RNA干渉
動物におけるRNAサイレンシングの最初の例は1996年に記載された。線虫C. elegansにおいて、par-1 mRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖のRNAを導入することで、par-1 mRNAの分解が引き起こされることが観察された。この分解は一本鎖RNAによって開始されると考えられていたが、その2年後の1998年、ファイアーとメローによってこのpar-1遺伝子発現のサイレンシング能力は実際には二本鎖RNAによって開始されていることが発見された。この発見によって、彼らはノーベル生理学・医学賞を受賞した。この画期的な発見の直後、合成siRNAを用いることで、サイレンシングの標的は遺伝子全体ではなく遺伝子中の特定の配列とすることが可能であることが発見された。そのわずか1年後、トランスジェニックマウスにおいてC型肝炎ウイルス配列を標的として、この配列特異的なサイレンシングの治療応用が実証された。それ以降、RNAiの治療応用を広げる試みが多くの研究者によってなされ、具体的にはさまざまなタイプのがんを引き起こす遺伝子を標的とすることに関心が寄せられた。2006年までに臨床試験に到達した最初の応用は、黄斑変性とRSウイルスの治療であった。その4年後、ナノ粒子デリバリーシステムを用いて、固形腫瘍を標的としたヒトでの初めての第I相臨床試験が開始された。現在のところ大部分の研究はがん治療へのRNAiの応用を試みるものであるが、可能な応用は広範囲にわたる。RNAiは、ウイルス、細菌、寄生虫による感染症、不適応な遺伝子変異の治療、薬物使用の制御、疼痛管理、さらには睡眠の調節にも利用できる可能性がある。
抗ウイルス治療はRNAiベースの医療応用として最初期に提唱されたものであり、2つの異なる種類のものが開発されている。1つはウイルスのRNAを標的とするものである。ウイルスのRNAを標的化することで、HIV、HPV、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、RSウイルス、SARSコロナウイルス、アデノウイルス、麻疹ウイルスなど、多数のウイルスの複製を抑制できることが多くの研究により示されている。もう1つの戦略は、宿主細胞の遺伝子を標的とすることでウイルスの侵入を防ぐものである。たとえば、宿主細胞のケモカイン受容体(CXCR4とCCR5)を抑制することでHIVの侵入を防ぐことができる。
伝統的な化学療法はがん細胞を効果的に殺すことができるが、正常細胞とがん細胞を区別する特異性を欠くために通常は重大な副作用を伴う。RNAiはがんと関連した遺伝子(がん遺伝子など)を標的とすることで腫瘍の成長を阻害する、より特異的なアプローチとなることが多くの研究で示されている。RNAiはがん細胞の化学療法薬に対する感受性を高めることも可能であり、化学療法との併用療法も提唱されている。細胞の浸潤や遊走の阻害も、RNAiベースの他の治療法となる可能性がある。
RNAiは神経変性疾患の治療法となる可能性が示されている。細胞やマウスでの研究では、アミロイドβ(Aβ)を産生する遺伝子(BACE1やAPPなど)をRNAiで特異的に標的化することで、アルツハイマー病と関係するAβペプチドの量を大きく低下させることができることが示されている。さらに、こうしたサイレンシングベースのアプローチは、パーキンソン病やトリプレットリピート病の治療においても有望な結果をもたらしている。
RNAiの臨床的可能性の実現のためには、siRNAが効率的に標的組織の細胞へ輸送される必要がある。しかしながら、臨床利用までに克服すべきさまざまな障壁が存在する。例えば、「裸」のsiRNAはその治療効力を低下させるいくつかの障害の影響を受けやすい。いったんsiRNAが血流に移行すると、裸のRNAは血清中のヌクレアーゼによって分解されたり、自然免疫系を刺激したりする。また、そのサイズと高いアニオン性のため、未修飾のsiRNA分子が細胞膜を通って細胞内へ移行するのは容易ではない。そのため、人工的なsiRNAやナノ粒子に封入したsiRNAを利用する必要がある。しかしながら、細胞膜を越えたsiRNAの輸送にはさらに固有の問題が存在する。siRNAが細胞膜を越えて輸送された場合、その量が最適化されていなければ意図しない毒性が生じたり、オフターゲット効果(部分的な配列相補性を持つ遺伝子に対する意図しないダウンレギュレーションなど)が生じたりする可能性がある。細胞に移行した後も、その効果は細胞分裂ごとに希釈されるため繰り返し投与が必要である。また、dsRNAを運搬するベクターの一部には調節作用がある場合があるため、非特異的な副作用も考慮し、制御される必要がある。
ヒトの免疫系は、自然免疫系と獲得免疫系の2種類に分類される。自然免疫系は感染に対する第一の防御機構であり、病原体に対して一般的応答を行う。一方、獲得免疫系は自然免疫系よりも後で進化した系であり、病原体の分子の特定の部分に反応するよう訓練された、高度に専門化されたB細胞とT細胞によって構成される。
siRNAは自然免疫系によって制御されており、自然免疫系による応答はさらに急性炎症応答と抗ウイルス応答に分類される。炎症応答では、低分子シグナル伝達分子やIL-1、IL-6、IL-12、TNF-αなどのサイトカインが誘導される。こうした炎症性サイトカインは食作用を刺激し、侵入した病原体を破壊する。抗ウイルス応答では、IFN-αやIFN-βなどのタイプIインターフェロンの放出や抗ウイルス遺伝子のアップレギュレーションが誘導される。どちらの応答も、パターン認識受容体(PRR)の刺激を介して引き起こされる。複数のPRRによってRNA構造のさまざまな側面が認識されるため、免疫刺激を避けることは困難なものとなっている。
2015年から2017年にかけて行われたsiRNA治療の第I・II相試験では、肝臓での強力かつ持続的な遺伝子ノックダウン効果と臨床効果を示す一部の徴候がみられ、許容できない毒性はみられなかった。トランスサイレチンの変異によって引き起こされる家族性神経変性・心筋症の治療へ向けた2つの第III相試験が進行中である。多くの研究でin vivoデリバリーシステムの有望性は示されており、またそれらの多様な特性は無数の応用を可能にしている。最も有望なものはナノ粒子デリバリーシステムであるが、製品の安定した品質を確保するためには厳密に制御された混合過程が必要となることなど、製造過程のスケールアップにはさらなる課題が残されている。
RNAiはバイオテクノロジー分野で応用されており、他の分野でも商業化が近い。ニコチンを含まないタバコ、カフェインを含まないコーヒー、栄養素を強化した野菜、低アレルゲンの作物など、RNAiを利用した新たな作物が発されている。遺伝子改変されたリンゴArctic Applesは2015年にFDAの承認を受けた。このリンゴはPPO(ポリフェノールオキシダーゼ)遺伝子をRNAiによって抑制することで、果実を切った後の褐変が起こらないようになっている。PPOがサイレンシングされたリンゴは、クロロゲン酸を標準的なキノン産物へと変換することができないため、変色が起こらない。
作物学におけるRNAiの応用には、ストレス耐性の付与や栄養素の強化などの改善などいくつかの可能性がある。RNAiはC3植物の生産性の向上のための光呼吸の阻害のほか、早期の開花、成熟や老化の遅れ、休眠の解除、ストレスに強い植物、自家不和合性の克服などの誘導に有用である可能性がある。
RNAiは食料生産における将来的有望性が示されているが、まだ若い技術であるためその利点と欠点に対する理解に欠けるところがある。そのため、よりよく理解し誤解を取り除く必要がある。RNAiはすでに、天然毒素の産生が少ない遺伝子組み換え植物に利用されている。こうした技術は、植物においてRNAiの表現型が安定かつ遺伝性のものであることを利用している。ワタの種子はタンパク質に富むが、有毒テルペノイドであるゴシポールを含むためヒトの食物としては適さない。ゴシポール自体は害虫による損傷から植物を守るために重要であるため、植物の他の部分に影響を与えることなく種子でのみゴシポールの産生に重要な酵素δ-カジネンシンターゼを減少させるためにRNAiが利用されている。同様に、キャッサバでシアン化物の原料となるリナマリンを減少させる試みも行われている。
トマト類ではアレルゲンの減少や抗酸化物質の強化に成功している。Flavr Savrトマトやパパイヤリングスポットウイルス耐性パパイヤの2品種など、これまで商業化されている品種はもともとアンチセンス技術を用いて開発されたものであるが、実際にはRNAi経路が利用されている可能性が高い。アスペルギルス・フラバスAspergillus flavusのα-アミラーゼを標的としたRNAiによるサイレンシングはトウモロコシ内でのこの菌類の増殖を低下せ、穀物を危険なアフラトキシンによる汚染から防ぐために利用されている。タマネギでの催涙因子合成酵素(lachrymatory factor synthase)のサイレンシングは切っても涙の出ないタマネギの生産に、アブラナでのBP1遺伝子のサイレンシングは光合成の改善に利用されている。コムギでは、アミロース含量の増大を目的としてSBEIIa、SBEIIb遺伝子が標的となっているほか、六倍体品種の機能ゲノミクス研究にRNAiが、そしてLr21遺伝子によってもたらされるコムギ赤さび病耐性機構の研究のためにvirus-induced gene silencing(VIGS、RNAiの一種)が利用されている。
タバコでは発がん性を有する可能性が高い物質の前駆体を減少させる取り組みが行われている。また実験室レベルでは、一般的な植物ウイルスに対する耐性の付与などの改変が行われている。ケシによる非麻薬性アルカロイドの産生も試みられている。
殺虫剤としてのRNAiの開発が行われており、遺伝子操作や外部からの投与など複数のアプローチがとられている。一部の昆虫の中腸の細胞は、environmental RNAiと呼ばれる過程でdsRNA分子を取り込むことがある。一部の昆虫では、その効果は昆虫の体中に広がり、全身に作用する。ヒトがこうした殺虫性のdsRNAを発現する遺伝子組み換え作物を消費することで予想される曝露量の数百万倍の量を曝露した場合でも、動物に悪影響はみられない。
RNAiの影響は鱗翅目(チョウやガ)の生物種によってさまざまに異なり、おそらくそれは唾液や消化液のRNA分解能力の違いによるものである。cotton bollworm、シロイチモジヨトウ、ニカメイガでは給餌によるRNAi感受性は示されていない。
RNAiに対する耐性は広域的、すなわちある配列に対する耐性が他のdsRNA配列に対する耐性も付与する可能性が示唆されている。あるウエスタンコーンルートワームの実験室集団では、腸からのDvSnf7を標的としたdsRNAの取り込みが起こらないために耐性が生じている。DvSnf7に対する他のdsRNA配列を試した際にも有効性は見られず、耐性管理は単純にdsRNAの配列を切り替えるだけでは困難であることが示唆される。バチルス・チューリンゲンシスBacillus thuringiensis由来のCryタンパク質とRNAiなど複数の戦略を併用することで、耐性の出現は遅らせることができると考えられている。
ショウジョウバエ属Drosophila spp.、カイコガBombyx mori、トノサマバッタ属Locusta spp、スポドプテラ属Spodoptera spp.、コクヌストモドキTribolium castaneum、トビイロウンカNilaparvata lugens、オオタバコガHelicoverpa armigera、セイヨウミツバチApis melliferaは、昆虫の特定の系統内でRNAiがどのように機能するかを知るために広く利用されているモデルである。イエバエMusca domesticaはAgo2遺伝子を2つ持ち、ツェツェバエGlossina morsitansは3つ持つことが知られている。miRNA経路に関しては、ロシアコムギアブラムシDiuraphis noxiaは2つのAgo1、M. domesticaは2つのDcr1、エンドウヒゲナガアブラムシAcyrthosiphon pisumはAgo1、Loqs、Dcr1を2つずつ持ち、Pashaを4つ持つ。piRNAに関しては、G. morsitansとA. pisumは2つまたは3つのAgo3を持つ。こうした研究により、将来的な殺虫剤開発の標的や、作用機序、他の殺虫剤に対する耐性の理由などが明らかとなった。
トランスジェニック作物はdsRNAを発現するように作製されており、その配列は標的害虫の重要な遺伝子をサイレンシングするよう慎重に選ばれたものである。こうしたdsRNAは、特定の遺伝子配列を発現する昆虫のみに影響を与えるよう設計されている。2009年の実証実験では、RNAが4種のショウジョウバエのうちいずれか1種のみに対して殺虫作用を示し、他の3種には害を及ぼさないことが示された。
2012年、シンジェンタはベルギーのRNAi企業Devgenを5億2200万ドルで買収し、モンサントはアルナイラム・ファーマシューティカルズから知的財産権の独占権を2920万ドルで取得した。ペルー・リマの国際ポテトセンターでは、幼虫によるサツマイモの食害が世界的に問題となっているアリモドキゾウムシに対する標的遺伝子の探索が行われている。他にも、アリ、毛虫、pollen beetleなどの遺伝子のサイレンシングが試みられている。モンサントは、アメリカ合衆国だけで毎年10億ドルの被害をもたらしているウエスタンコーンルートワームのSnf7遺伝子を標的としたdsRNAを発現する、トランスジェニックトウモロコシの種子を初めて販売することとなる可能性が高い。2012年の論文では、Snf7のサイレンシングは幼虫の成長を止め、数日以内に死滅させることが示されている。2013年に同チームは、このRNAが他の生物種に影響を与えることはほとんどないことを示した。
dsRNAは遺伝子組み換え以外の方法でも供給することができる。1つのアプローチは、灌漑用水への添加である。RNA分子は植物の維管束系へ吸収され、その植物を食べる昆虫を殺す。他のアプローチは、従来の農薬のような形でのdsRNAの噴霧である。こうした方法は耐性の出現に対してより早く対応することができるが、dsRNAの低コストでの作製法を必要とし、そうした手法は現在のところ存在しない。
ゲノムスケールでのRNAi研究は、ハイスループットスクリーニング(HTS)技術に依存している。RNAi HTS技術はゲノムワイドな機能喪失スクリーニングを可能にし、特定の表現型と関係する遺伝子の同定に広く利用されている。この技術は、遺伝子発現マイクロアレイや一塩基多型発見プラットフォームといったゲノミクスの第一の波に続く、第二の波となる可能性があるとの評価がなされている。ゲノムスケールでのRNAiスクリーニングの大きな利点の1つは、数千もの遺伝子を同時に調査することができる点である。ゲノムスケールでのRNAiスクリーニングでは1つの実験から大量のデータが生み出されるため、データ生成量の爆発的増加をもたらしている。こうした巨大なデータセットの処理は基本的な課題となっており、適切な統計学やバイオインフォマティクス的手法を必要とする。細胞ベースのRNAiスクリーニングの基本的過程は、RNAiライブラリや頑強で安定した細胞種の選択、RNAi試薬によるトランスフェクション、処理とインキュベーション、シグナル検出、重要な遺伝子または治療標的遺伝子の解析、同定などからなる。
RNAi過程は、それがRNAと関連した機構であることが知られる前には、"co-suppression"や"quelling"と呼ばれていた。RNAiの発見に先立って、トランスジェニック植物で発現させたアンチセンスRNAによる転写阻害がまず観察され、そして1990年代初頭のアメリカ合衆国とオランダの植物学者によって行われた実験による予想外の結果の報告によってより直接的にRNAiの発見への道が開かれた。この実験ではペチュニアの花の色の変化が試みられ、研究者らは正常なピンクまたはスミレ色の花のペチュニアに対し、花の色素形成に重要な酵素であるカルコンシンターゼをコードする遺伝子のさらなるコピーを導入した。コピー数の増加による遺伝子の過剰発現によってより濃い色の花となることが予想されたが、実際には一部の花では紫色の色素は薄くなり、そして斑入りのパターンが形成されることもあった。このことは、カルコンシンターゼの活性は状況依存的に大きく低下するか、または抑制されていることを示していた。後に、一部の形質転換体のゲノム中のさまざまな位置で反対向きのプロモーターに隣接して導入遺伝子が挿入された結果、プロモーターの活性化によってアンチセンス転写産物が発現し、遺伝子がサイレンシングされたという説明がなされた。初期のRNAiの観察の他の例としてはアカパンカビNeurospora crassaの研究のものがあるが、これが関連した現象であるとはすぐには認識されなかった。植物での現象のさらなる研究によって、ダウンレギュレーションはmRNAの分解率の上昇を介した、遺伝子発現の転写後阻害によるものであることが示された。この現象は"co-suppression of gene expression"と呼ばれたが、その分子機構はいまだ不明のままであった。
それから間もなく、ウイルス病に対する植物の耐性の改善に取り組んでいた植物ウイルス学者らによって、類似した予想外の現象が観察された。ウイルス特異的タンパク質を発現する植物はウイルス感染に対するトレランス(tolerance)や抵抗性(resistance)の向上がみられることは知られていたが、ウイルスRNA配列の短い非コード領域のみを持つ植物も同様の防御レベルを示すという予想外の結果が得られた。研究者らは導入遺伝子によって産生されるウイルスRNAがウイルスの複製を阻害すると考えた。逆実験として、植物遺伝子の短い配列を導入したウイルスは、感染した植物で標的遺伝子を抑制することが示された。この現象は"virus-induced gene silencing"(VIGS)と呼ばれ、これらの現象はまとめて"post transcriptional gene silencing"と呼ばれるようになった。
こうした植物における初期の観察の後、他の生物種におけるこうした現象の探索が行われた。クレイグ・メローとアンドリュー・ファイアーによる1998年のNature誌の論文では、C. elegansに二本鎖RNAを注入した後に強力な遺伝子サイレンシング効果がみられることが報告された。彼らは筋タンパク質の産生の調節の研究の際に、mRNAやアンチセンスRNAの注入はタンパク質産生に影響を及ぼさないが、二本鎖RNAの注入によって標的遺伝子がサイレンシングされることを発見した。この研究をもとに、RNAiという用語を作った。この発見は、この現象の原因となる因子を初めて同定したこととなる。ファイアーとメローは2006年にノーベル生理学・医学賞を受賞した。