האפס של תבנית הארה מתקבלת זהירה בעקבות ירידת הפלורופור לרמת היסוד, וכתוצאה מכך מתקבלת תבנית עירור חדה של אזורים חשוכים, וביניהם פסים דקים מוארים.
האפקטים הללו מוסיפים תדרים מסדר גבוה יותר לתבנית העירור.
בשיטה זו, הרזולוציה המרחבית כבר לא מוגבלת על ידי עקיפת האור, אלה רק על ידי זמן החיים של הפליטה הספונטנית.
רזולוציית-על בשיטת מיקום מולקולה יחידה
מבנה ביולוגי מוגדר על ידי מיקום המולקולות המרכיבות את המבנה.
באופן דומה, תמונה פלואורסצנטית מוגדרת על ידי הקואורדינטות המרחביות של הפלורופורים היוצרים את התמונה.
אפשר לנצל זאת, ועל ידי מציאת מיקום הזהירה במדגם ברמת דיוק גבוהה ניתן להגיע לרזולוציית-על.
אף על פי שהתמונה המתקבלת מפלורופור בודד היא נקודה בגודל סופי, קביעת מיקום הפלורופור מהתמונה המתקבלת יכולה להיות מדויקת הרבה יותר מגבול הדיפרקציה, כל עוד התמונה מתקבלת ממספר רב של פוטונים אשר נפלטים מהפלורופור.
אפשר להתייחס להרכבת תמונה בעזרת N פוטונים כאל מדידת מיקומם של N פלורופורים, עם אי ודאות המוערך על ידי Δloc≈ Δ/√N כאשר Δloc הוא אי ודאות המיקום, ו-Δ הוא אי ודאות של מדידת מיקום בודדת.
קנה מידה זה מאפשר מיקרוסקופיה ברזולוציית-על, אשר לא מוגבלת על ידי דיפרקציית האור.
מדידה בדיוק גבוה של מקורות אור, כמו חלקיקים פלואורוצנטים, נפוצה בניסויים ביופיזיקליים, והגיע לרמת דיוק שקרובה ל-1Å(אנגסטרום).
דגימה ביולוגית-פלואורוצנטית אופיינת מכילה אלפי, או אפילו מיליונים פלורופורים בצפיפות גבוהה, דבר המקשה על קבלת תמונה ברורה בשיטת ה-SMLM.
על ידי שימוש בגשושיות פלואורוצנטיות (פלורופורים) הניתנות לשליטה (photoswitchable probes), היכולות להחליף בין מצב חשוך למצב פולט אור, אפשר לחלק את תמונת הזהירה המתקבלת לתחומי זמן שונים, כך בעיית התמונה החופפת שמתקבלת ממולקולות שונות ניתנת לפתרון.
בשיטה זו, מולקולות הנמצאות בתחומי דיפרקציית האור יכולות להיות להיות "מצולמות" בנקודות זמן שונות, כך שעבור מולקולות חופפות, ניתן לצלם מולקולה מסוימת, לאחר מכן "לכבות" את המולקולה ולצלם את המולקולה הבאה, כך שהתמונה הכוללת המתקבלת כבר לא תהיה מוגבלת על ידי החפיפה.
בצורה זו קואורדינטות הפלורופורים ממופות, ונבנית תמונה ברזולוציית-על.
שיטה זו תוכננה ויושמה באופן עצמאי על ידי שלוש מעבדות, והיא קיבלה את השמות STORM PALM ו־FPALM בהתאמה.
שלושת המעבדות השתמשו בתחילה בפלורופורים אשר עשויים מצבעים או חלבונים פלואורסצנטיים המופעלים על ידי אור הדמיה חלש, המפעיל רק חלק קטן מהם.
הפרדה זאת מאפשרת שליטה על כמות המולקולות הנמצאות במצב פלואורסצנטי מסוים בזמן נתון, כך שהמולקולות המופעלות ניתנות להפרדה ומיקומם מתקבל.
חזרה על התהליך מאפשר למפות את מיקומי הפלורופורים בדיוק רב, ולקבל תמונה ברזולוציית-על.
המאפיינים הפיזיים והכימיים של הפלורופורים קריטיים לקבלת תמונה ברזולציית על בשיטת ה-SMLM.
עד כה נעשה שימוש במספר גדול של פלורופורים הניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים.
הפלורופורים הללו יכולות להיות עשויות ממגוון רחב של חומרים, החל מצבעים אורגנים עד לחלבונים פלואורסצנטים, המאפשרים סיווג של דגימות ביולוגיות בעזרת מגוון של שיטות.
הרזולוציה של טכניקה זו מוגבלת על ידי מספר הפוטונים שנקלטו בכל אירוע של פליטת אור מהפלורופור, אשר משתנה ממאות עבור חלבונים פלואורוצנטים, עד אלפים עבור צבעים אורגניים מסוג ציאנין, כגון Cy5. מספרים אלה מאפשרים שיפור של יותר מסדר גודל אחד ברזולוציה המרחבית של המיקרוסקופ.
בפועל, חוקרים הצליחה להגיע לרזולוציה רוחבית של 20 ננומטר באמצעות שימוש בפלורופורים העשויים מציאנין.
שיטה זו אפשרה להגיע לרזולוציות גבוהות בחקר מבנה ה-DNA ומבנה החלבונים השונים המרכיבים אותו, בנוסף למבנים תאיים אחרים.
בשנים האחרונות נעשתה התקדמות בתחום של רזולוציית-על, המאפשרת יישומים חדשים בדגימות ביולוגיות.
ההתקדמות הטכנית הזו התאפשרה באמצעות פיתוח השיטות של הדמיה אופטית ושימוש בפלורופורים בעלי מגוון רחב של תכונות.
קבלת תמונה של מבנה ביולוגי חשובה כדי להבין את הפונקציונליות שלו, אך אין זה תמיד מספיק כיוון שתהליכים ביולוגיים רבים מעורבים באינטראקציות בין מבנים ותתי מבנים שונים.
אחת מהדרכים להתמודד עם אינטראקציות אלה היא באמצעות שימוש במיקרוסקופיה מרובת צבעים, בה מרכיבים שונים במבנה מסומנים בצבעים שונים.
הצבעים השונים בתמונה משמשים כאינדיקטורים לאינטראקציות אפשריות, אך רמת הדיוק בשיטה זו מוגבלת על ידי הרזולוציה של שיטת ההדמיה.
הדמיה מרובת צבעים ברזולוציית-על מאפשרת לקדם באופן ניכר את ההבנה של אינטראקציות מולקולריות בתאים.
הדמיה מרובת צבעית בשיטת תבנית העירור המרחבית
הדמיה מרובת צבעים בשיטת STED ניתנת לביצוע באמצעות פלורופורים בעלי דרגת עירור ופליטת אורך גל שונה.
כדי לקבל הדמיה מרובת צבעים, יש להשתמש בלפחות שני סוגי פלורופורים.
באמצעות שימוש בזוג צבעים פלואורסצנטיים ואלומות לייזר STED, ניתן לקבל הדמיה של קולוקליזציה (Colocalization) בין אשכולות החלבון הסינפטי והמיטוכונדריה, ברזולוציה שמגיעה ל-5 ננומטר.
שימושים נוספים בשיטה זו איפשרו לדמות את קרום הממברנה החיצוני של המיטוכונדריה בשלושה ממדים.
הדמיה מרובת צבעית בשיטת ה-SMLM
המפתח להדמיה רב צבעית בשיטת מיקום מולקולה יחידה היא להבדיל בין התכונות של כל אחת מהגשושיות הפלואורסצנטיות המורכבת מהפלורופורים.
מלבד פליטה של גל כתוצאה מעירור, אורך הגל המשמש להפעלה יכול לשמש כחתימה של הפלורופורים.
לכן הדרישה המוקדמת של הדמיה בשיטה זו היא שהגשושיות הפלואוסנטיות יהיו בעלי אורכי גל שונים עבור עירור, פליטה או הפעלה, דבר המאפשר הבדלה ביניהם.
גשושיות אלו נוצרו על בסיס צבעים אורגנים-פלואורסצנטיים מסוג ציאנין.
הגשושיות מורכבות מפלורופור "מדווח", שיכול להפוך לחשוך כאשר מעורר על ידי אור ההדמיה, ופלורופור "מפעיל", אשר מאפשר את ההפעלה של הפלורופור ה"מדווח" כאשר מואר על ידי אור באור גל מתאים.
צבעי ציאנין בתחומים שונים החל מאדום כהה עד אינפרא-אדום, מתפקדים כ"מדווחים" הניתנים לשליטה, וגם לצבעי הציאנין עבור ה"מפעילים" יש מגוון רחב של אפשרויות, החל מסגול ועד צהוב.
שילוב של "המדווחים" וה"מפעילים" יוצר מגוון רחב של גשושיות פלואורצנטיות הנבדלות באורכי גל ההפעלה והפליטה.
הדמיה תלת-צבעית של מולקולות DNA, הדמיה דו-צבעית של מיקרוטובולים בתאים והדמיה דו-צבעית תלת-ממדית של מיקרוטובלים ומיטוכונדריה הושגו באמצעות שיטה זו.
אחד מהיתרונות של מיקרוסקופיית אור הוא היכולת ליצור הדמיה של תאים חיים.
ישנן שתי דרישות עיקריות כדי לערוך הדמיית תאים חיים: יש לסווג את התאים, ולוודא שרזולוציית הזמן גבוהה מספיק כדי לעקוב אחרי התנועות בתא.
השיטות ברזולוציית-על שיושמו עד כה, כוללות את שיטת תבנית העירור המרחבית ושיטת מיקום המולקולה היחידה.
שתי שיטות ההדמיה איטיות באופן יחסי.
האחרונה כרוכה בהכנסת גשושיות פלואורסצנטיות לתאים חיים, מה שמוסיף אתגר נוסף.
עם זאת, מספר רב של חומרים התגלו כניתנים לשליטה על ידי אותות אופטיים, דבר שהקנה גמישות.
הדמיית תאים חיים בעזרת שיטת תבנית העירור המרחבית:
משום שהרזולוציה בשיטת STED גדולה הרבה יותר מאשר שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית, כך הזמן הדרוש לביצוע סריקה של דגימה גם הוא ארוך יותר בצורה משמעותית.
באמצעות הגדלת זמן הסריקה והגבלת שדה התמונה למספר מיקרו-מטרים, הצליחו לצפות בתנועה בראונית של חלקיקים בגודל של מספר ננומטרים בקצב של 80 פריימים לשנייה.
לאחרונה הצליחו מדענים לדמות נוירונים בהיפוקמפוס ולהבחין בתנועת שלפוחית סינפטית בודדה ברזולוציה של 60–80 ננומטרים.
הדמיית תאים חיים בשיטת ה-SMLM:
הדמיה ברזולוציית-על בשיטת ה-SMLM גם היא איטית יחסית, כיוון שהתמונה הסופית היא למעשה מפה של מיקומי הפלורופורים שהצטברו על פני מחזורים רבים.
הדמיה ברזולוציה גדולה מגבול הדיפרקציה של חלבוני אדהזיה פוקליים(focal adhesion proteins) הושגה לאחרונה.
בעזרת שימוש בחלבון פלואורסצנטי הניתן לשליטה באמצעות אותות אופטיים (EosFP), הצליחו לקבל הדמיה ברורה של החלבון פקסילין .
רזולציית הזמן אשר הושגה הייתה בין 25–60 פריימים לשנייה, ובמהלך פרק זמן זה, הופעלו כ-103 פלורופורים בכל מיקרומטר מקובע, והושגה רזולוציה של 60–70 ננומטר.
לאחרונה הצליחו להכניס חלבון פלואורסצנטי צהוב הניתן לשליטה לתוך תא בקטריה חי, דבר האפשר מעקב אחרי חלבון ה-MreB .
גשושיות פלואורסצנטיות יכולות להקל מאוד על מעקב אחר החלקיקים.
בניגוד לניסויים קונבנציונלים של מעקב אחרי חלקיק יחיד, שבו מתבצע סיווג ומעקב רק אחר חלק קטן של המטרות, השימוש בגשושיות הפלואורסצנטיות מאפשרות לעקוב אחר מטרות בצפיפות גבוהה יותר.
אף על פי שניתן להפעיל את הגשושיות רק בחלק קטן של המבנים בזמן נתון, לאחר מחזורי פעולה רבים מתקבלת מפה מפורטת של מסלולי החלקיקים.
גישה זו שימשה לבדיקת קיומם של מיקרו-מבנים בממברנה על ידי בחינת תכונות המפה המרחבית של החלבונים בממברנה.
מרבית המבנים התאיים הם תלת־ממדיים מטבעם, והיכולת לפענח מבנה תלת־ממדי מוגבלת על ידי המימד בעל הרזולוציה הנמוכה ביותר.
מכאן נבע הצורך לפתח שיטות המאפשרות קבלת רזולציית על בשלושה ממדית.
הדמיה תלת־ממדית בשיטת ה-SMLM זו יושמה לראשונה באמצעות שיטת אסטיגמציה למיקום הצירים.
בשיטה זו מוכנסת למכשיר עדשה גלילית, המאפשרת פוקוס שונה בכיווני x ו־y.
כתוצאה מכך, התמונה המתקבלת מפלורופור יחיד הופכת לאליפטית, דבר המאפשר מדידה בו זמנית של המיקום הצירי שלה מפחיסות האליפסה, ואת המיקום הרוחבי ממרכז התמונה.
שיטה זו הגיעה לדיוק רוחבי של ~ 25 ננומטר ודיוק צירי של ~ 50 ננומטר.
תיאור מלא של מבנים ביולוגים, לדוגמה הדמיה מלאה של תאי יונקים, הושגו באמצעות שיטה זו.
יישום נוסף של הדמיה תלת־ממדית נעשה על ידי הדמיה על שני מישורים שונים, בהם האור הנפלט מהדגימה מפוצל ומגיע לאזורים שונים במצלמה.
אורכי הדרכים השונות בהם עבר האור מאפשרים לקבוע את הקואורדינטות בציר Z, ובכך לקבל תמונה תלת־ממדית.
שיטה נוספת להדמיה תלת־ממדית היא שילוב של STORM עם הנדסת פונקציית פיזור הנקודות (PSF engineering): צורות ההארה של המולקולות הפלואורסצנטיות הבודדות המתקבלות במהלך הניסוי כוללות בתוכן אינפורמציה תלת־ממדית.
שיטה זו כוללת אנליזה חישובית מתקדמת כדי לקבוע את מיקום המולקולות במרחב.
בשיטה זו אין צורך לסרוק את נפח הדגימה כדי לקבל תמונה תלת־ממדית.
רמת הדיוק של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על
שיטות מיקרוסקופיות מספקות יכולת לבחון את המבנה המרחבי של הדגימה ולראות כיצד הדגימה משתנה בזמן.
הרזולוציה המרחבית ורזולוציית הזמן של הטכניקות קובעת באיזו רמת דיוק ניתן לראות את פרטי המבנה, ובאיזה מהירות ניתן לצפות בתהליך.
כאשר מתקרבים לרזולוציות גבוהות, גורמים שונים מהווים בעיה ומורידים מהדיוק.
הרזולוציה האופטית מהווה את היכולת הבסיסית של שיטות המיקרוסקופיה השונות לקבלת תמונת המבנים.
ניתן להגדיר אותה כהיכולת להבחין בין שני מקורות נקודתיים קרובים.
עבור שיטות תבנית העירור המרחבית, הרזולוציה האופטית מיוצגת על ידי הגודל האפקטיבי של ה-PSF.
עבור שיטות ה-SMLM, הדיוק של קביעת מיקום הגשושיות הפלואורסצנטיות הוא העיקרון של מדידת הרזולוציה האופטית.
הרזולוציה האופטית בשיטת תבנית העירור המרחבית:
בשיטה זו, קבלת רזולוציית-על מושגת על ידי יצירת תחום עירור בעל ממדים הקטנים בצורה משמעותית מאשר גבול העקיפה.
עבור STED לדוגמה, החדות של ה-PSF נובעת מדיכוי הזהירה של פלורופורים הממוקמים מחוץ למרכז הפוקוס.
עם הגדלת עצמת הלייזר, האזור של דיכוי הזהירה מתרחב ומתקרב אל נקודת הפוקוס, אך הפלורופורים בנקודת הפוקוס אינם מושפעים ידי לייזר ה-STED אם עצמת הלייזר נשמרת על אפס בנקודת הפוקוס.
באופן תאורטי, ניתן להגיע לרזולוציה מרחבית בלתי מוגבלת אם תבנית דלדול העצמה סביב נקודת הפוקוס אידיאלית.
בפועל, תבנית דילול העצמה היא לא אידיאלית, ויכולה לנבוע ממספר רב של גורמים, המגבילים את רמת הרזולוציה.
לדוגמה, עצמת לייזר בנקודת הפוקוס של 1% מעוצמת השיא מאפשרת להגיע לשיפור של עד פי 7 ברזולוציה האופטית לעומת מיקרוסקופיה קונפוקלית, ואילו עבור עצמה של 0.1% בנקודת האפס ניתן להגיע לשיפור של עד פי 20 ברזולוציה.
לעצמת הלייזר בנקודת בפוקוס יש חשיבות דומה גם עבור SSIM.
הסיבות השונות שגורמות לתבנית דלדול לא אידיאלית, כוללות פגמים במצב הלייזר, אברציה כדורית הנגרמת ממקדמי השבירה השונים, וגורמים נוספים.
רזולוציה אופטית בשיטת מיקום מולקולה יחידה:
בשיטה זו קבלה של רזולוציית-על מושגת באמצעות בדיקת המיקום של פלורופורים בודדים בדיוק גבוה.
מספר הפוטונים הנאספים מכל פלורופור הוא הגורם העיקרי להגבלת הרזולוציה.
דרך קפדנית לאפיין את דיוק המיקום בשיטת ה-SLML הוא באמצעות בדיקת מיקום חוזרת של הפלורופורים הניתנים לשליטה.
לחלופין אפשר לקבל את הדיוק מההתפלגות של המיקומים שנמדדו על ידי מספר רב של גשושיות במבנה מוגדר היטב, למשל משטח שטוח המאפשר למדוד את הדיוק בציר Z.
עבור צבעי הציאנין, דיוק המיקום אשר התקבל באופן ניסיוני הוא ~ 20 ננומטר לרוחב.
לעומת זאת, הרזולוציה התאורטית עבור צבעי ציאנין היא 6 ננומטר.
סיבות אפשריות לפער בין הערך התאורטי לערך הנמדד הוא שה-PSF של הפלורופורים אינו פונקציה גאוסית מושלמת, התמונה המתקבלת מפלורופור רוטט אינה סימטרית עקב פליטה הנובעת מהדיפול של הפלורופור, גודלי הפיקסלים השונים במצלמה אינם זהים לחלוטין, יציבות המכשיר, ועוד.
אם כן, צריך לקחת מספר רב של גורמים בחשבון בשביל להעריך נכונה את רזולוציית השיטה.
גורמים המשפיעים על הרזולוציה המרחבית
הרזולוציה האופטית, כפי שפורט לעיל, מגדירה את הגבול של המבנה הקטן ביותר בו השיטה יכולה להבחין.
כאשר עורכים הדמיה על דגימה ביולוגית, הרזולוציה האפקטיבית מושפעת גם ממספר גורמים נוספים הכוללים את צפיפות המדגם, והגודל הפיסי של הגשושית.
במיקרוסקופיה ברזולוציית-על, הרזולוציה האופטית עשויה להתקרב לגודל של המרחק בין גשושיות פלואורצנטיות סמוכות, לכן צפיפות המדגם יכולה להיות גורם המגביל את הרזולוציה המרחבית האפקטיבית.
הגבלה זו חלה על כל שיטות המיקרוסקופיה ברזולוציית-על.
כאשר מספר המולקולות הממופות בדגימה אינו מספיק, מופיעים פגמים בתמונה, היכולים לגרום, לדוגמה, למבנה רציף להיראות כלא רציף.
גודלה של הגשושית מגביל את האופן שבו התמונה משקפת את המבנה בפועל.
לדוגמה, עבור אימונופלואורסצנציה בלתי ישירה (indirect immunofluorescence), קשירת הנוגדנים הראשיים והמשניים מגדיל את הקוטר של המיקרוטובול מ-25 ננומטר ל-60 ננומטר.
הפתרון האולטימטיבי של הבעיה היא שימוש בפלורופורים אורגנים, המגיעים לגודל של ~ 1 ננומטר, כך שהשפעתם על תמונת המבנה פחות משמעותית.
בנוסף למבנים ביו-מולקולריים שנבחנו, כגון DNA, שימוש בשיטות התוארו לעיל נעשה גם על מספר רב של מבניים תאיים.
הדגימה הנפוצה בה משתמשים לחקר המיקרוסקופיה ברזולוציית-על הוא שלד התא של יונקים, במיוחד המיקרוטובול.
מבנים אחרים של שלד התא שצולמו עד כה כוללים סיבי אקטין של למליפודיום , סיבי ביניים של קרטין, נוירופילמנטים ועוד.
הדמיות אלו מדגימות את היכולת של מיקרוסקופיה ברזולוציית-על להבחין ולהבדיל בין סיבים שונים בחלבונים, כמו כן להבין את המבנה התלת-ממדי של שלד התא בתאים של יונקים.
לאברונים שונים, דוגמת הרשתית תוך-פלזמית, ליזוזום ומיטוכונדריה נעשתה הדמיה בעזרת השיטות שתוארו.
לדוגמה, בשיטת מיקום המולקולה היחידה, ניתן היה לקבל תמונה ברורה של צורת ההמיספירה של הקלטרין, אשר מופיעים רק ככתמים במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבציואונלי.
בעזרת שימוש בשיטת STED ניתן לראות את הצורה החלולה של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה, ואת האינטראקציות שלהם עם המיקרוטובול.
ההדמיות בשיטות השונות של סוגי מבנים תאיים רבים מדגימות את היתרונות הרבים שיש למיקרוסקופיה ברזולוציית-על על פני מיקרוסקופיה קונבנציאונלית.
מיקרוסקופיה דינאמית דיפרנציאלית היא שיטה שפותחה בשנת 2008 על ידי Cerbino ו Trappe
המהווה אלטרנטיבה לשיטות קלאסיות כמו פיזור אור דינאמי (Dynamic light scattering) ומעקב אחר חלקיקים (VPT Video particle tracking).
בדומה לשיטות הקלאסיות, גם באמצעות DDM ניתן לאפיין את הדינמיקה במערכת, אך לעומת שיטות פיזור סטנדרטיות, DDM מצריכה מיקרוסקופ אופטי פשוט, מצלמה וחישובים נומריים בלבד.
בשיטת DDM נעשה שימוש בצילום רצף תמונות של אובייקטים נעים כמו ב VPT, אך באמצעות התמרת פורייה ממוחשבת, ניתן לחלץ מכך מידע ממוצע על המערכת, הזהה לזה המתקבל מניסוי (Dynamic light scattering).
אנליזה ממוחשבת של הסרט המצולם, מובילה לחישוב הפונקציה f, פונקציית הפיזור הזמנית ( intermediate scattering function ISF), אשר רגישה לשינוי המערכת בזמן.
פונקציית הפיזור הזמנית נותנת מידע על מידת השוני בין תמונות המופרדות זו מזו בפרק זמן 𝜏.
במרחב פורייה, הביטוי עבור f הוא:
כאשר הוא התמרת פורייה של עוצמת התמונה המצולמת בזמן t.
במקרים בהם המערכת ארגודית והדינאמיקה בה איזוטרופית, f אינה תלויה בזמן ובווקטור הגל , אלא במרווח הזמן 𝜏 ובמספר הגל q.
הפונקציה f דועכת מ-1 לאפס, (מכיוון שבמרווח הזמן 0 = 𝜏 אין כל שינוי במערכת, וכאשר 𝜏 שואף לאינסוף המערכת משתנה באופן מלא).
הדעיכה של f ומרווח הזמן האופייני שלה, 𝜏, תלויים בסקאלת האורך q.
בסקאלות אורך גדולות, הזמן האופייני לדעיכה יהיה ארוך יותר, מאחר שלאובייקטים גדולים לוקח זמן ארוך יותר לאבד את הקורלציה.
לפיכך, השילוב של המשתנים f, q ו- 𝜏 יוביל למנגנון הפיזיקלי של תהליך איבוד הקורלציה.
על מנת למצוא את הפונקציה f, מחושב תחילה ההפרש בין כל שתי תמונות המופרדות זו מזו במרווח זמן 𝜏 לפי:.
לאחר מכן, פונקציית הקורלציה הדיפרנציאלית (Differential Image Correlation Function DICF) מחושבת על ידי:
כאשר התמרת הפורייה מאפשרת לחלץ את הרכיבים שמשתנים באופן מחזורי עם אורך הגל בכיוון וקטור q (במערכות איזוטרופיות, המשתנה הרלוונטי יהיה הגודל של q).
הפונקציה g, קשורה ל- f לפי:, כאשר (A(q תלוי באופטיקה של המערכת וצורת האובייקטים, ו- (B(q תלוי ברעש המצלמה.
עבור אובייקטים הנעים באופן בלתי תלוי, פונקציית ה- ISF היא: , ואופן הדעיכה שלה מכיל אינפורמציה על התנועה בסקאלת אורך מסוימת.
לכן, על פי צורת השינוי של פונקציית ה- ISF, ניתן לחלץ את מאפייני החומר בסקאלות אורך וזמן שונות.
בשיטה זו נעשה שימוש לאפיון הדינמיקה של תנועה בראונית של חלקיקים קולואידים, ובקטריות.
מיקרוסקופ אלקטרונים בטמפרטורות נמוכות או מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני (Cryo-EM) הוא מיקרוסקופ אלקטרונים המאפשר שיקוף ומדידת גדלים אופייניים של מולקולות מורכבות, כמו חלבונים ופחמימות בתוך תמיסה.
שיטה זו אפשרה לראשונה שיקוף של חומרים ביולוגיים רגישים לקרינה בסביבה הטבעית שלהם.
השיטה מתבססת על העובדה שקרח זגוגי (Vitrous ice), המושג באמצעות קירור מהיר (Super cooling) של מים, יכול להיווצר בתצורה לא גבישית.
שימוש בתמיסה מוקפאת מעין זו, מאפשר שיקוף של החומר במיקרוסקופ אלקטרונים ללא אפקט פיזור גבוה הנוצר בקרח גבישי.
לשיקוף החומר בתמיסה חשיבות רבה, בשל התלות של מאפייני החומר ובייחוד המבנה שלו בקיומה של התמיסה ובהרכבה.
כתוצאה מכך, מבנה חומרים ביולוגיים בסביבת ואקום שונה בתכלית מהמבנה שלהם בסביבתם הטבעית (אין ויוו).
השיטה הוצגה לראשונה ב-1974 על ידי קן טיילור (Ken Taylor) ורוברט גלאסר (Robert Glaeser) שהוכיחו כי ניתן לשמר מבנה של חלבונים בתוך קרח זגוגי.
בראשיתה, השיטה לא היוותה תחרות אמיתית לשיטות המקובלות כמו קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן, בשל רזולוציה נמוכה.
עם השנים התפתחה השיטה והרזולוציה עלתה בהדרגתיות, כשב-2014 הושגה באמצעות השיטה רזולוציה כמעט אטומית (4.5 Å) שאפשרה להציג את צורתם של ריבוזומים ושל מיטוכונדריה.
השיטה התפתחה על רקע שתי בעיות מרכזיות בשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים.
הבעיה הראשונה נובעת מכך שהאנרגיה של אלומת האלקטרונים (בסדר גודל של מאות KeV) גבוהה בכמה סדרי גודל מהאינטראקציות הפועלות בין המולקולות ולפיכך מסוגלת לפרק אותם ולגרום לפגיעה בחומר ובמבנה שלו.
עובדה זו הופכת את האפשרות לשקף חומרים ביולוגיים במיקרוסקופ אלקטרונים לקשה עד בלתי אפשרית.
הבעיה השנייה טמונה בכך שדוגמה הנמצאת במיקרוסקופ אלקטרונים מצויה בוואקום ובנוסף עליה להיות דקה במיוחד בגלל האינטראקציה החזקה של החומר עם אלומת האלקטרונים.
לכן, החומר לא יכול להימצא בתמיסה מימית בזמן הבדיקה (אם החומר יימצא בסביבה מימית, המים יתאיידו בשל רמת הוואקום הגבוהה ויחס שטח פנים-נפח גדול).
אילוץ זה מהווה בעיה מרכזית בניסויים מולקולות ביולוגיות ותאים חיים, שמאפייניהם וצורתם משתנים באופן קיצוני כשהם מצויים מחוץ לתמיסה.
אחת השיטות הראשונות שהוצעו לפתרון בעיית הרס החומר הנבדק על ידי אלומת האלקטרונים נקראת Negative stains.
בשיטה זו החומר מצופה בשכבת שרף בעל עמידות גבוהה לאינטראקציות חשמליות חזקות.
באופן זה, החומר מוגן מצד אחד על ידי השרף, ומצד שני, פיזור האלקטרונים מהשרף הדבוק לאטומי או מולקולות החומר מאפשר לקבל תמונה טובה יחסית של צורתם החיצונית.
עם זאת, ציפוי החומרים הביא לפיזור לא אחיד של השרף על פני השטח ולשגיאות במדידה.
בנוסף, שיטה זו עדיין לא אפשרה לבצע דיאגנוסטיקה של החומר בסביבתו הטבעית.
כדי למנוע את התאיידות המים בתמיסה, ניתן להכניס את החומר בתמיסה שהוקפאה לתוך המיקרוסקופ.
עם זאת, כיוון שקרח בתצורתו הרגילה הוא גבישי, הדיפראקציה האלקטרונית מהקרח תהיה מאוד חזקה ולא תאפשר לקבל תמונה של החומר המצוי בתמיסה הקפואה.
בתחילת שנות ה-70 בוצע הצעד הראשון לקראת פתרון הבעיה.
קבוצות של פיזיקאים החלו במחקר השיטות השונות לקירור מהיר של מים (Super-cooling).
הם גילו, כי בצורה זו, של קירור מהיר, ניתן לקבל קרח בתצורה לא גבישית.
ממצא זה אפשרה לקבוצת סטודנטים ב-"מעבדה לביולוגיה מולקולרית האירופאית" להשתמש ב-Cryo-EM הראשון, ולהציג לראשונה תמונה של חומר בסביבתו הטבעית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים.
בשלב זה הושגה רזולוציה של עשרות אנגסטרום בלבד, שלא יכלה להתחרות ברזולוציה שהתאפשרה בשיטת הקריסטלוגרפיה באמצעות קרני X.
עם השנים השיטה השתכללה ובוצע שימוש בציוד עם דיוק גבוה יותר שאפשר השגת רזולוציה של אנגסטרומים בודדים.
בכך, הקרח הזגוגי שומר על מבנהו בפאזת מוצק לא מסודר.
בנוסף, הטמפרטורה הנמוכה של החומר מאפשרת לשמור עליו מפני נזקי האינטראקציה עם האלקטרונים.
אלומת האלקטרונים מפוזרת על ידי החומר ומרוכזת שנית על ידי סט עדשות אלקטרומגנטיות ונקלטת על פני גלאי אלקטרונים הממיר אותם לפוטונים לקבלת תמונה.
בשל הרגישות של החומרים הביולוגיים לקרינה, אלומת האלקטרונים היא קצרה בזמן ומוגבלת באנרגיה שלה.
בשל כך, מתקבלת תמונה עם ניגודיות נמוכה.
לפתרון בעיה זו מבצעים מיצוע על פני האובייקטים הנמדדים בחומר, לקבלת תמונה חדה יותר.
סוגים שונים של מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני
בדומה למיקרוסקופ אלקטרונים, ישנם סוגים שונים של מיקרוסקופ אלקטרוני קריוגני המאפשרים קבלת תוצאות שונות בהתאם לצורכי המדידה:
מיקרופכיצפלוזאורוס (שם מדעי: Micropachycephalosaurus; משמעותו לטאה קטנה בעלת ראש עבה) הוא סוג נכחד של דינוזאור קטן מתת-סדרת הצרטופסים שחי בתקופת הקרטיקון העליון, 70.6-68.5 מיליון שנה לפני זמננו.
מאובן חלקי של המיקרופכיצפלוזאורוס נמצא במצוק דרומית למחוז שאנדונג בסין.
המיקרופכיצפלוזאורוס היה צמחוני והילך על שתי רגלים.
גובהו כמטר אחד (3.3 רגל).
המיקרופכיצפלוזאורוס הוא הדינוזאור בעל השם הארוך ביותר (23 תווים באנגלית) נכון להיום.
שמו ניתן לו על ידי הפלאונטולוג הסיני, דון ג'ימינג, שחשב שהוא חבר זעיר במשפחת הפכיצפלוזאורים.
מחקרים מאוחרים יותר גילו, בניגוד להערכות הראשוניות, שהמיקרופכיצפלוזאורוס הוא חבר בתת-סדרת הצרטופסים, שכללה גם את הפסיטקוזאורוס והטריצרטופס.
מיקרופוזאורוס (שם מדעי: Microposaurus; מילולית: "לטאה קטנת עיניים") הוא סוג נכחד של דו-חיים מסדרת הטמנוספונדילים.
יצור זה חי בדרום אפריקה ובאוסטרליה של אמצע-סוף הטריאס לפני 247-242 מיליון שנה.
נמצאו מסוג זה 2 מינים שהראשון שבהם התגלה בשנת 1925.
דו-חי זה הגיע לאורך 1-2 מטר והיה בעל גולגולת כבדה ושטוחה שהייתה מלאה שיניים חרוטיות קטנות שעזרו לתפיסת טרף שעבר בסביבתה אך הכילה זוג ניבים קדמיים גדולים יותר.
יחסית לדו-חיים אחרים הגולגולת הייתה מוארכת יחסית.
כפי ששמו מרמז היא הכילה עיניים קטנות בקדמת הגולגולת.
ייתכן שאורח חייו הזכיר את סלמנדרת הענק מיפן וסין, אך הוא חי באזורים טרופיים וחמימים בהרבה.
המיקרופוזאורוס יכל לצאת מהמים אך היה חייב לשמור על עור רטוב וכנראה חי מרבית זמנו בתוך מקווי מים מתוקים.
הוא היה אוכל בשר של דגים ויצורים קטנים נוספים שהוא לכד במלתעותיו.
הוא נכחד לחלוטין בסוף הטריאס.
מִיקְרוֹפַּיְיל (Micropile; נקרא גם מיני פייל, Mini pile ומיניפייל, Minipile) הוא ציוד מכני הנדסי וסוג של מקדח בורות, המשמש לקידוחי יסודות בקרקע סלעית קשה בעיקר לצורך יסודות וביסוס למבנים, חניונים ותימוכין מסוגים שונים, ומשתמש לשם כך בשיטת ההקשה – דפיקה עזה בקרקע ופינוי החומר המרוסק באמצעות לחץ אוויר.
הקידוח הוא הכנה לפעולה הנדסית המשכית – בדרך כלל יציקת יסודות מעומק החפירה ועד פני הקרקע ועל גביהם מוקם המבנה הרצוי.
מיקרופייל מורכב משני חלקים עיקריים: מקדח ומדחס.
המקדח הוא למעשה איזמל ענק בקוטר שנע בין 20–60 ס"מ ומורכב על תורן באורך של בין 5–12 מ'.
בעת ביצוע הקידוח נזקף התורן והמקדח הולם בקרקע בצורה עזה המפוררת את הסלע בעיגול בקוטר המקדח.
יחד עם תחילת הקידוח נכנס לפעולה החלק השני של הכלי שהוא המדחס.
המדחס דוחס אוויר בלחץ ומזרים אותו באמצעות צינור אל מוקד החפירה, האוויר הדחוס מעיף את גרגרי הסלע המרוסקים למרחק ומפנה את השטח להמשך ההקשה של המקדח.
מיקרופייל מתאים לקידוח יסודות בקרקע סלעית קשה שמכונות קידוח אחרות אינן מצליחות לקדוח בה כראוי.
אופי הקידוח מתאים לקרקע סלעית קשיחה וכזו שאיננה דורשת דיפון פנימי בעת הוצאת המקדח מחוץ לבור הקידוח.
בדרך כלל יתבצע קידוח במקירופייל בקרקע שבה סלעי גיר, קירטון, דולומיט וצור.
עומק הקידוח נקבע בהתאם לדו"ח ביסוס המוכן על ידי מהנדס ובהתייעצות עם גאולוג.
עם סיום הקידוח מניף המקדח את זיון הכלונס ומכניס אותו אל תוך פיר הקידוח, לאחר מכן מתבצעת יציקת בטון הממלאת את פיר הקידוח לכל אורכו.
מיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית היא טכניקה המאפשרת הדמיה של רקמות חיות עבות ברזולוציה גבוהה.
אופן פעולתה הייחודי מקטין את הפגיעה ברקמות אותן מאירים, מה שהופך אותה לאחת משיטות ההדמיה הבודדות המאפשרות צפייה ברקמות חיות, כמו מוחות פעילים של ייצורים חיים, מבלי לפגוע בתפקוד מושא המחקר לאורך זמן.
על כן, טכניקה זו נמצאת בשימוש יחסית נרחב בביולוגיה ובמדעי המוח, ענפים בהם ישנה חשיבות למזעור הפגיעה או ההפרעה לאיבר שאותו בוחנים תחת המיקרוסקופ.
עירור "סטנדרטי" כולל מעבר של חלקיק, לדוגמה מולקולה פלואורסצנטית, ממצב היסוד שלה למצב בעל אנרגיה גבוהה יותר על ידי קליטה של חלקיק (נניח פוטון) עם אנרגיה השווה לפער האנרגיה בין שני המצבים.
כבר ב־1931 הוצגה סברה על ידי Maria Göppert-Mayer כי תהליך זה יכול להתבצע בעזרת שני חלקיקים (פוטונים), כל אחד עם חצי מכמות האנרגיה הדרושה, שמגיעים יחדיו לאותה מולקולה ומעוררים אותה כאילו היו חלקיק אחד.
על החלקיקים להגיע באותו הרגע (הפרש שלא עולה על עשירית הפמטו-שנייה בערך, 10-16~ שניות) לאותה הנקודה בכדי לייצר את האפקט, מה שהקשה מאוד על הדגמה פיזיקלית של רעיון תאורטי זה במשך עשרות שנים.
עם זאת, בתחילת שנות ה־60, לאחר המצאת הלייזר, מדענים הראו כי ניתן לערוך ניסוי המדגים את העיקרון הפיזיקלי הבסיסי ולעורר מולקולות ואף אטומים בודדים בעזרת צמדי פוטונים באורכי גל מתאימים.
אורכי הגל הנפוצים במיקרוסקופיה שכזאת נמצאים לרוב בתחומי האינפרא-אדום, כיוון שהאנרגיה של פוטון הופכית לאורך הגל שלו; במילים אחרות, כשאורך הגל גדל פי שניים האנרגיה נחתכת בחצי.
לדוגמה, אם מולקולה פלואורסצנטית נמצאת במצב הייסוד שלה ואנו מעוניינים לעורר אותה לאחד מהמצבים המעוררים שלה, עלינו לכוון לעברה פוטון עם האנרגיה המתאימה לפער אנרגטי זה.
אם לפוטון עם אורך גל של 400 ננומטר ישנה אנרגיה מתאימה עבור ניסוי זה, אז גם לשני פוטונים בעלי אורך גל של 800 ננמוטר ישנה אנרגיה מתאימה לעירור המולקולה, וכך גם לשלושה עם אורך גל של 1200 ננומטר, וכו'.
אורכי גל ארוכים יותר אלו אכן אופייניים למיקרוסקופיית עירור רב-פוטונית, כאשר אורך הגל המדויק לעירור ייקבע לפי החומרים הפלואורסצנטיים בהם נעשה שימוש בניסוי ספציפי.
לעירור המבוסס על שני פוטונים ומעלה ישנה יכולת גבוהה של "חיתוך אופטי" (optical sectioning), כלומר עירור בנקודה או מישור בודדים בדוגמה ולא בכל הנפח המואר.
תופעה זאת מתרחשת כתוצאה מהשימוש באורכי הגל הארוכים יותר, כלומר באנרגיות נמוכות יותר לכל פוטון.
בעירור המתבצע בעזרת פוטון אחד לכל פוטון ישנה מספיק אנרגיה בכדי לעורר את הדוגמה - אחרת היה נבחר אורך גל אחר, קצר יותר (אנרגיה גבוהה יותר) שמספיק בכדי לעורר את הדוגמה.
על כן, עוד לפני שהפוטון מגיע למישור המוקד אותו הוא אמור להאיר סביר שייתקל במולקולה אותה הוא מסוגל לעורר ואכן יעשה זאת.
כשהדוגמה היא פלואורסצנטית אז המולקולה תפלוט חזרה פוטון באורך גל אחר, וכך יקרה לאורך כל מסלולי הפוטונים בתוך הדוגמה.
כתוצאה מכך נפח גדול מאוד מהדוגמה יעורר וייווצר "קונוס אור", תוצאה שאינה רצויה במיקרוסקופיה בה יש רצון לזהות פרטים בודדים מתוך הדוגמה כולה.
עם זאת, בעירור המבוסס על שני פוטונים או יותר, לפוטון בודד אין מספיק אנרגיה בכדי לעורר את הדוגמה.
בנוסף, הסיכוי שיגיעו שני פוטונים (או יותר) לנקודה קטנה במרחב (כ- 1 פמטוליטר) בו-זמנית הוא נמוך במיוחד וכמעט אפסי מחוץ למישור המוקד.
על כן, רק כאשר כלל הפוטונים "מתכנסים" במישור המוקד שאליו כוונו נוצרים תנאים מתאימים לעירור - יש שטף גבוה מספיק שלהם שמעלה את הסיכוי לעירור רב-פוטוני, והוא אכן קורה באותה הנקודה (או המישור), ובה בלבד.
המבנה האופטי של מיקרוסקופ רב פוטוני הוא בסיסי יחסית, ומורכב ממספר אלמנטים בולטים.
הראשון שבהם הוא מקור אור - הלייזר המעורר את הדוגמה.
עד להמצאת הלייזר לא היה ניתן לייצר שטף פוטונים גדול מספיק בכדי לייצר עירור רב-פוטוני, וגם לייזרים מודרניים מסוגלים לייצר את העירור אך ורק במישור המוקד שלהם, כלומר בנקודה בה שטף הפוטונים הוא הגדול ביותר.
בכדי להגדיל את הסיכוי לעירור עוד יותר, לרוב משתמשים בלייזרים שפולטים פעימות של אור, כלומר האור "נדחס" לפעימות קצרות ובהירות מאוד, כשביניהן הלייזר לא פולט אור.
האלמנט הנדרש הבא אחראי על ניהוג הקרן (beam steering), כלומר הזזה שלה במרחב.
זאת מכיוון שמיקרוסקופ רב-פוטוני לרוב מתבסס על טכניקה של סריקת קרן-לייזר לאורך ולרוחב דוגמה (כאמור, בדרך כלל פלאורוסנטית), בדומה למיקרוסקופ קונפוקלי.
כלומר, בכל רגע נתון קרן האור שנשלחת אל הרקמה מרוכזת כולה בנקודה אחת בדוגמה, והאור החוזר משויך כולו לפיקסל אחד בתמונה הסופית.
לאחר סיום איסוף האור מאותו הפיקסל, לרוב תוך כמיקרו שנייה אחת, מראות גלוונומטריות מיוחדות - או כל אלמנט אופטי דומה אחר - מסיטות את קרן האור במעט לכיוון הפיקסל הבא, והתהליך חוזר על עצמו שוב.
האלמנט הבא הוא זוג עדשות המכונות scan lens ו־tube lens (עדשת סריקה ועדשת צינור) המייצרות דמות של המראות הסורקות בגב עדשת האובייקטיב ("עצמית").
דבר זה נדרש לצורך מימוש פעולת הסריקה של המראות על גבי הדוגמה.
עדשת האובייקטיב (objective lens) היא עדשה ש"מתרגמת" את סריקת קרן הלייזר לתנועה שלה על הדוגמה שעליה מסתכלים במיקרוסקופ.
בנוסף, במיקרוסקופיה רב פוטונית המתבססת על פלואורסצנציה, האור הנפלט מהדוגמה נאסף דרך עדשת האובייקטיב חזרה ופוגע במסנן.
מסנן זה מעוצב כך שהוא יעביר אורכי גל ארוכים (כמו חלון שקוף), אך ישמש כמראה עבור אורכי גל קצרים.
תכונה זו מאפשרת לו לנתב את הפוטונים החוזרים מהדוגמה אל גלאי אלקטרוני המסוגל להמיר אור לאות חשמלי, כדוגמת photomultiplier tube, הרכיב האחרון הנדרש במיקרוסקופ רב-פוטוני.
לסיום, אותו גלאי מחובר למחשב המציג תמונה המתבססת על קריאת הגלאי בכל נקודה בדוגמה; ככל שנקלטו יותר פוטונים בזמן נתון כך התמונה במחשב, בפיקסל המשויך לנקודה הזו, תהיה בהירה יותר.
עירור רב-פוטוני הוא תהליך לא-ליניארי, כלומר תלוי בחזקה גבוהה של העוצמה או שטף הפוטונים (Intensity, flux) במישור המוקד.
ככלל בתהליך רב פוטוני שמבוסס על עירור של פוטונים, הסיכוי לעירור מוצלח מתכונתי ל- .
ביטוי זה מדגיש כי עוצמת ההארה תלויה בהתפלגות הפוטונים במרחב - קרן אור גאוסיאנית, לדוגמה - כמו גם בזמן המדויק בו אנו מודדים את השטף.
לייזרים המשמשים לעירור רב-פוטוני לרוב עובדים במצב של פולסים, כלומר מאירים רק למשך תקופות קצרות במיוחד, ועל כן לזמן המדידה יש חשיבות גדולה.
הביטוי לעוצמת ההארה של לייזר פולסי יכול גם להיכתב באופן הבא: .
ביטוי זה מראה כי העוצמה, שהיא הספק ליחידת שטח, תלויה באופן ישר בהספק האור, אך גם בכמות הפולסים לשנייה ובמשכו של כל פולס .
ההספק הממוצע של לייזר המשתמש לעירור רב פוטוני הוא כ- 1 וואט, כמות הפולסים לשנייה היא כ- 1–100 מיליון, ומשכו הממוצע של פולס הוא כ־100 פמטו שניות.
ביטוי זה מדגיש את חשיבות השימוש בלייזרים בעלי הספק גבוה ומשך פולס קצר במיוחד בזמן הדמיה של דוגמאות תוך שימוש בשיטת עירור רב-פוטונית.
הערכים הנפוצים שהוזכרו מעלה מובילים אותנו למסקנה כי פולס אור ממוצע של לייזר מכיל כמיליארד פוטונים המגיעים לדוגמה.
בכדי להעריך מה תהיה בהירות הפיקסל אותו אנו מאירים בתמונה הסופית יש להביא בחשבון את היעילות הנמוכה של תהליך העירור ואת העובדה שרק חלק קטן מהפוטונים הנפלטים מהחומר הפלואורסצנטי נקלטים בגלאים.
לכן, בהערכה גסה, כמות האור המתוארת למעלה תוביל לגילוי של כ־100 פוטונים מאותה הנקודה.
השימוש במיקרוסקופ רב-פוטונים נפוץ במיוחד במדעי החיים והמוח ממספר סיבות.
הראשונה היא שהשימוש בפוטונים עם אורכי גל ארוכים מאפשר להם לעבור מרחק רב יותר בתוך הרקמה מבלי להיבלע או להתפזר בתוכה.
בעוד שמיקרוסקופ שמתבסס על עירור חד-פוטוני יכול לצלם בעומק של כ־50 מיקרומטר ברקמה חיה (המסוגלת לבלוע ולפזר אור ביעילות), מיקרוסקופ המתבסס על בליעה דו-פוטונית יכול לחדור לעומק של כמילימטר בתוך הרקמה, או 1000 מיקרומטר.
מיקרוסקופ המתבסס על בליעה של שלושה פוטונים כבר מגיע לעומק של כ־2000 מיקרון ברקמה חיה.
עומקים אלו מאפשרים למדעני מוח, לדוגמה, להקליט מידע מכל שכבות קליפת המוח בחיות מעבדה כמו עכבר, מה שעוזר לפענח את תפקודו הבסיסי של המוח בחולייתנים, כמו גם את השוני בדפוסי פעולתו כתוצאה ממחלות נוירודגנרטיבית כדוגמת מחלת אלצהיימר.
יתרון נוסף של מיקרוסקופיה רב-פוטונית הוא הפגיעה המועטת שהיא יוצרת בדוגמה.
אורך הגל הארוך מאפשר לפוטונים לעבור דרך רוב הרקמה החיה, עד שהם מגיעים למישור המוקד ושם מייצרים עירור.
בנוסף, כשהפוטונים עוברים דרך הרקמה הם לא מבצעים איתה שום אינטראקציה, או במילים אחרות לא משפיעים עליה.
ספיגה של הפוטונים ברקמה פירושה חימום שלה - אנרגיית הפוטון עוברת לחימום התאים בנקודה - וחימום גבוה לאורך זמן יכול לגרום לנזק כמו פירוק חלבונים בתאים שעוררו.
הגבלת נקודת העירור לאזור קטן מאוד בדוגמה דואגת שגם אם נוצר מעט נזק הוא מקומי בלבד ולא משפיע לאורך, לרוחב ולעומק הרקמה.
יתרון שלישי נובע מיכולות החיתוך האופטיות (optical sectioning) של המיקרוסקופ.
כיוון שעירור רב-פוטוני הוא תופעה מאוד מקומית, האור שנפלט מהרקמה (אם היא פלואורסצנטית) מגיע אך ורק מנקודה בודדת, ועל כן קל מאוד לשייך את האור שנאסף מנקודה זו לאזור קטן מאוד (פיקסל בודד) בתמונה שאותה יוצר המיקרוסקופ.
לו אור היה מגיע ממספר אזורים שונים בדוגמה, היה נדרש בדיעבד להסיק מהו מקור האור המרכזי שגרם לפליטת כל הפוטונים שנקלטו, תהליך עיבוד קשה המכיל חוסר ודאות.
מיקרופילמנט, הנקרא גם סיב אקטין, הוא סיב חלבון בציטופלזמה של תאים אאוקריוטיים המהווה חלק משלד התא.
קוטר סיב האקטין הוא כ-7 ננומטר והוא בנוי משני גדילים הכרוכים אחד סביב השני.
כל אחד משני הגדילים המרכיבים את המיקרופילמנט הם פולימרים של חלבון האקטין, אשר יכולים לעבור על ידי חלבונים רבים אחרים בתא.
המיקרופילמנט לוקח חלק במגוון תהליכים בתא כגון ציטוקינזה, תנועה אמבואידית, שינויים בצורת התא, אנדוציטוזה, אקסוציטוזה, והתכווצות התא.
כמו כן, המיקרופילמנט מסייע ליציבות המכנית של התא יחד עם מרכיבי שלד התא האחרים.
אקטין, החלבון המרכיב את המיקרופילמנטים, התגלה לראשונה בשרירי השלד של ארנב בשנת 1940 על ידי הביוכימאי ברונו פרנץ שטראוב .
כמעט 20 שנה לאחר מכן היו האקסלי הדגים שאקטין חיוני להתכווצות שרירים.
המנגנון שבו אקטין יוצר סיבים ארוכים תואר לראשונה ב-1983.
מיקרופילמנטים נוצרים על ידי קישור יחידות אקטין.
זהו אחד החלבונים התוך תאיים הנפוצים ביותר הנמצאים בתאים אאוקריוטיים.
אקטין מופיע בתא באחד משני מבנים עיקריים, כשכל אחד מהם ניתן לחלוקה נוספת.
הסוג הראשון הוא פולימר של יחידות אקטין המכונה אקטין סיבי (F – אקטין).
מבחינה מבנית, סיבים אלו מופיעים כשני גדילים של תת-יחידות הכרוכות זו בזו בסליל ימני, המסודרות לסירוגין כאשר המרחק בין כל יחידה הוא מחצית האורך של יחידת אקטין או 27.6Å.
סיב האקטין מכיל קצה "דוקרני" (Barbed) וקצה "מחודד" (Pointed) שבו נמצאים "חלבון קושר המטרה" ו"שסע קושר נוקלאוטיד" בהתאמה.
צורה נוספת בה אקטין מופיע בתא היא אקטין כדורי (G – אקטין), צורה זו נקראת גם אקטין חופשי.
מבנה חלבון זה נראה שטוח כאשר הוא מרכיב את סיבי האקטין עקב סיבוב אזור דמוי מספריים במהלך הקישור בסיב.
ליחידות האקטין הבודדות ישנו אתר קישור לנוקלאוטיד ATP.
מיקרופילמנטים נמצאים במצב רציף של הרכבה ופירוק.
קישור של יחידות אקטין כדורי לאקטין סיבי מושפע מנוכחות ממס יוני חזק.
כלומר, נוכחות של יונים חד ערכיים או דו ערכיים.
בדומה למיקרוטובולים, לחוטי אקטין יש כיווניות מבנית מוגדרת.
כאשר הרכבה ופירוק של יחידות האקטין מתרחשות בקצה הדוקרני והמחודד של החוט בהתאמה.
הרכבת הסיב בסביבת מעבדה (in vitro) מתחילה בהתגרענות (נוקלאציה), הכוללת הרכבה של שלוש יחידות אקטין ליצירת טרימר המתפקד כגרעין הסיב.
בסביבה התאית, חלבונים קושרי אקטין (ABP) כגון קומפלקס ARP2/3 ממלאים תפקיד מרכזי בהתגרענות סיב האקטין.
התארכות סיב האקטין מתרחשת על ידי הוספת יחידות אקטין הקשורות ל-ATP בקצה הדוקרני של הסיב, אשר לאחר מכן עוברות הידרוליזה ל-ADP.
אקטין סיבי הקשור ל-ADP פחות יציב מאקטין חופשי הקשור ל-ADP, לכן יחידות אקטין מתפרקות מהקצה המחודד של הסיב.
תהליך הפירוק מואץ על ידי גורם האקטין-דה-פולימריזציה (ADF), ובני משפחת חלבוני הקופילין.
אורך סיב האקטין מבוקר על ידי חלבוני מכסה המונעים הוספת יחידות לסיב וגורמים מאיצי פירוק.