フィブロネクチン
1993年、米国・マサチューセッツ工科大学のリチャード・ハインズの研究室が、遺伝子ノックアウトの手法でフィブロネクチン遺伝子欠損マウスの作成に成功した。フィブロネクチン遺伝子を不活化させた胚は初期の段階で死んだので、フィブロネクチンは胚発生に必要なタンパク質ということになる。
フィブロネクチンは胚発生の時期においても細胞接着と移動の誘導に重要な働きをする。哺乳類の発生では、フィブロネクチンが欠損すると中胚葉、神経管、血管の発達に欠陥が生じる。両生類でも同様にフィブロネクチン・マトリックスが欠損すると中胚葉形成が異常になり、原腸形成が阻害される。
特定の組織あるいは特定の時期に遺伝子を不活化する条件的ノックアウト法も使用されている。一例をあげると、出生後の乳腺上皮のフィブロネクチン遺伝子を不活化した実験では、肺胞小葉の発達が異常になった。フィブロネクチンからインテグリンβ1を介した焦点接着キナーゼ(focal adhesion kinase)の経路が不活化したためだと思われる。
フィブロネクチンは、in vitroで、細胞の接着、成長、細胞移動、分化を促進することから、in vivoで、細胞の細胞外マトリックスへの接着、結合組織の形成・保持、創傷治癒、胚発生での組織や器官の形態・区画の形成・維持など、脊椎動物の正常な生命機能を支える多くの機能があると考えられている。
フィブロネクチンのいろいろな機能は、細胞接着・細胞伸展を促進することが根源である。
まず、in vitroでの細胞接着・細胞伸展のようすを述べよう。
前述したように、1970年代後半、欧米のいくつかの研究室が、フィブロネクチンの細胞接着活性を、独立に同時に発見した。代表例をあげると、1976年、米国・NIH・国立がん研究所のケネス・ヤマダがフィブロネクチンの細胞接着活性を発見した。
細胞接着活性を簡便・容易で定量的に測定する方法も確立した。フィブロネクチン溶液を培養皿や6穴〜96穴マイクロプレートに入れ、1時間ほど室温放置すると、微量のフィブロネクチンが容器(培養皿やマイクロプレート)の底面に吸着する。その上に、生きた培養細胞をまくと、60〜90分で、細胞は容器底面に接着し、丸い球形の細胞が伸展し、三角形-五角形の形状になる(細胞伸展)(図5)。フィブロネクチンをまかない容器(対照実験)では細胞は丸い形状のままである。必要なら細胞を固定・染色し、顕微鏡下で、全細胞中の伸展した細胞数を数え、細胞接着活性を数値化する。
細胞接着・伸展に必要な条件は、溶液中の二価カチオン(Ca++ 、Mg++)、中性pH、30-37 ℃という生体内の通常の条件である。タンパク質合成阻害剤や核酸合成阻害剤を加えても接着・伸展する。フィブロネクチンの糖鎖および細胞表面の糖鎖は接着に関与していない。
この定量的な測定法で、フィブロネクチンは1 μg/mLの低濃度で細胞接着活性を示す。この数値は血漿中のフィブロネクチン濃度の数百分の1なので、血漿中のフィブロネクチンのごく一部が組織に接着するだけで、細胞接着が引き起こされると推定された。このことも、血流中のフィブロネクチンは不活性なフィブロネクチンの貯蔵庫で、必要な時に、必要な組織にホンの少し沈着し活性化されるという考え方に合致する。
プラスチック上のフィブロネクチンに接着・伸展するメカニズムは、細胞膜貫通タンパク質でフィブロネクチン・レセプター・タンパク質であるインテグリンがフィブロネクチンのRGD配列に結合するのが最初のステップである。その後、細胞膜上にインテグリン分子が多数会合し、斑点を形成する。これが、接着構造の1つである焦点接着 (focal adhesion) である。焦点接着にはビンキュリンなどたくさんの細胞内タンパク質(細部膜裏打ちタンパク質)が関与・会合し、細胞内で細胞骨格のアクチン線維が配向し、細胞が伸展する(図6)。
細胞接着・伸展のin vivoの役割は、単純な「接着」である。つまり、細胞の細胞外マトリックスへの接着で、そのことで、結合組織の形成・保持、胚発生での組織や器官の形態・区画の形成・維持に機能している。
In vitroでは、図7に示すように、4段階で細胞は移動する(ここでは、左から右への移動を示す)。
細胞質を前方に伸張(extension)
伸張した細胞質が新たに接着(adhesion)
細胞全体が位置を変える(translocation)
細胞の最後端の接着部分をはずす(de-adhesion)
細胞が移動するには、着脱できる接着が必要である。
フィブロネクチンはこの着脱できる接着を提供している。1978年、米国・NIH・国立がん研究所のケネス・ヤマダがフィブロネクチンの細胞接着活性を発見した。マウスSV1細胞の小さなかたまりをフィブロネクチンをコートした培養皿、あるいはコートしてない培養皿の上に置いた。24時間後、フィブロネクチンをコートしてない培養皿では、細胞のかたまりはもとのままであったが、フィブロネクチンをコートした培養皿では、細胞は移動し、分散していた。同年、米国・マサチューセッツ工科大学のリチャード・ハインズもフィブロネクチンの細胞移動活性を発見した。
細胞移動のin vivoの役割は、生体内での細胞移動そのものである。神経堤細胞(neural crest cell)、生殖細胞(germ cell)、筋細胞(muscle cell)は、発生の初期段階で移動する。
神経堤細胞を例に説明すると、神経堤細胞が生体内で移動する道筋にフィブロネクチンがある。その移動は、フィブロネクチンとインテグリンの結合を特異的に阻害するRGDペプチドで阻害される などから、生体内で、神経堤細胞はフィブロネクチンの敷かれた道を移動するとされた。
フィブロネクチンは、細胞接着、細胞移動を担い、細胞外マトリックスという細胞環境を提供することから、いろいろな細胞の分化にも関与していると考えられる。ここでは、軟骨形成 (chondrogenesis) の例を挙げる。
間葉細胞(mesenchymal cell)が前軟骨凝集を経て軟骨に分化する軟骨形成の全過程にフィブロネクチンが存在し、コラーゲンやアグリカンと相関しながら分化に寄与している。フィブロネクチンを異常にすると軟骨形成は正常に進行しない。
フィブロネクチンは、1973年、培養細胞の細胞のがん化に伴い細胞表面から消失する糖タンパク質として発見された。そのことから、腫瘍由来の培養細胞の形態が、フィブロネクチン発現の減少や分解が原因と考えられている。
1つの注目するアイデアが広範囲に追及されたのはRGDペプチドによるがん転移阻止である。1986年、GRGDSペプチドが、マウスの悪性黒色腫細胞の実験的がん転移を抑制すると報告された。その後、がん転移を抑制する画期的な医薬品の開発につながるとして、膨大な研究がなされたものの、がん転移の予防として臨床的に使用されるには至っていない。
フィブロネクチンはがん化に関係している報告はいくつもある。肺がん特に非小細胞がん(悪性度の高い小細胞がんを除いた扁平上皮がん、腺がん、大細胞がんなど)ではフィブロネクチンの発現が増加している。肺がん細胞のフィブロネクチンへの接着によって発がん性は促進される。
しかし、確実なのは、EIIIAとEIIIBを持つフィブロネクチンが腫瘍部位で増加すること程度で、2014年現在、がんの予防・診断・治療に臨床的に応用している現実はない。
フィブロネクチンという名称以前に寒冷不溶性グロブリンと呼ばれた時代の1970年、血漿中濃度は0.3 mg/mLlだが、血清中濃度が0.2 mg/mLなので、凝固に伴って減少すると推定された。その後、フィブロネクチンはフィブリノーゲンやフィブリンと結合すること、血小板とコラーゲンとフィブロネクチンの会合の発見などから、血液凝固を促進する因子として確立したように思えた。
しかし、現在の知見では、フィブロネクチンは通常の血液凝固には関与しない。血管再構築、アテローム性動脈硬化症、心臓修復など疾患部位の時の血栓症に関与している。
フィブロネクチンの細胞接着、細胞移動、血液凝固、細胞外マトリックス形成機能を考えれば、フィブロネクチンが創傷治癒に重要な役割を果たしているのは容易に想像がつく。
In vitroで、集密的な培養細胞層を一定の幅で上から下に削り、削られた部分を創傷ととらえ、周囲の細胞が移動し修復するのを創傷治癒とする実験系がある(動画1)。実験的創傷治癒と呼ぶ。この時、フィブロネクチンありなしで実験すると、フィブロネクチンありの方が有意に創傷治癒の速度が速い。
In vivoでは、血液中の血漿フィブロネクチンが、傷害部位(図8)にすぐに作用する。血漿フィブロネクチンはフィブリンとともに傷害部位に沈着し、凝血塊を形成して出血を止め、その下にある組織を保護する。傷害組織の修復が始まると、線維芽細胞とマクロファージは傷害された区域の再構成(リモデリング)のために、応急的に作られた凝血塊のタンパク質を分解してより周囲の正常な組織に似た細胞外マトリックスで置き換える。線維芽細胞は種々のタンパク分解酵素を分泌するが、そのうちのマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)は血漿フィブロネクチンを分解し、さらに線維芽細胞によって分泌された細胞性フィブロネクチンが不溶性の細胞外マトリックスに集積する。
マトリックスメタロプロテアーゼによって分解されたフィブロネクチンの断片は、創傷治癒の重要な過程である創傷収縮を促進することが示唆されている。フィブロネクチンの断片化によってα4β1インテグリン結合部位である可変領域が暴露される。この断片化フィブロネクチンがα4β1インテグリン発現細胞の結合を促進し、それらの細胞どうしの接着や周辺の細胞外マトリックスの強制的な収縮を可能にすると考えられる。
部位を眼の角膜損傷に限定した上記の創傷治癒の一例である。臨床的に実施されている。目薬としての開発も一時期行われた。
1980年代、大阪大学医学部眼科の西田輝夫は、フィブロネクチンがウサギの眼の角膜の損傷部位に現れることをヒントに、血漿フィブロネクチンの点眼で角膜損傷が治癒することを発見した。
ヒトに応用するには、ヒト血液に含まれるウイルスに対処しなくてはならない。患者本人の血液を出発材料に用いて、数時間で血漿フィブロネクチン点眼薬を作る装置を開発し、この問題を解決した。
角膜の傷は、外傷のほか、角膜ヘルペス感染、糖尿病による神経障害で角膜の表面が損なわれる糖尿病角膜症、三叉(さんさ)神経の手術後のまひ、コンタクトレンズによる障害と、多様な原因で生じる。軽い傷なら、体内にあるフィブロネクチンの作用などで多くは治るが、感染や神経障害が長引くと治りづらくなる。自己血による点眼治療は、この成分を補って治癒を促す。
山口大学病院で、2000年4月から2005年3月までに点眼治療した249例では、202例(81%)に効果がみられた。障害の種類によっても効果に差があり、ヘルペス感染や糖尿病神経障害で角膜表面が損なわれた場合(有効率74%)に比べ、外傷性(同94%)などには効果が高かった。(角膜の傷治療-自己血成分点眼が効果 読売新聞 2006年11月24日)、新聞掲載記事2|山口大学医学部附属病院眼科
西田の発見に基づいて、日本ケミカルリサーチ社がウイルスを不活化させたフィブロネクチン目薬を開発し、臨床試験を進めていた。しかし、ヒト血漿の原料を多量に調達するのが困難で、他方、患者から採血し調製する方がよい品質が得られることから、2004年に開発を中止した。厚生労働省・薬事・食品衛生審議会医薬品第一部会もこの開発中止を了承した。現在、特定の眼科医が、患者本人の血液からフィブロネクチン点眼薬を調製し治療に用いている。
フィブロネクチンは正常なヒトの唾液中にも存在し、口腔や咽頭で病原細菌が増殖するのを防いでいる。
健康時の生体内では血漿フィブロネクチンと細胞性フィブロネクチンの均衡が保たれている。しかし、アルコール性肝疾患で肝臓に障害が起こると、均衡が崩れ、細胞性フィブロネクチンが増加し、この増加がさらに障害を増幅する。
早産の危険性の検査法である。膣分泌液中の胎児性フィブロネクチンを測定することで、それまで曖昧だったヒト妊婦の早産の危険性を的確に検査できる。胎児性フィブロネクチン
遺伝子組換え技術の1つに利用されている。今まで述べてきたように、フィブロネクチンは哺乳類の細胞に接着する。レトロウイルスベクターがフィブロネクチンのヘパリン結合ドメインに結合することを利用し、レトロウイルスベクターを哺乳類細胞の細胞表面にひきつけ、哺乳類細胞へ効率よく遺伝子を導入する方法が開発され、「RetroNectin」(商品名)としタカラバイオ株式会社から市販されている。
さらには、伝令RNA(mRNA)を哺乳類細胞に導入するのにもフィブロネクチンが利用されている。
モノボディ (Monobody)、フィブロネクチンIII型ドメインをベースにした人工的な機能性接着材料
RDGペプチド。RGDモチーフ