DNA複製
複製開始を概観してきたが、ライセシングの正体は以下に述べる調節機構である。これまで述べたように、真核生物の複製はその前にpre-RCの形成とCdkの活性化を必要とする。Cdkは既存のpre-RCの活性化のほかに実は新たなpre-RCの形成を阻害する働きも持つ。すなわち、ORC複合体にほかの成分が結合することを防ぐ。Cdkの活性化レベルはG1期に低く、それ以外の細胞周期上の時期には高い<watson241>。したがって、pre-RCが形成される機会はG1期にしかない。同様に、pre-RCの活性化が起き得るのも直後のS期しかない。。
また、ARSには早期に複製が開始されるものとS期の後半に複製が開始されるものとにわかれる。出芽酵母をモデルとした研究からは細胞周期のチェックポイントをつかさどるタンパク質群は、DNA障害などの異常を検知すると、後半に複製が開始されるARSからの複製開始反応をとめることで、DNA修復が終了するまで複製反応が起こるまでの時間稼ぎをおこなうことが知られている。
真核生物の場合、伸長段階にかかわる酵素のいくつかは巨大な複合体(複製工場)を形成するものの、すべての酵素が複製フォークに集まるわけではないらしい。真正細菌のようにリーディング鎖とラギング鎖のDNAポリメラーゼはつながっていない。真核生物のDNAポリメラーゼは真正細菌と比べて種類が多く、また娘DNAの合成に直接かかわるDNAポリメラーゼの種類は複数存在することが確認されている。DNAポリメラーゼαはDNAプライマーゼのサブユニットを含んでおりプライマーの合成を行う。DNAポリメラーゼδはリーディング鎖の、DNAポリメラーゼεはラギング鎖の複製を行う。
ヘリカーゼがほどいたssDNAは、一本鎖DNA結合タンパク質である複製タンパク質Aが安定化させている。まずDNAポリメラーゼαがプライマーを合成し、それにデオキシヌクレオチドを20 bp付加した後、クランプローダータンパク質である複製因子C (replication factor C:RFC) がDNAポリメラーゼαをDNAから移動させて、替わりにDNAクランプの増殖細胞核抗原 (PCNA) を引き寄せる。PCNAは、デオキシヌクレオチドの付加反応の連続反応性がより大きいDNAポリメラーゼδを誘導し、そこから先はδが本格的に複製を進める。PCNAがDNAからDNAポリメラーゼαを除去してDNAポリメラーゼδをDNAに結合させることをポリメラーゼ交代という。
真核生物のラギング鎖における岡崎フラグメントは約200 bpの間隔で合成されることが知られており、伸長反応の開始にPCNAは其の間隔でDNAに付加されると考えられている。DNAポリメラーゼδが隣接岡崎フラグメントまで伸長反応を完了させると、岡崎フラグメントの除去(岡崎フラグメントのプロセシング)され、PCNAはElg1複合体によりDNAから解離する。DNAに結合したPCNAはSUMO化(SUMOylation)されることが知られており、未修飾およびSUMO化されたPCNAの両方を標的とする。特にSUMO化されたPCNAに好んで結合し、よりよく標的とする。また、人工的に合成したDNAを用いたin vitroの系においてElg1複合体はPCNA解離活性を示さなかったが、in vivoにおけるDNAの存在形態であるクロマチンを導入したin vitroにおいてPCNA解離活性が現れたため、Elg1複合体の活性はヌクレオチドにおいて発揮されることがわかっている。ただし、出芽酵母の細胞においてElg1複合体非存在下でもPCNAは最終的にクロマチンから除去されるため、代替としてPCNAを除去する機構が存在することが示唆されている。
真核生物は、Elg1複合体、Rad24複合体、Ctf18複合体の3種類の複製因子様複合体 (RFC-like complex) を持っている。RFCは大きなサブユニットであるRfc1と小さなRfc2~5から構成されるが、複製因子様複合体もRfc2~5を含み、Rfc1の代わりにそれぞれElg1、Rad24、またはCtf18を持つ。Rad24複合体は、PCNA様複合体9-1-1をDNA損傷部位に誘導する働きがあるとされている。Ctf18複合体はin vitroにおいてPCNAをDNAに誘導およびDNAから除去する活性があるが、それらの活性はin vivoにおける主な機能ではないことが知られており、正しい機能は明らかとなっていない。
#ニックトランスレーションにおけるプライマー除去は真正細菌と異なる過程を経る。プライマー除去には5'→3'のエキソヌクレアーゼが必要だが、真正細菌と異なり真核生物でそれを担うのはDNAポリメラーゼではない。中心的な役割を果たすのはフラップエンドヌクレアーゼであるFEN1(Flap structure-specific endonuclease 1、以前はMF1と呼ばれていた)である。これは岡崎フラグメントの3`末端でDNAポリメラーゼδ複合体に結合し、その隣接プライマーを分解する。ただし、分解活性はプライマー5'最末端部のリボヌクレオチドにある三リン酸基により阻害される。これを真核生物がどのように乗り越えるかはまだはっきりと判明していない。
実際のプライマー除去機構には様々な仮説が考えられている。その一つは、プライマーの大部分はFEN1ではなくRNアーゼHによって除去されるというものである。RNアーゼHはRNA間のホスホジエステル結合を切断できるが、RNA-DNAのそれはできないという特徴を持つ。そのため、少なくともDNAと隣接する最後のプライマーRNAは残ってしまうはずである。ここで、ホスホジエステル結合切断から生じた5`末端は三リン酸ではなく一リン酸基なので除去作業はFEN1が引き継ぐ。しかし、RNアーゼを持たない細胞でもラギング鎖複製が行われることが確認された。もう一つの仮説では、ヘリカーゼがプライマーと親鎖間の塩基対を切断し、はがれた部分(フラップ flap )をDNAポリメラーゼδが隣の岡崎フラグメントから伸長して補う。フラップはFEN1が切断する。
ここでは、細胞小器官(オルガネラ)のDNA複製 (organelle DNA replication:ODR) について記述する。
動物のミトコンドリア や植物の葉緑体などの細胞小器官(オルガネラ)にある小さな環状DNAでは、置き換え型複製と呼ばれる特殊なDNA複製が観察される。まずRNAポリメラーゼが、二本のDNAの一方(H鎖、heavy strand)の複製起点に相補的なRNAを合成する。複製されるH鎖の領域と娘鎖は新しい二重らせんを形成するため、もともとH鎖と二重らせんを形成していたもう一方のDNA鎖(L鎖、light strand)は一本鎖の状態になる。この、3本のDNAが現れた領域をエンドヌクレアーゼが認識してRNAを切断し、プライマーとする。ここから娘鎖の伸長は始まり、H鎖の塩基対の相手がL鎖からRNAへと置き換わっていく。この領域をDループ(置換ループ displacement loop。tRNAのDループとは関係ない)と呼ぶ。
L鎖は独自にプライマーを付加され、遅れて複製される。哺乳類のミトコンドリアDNAの場合、Dループの拡大がH鎖の3分の2まで進んだ時に、L鎖の複製は始まる。L鎖の複製起点が一本鎖となり、露出するためである。H鎖の複製が完了するとL鎖が完全に外れて追い出される。この時点ではL鎖の複製は3分の1までだが、遅れながらも完了する。
細胞分裂におけるミトコンドリアおよび葉緑体の分裂機構に研究において、単細胞紅藻シゾンCyanidioschyzon merolaeがモデル生物としてよく用いられている。C. merolaeにおける研究から、ミトコンドリアと葉緑体のDNA複製は核のそれより先んじて行われ、オルガネラにおけるDNA複製の開始はG1期/S期に特異的なサイクリン依存性キナーゼCDKA (cyclin-dependent kinase A) を活性化し、これが核の複製を開始させることが明らかとなっている。この知見はオルガネラの複製開始をCDKAの活性化につなげるシグナル伝達の存在を示唆する。このような、オルガネラから核へのシグナル伝達をレトログレードシグナルという。
C. merolaeにおいて、葉緑体から発信されてCDKAの活性化を引き起こすレトログレードシグナルのシグナル分子は、テトラピロールの一種であるMg-プロトポルフィリンIX (Mg-protoporphyrin IX:Mg-ProtoIX) である。また、Mg-プロトポルフィリンIXのレトログレードシグナルはタバコの培養細胞BY-2においても確認されているため、このシグナルは高等植物一般である可能性がある。葉緑体のDNA複製が行われると、葉緑体で合成されているMg-プロトポルフィリンIXが葉緑体外に放出されて細胞質に蓄積し、サイクリン1 (cyclin 1) の細胞内濃度を増大させる。サイクリン1がCDKAと結合すると、CDKAを活性化させる。
S期以外の細胞周期においてサイクリン1はポリユビキチン化され、ポリユビキチン化したタンパク質を標的とするプロテオソームによりサイクリン1が分解されている。サイクリン1のポリユビキチン化を行う酵素(ユビキチンリガーゼ)はSCF複合体であるとされている。SCF複合体はSkp1、Cullin 1、Fボックスタンパク質から構成され、標的の認識はFボックスタンパク質が行う。C. merolaeにおける典型的なFボックスタンパク質はFbx1~4の4種類があるが、サイクリン1を認識するFボックスタンパク質はFbx3である。Mg-プロトポルフィリンIXはFbx3との結合能を有しており、Mg-プロトポルフィリンIXがFbx3と結合することによりサイクリン1の結合を競合阻害すると考えられている。
古細菌のDNA複製については全貌が明らかになっていない。研究ではもっぱらスルフォロブス属のSulfolobus solfataricus P2などを用いる。知見の多くは、真正細菌か真核生物の複製に関わるDNA配列やタンパク質と相同な古細菌のそれから推測されている。類似遺伝子の探索では複製起点を発見することができなかったが、古細菌ゲノムの領域ごとにヌクレオチドの出現頻度を統計する方法により、ピュロコックス属であるPyrococcus abyssi の複製起点が断定された。古細菌のDNA複製は真核生物寄りの複製機構を基本に、真正細菌的な要素が一部混合するようである。
古細菌の伸長段階で働くタンパク質の多くは、真核生物の当該タンパク質のアミノ酸配列にも遺伝子にもよく類似している。特に、RFCやPCNは相同タンパク質が存在する。また、メタン生成古細菌の3種を除いて、現在までに配列決定されたすべての古細菌ゲノムは、少なくとも、Orc1とCdc6の両方に相同性を有する遺伝子を1つ含んでいる。古細菌のDNAポリメラーゼは、デオキシヌクレオチドを合成するサブユニットが真核生物のDNAポリメラーゼδのそれと類似性を示す。一方、DNA複製中に行われる校正修復を担うタンパク質は、大腸菌のDNAポリメラーゼIIIのεサブユニットと相同であるとされる。
DNAウイルスの多くは、宿主のDNA複製にかかわるタンパク質を使って複製する。ヘルペスウイルス科、アデノウイルス科、パポバウイルス科、パルボウイルス科などのDNAウイルスは核内でDNAを複製するが、天然痘ウイルスを代表とするポックスウイルス科では細胞質で複製をする
ウイルスの中には線状ゲノムを末端から複製するという珍しい例が存在する。代表的なのはアデノウイルスとφ29ファージにおける鎖置換である。両3'末端からそれぞれ一本の娘鎖が合成されるが、これは同時期ではない。すなわち、一度の複製フォーク出発に1つのDNAポリメラーゼしか伴わず、別時期のリーディング鎖合成が2回行われる。ほかの生物ならラギング鎖が合成されるだろう5'→3'の親鎖は複製が進み、遊離してもssDNAのまま放置。複製が反対側の末端に到達すると、完全に塩基対が置き換えられた親ssDNAは遊離する。このssDNAも独自に複製されるが、そのためには短くとも3'末端に塩基対が作られ、複製起点が二重らせんであることが必要である。
鎖置換を複製機構とするいくつかのウイルスは、それぞれの5'末端に末端タンパク質が共有結合している。例えば、アデノウイルスではセリンがホスホジエステル結合でつながっている。末端タンパク質には、プライマーとなるヌクレオチドのシチジンを持つことと、DNAポリメラーゼと会合するという2つの役割がある。このことから次のモデルが考えられている。末端タンパク質とDNAポリメラーゼが複合体を形成し、これがDNA末端に結合するというものである。次いでシチジンから娘が伸長されるのだろう。この共有結合は複製後も取り残されると考えられており、実際アデノウイルスの5'末端に前回使用されたままのセリンが観察される。これは次の複製開始まで放置され、複製のときに新しい末端タンパク質と置き換わる。
末端タンパク質はDNA末端から9〜18 bpの間に陣取る。隣の17〜48 bpの領域は、複製開始に必要な宿主由来の核因子I (nuclear factor I:NF I) の結合に不可欠である。したがって、複製開始複合体はDNA末端から9〜18 bpの間で形成される。
一部の環状DNAはローリングサークル型複製と呼ばれる特殊な機構で複製される。一般的に、1本鎖環状DNAをゲノムとするファージが行う。
大腸菌ファージφX174の場合を紹介する。複製が開始されたとき、DNAは二重らせんとなる。このときの二本鎖DNA状態を複製型 (replicative form:RF I) と呼ぶ。複製型のうち、もともとのゲノムを(+)鎖、新しく合成された方を(-)鎖に呼び分ける。まず、エンドヌクレアーゼのAタンパク質が (+)鎖の複製起点にニック(切れ目)を入れる。この後、Aタンパク質はニックの5'末端に残る。このように、dsDNAにニックを入れ、生じた5`末端に結合する酵素をリラクセーズ(弛緩酵素、relaxase)と呼ぶ。さて、ニックの3'末端は(+)鎖伸長のためのプライマーとなり、(-)鎖を鋳型として新たな娘ssDNAが合成されていく。それに追い出されるように、対岸の5'末端側は伸長に連れてどんどん(-)鎖から離れる(この(+)鎖のssDNAをテールと呼ぶ)。やがて娘鎖の伸長は一周して複製起点に到達する。このとき、娘鎖は親鎖と同じ長さ、すなわち(+)鎖全体がテールとなるが、テール末端のAタンパク質は再び複製起点を認識して(+)鎖を娘鎖から切り離す。実はAタンパク質は5'末端と同時に3'末端にも連結しており、複製フォークが複製起点を過ぎるころ、すなわちちょうど一周した時にはAタンパク質も複製起点近くに存在する。(-)鎖からも離れ、遊離した(+)鎖は環状となり、ゲノムDNAは複製される。娘鎖と(-)鎖の二本鎖はその後も複製型DNAとして使い回され、同じ方法で複製は続いて(+)鎖のコピーが多数生成される。ローリングサークル型複製の名前は、娘鎖の伸長の際に二本鎖部分が反時計回りに回転し、(+)鎖が引き出されているように見えることから名づけられた。この様子は、まるでトイレットペーパーのロールが床に転がってほどけるようである。ギリシャ文字のσにも似ており、ローリングサークル型複製はσ型複製とも呼ばれる。
次にλファージの場合を紹介する。λファージはローリングサークル型複製を二本鎖DNAの複製に利用する。DNA複製の初期段階では、θ型の複製(前項#複製の機構で解説されている通常の方式に則った、環状DNAの複製)により環状DNAのコピーがいくつか生じる。しかし、ここで作られる環状DNAをλファージは頭部に取り込むことができない。そこで、これらを鋳型にしてローリングサークル型複製を行い、直鎖DNAが作られる。このときのローリングサークル型複製は半不連続的である。鋳型の環状DNAから直接複製されたDNAはリーディング鎖として連続的に伸長し、鋳型の数倍の長さにまでなる。そのリーディング鎖を鋳型に、ラギング鎖としてさらにDNA断片が合成されていく。こうして新生された直鎖dsDNAをコンカテマー (concatemer) と呼ぶ。コンカテマーは1ゲノム分に切り出され、二本鎖の娘鎖がファージ頭部に導入される。
複製は極めて高い精度で行われるが、それでも1/(10)^9程度の確率で合成ミスが生じる。その結果、DNAの塩基置換が起こり、突然変異が起こる。このような複製ミスによる突然変異のほかに、紫外線や化学物質によってDNAが損傷し、突然変異が生じることがある。