膜電位感受性色素
・最初用いられたのはライトガイド方式である。これはライトガイドとして光学繊維を用い、その一端にphotodiodeを取り付けたもので、これを何本か作り、それらの他端を実像面上の複数個のニューロンの像に合わせて並べ、おのおののニューロンから活動電位を吸光シグナルとして同時記録する方法である。この方法によって、Cohenのグループ (Salzberg, et al, 1977) によって、巨大フジツボの神経節内の11~14個のニューロンから活動電位が同時記録された。これが多チャネル同時測定として最初の記録である。神野らは、16チャネル同時測定システムを組み立てた(Fujii, et al,1981 ; Kamino, et al, 1981 ; Hirota, et al, 1981 ; 神野, 1982)。このライトガイド方式では、ディスプレイは多チャネル型オシロスコープあるいは多チャネル型ペンレコーダーだけで充分であり、ライトガイドの口径は自由に選ぶことができるうえ、ライトガイドをいろいろな位置にいろいろな間隔をおいて電位活動を同時記録できるので、使いようによっては、現在でも中枢神経系その他の研究でかなり有効な方法である。
・続いて、同じくCohenの研究室でなるべく多くのニューロンあるいは部位から電位活動を同時記録するための装置を作る計画が立てられた。この時、問題となったのは imaging deviceとdisplayの方法であった。その時、imaging device としては、(1)TV tube (vidicon, vacuum tube), (2)solid state TV camera, (3)array of individual detectorsが、recording deviceとしては、(1)computer, (2)multichannel recorder, (3)multi-channel tape recorderが検討された。そして、photodiode array方式が採用され、144個のphotodiodeをmatrix型に並べた12×12-素子・photodiode arrayとコンピューターを組み入れた測定システムがCohenの研究室で作り上げられた(Grinvald, et al, 1981a)。これに続いて、Salzberg (Salzberg, et al, 1983), Ross (Krauthamer and Ross, 1984) Grinvald (Grinvald, et al, 1982b), Salama (Salama, et al, 1987) および神野ら (Hirota, et al, 1985) の各研究室で同じような測定システムが組み立てられた。
現在、用いられている測定システムの構成は、どの研究室のものでも基本的には同じであり、光学系、検出系、増幅系、マルチプレクサー(あるいはレコーディングシステム)、コンピュータで構成されている。測定システムと測定方法については、Cohen and Lesher (1986) により詳しく解説されている。
このような測定システムで膜電位変化を測定する場合、信号対雑音比 (SN比) は深刻な問題となる。一般に、光学測定は雑音とartifactとの戦いであるといわれる所以でもある。実際の測定では次のような雑音が問題となる。
(1) ショット雑音、
(2) detector内の暗電流による雑音、
(3) 光源の光量の変動による雑音、
(4) 電気回路、シールディング、周辺光による雑音、
(5) 被検体の微小な動きによる雑音。
この中で、(3)〜(5)のような外来性の雑音はその発生源を点検して除去することができるが、ショット雑音は光電子発生の確率的な不規則性により、これが光電流自体の雑音となったもので、これを除くことはできない。なお、CCDカメラなどでは、素子の冷却によりS/N比が向上することが知られているが、これは1つの画素に流れる光電流が小さく、光電流を電圧に変換する回路にある抵抗のジョンソンノイズが問題になる場合に有効な方法である。膜電位変化の光学的測定では、1つの画素に少なくとも10 nAオーダーの光電流が流れる条件でないと定量解析可能なシグナルが得られないため、光電流の平方根に比例して増大するショット雑音に比べ、ジョンソンノイズは無視出来るほど小さいものとなる。したがって、冷却してもS/N比はほとんど向上しない。
膜電位感受性色素を用いた電位変化の光学的測定で、時間分解能は電位変化に対する色素の応答時間と測定システムの時間分解能の2つの因子に依存する。色素の応答時間については先にもふれたが、merocyanine系色素の場合、時定数は2.0~5.0 秒であり、また、測定システムの分解時間は0.1-1.0m秒である。
空間分解能では二次元分解能と三次元分解能の問題がある。
・二次元分解能は顕微鏡の分解能、すなわち倍率と開口数に依存する。しかし、高倍率にして解像力を上げると、S/Nが小さくなるという問題が生じてくる。これは、detectorがうける背景光強度が小さくなるためで、S/Nは背景光の平方根に反比例する。これが、二次元分解能を制約する因子になる。さらに、組織の散乱光が空間分解能に影響を与えることも指摘されている (Orbach, et al, 1985 ; London, et al, 1987)。
・三次元分解能は現在の光学的測定で困難性として最も大きいものであり、これが光学測定の適用範囲を規定している大きな要因の1つにもなっている。
・さらに、組織のどれくらいの深さまでの信号を検出できるかという問題がある。これは、組織の光学的不透明度 (opacity) あるいは光学密度 (optical density) の大きさや色素の組織内への拡散の度合いによる。
膜電位感受性色素を導入して研究を展開している研究室は現在たくさんあり、その適用例の全てを網羅して紹介することはむずかしい。ここでは、初期の測定例を中心に紹介する。
ニューロン活動の多チャネル同時測定は、Cohenの研究室で、まず巨大フジツボの神経節 (supraesophageal ganglion) に適用することから始められた (Salzberg, et al, 1977) 。これは、下等動物の行動、学習の神経機構解析を目指したものである。下等動物の神経節を構成するニューロンの数は比較的少なく、それらのほとんどすべてのニューロンから光学的方法で電位活動を同時記録することも可能である、というCohenの考えに基づいている (Boyle, et al, 1983)。
Cohenのグループが、巨大フジツボに続いて取り上げたのはNavanax (軟体動物 後鰓類)の口球神経節 (buccal ganglion) である。神経節をoxonol系色素 (RH155) で染色し、Navanaxの食餌中の電位活動を、神経節内の128カ所の領域から同時測定した (London, et al, 1987)。この実験で、Navanaxの口唇の動きに伴って22個のニューロンから活動が記録されている。これは、動物の行動に伴う中枢神経系のニューロン活動の最初の記録である。もう1つは、アプリシアのえら引っ込め反射 (gill-withdrawal reflex) が取り上げられている (Zecević, et al, 1989)。これは Eric Kandelら (Kupferman, et al, 1988) が詳細に調べているが、Cohenらの研究は、このアプリシアのえら引っ込め反射に関する神経回路網とその動的神経機構を解析することがそのねらいである (Cohen, et al, 1989)。サイフォン、えら、および腹部神経節を含む神経系を付けたままで切り出した標本で、サイフォンに軽い機械的な刺激を加えると、えらの運動が引き起こされる。この運動をビデオテープに撮りながら、一方で腹部神経節内のニューロン活動を多数部位から同時記録するという方法である。12×12-素子photodiode arrayでニューロン活動を同時記録して、えら引っ込め反射時は、これまでに示唆されているよりはるかに多くのニューロンが活動していることを示した。さらに慣れ (habituation) および感作 (sensitization) に伴うニューロン活動の記録で、急性的に感作された神経節内で、えら引っ込め反射に伴って活動するニューロンの数は250から400個ぐらいと見積もっている。
Salzbergら (1983) はツメガエルの神経性下垂体 (neurohypophsis) をmerocyanine-rhodanine色素 (NK2761) で染色して、活動電位を吸光シグナルとして記録した。この実験で、後葉から得られるシグナルはスパイクのシグナルとそれに続く方向が逆向きでやや持続時間の長いシグナルの2つの成分から成ることが見いだされた。この遅いほうの成分は外液の低Ca2+ 濃度で抑制され、TTXの添加では速い成分、遅い成分とも消失あるいは抑制される。続く実験で、スパイク状の速い成分は神経終末の活動電位を反映した色素の吸光変化であり、遅い成分は色素の吸光変化によるものではなく、神経終末からの神経ホルモン分泌過程を反映した光散乱の変化であることが示された (Salzberg, et al, 1985 ; Obaid, et al, 1989 ; Salzberg and Obaid, 1988)。なお、Salzbergら (1985) は同じタイプのシグナルをマウスの神経性下垂体からも記録している。興奮-分泌連関を光学的シグナルとして捉えたことは神経分泌現象の研究に新しい測定方法を打ち出したものであり、その点でも注目すべきものである。さらに空間分解能を上げることにより興奮-分泌過程をより詳細に解析できる可能性が期待できる。
カエルの中枢神経系では、Grinvaldら (Grinvald, et al, 1984) によって視蓋 (optictectum) のニューロン応答が光学的方法で測定された。これは、カエルを“まるごと"のままで行う in situでの測定であり、光学的測定方法としては、その適用面での新しい展開の1つである。カエルの頭蓋骨を部分的に開けて視蓋部を露出し、そこを螢光色素 (styryl dyes) で染色して、眼球の散発的な光照射(フラッシュ)によって引き起こされる視蓋皮質の電位応答を螢光シグナルとして記録するというやり方である。“まるごと"の動物を用いる実験で問題となるのは、雑音である。その原因として、Grinvaldは呼吸運動と心拍動をあげている (Grinvald, 1985 ; Grinvald, et al, 1988)。さらには、 脳皮質血管内の不連続的な赤血球の流動による影響も考えられる。
Kauerら (1987) は、嗅上皮の臭気剤刺激によって引き起こされる嗅球におけるニューロン応答を測定した。この実験では摘出標本でなく、嗅上皮と嗅球を露出した“まるごと"のサンショウウオが用いられ、嗅上皮に amyl acetateとcamphorの気体を吹きつけて刺激した。先のOrbachとCohen (1983) の電気刺激による測定では、ニューロン応答のシグナルは嗅球のほとんど全域で記録されているが、amyl acetateとcamphorによる刺激では、その両者の間でシグナルの大きさには違いがみられる。応答はいずれの場合も外顆粒層と内顆粒層に限局しており、シグナルは外顆粒層で大きく内顆粒層では小さい。また、神経線維層および糸球体層には応答がみられない。これは、電気刺激と大きく違うところであり、実験的電気刺激と生理的条件という自然刺激による応答の空間的パターンの違いをよく示している。
魚類では、Konnerthら (1987) によってエイ (Raja erinacea) の小脳スライスの平行線維についての測定がなされている。この論文では、RH155とRH482のシグナルの波形の違いから、neuronとgliaの染色性についても解析されている。なお、このほか金魚の視蓋部についてManisとFreeman (1988) よる測定があるが、この実験ではシナプス電位が螢光シグナルとして記録されている。
哺乳類の中枢神経系におけるニューロン活動の光学的測定は、intactな中枢神経系とslice標本についてなされている。
intact : intactの測定は両生類の場合と同じように、皮質におけるニューロン応答に限られている。これは、現在の光学的測定が二次元計測に限られ、三次元的計測に弱いという方法論的制約によるものであり、その適用の限界を示すものでもある。
Orbachら (1985) は、大脳皮質を露出した“まるごと"のラットを頭部が対物鏡の下になるようにして、顕微鏡の載物台の位置に固定し、口ひげを動かしたときの体性感覚野皮質でのニューロン応答と、眼球に光照射したときの視覚野皮質でのニューロン応答を、それぞれの124カ所の部位から記録した。皮質の染色にはstyryl系のRH414が用いられ、ニューロン活動は落射法により螢光シグナルとして測定されている。この測定によって、口ひげを動かした距離や、その持続時間により応答の空間的パターンが変化するという興味ある結果が得られている。なお、まるごとの動物を用いた大脳皮質におけるニューロン応答の測定では、この実験が最初のものである。これによって、光学的測定法を哺乳動物の中枢神経系にも適用できることが示された。slices : これに先鞭をつけたのはGrinvaldら (1982b) によるラット海馬スライスでの測定であり、これによって、海馬の研究に新しいルートがひらかれた。ラット脳から切り出された海馬のスライスをmerocyanine-rhodanine系色素 (WW401) で染色して、透過光の変化を10×10-素子のphotodiode arrayでdetectして、CA1錐体細胞におけるニューロン活動を見事に捉えている。
光学的多チャネル測定の末梢神経線維への応用は少ないが、ShragerとRubinstein (1990) の論文が興味をひいた。彼らの実験はツメガエル (Xenopus) の坐骨神経の軸索内にlysolecithinを注入して脱髄を起こさせて、それに伴う興奮の伝播速度の変化を調べたものである。
Grinvald, RossとFarber (1981)は10×10-素子photodiode arrayを用いて培養されたNIE-115ニューロブラストーマから電位活動を記録したが、これが、光学的測定を培養神経細胞へ適用したものとしては最初である。細胞体に電極を刺して刺激を行い、そこから活動電位を電気的に記録するとともに細胞の多数部位から光学的シグナルを同時記録した。活動電位のシグナルは細胞体を含めて神経突起に沿って各部位から検出され、それらのスパイクは部位ごとに異なった形状を示している。また、活動電位は刺激部位から神経突起に沿って伝播し、その速度は比較的小さく、約0.1m/秒という値が得られている。さらに、Grinvaldら (1980) はレーザーのマイクロビームを用いて、NIE-115ニューロブラストーマ細胞体と成長円錐 (growth cone) からカルシウム活動電位を同時記録している。
その後、培養細胞での光学的測定は Bill Rossに引き継がれ、活発な研究が行われているが、彼らは、膜電位感受性色素とカルシウム指示薬を組み合わせた測定というもう1つの方向をひらいた (Ross, et al, 1987, 1989)。
脊椎動物の個体発生、特にその初期過程では中枢神経系のニューロンは非常に微小でかつ脆弱ということもあって、通常のガラス微小電極法による測定は技術的にほとんど不可能といってもよい。したがって、個体発生に伴う中枢神経系の形態学的、細胞生物学的、さらには分子生物学的研究の著しい進展ぶりに比べて、動的システムとしての生理学的研究あるいは機能構築過程に関する研究は大きい遅れをとっている。これは個体発生の早い段階での神経細胞は微小で、微小電極が刺入できないことや、多領域からのニューロン活動を同時記録できないという方法論的制約に起因している。そこで、神野らは膜電位感受性色素を用いた光学的方法を導入することによって初期胚の心臓、中枢神経系におけるニューロン応答を検出しながら、その機能構築過程の追跡を進めた。(Kamino, et al, 1989 ; Kamino, 1990, 1991 ; 神野, 他, 1983 ; 神野、1985, 1991)。
これまで述べてきた測定は、吸光とか螢光の変化をシリコンphotodiodeを用いて検出する方法であるが、もう1つの方法としてビデオカメラやCMOSカメラを用いて、光学的変化を画像化する方法が用いられるようになってきた。これを最初に発表したのはBlasdelとSalama (1986)の論文である。BlasdelとSalamaの測定法は、脳皮質の光を照射し、その“reflectance"をTVカメラでモニターするものである。彼らは、サルの視覚野皮質を露出させ、そこをmerocyanine-oxazolone系色素(NK2367)で染色したうえで、サルに垂直、水平スリットの光をみせたとき皮質に誘発される“reflectance"の変化を画像化し、皮質における眼球優位性 (ocular dominance) と方位選択性 (orientation selectivity) のパターンを捉えることができた。これは、ニューロンの光学的測定で新しい局面をひらいたものとして大きな意義をもっていることは確かである。しかしながら、光学的測定という面からみるとき、いくつかの問題は残されている。この論文では、光学的変化は単に“reflectance"と表現されているが、この“reflectance"という表現の意味はそれほど簡単ではない。このような系に対して、“reflectance"を厳密に定義することは難しいが、平面の鏡の場合とは違って、いわゆる拡散反射 (diffuse reflection) という意味に近い。一方、皮質のほうから考えると、それは光を反射、拡散、吸収する粒子(細胞)が不均一に詰まった層でもある。かつ、その散乱は大粒子の多重散乱である。これに加えて、着色系で吸光度の変化がreflectanceの中にどの程度入ってくるかという問題もある。したがって、測定している光学的変化が、皮質のどのような変化を反映しているかを一意的に決めることは難しい。この実験で膜電位感受性色素を用いているということで、ストレートに皮質における電位活動を見ていると結論づけるのは危険であるようにみえる。事実、ここで使われている色素NK2367の活動電位に伴う吸光変化は背景光に対して10-4~10-3 のオーダーであり、ビデオカメラで、それを捉えることはほとんど不可能といってよい。したがって、ここでは、電位活動によって引き起こされた何かほかの現象を拾っているかもしれない。
膜電位感受性色素を用いた画像法では、Kauer (1988) も発表している。彼はサンショウウオの嗅球をstyryl系色素 (RH414) で染色し、嗅神経線維を電気刺激して、嗅球での螢光変化(励起波長530nm, 螢光波長610nm)をTVカメラで捉え、画像化した。この実験では対照測定としては膜電位に対して非感受性色素が併用されており、その結果からも、この画像は明らかに嗅球での電位変化の場所的分布を示していると考えられる。
膜電位感受性色素を用いないで、内因性 (intrinsic) の光学的変化を捉えることによってネコやサルの中枢神経系のニューロン活動をモニターしようとする方法が、Amiram Grinvaldらによって開発された(Grinvald, et al, 1986) ; Frostig, et al, 1990 ; Ts'o, et al, 1990)。
彼らは、photodiode法で、ネコの視覚野の皮質から、スリット光刺激に応じた持続時間が比較的長い(約3秒)内因性の光学的変化 (reflectance) を見いだし、これがニューロン応答を表しているとして、その画像化を行った。測定方法は、膜電位感受性色素を用いないという以外は、BlasdelとSalamaと全く同じである。Photodiodeで測定される内因性の変化 (fractional change) は2×10-4 で、膜電位感受性色素の場合よりも1桁から2桁小さい。ここでも問題になるのは、このreflectanceの変化が実質的に何を表しているかということである。ニューロン活動を反映していることは間違いないと考えられるが、変化の持続時間が長いことからみても、活動電位のような電位変化を拾っている可能性はまずない。Grinvald自身も電位変化以外に、いろいろな生理学的因子を上げている。最近の論文で彼らが特に注目しているのはcytochrome-oxidaseとの対応である。しかし、一方では微小循環との対応性も論じている (Ts'o, et al,1990)。
この方法は、色素を用いないことから脳外科手術中の患者にも適応することが可能であり、intraoperative intrinsic optical imagingと呼ばれている。