核酸医薬
神経疾患のみならず、核酸医薬全般の最大の問題点は標的臓器または標的細胞へのデリバリーである。具体的にはsiRNAはなんらかのドラッグデリバリーシステムを付加する必要がある。一方ASOは核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化によってアルブミンをはじめとした血中の生体内分子と結合して様々な臓器にデリバリーされることが示されているがアルブミンの性質上、標的臓器または標的細胞特異的なデリバリーにはならない。核酸医薬のベクターとしてカチオニックリポソームやそれに様々な修飾を加えたものがある。これらのベクターの中には効率よくsiRNAをデリバリーさせるものも報告されているが、肝機能障害を代表とする副作用が指摘されている。またリポソームはその性質上肝臓に集結するため、中枢神経系を含めた肝臓以外へのデリバリーが困難となる問題が存在する。
核酸医薬だけでなく、広く中枢神経疾患に対する治療薬を検討する際に最大の問題点となるのが血液脳関門の存在である。血液脳関門を通過する分子は分子量500Da以下の疎水性低分子とされており、核酸医薬のような親水性高分子(ASOの場合は分子量5,000Da程度、siRNAの場合は分子量14,000Da程度)を血液脳関門を通過して脳内に薬物を届ける方法は未だ確立していない。各投与法の利点と欠点を表にまとめる。
静脈内投与は投与した薬物が直ちに循環に入り、急速に血漿濃度を高めることができる投与法である。バイオアベイラビリティは1.0となる。筋肉内注射や皮下注射と比べると大量の薬物投与が可能である。短所としては急速に血漿濃度が高まるため望ましくない作用も急激に起こりうること、塞栓、出血、感染などの危険を伴うことがあげられる。静脈内投与により血液脳関門を通過させて神経細胞に核酸医薬をデリバリーさせる方法は少ないがいくつか報告されている。特定物質のコンジュゲートによってASOを中枢神経へ送達する方法が知られている。膜透過ペプチドを用いる方法、抗体を用いる方法、脂質を用いる方法などがある。また中枢神経系には送達されないがN-アセチルガラクトサミン(GalNac)は肝細胞内へ送達し家族性アミロイドポリニューロパチーの治療へ応用可能という点は注目に値する。抗体のコンジェゲートの例としてはトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体をASOにコンジュゲートし受容体介在性エンドサイトーシスの機序で中枢神経系へASOを送達したという報告がある。膜透過ペプチドをASOにコンジェゲートする方法も知られている。アルギニンを多く含む膜透過ペプチドを用いると大脳および小脳へASOを送達することができる。しかしアルギニンを多く含む膜透過ペプチドを用いた方法は血液脳関門への選択性が乏しく様々な臓器への核酸医薬の移行性を高める。副作用としては行動異常、体重減少、腎障害といった副作用が報告されている。脂質ナノ粒子(lipid nanoparticle、LNP)にトランスフェリン受容体に対するモノクローナル抗体を結合させ受容体介在性エンドサイトーシスの機序でASOを中枢神経に送達するという報告もある。
siRNAではペプチドを用いて神経細胞に送達させたという報告がある。またインスリン受容体やトランスフェリン受容体など、脳血管内皮細胞に発現している受容体に対するモノクローナル抗体をリポソームに結合させ、siRNAを内包してデリバリーさせる方法が報告されている。またsiRNAに狂犬病ウイルス外殻の一部の糖蛋白配列(rabies virus glycopretein、RVG)を結合させる方法が報告されている。RVGはアセチルコリン受容体に対するリガンド配列となっており、アセチルコリン受容体は脳血管内皮細胞および神経細胞に発現していることから、静脈内投与により神経細胞に特異的にデリバリーさせることが可能とされる。RVGをsiRNAに静電的に直接結合させる方法やエクソソームにRVGを発現させ、siRNAを内包させる方法などが報告されている。最大の問題はRVGの合成が容易でなく、医薬品化する際の精製は困難であると考えられている点である。グルコース修飾高分子ミセルといったナノマシンもASOやsiRNAのデリバリー方法となる可能性もある。
核酸自体を修飾するのではなく血液脳関門のタイトジャンクションを制御することでASOをはじめとした高分子医薬品を送達する方法も考案されている。代表例が収束超音波法(high-intensity focused ultrasound、HIFUまたはFocused ultrasound、FUS)である。収束超音波法は外科的処理を必要とせず一過性にタイトジャンクションに作用して送達される。しかし収束超音波法は無菌性の炎症を誘発すると報告されている。トリセルラータイトジャンクションに存在するangulin-1に結合するウェルシュ菌のイオタ毒素由来のリコンビナント蛋白質angubindin-1を利用してASOを中枢神経系へ送達したという報告もある。
また脳血管内皮細胞自体を標的としたデリバリーも選択肢の一つとなる。脳梗塞や多発性硬化症といった脳血管内皮細胞が病変の場となる疾患だけでなく、アルツハイマー病などの神経変性疾患においても脳血管内皮細胞が病変の一端を担っているという報告がなされている。脳血管内皮細胞に対する標的遺伝子の発現抑制の方法としては、siRNAを大量の輸液とともに静脈内投与することで圧力をかけて投与する方法(ハイドロダイナミクス法)やHDLをベクターとしてコレステロール結合siRNAを静脈内投与する方法が報告されている。血液脳関門と同様に血液脳脊髄液関門(blood-cerebrospinal fulid barrier、BCSFB)を構成する脳脈絡叢についても中枢神経疾患の病態への関与が指摘されており、ASOを静脈内投与することによって脳脈絡叢における有効な標的遺伝子発現抑制が報告されている。
皮下投与は血漿濃度の上昇は筋肉注射よりも遅い。緩徐な効果発現を特徴とする投与方法である。油性や懸濁性の薬物が投与可能である。短所としては少量の薬物投与しかできない点があげられる。核酸医薬を皮下投与する方法も報告されている。肝細胞表面上のアシアロ糖蛋白のリガンドとしてN-アセチルガラクトサミンが知られている。N-アセチルガラクトサミンを化学修飾siRNAもしくはASOリンカーを介して結合させたものが開発されている。最大の利点は皮下投与が可能と成る点であり、静脈内投与による方法と比較して単回投与での有効性は劣るものの、複数回投与が容易であることから、家族性アミロイドポリニューロパチーのように核酸医薬を長期間投与する必要がある疾患に対しては有利と考えられている。家族性アミロイドポリニューロパチーは神経疾患であるが核酸医薬が作用しているのが肝臓であり中枢神経ではないことに注意が必要である。
脳室内投与は血液脳関門を考慮する必要のない投与法であり、高い有効性を保って核酸医薬を神経細胞へデリバリーできる有力な方法であるが、最大の問題点は侵襲性が高いことである。siRNAとASOのいずれも数種の報告がなされている。ASOは静脈内投与と同様に核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化された核酸を用いることが一般的であるため、ドラッグデリバリーシステムを考慮せず、そのまま投与されることがほとんどである。一方siRNAについては、そのまま脳室内投与した報告もあるが、より高い効果を得るために各種化学修飾を加えることやDDS素子を結合させる方法が報告されている。また通常二本鎖であるsiRNAを一本鎖にしたsiRNA(single-stranded siRNA、ss-siRNA)も報告されており、その脳室内投与でハンチントン病のモデルマウスを治療した報告がなされている。
髄腔内投与も血液脳関門を考慮する必要のない方法である。脳室内投与よりも侵襲性が低いが処置が簡便ではない。ASOは一般的に単独投与では血液脳関門を通過しにくいことから髄腔内投与で臨床試験が行われている。化学修飾をしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを髄腔内投与すると脊髄の神経細胞とグリア細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドは取り込まれた。髄腔内投与の代表例が脊髄性筋萎縮症の治療薬であるヌシネルセンである。脳室内投与でsiRNAとASOのいずれも神経細胞に送達されるため髄腔内投与でも同様に分布すると考えられる。
経鼻投与は最も侵襲性の低い方法で、脳室内投与同様に血液脳関門を無視することのできる方法である。簡便であることも利点であるが、鼻粘膜からの吸収率がとても悪いため、それを向上させる各種工夫が必要な点と、局所濃度が上がっても脳内全般に行き渡らない点が問題となる。化学修飾したsiRNA自体を投与する方法やデンドリマーをキャリアとする方法が報告されている。いずれも上記の問題点を解決する必要があるが、頻回投与などで解決できる部分もあると考えられ、今後の進展が期待される。
核酸医薬は脂質のコンジェゲートや微粒子キャリアを用いることが多いためウイルスに対する免疫系が関与することが多い。ウイルスに関与する免疫系は自然免疫系と適応免疫系の両者がある。自然免疫系の活性化によって適応免疫系が発動できる状況が準備され、適応免疫系の機能発現の一部は感染細胞や生体に不都合な分子を自然免疫系である貪食細胞に取り込ませることによってなされる。
核酸医薬は自然免疫系に認識され副作用が起こることがある。自然免疫系は正常の宿主細胞には出現しない分子や構造、すなわち細菌の細胞壁に存在するLPS(lipopolysaccharaide リポポリサッカライド)、細菌や真菌の糖蛋白質末端のマンノース残基、ウイルスに特徴的な二本鎖RNA、非メチル化シトシンリン酸グアニン-オリゴデオキシヌクレオチド(CpG ODN)などの病原体関連分子パターン(pathogen-associated molecular pattern、PAMP)、壊死細胞、組織から放出されるダメージ関連分子パターン(damage-associated molecular pattern、DAMP)を認識して活性化する。適応免疫系で認識される抗原は突然変異により適応免疫系の監視から逃れるが、PAMPは微生物にとって宿主への感染能やコロニー形成に必須である。感染性微生物は自然免疫系の監視を逃れることはより困難である。PAMPやDAMPを認識するパターン認識受容体(pattern recognition receptor、PRR)はToll様受容体(Toll-like receptor、TLR)NOD様受容体(NOD-like receptor、NLR)、RIG様受容体(RIG-like receptor、RLR)、C型レクチン受容体(c-type lectin receptor、CLR)が同定されている。マクロファージ、樹状細胞、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞に発現している。適応免疫系のT細胞受容体(TCR)や抗体と異なり、体細胞遺伝子組み換えは行われず多様性をもたない。
Toll様受容体(Toll-like receptor、TLR)はショウジョウバエの発生に必要な遺伝子として同定された。後に感染防御に必須な分子であることが判明したTollと相同性の高い遺伝子である。ヒトでは10種類のTLRが同定されている。微生物の構成成分を認識するTLR1、TLR2、TLR4、TLR5、TLR6は細胞表面に存在する。一方でDNAやRNAを認識するTLR3、TLR7、TLR8、TLR9は細胞内エンドソームに存在する。TLR3がウイルスのもつ二本鎖RNA(一本鎖RNAや二本鎖DNAは認識されない)を、TLR7およびTLR8が一本鎖RNAを、TLR9が非メチル化CpG DNAを認識する。TLRは特異的な分子によって活性化し二量体となりアダプター分子と結合しシグナルを下流に伝達する。アダプター分子としてはMyD88(myeloid differentiation maker 88)がよく知られている。MyD88以外ではTRIF、TIRAP、TRAMなどがアダプター分子である。TLR3とTLR4のシグナルの一部はMyD88非依存である。TLRからのシグナルはNF-κB(nuclear factor-kappa B)やインターフェロン制御因子などの転写因子を活性化し、Ⅰ型インターフェロンであるIFNα、IFNβやIL-1、IL-6、IL-17などのサイトカインの産生を誘導し、炎症を惹起する。パターン認識受容体から発生するシグナルは樹状細胞をより強力な抗原提示細胞に誘導し、抗原ペプチドをT細胞に提示することにより適応免疫との架け橋になる。多発性硬化症の動物モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)ではTLR2、TLR4、TLR7やTLR9の活性化によって増悪し、TLR3の活性化は防御的に機能することが報告されている。
NOD様受容体(NOD-like receptor、NLR)は細胞質のDAMPとPAMPを感受する細胞質の受容体の大きなファミリーである。インフラマソームがよく知られている。AIM2インフラマソームは二本鎖DNAを認識する。またNLRP3インフラマソームはATP、尿酸、遊離脂肪酸などを認識する。NLRP3インフラマソームは自己炎症症候群との関連が知られている。
RIG様受容体(RIG-like receptor、RLR)は細胞質に局在を示して、細胞質内に侵入した外来RNAを検知し、Ⅰ型IFNを産生する細胞内RNAセンサーである。
DNAは遺伝情報の運び手として知られる以前から、貪食細胞の遊走などの免疫応答を引き起こすことが知られていた。しかし、どのような分子がDNAを認識し、免疫応答を誘導しているかについては明らかになっていなかった。TLR非依存性の機序としてDAI、DDX41、IFI16、Sox2といった分子が細胞内DNAセンサーであるとする報告がなされたが、それらの分子が真のDNAセンサーであることの確証は得られなかった。2013年にChenらがDNA刺激によりセカンドメッセンジャーとして働くcGMPを産出する細胞内DNAセンサー分子としてcGASを同定した。cGASがDNA配列や細胞種に関係なくDNAと結合しcGAMPを合成すること、そうして合成されるcGAMPが小胞体に局在するアダプター分子STINGを介してインターフェロンの産出を誘導すること、cGASのノックアウトマウスはDNAウイルスの感染に対して抵抗性を失うことから、細胞質内DNAセンサーとしてのcGASの役割が確立した。
以下のものがFDAで承認されている。
ホミビルセンは1998年にFDAで承認された核酸医薬である。AIDS患者のCMV性網膜炎に対する硝子体内局注するアンチセンス核酸である。サイトメガロウイルス遺伝子のIE2のmRNAを標的としている
ミポメルセンは2013年にFDAで承認された核酸医薬であり、全身投与可能な核酸医薬としては初である。皮下注射で投与する。ホモ接合型家族性高コレステロール血症の治療薬である。ApoB100 mRNAを標的としておりた2'-MOE修飾がされている。
ヌシネルセンは2016年にFDAで承認された核酸医薬であり髄液中に投与する。脊髄性筋萎縮症の治療薬である。18塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。すべての核酸がホスホチオエート化され、2'-MOEの修飾がされたRNA誘導体になっている。このためRNase H依存性のmRNAの分解は起こらない。イントロンに結合することでスプライシング機構を阻害しエクソンインクルージョンを行う。脳脊髄液内の濃度が4~5ヶ月保たれるため投与開始時は2ヶ月で4回投与するが、その後は4ヶ月毎の投与になる。
ペガプタニブ(商品名マクジェン)は2004年にFDAで承認され、2008年からは日本でも承認された核酸医薬である。加齢性黄斑変性症に対する硝子体内局注するアプタマーである。VEGFと結合することで血管新生を抑制する核酸医薬である。プリンあるいはピリミジンのリボースの2'位のOH基がそれぞれフッ素基あるいはO-Me基に置換し、さらにPEG鎖を結合している。
Eteplirsen(商品名 Exondys 51)はデュシェンヌ型筋ジストロフィーに対する治療薬であり2016年にFDAに承認された。モルフォリノオリゴを用いたジストロフィン遺伝子のエクソン51を標的としたものである。エクソンスキップ法である。
東京医科歯科大学の仁科、横田らは核酸医薬のデリバリーとしてビタミンE(α-tocopherol、Toc)に注目した。彼らはTocをアミダイト化しsiRNAの5'末端に結合させたToc-siRNAを合成して、肝臓をターゲットとした生体内でのTocの生理学的輸送動態を用いたsiRNAのデリバリーを試みた。マウスに静脈注射し肝臓での標的mRNAの発現量を検討した。従来のコレステロール結合siRNAと比較して投与量を1/10に減らすことに成功した。次に彼らはTocをギャップマー型ASO(一本鎖DNAの両端をLNAで置換したASO)へ応用することを考えた。しかし脂質をはじめとした各種分子をASOに直接結合するとASOの有効性が減弱することが知られていた。そのためASOに対して相補となる両端を2'-OMeで化学修飾したRNA(complementary RNA、cRNA)を合成し、ASOとアニーリングすることで日本発の新規核酸医薬となるDNA/RNAヘテロ2本鎖核酸(DNA/RNA heteroduplex oligonucleotide、HDO)を開発した。ASOではなくcRNAの5'末端にTocを結合させるToc-HDOを合成することでASOに間接的にTocが結合しASOの有効性に対して干渉が少ないと考えられた。実際にToc-HDOはASOと比較して20倍以上の有効性を示した。LNAを用いたASOは肝障害を示すことが報告されていたがToc-HDOではASOよりも少ない投与量で同等の効果を生じることから投与量削減に伴う肝障害の改善が示唆された。またToc-HDO投与後のインターフェロン値の上昇は認められなかった。HDOはcRNAが核内でRNase Hによって切断され、DNA鎖がASOとなってmRNAと結合し同様にRNase HによってmRNAが切断されることが想定されたが、cRNAが細胞質でDNA鎖と分離されること、最終的にRNaseで切断されるが詳細なメカニズムは不明である。
消化管から吸収されないのが高分子医薬品の特徴のひとつである。大阪大谷大学の村上正裕は東京医科歯科大学の横田隆徳との共同研究でビタミンE結合siRNAを脂肪酸などから構成される脂質ナノ粒子に組み入れることで世界初の腸管投与可能な核酸医薬を開発した。いわゆる坐薬である。この方法は既存の大腸デリバリー技術と組み合わせることで経口投与可能な核酸医薬を開発可能にする可能性がある。脂肪酸は吸収促進薬としても知られているリノール酸を用いた。