DNA複製
DNAのリンキング数を変えて別のトポロジー体(トポイソマー)に変換させる酵素。この変換のためにDNAを一時的に切断するが、その様式によってI型とII型の2種類に分類される。I型は二本鎖の一方の鎖だけを一時的に切断し、一方、II型は両鎖の一時的切断を引き起こす。I型は#DNAのよじれの解消で、II型は#脱カテナン化およびヌクレオソームの組み立てで活躍する。</dd>
</dl>
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<dt>DNAヘリカーゼ</dt>
<dd>ヘリカーゼ
親鎖の二重らせんをほどくことで、複製フォークを進行させる巻き戻し酵素。</dd>
</dl>
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<dt>DNAプライマーゼ</dt>
<dd>DNAプライマーゼ
プライマーを合成する酵素。</dd>
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真正細菌のDNA複製については、主に大腸菌とそれに感染する大腸菌ファージを用いた研究により大部分が解明されている。大腸菌ファージは非常に単純なゲノムを持ったウイルスで、複製は基本的に宿主のタンパク質を利用するので研究には欠かせない。
原核細胞のゲノムは単一のレプリコンである。DNA複製は常に唯一の複製起点から、細胞周期の中ただ一度だけ実行される。この仕組みを単コピー型と呼ぶ。ただし、真正細菌の中にはコレラ菌のように複数の環状染色体を持つものや、ボレリア菌のように複数の線状染色体をもつものも存在する。原核細胞にはゲノムDNAだけでなく、自律的に増殖する染色体外DNAたるプラスミドも存在する場合が多い。こちらは染色体同様に単コピー型制御の場合もあれば、それとは異なる多コピー型制御を受ける場合もある。多コピー型の制御下では一回の細胞周期中にプラスミド複製が繰り返され、細胞中に複数のコピー体が存在することになる。
大腸菌と枯草菌の場合、DNA複製を終わらせるter配列に独特で面白い性質がみられる。両方向にほぼ同じ速さで進む2つの複製フォークは複製起点oriC から半周した位置に出会う。この遭遇点から約100kbにわたり、2か所の終了領域がある。大腸菌において一方はterE, D, Aが、他方はterC, A が集まっている領域。枯草菌ではterI とterII およびこのほかの2, 3の部位である。各領域は終了させる複製フォークの方向が特異的に決まっている。独特なのは、複製フォークが対応するter配列まで行くのに、他方に対応している終了領域を通り過ぎることである。この配置は複製フォークの待ち伏せを起こす。すなわち、何らかの理由で一方の複製フォークが遅れ、両フォークが本来の遭遇点で出会えなくても、早く進んできたほうがter領域で止まって到着を待つのだろう。
細胞周期にDNA複製がたった一回しか行われないためには複製起点に点火済みか否かを示す目印が必要となる。細菌の複製起点にはいくつかメチル化された配列が存在し、これらメチル化状態はDNA複製の前後で異なる。この違いが目印である。例えば大腸菌のoriC には11個のGATC-CTAGがあり、これはアデニンのN6位をメチル化するDamメチラーゼ (Dam methylase, Dam methyltransferase, DNA adenine methylase) の標的配列である。複製前は標的配列の両鎖ともメチル化されている。複製により、メチル化のない娘鎖が会合。結果、dsDNAの一方だけメチル化されたヘミメチル化DNA (hemimethylated DNA) となる。ヘミメチル化は複製開始を阻害すると考えられている。なぜなら、全くメチル化されていない複製起点は効率よく機能するため、複製開始に両鎖のメチル化が必要という考えが否定されているためである。ゲノム中のほかの典型的なGATC配列はどこにあろうと複製後1.5分以内にメチル化されるのに対し、複製起点のそれは約13分かかる。このため、複製起点の標的配列は何らかの形で保護されていると思われる。
damメチラーゼをoriCから隔離する機構がseqA遺伝子の研究で明らかにされつつある。
大腸菌の環状DNAは唯一の複製起点oriC から2つの方向にそれぞれ複製される。このいわゆる双方向性複製途中のDNAは、ギリシャ文字のθに見えることからシータ構造と呼ばれる。oriCの長さは245 bpで、これは真正細菌一般の複製起点で共通しているようである。
oriCにおける複製開始の過程を示す。大腸菌にはTTATCCACAという共通配列が4つ存在し、このうち2つは残りの2つに対して逆を向く。これらをdnaAボックス dnaA box と呼び、遺伝子dnaA から発現する(dnaA産物:dnaA product である)DnaAが結合することからDNA複製は始まる。この状態をさらに詳しく述べると、親和性の高い5か所のdnaAボックスに5つ、次に親和性の低い部位に1つDnaAが結合し、これらがさらにオリゴマーを形成する。このオリゴマーは環状六量体である可能性が高く、親鎖はその外側に巻きつく。複製開始の合図は、oriC にある3つの13bpの反復配列を融解させて開鎖複合体 open complex の形成を促す。そして、むき出しのssDNAにDnaCの補助でDnaBが結合する。DnaAの役割はDnaBをoriC に導くことであるが、これは開鎖複合体の出現というよりは、DnaAの直接の機能のようである。たとえば、R6Kと呼ばれるプラスミドにおいて、ヘアピンループの軸にoriC があり、DnaAの結合からDnaBが誘われる場合、二重らせんの融解は起こらない。
開鎖複合体の形成には少なくともほかにRNAポリメラーゼとHUタンパク質の2つが必須である。RNAポリメラーゼはoriC に隣接する領域にRNAを合成する。この短鎖は親鎖の一本に結合し、もともとの会合DNAに取って代わって塩基対を形成。こうして生じるDNAとRNAの部分的な二重らせんをRループと呼ぶ。一方、HUタンパク質は親鎖を屈曲させる。Rループと屈曲の共存がoriC の融解を促進すると考えられている。
DnaAがDnaBを導くのと同様に、DnaBもまたプライマーゼであるDnaGをoriC に結合するよう促す。DnaBが来た開鎖複合体はその後、SSBが結合してプレプライミング複合体 prepriming complex という構造になる。DnaGとほかのタンパク質が結合するのはこのssDNA領域が形成されたときである。DnaBとDnaGがそろい、プライモソームは完成。親dsDNAを解いて複製バブルを形成し、リーディング鎖のプライマーを合成する。この後、プライモソームは次の伸長段階を執り行う複製工場レプリソームの一部として働く。その役割は、第一にプライマーゼとして岡崎フラグメントのプライマー合成を繰り返すこと。第二に、DNAヘリカーゼとして親鎖を解き続けることである。プライモソームもレプリソームも複製バブルを拡張させつつ、そばに複製フォークを留める。
大腸菌ファージは宿主である大腸菌のタンパク質を拝借するとはいえ、プライマー合成の方法はファージの種類により大きく異なる。最初に発見されたM13ファージは宿主のRNAポリメラーゼをプライマーに利用する。しかし、ほかのファージや大腸菌自身はRNAポリメラーゼではなく、大腸菌DnaG遺伝子の産物であるDnaGを利用する。アーサー・コーンバーグ Arthur Kornberg によると、大腸菌や大半の大腸菌ファージにとってラギング鎖でのプライマー合成には少なくともほかにDNAヘリカーゼであるDnaBも必要であるようらしい。プライマー合成に必要なこれらのタンパク質群をプライモソーム(primosome)と呼ぶ。プライモソームは普通DnaGとDnaBの2つのみを指すが、プライモソームを形成するためにほかのタンパク質が必要な場合もある。
大腸菌のプライモソームは移動性を持つ。一本鎖DNA結合タンパク質に覆われていない、φX174ファージの環状DNA上を動きながらプライマー合成を繰り返すことができる。この性質は、岡崎フラグメントの合成を繰り返すラギング鎖合成に必要である。一方で、ただ一つの複製起点で済むリーディング鎖合成にはDnaBやRNAポリメラーゼの単独で十分である。
伸長段階の始まりは前段階におけるDNAクランプとDnaBのプレプライミング複合体への結合を引き金とする。これらの相互作用はDnaAオリゴマー内でATP加水分解を起こす。すると、オリゴマーは分離するのでその複製起点からもう一度DNA複製が起こるのは防がれる。
真正細菌についての遺伝学的研究は大腸菌で際立って進んでいる。そこで、大腸菌において実際に伸長段階を担う複製装置であるレプリソームについて第一項で解説する。大腸菌ではDNA複製はまずリーディング複製から始まる。1000〜2000 ntが合成されてから次いで最初のラギング鎖合成へと続く。#伸長で前述したようにラギング鎖合成はリーディング鎖に比べ複雑である。その機構の精妙で興味深い特徴が大腸菌で発見された。トロンボーンモデルと名付けられたそれは第二項で紹介する。
レプリソームとは、DNA複製伸長段階において複製フォークに形成される酵素の総称である。複数の複合体が集合し、1つの「工場」として機能していると考えられている。その詳細が最も明らかになっているのは大腸菌であるが、大腸菌における酵素の構成とそれらの協調的機能を紹介する。
レプリソームにおいて最も重要なのはやはりDNAポリメラーゼだろう。大腸菌においてこれを含み、実際にDNAを伸長させる複合体はDNA Pol IIIホロ酵素である。構成するタンパク質は2つのpol IIIコア酵素とγ複合体(クランプローダータンパク質)、さらにSSBと相互作用するχとφサブユニットである。pol IIIコア酵素はDNAポリメラーゼたるpol III(αサブユニット)と3'→5'方向のDNA修復をするエキソヌクレアーゼ(εサブユニット)、θサブユニット、さらにDNAクランプであるβクランプ(βサブユニット二量体)で構成される。一方、γ複合体はγ、δ、δ'および2つのτサブユニットから成る。見た目から言えば、βクランプを構える5本のサブユニットと、その五本指の手のような巨大部位に伸びている細長いτサブユニットがある。τタンパク質の先端はpol III(とDnaB)に結合し、一方、装着部位との連結鎖は柔軟である。2つのpol IIIはそれぞれリーディング鎖とラギング鎖を担当するためγ複合体とつながっていてもある程度自由に動けなければならない。連結鎖の柔軟さはこのためにあるとされる。
各サブユニットの相互作用について説明する。まず、βクランプはDNAクランプの項で説明したようにpol IIIと結合する。レプリソームはさらにDnaB(DNAヘリカーゼ)を含み、γ複合体と相互作用する。。2本のτサブユニットはDnaBにも連結するために挟み込むためである。この連結はDnaBの移動速度を10倍に促進する。次に、プライマーゼの相互作用はDnaBとの間で起こる。この場合、ほかの構成タンパク質と異なり、複製フォークへの結合は強固ではない。もともとプライマーゼの役割はSSBに覆われたssDNAに結合してプライマーを合成することであるが、このときにヘリカーゼとも結合する。その理由は、この結合が本来の仕事を1000倍に促進するためである。仕事が済めばDNAからすぐに離れる。
真核生物の場合、大腸菌のように2つのDNAポリメラーゼによる複合体は形成しない。γ複合体にあたるクランプローダータンパク質(複製因子C : replication factor C:RFC)は存在するが、リーディング鎖とラギング鎖の各DNAポリメラーゼは別々に働く。
トロンボーンモデルとは、大腸菌で発見されたラギング鎖合成の特徴的な様式を指す。すなわち、ラギング鎖合成では親鎖の一部がループ構造を形成し、複製過程でこのループが演奏中のトロンボーンのように伸びたり縮んだりする。
進行方向が反対であるにもかかわらず、2つの親鎖は同じ速度で複製されるのは不思議なことである。絶えず複製を続けるリーディング鎖はともかく、ラギング鎖のpol IIIは複製作業を分散している。中断してはDNAから離れ、はるか遠くのプライマー-鋳型接合体に移動し、作業を再開しなければならない。これがリーディング鎖と同じペースというのは、解離から再結合までのタイムラグが一瞬でなければならないはず。不可思議なpol IIIのジャンプのカギはラギング鎖が成すループ構造とその根元を掴むレプリソームである。
前述したようにレプリソームはDNAへリカーゼを持つため、常に複製フォークに存在する。リーディング鎖、ラギング鎖担当のDNAポリメラーゼも含む。すなわち、レプリソームはラギング鎖において2カ所を掴む。1つはDNAへリカーゼを介した複製フォーク。ループの根元の1本はそこから分かれたばかりのssDNAである。もう1カ所はpol IIIにより複製中の部分である。ループ構造はこれら離れた2箇所の距離をなくす。
2本の根元ssDNAは1本の親鎖であるが、流れる向きは異なり、どちらもループへと向かう。pol IIIの通過DNA領域とDnaBのそれを送り込むため、ループは大きくなっていく。このとき、γ複合体は開いたDNAクランプを準備している。また、岡崎フラグメントが伸長され始めてからしばらくすると、DNAヘリカーゼにプライマーゼが結合する。プライマーゼはループの中、すなわちpol IIIの複製方向と逆の位置に行き、プライマーRNAを置く。プライマーゼは離れ、やがてpol IIIは直前に伸長した岡崎フラグメントに到達する。DNAクランプの項で述べたように、pol IIIは既製の岡崎フラグメントに出会うと、親鎖(にはまったDNAクランプ)から離れる。レプリソームが根元の一つを放すことにより、ループは縮む。pol IIIは鋳型鎖から解離した後もレプリソームの一部として複製フォークに留まるので、次のプライマー-接合体へと素早く移動。そこにγ複合体は用意していたDNAクランプをはめ、pol IIIはこれに結合する。ラギング鎖合成ではこれが繰り返される。
接合においてDNA複製が利用される。接合とは細菌の生殖様式の一つで、一つの個体(供与菌、F+)が別の個体(受容菌、F-)に自身の(染色体やプラスミドの)DNAを移動させることである。その典型例は大腸菌のエピソームであるF因子(Fプラスミド)の仲介で起こる。すなわち、このF因子を、持つ供与菌が持たない受容菌に移す。
接合ではF因子(とそれと地続きの染色体)の巻き戻りが起こり、一方のssDNAは受容菌へと移動。もう片方は供与菌に残る。DNA複製はここで登場し、供与菌と受容菌両方のssDNAを正常なdsDNAに変換する。
具体的な過程を示す。接合には伝達領域と呼ばれるF因子の大きな(約33 kb)領域が必要で、伝達領域の一端にある伝達起点oriTから始まる。リラクセーズのTraIはoriTを認識し、nicと呼ばれる部位を切断する。生じた5'末端に共有結合し、約200bpにわたりdsDNAを巻き戻す。巻き戻しはTraIが5'末端から環に沿って移動しながら行う。遊離した5'末端は受容菌へと移動し(このとき供与菌と受容菌は接触し、つながっている)、次々と巻き戻されるssDNAを先導する。F因子がプラスミド型の場合、巻き戻しは環全体にわたり、(一本鎖の)F因子丸々1個が受容菌に伝達される。一方、染色体に組み込まれている場合、DNA伝達は伝達領域とは逆方向へ進む。プラスミド型と同様に5'末端から受容菌へと入っていくが、これは細菌間の接触が壊れるまで続く。細菌の染色体全体が伝達するのにおよそ100分かかるが、通常はその前に接合は中断する。
接合によって互いのF因子または染色体は一本鎖になるが、それはDNA複製によって二重らせんに戻る。DNA複製が巻き戻しと同時に起こっているなら、ウイルスのDNA複製で紹介するローリングサークル型複製に似ている。しかし、伝達は複製と全く独立した過程であり、これはローリングサークル型複製とは言えない。
真核生物のDNA複製機構は基礎を真正細菌と同じにしながら、それよりもはるかに複雑となっている。その大きな特徴の一つはまず、レプリコンがゲノム中に多数点在することである。理由はいくつかあり、第一にゲノムサイズが著しく巨大である。第二に、例えば大腸菌のゲノムは1本の染色体で十全だが、人間の場合23対も存在する。最後に、ほとんどの原核生物は染色体が環状であるのに対し、ほとんどの真核生物は線状であること。これは#末端複製問題で説明したような問題を引き起こす。
真核生物のレプリコンは比較的短く、酵母やショウジョウバエで約40kb、動物細胞では約100kbである。ただし、この大きさは同一ゲノム内でも10倍以上のばらつきがある。真核生物の複製速度は約2000bp/分であり、約50,000bp/分の細菌と比べるとずっと遅い。また、真核生物には複製停止点がなく、隣の複製フォークとの衝突によりその複製部位でのDNA複製は完了する。
真核細胞では、DNA複製は細胞周期におけるS期(S phase)にのみ起きる。S期は最初のレプリコン点火から始まり、典型的な哺乳類の体細胞ではS期が6時間以上続く。
複製プログラムとは、真核生物のDNA複製においてレプリコンが点火される順番である。全てのレプリコンが一度に点火されないことには例外があり、ショウジョウバエの初期胚の核分裂では多数のレプリコンが同時に点火され、S期は短縮されている。
染色体には「初期に複製する領域」と「後期に複製する領域」とがある。また、ブロモデオキシウリジンで複製フォークを標識し、抗体で染色して観察すると、染色が集中した「フォーカス」が染色体あたり100〜300観察される。このフォーカスはおよそ300以上の複製フォークを含む。これらのことから、ある時期にレプリコンの一群が一斉に点火されてそのDNA複製は局所的に制御されると考えられている。
複製プログラムの実態は複製開始因子が複製起点に作用する順番であり、クロマチン構造や核における三次元的配置といったエピジェネティクスな制御により各領域への複製開始因子の接近のしやすさを調節することで複製プログラムは制御されている。出芽酵母において複製開始因子のいくつかは複製起点の数よりも少なく、上述のように全てのレプリコンの同時点火は起こらず、また、複製開始因子の複製起点への結合がDNA複製の律速段階である。Saccharomyces cerevisiaeを用いた研究から、S. cerevisiaeのヒストン脱アセチル化酵素のRpd3は初期および後期の複製起点の両方の複製開始を抑制し、Sirtuinファミリー(NAD+依存性ヒストン脱アセチル化酵素)のSir2は初期の複製起点の複製開始を促進することが明らかとなった。
限られた複製因子を取り合うために、染色体外のリボソームRNAをコードしている多コピーのリボソームDNA (rDNA) 領域と単一コピー領域のDNA複製は競合しており、Sir2がDNA複製される活性なrDNAの複製起点の分布を低く抑えることにより正常なDNA複製が行われる。S. cerevisiaeの複製開始点の約30%が、ヒトの場合は50%がrDNA領域といった多コピーの繰り返し配列に存在する。S. cerevisiaeのrDNAには150~200コピーの繰り返し配列があり、各繰り返し配列に複製起点があるが、1回のS期においてDNA複製される活性な複製起点はそのうち20%に過ぎない。rDNAの活性な複製起点は転写が活性な遺伝子の下流に存在する。また、rDNAにおける活性な複製起点の分布はSir2により決定されている。rDNAにおいて隣接する3~4個の活性な複製起点の集団が形成されており、各集団はSir2によるヒストン脱アセチル化により不活性化された領域で隔てられている。
Sir2がrDNA領域の複製における負の制御効果を持つのに対し、Rpd3は正の制御効果を持つ。吉田和真は、複製プログラムの制御においてヒストン脱アセチル化酵素の各複製起点への作用よりもむしろrDNA領域の複製開始点の活性の操作の重要性が大きいとする説を提唱した。
複製プログラムは、細胞の系統や分化および発生の過程に応じて柔軟に変化する。複製プログラムの制御の生理的意義については、DNA複製を転写や修復といった染色体の他の機能と協調させることが遺伝情報の継承において重要であると考えられている。
真核生物の染色体には、正常なDNA複製で点火される数以上の余剰な複製起点(休眠複製起点)が存在し、複製フォークの進行が阻害されてフォークが停止した場合に、複製を完了させるためにフォークが到達できなかった領域にある休眠複製起点で点火される。休眠複製起点は、通常の複製起点と同様にG1期にライセンシングを受ける。マウスにおける実験から、外来のストレスがない状態であっても複製フォークの停止は多数引き起こされ、ライセンシングを受けた休眠複製起点の数が低く抑えられた個体において停止複製フォークが蓄積することが明らかとなった。停止複製フォークの蓄積は複製後染色体の不分離の原因となり、がんを引き起こす。休眠複製起点の抑制は、マウスにおいてMCM六量体のドメインのひとつであるMCM4をコードするMcm4変異体(345番目のフェニルアラニンがイソロイシンに変換された点突然変異)で観察することができる。Mcm4変異体において、MCM六量体に2つの補因子CDC45とGINSが結合したCMG複合体の量が減少し、野生型と比べて分子量が低いものと同じものの両方が観察された。変異型CMG複合体のヘリカーゼ活性は野生型と同等であり、Mcm4変異は正常なMCM六量体の形成を減少させることでライセンシングされた休眠複製起点の数を減らすと考えられている。
休眠複製基点は停止複製フォークのレスキューの主要な手段であるが、染色体上に均一に分布しておらず、休眠複製基点がほとんどない脆弱部位が存在する。脆弱部位では、停止複製フォークのレスキューにおいて相同組換えなどによる複製フォークの再始動が重要となる。脆弱部位をはじめとする染色体のさまざまな部位ではストレスによって不完全なDNA複製が起こり、このことは染色体の再編成 (gross chromosomal rearrangements:GCR)、遺伝子増幅 (copy number variation:CNV)、遺伝子欠失の原因となる。
脊椎動物などの真核細胞において、複数の、複製が行われる配列(複製部位)は特定の場所に集まることが知られており、その場所を複製焦点と呼ぶ。複製部位は、免疫染色による娘鎖または複製酵素の、もしくはGFPタグによる複製因子のモニタリングにより観測できるが、それらの実験によって、複製が行われるS期において大きさや位置が様々な複製焦点が、複製フォークの総数よりもはるかに小さな数で存在することが明らかとなった。
出芽酵母の複製焦点を追跡したArmelle Lengronneらの研究によると、複製起点はG1およびS期の細胞において常に移動しており、またG1期からS期への移行時にそのダイナミクスが減少する。このため、複製起点は、ラミンタンパク質といった、クロマチンの立体構造を形成するタンパク質に結合するなりして核内の特定の位置に固定されているわけではなく(出芽酵母はラミンタンパク質を持たない)、またS期に入ると複製起点は自己集合して複製焦点を形成することが示唆された。
複製焦点の形成は、複製起点の点火が空間的にも時間的にも調節されていることにより引き起こされる。Drew M. Pardollらは、哺乳動物の細胞において隣接する複製起点は同時に点火されることを発見した。複製部位が空間的に並列することにより複製フォークの密集化(クラスター化)がもたらされる。クラスター化は、隣接複製起点の一方が点火前に何らかの原因で巻き戻されて点火されなくなる、もしくは複製フォークの進行が阻害されて停止したとき(原因として、転写装置などのDNAと強く結合しているタンパク質との衝突、伸長反応の基質であるdNTPの枯渇、DNA損傷による妨害などがある)に、複製に失敗した領域をもう一方からの複製フォークがすぐに複製に再挑戦するようにするためと考えられている(停止複製フォークのレスキュー)。停止複製フォークのレスキューの機構には、正常なDNA複製には点火されない休眠複製起点の利用もある。
真核生物におけるDNA複製のモデル生物は酵母である。複製開始が行われる領域は自立複製配列 (autonomously replicating sequence:ARS) であり、そこには複製開始点複製エレメント (origin replication element:ORE) が存在する。この11塩基対にタンパク質が結合し、複製開始点認識複合体 (origin recognition complex:ORC) は形成される。ORCに相当するイニシエーター-DNA複合体は、調べられた限りすべての真核生物に共通する。OREのすぐ隣はDNA開裂領域 (DNA unwinding element:DUE) である。約80塩基対のこの配列は、容易に分解するようAとTに富む。DUEは酵母における複製開始点であり、複製開始と伸長に関わるMCMタンパク質複合体が結合する。
真核生物の染色体上には複製起点が多数存在するが、全て細胞周期一回あたり一度しか複製が開始しないように調節されており、これを複製のライセンシングと呼ぶ。複製のライセンシングが破綻すると、ゲノムの一部が一度の細胞周期に2度複製される、また逆に複製されないなどの問題が生じる。
ライセシングの過程はG1期(S期の前)からS期にかけて起こる。ARSのレプリケーターにイニシエーターである複製起点認識複合体(Origin Recognition Complex:ORC。オークと読む)が結合することが複製開始の引き金である。ここで注目すべき、原核生物にはないライセシングの特徴は、レプリケーターとイニシエーターの結合が複製起点の点火と別である点である。
ライセシングの前にまず複製開始と伸長の機構を詳述する。複製起点点火前、G1期におけるARSとORCとの結合は複製前複合体 (prereplicative complexes:pre-RC) の形成に続く。すなわち、pre-RCはORC複合体を前身とし、4種類のタンパク質から構築される。まず、ORCの結合から2種類のヘリカーゼ装着タンパク質(Cdc6とCdt1)が引き寄せられる。ORCと装着タンパク質が協力して複製フォークヘリカーゼを呼び、pre-RCは完成。このヘリカーゼはMcm2から7の6つのタンパク質による複合体だが、これはdsDNAを囲むだけであり、巻き戻しやDNAポリメラーゼの導入には直接結びつかない。しかし、G1期に生じたpre-RCは次のS期で複製の出発点となる。
伸長段階はS期に入って2種類のキナーゼがpre-RCを活性化してから開始される。サイクリン依存性キナーゼ (cyclin-dependent kinase, Cdk) とDbf4依存キナーゼ (Dbf4-dependent kinase, Ddk) はS期に入ると活性化し、pre-RCやほかの複製タンパク質をリン酸化する。するとさらに多くのタンパク質が複製起点に集まり、伸長段階へ移行する。これには3種類のDNAポリメラーゼとその補助因子が含まれ、ポリメラーゼ類は決まった順序で結合する。最初がDNA Pol δとPol εで、次にDNA Pol α/プライマーゼである。実際に伸長が始まるのはDNAポリメラーゼαが結合してからで、その前にδとεが来ることで複製に関わる全てのDNAポリメラーゼを伸長前に確実にそろえることができる。集合したタンパク質のうち、DNAポリメラーゼやその招集に関わった因子の多く、Mcm複合体は複製装置として複製フォークに留まる。Cdc6やCdt1といったその他の因子は伸長段階が始まるころには解離したり破壊されたりする。