タンパク質工学
このin vitroの方法は、キメラ遺伝子を生成するためのテンプレートスイッチングに基づくものである。このPCRに基づく方法は、テンプレートの最初の変性から始まり、プライマーのアニーリングと短い伸長時間が続く。その後のすべてのサイクルで、前のサイクルで生成された短い断片とテンプレートの異なる部分との間にアニーリングが生じる。これらの短い断片とテンプレートは、配列の相補性に基づいて一緒にアニールする。このように断片がテンプレートDNAとアニールするプロセスは、テンプレートスイッチングとして知られている。そして、これらのアニールした断片は、さらに伸長するためのプライマーとして機能することになる。この方法は、親長さのキメラ遺伝子配列が得られるまで実行される。この方法の実行には、フランキングプライマーが必要なだけである。また、DnaseI酵素も必要ない。
この方法では、キメラ遺伝子1個あたり平均14回のクロスオーバーでキメラ遺伝子ライブラリーを作成できることが確認されている。まず、親株のトップストランドの断片を、相同遺伝子のウラシルを含むテンプレートのボトムストランドにアライメントする。Pfuおよびtaq DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性により、5'および3'オーバーハングフラップが切断され、ギャップが埋められる。その後、ウラシルを含む鋳型をウラシルDNAグルコシラーゼで処理することによりヘテロ二重鎖から除去し、さらにPCRを用いて増幅させる。この方法は、比較的高いクロスオーバー頻度でキメラを生成することができるため、有利である。しかし、一本鎖DNAやウラシル含有一本鎖鋳型DNAの作製が必要であり、複雑であるため、やや制限がある。
合成縮重オリゴヌクレオチドのシャッフルは、最適コドンや有益な変異を含むオリゴヌクレオチドを含むことができるため、シャッフル方法に柔軟性を与える。
酵母で行われるクローニングでは、断片化した発現ベクターをPCRによって再集結する。この再構築されたベクターは、酵母に導入され、クローニングされる。酵母を使ってベクターをクローニングすることで、大腸菌でのライゲーションや増殖で生じる毒性や逆選択を回避することができる。
この方法は、酵母の相同組換えの頻度が高いことを利用して、遺伝子の特定領域に変異を導入し、他の部分はそのままにするものである。
この方法は、進化した遺伝子を宿主から宿主に移すために、ライフサイクルを変更したバクテリオファージを利用するものである。ファージのライフサイクルは、転送が酵素からの目的の活性と相関するように設計されている。この方法は、遺伝子を継続的に進化させるために、人間の介入を最小限に抑えられるという利点がある。
これらの方法は、タンパク質が配列の相同性を欠きながら、類似した構造の同一性を示すことがあるという事実に基づいている。
エクソンシャッフリングとは、イントロンで起こる組換え現象によって、異なるタンパク質のエクソンが組み合わされることである。オルソログエクソンシャッフルは、異なる生物種のオルソログ遺伝子のエクソンを結合する。オルソログドメインシャッフリングは、異なる種のオルソログ遺伝子からタンパク質ドメイン全体をシャッフルするものである。パラロガスエクソンシャッフリングは、同一種の異なる遺伝子からのエクソンをシャッフルする。パラロガスドメインシャッフリングは、同じ生物種のパラログタンパク質からタンパク質ドメイン全体をシャッフルする。機能的相同ドメインシャッフルは、機能的に関連する非相同ドメインのシャッフルを行う。これらのプロセスはすべて、キメラ合成オリゴヌクレオチドを用いて、異なる遺伝子から目的のエクソンを増幅することから始まる。この増幅産物は、プライマーレスPCRを用いて全長の遺伝子に再構成される。このPCRサイクルの間、断片はテンプレートおよびプライマーとして機能する。この結果、キメラ全長遺伝子が得られ、スクリーニングに供される。
親遺伝子の断片は、エキソヌクレアーゼIIIによる制御切断で作られる。これらの断片はエンドヌクレアーゼで平滑末端化され、ハイブリッド遺伝子を生成するためにライゲーションされる。THIOITCHYは、ITCHYを改良したもので、α-ホスホチオエートdNTPなどのヌクレオチド三リン酸アナログを利用した手法である。これらのヌクレオチドを組み込むことで、エキソヌクレアーゼIIIによる切断を阻害することができる。このエキソヌクレアーゼIIIによる切断の阻害をスパイクと呼ぶ。スパイキングは、まずエキソヌクレアーゼで遺伝子を切断し、短い一本鎖のオーバーハングを持つ断片を作ることで達成できる。これらの断片は、少量のホスホチオエートdNTPsの存在下でDNAポリメラーゼによる増幅のためのテンプレートとして機能する。これらの断片は、その後、全長の遺伝子を形成するために一緒にライゲーションされる。あるいは、インタクトな親遺伝子を、通常のdNTPおよびホスホチオエートdNTPの存在下でPCRにより増幅することもできる。これらの全長増幅産物は、次にエキソヌクレアーゼによる切断に供される。切断はエキソヌクレアーゼがα-pdNTPに出会うまで続けられ、異なる長さの断片ができる。これらの断片をライゲーションしてキメラ遺伝子を生成する。
本方法は、DNAシャフリングとITCHYを組み合わせることにより、多重クロスオーバーを抑制するハイブリッド遺伝子のライブラリーを作成するものである。本方法は、まず2つの独立したITCHYライブラリーを構築する。一つは、遺伝子AをN末端に持つもの。そしてもう一つは、N末端に遺伝子Bを持つものである。これらのハイブリッド遺伝子断片は、制限酵素切断または末端プライマーを用いたPCRにより、アガロースゲル電気泳動で分離される。これらの分離された断片を混合し、さらにDNaseIを使って切断する。切断された断片は、テンプレートスイッチングによるプライマーレスPCRで再組み立てされる。
本方法は、キメラのテンプレートとなる一本鎖DNA断片の存在下で、一方向に成長するポリヌクレオチドのテンプレートスイッチングによりハイブリッド遺伝子のライブラリーを作成する。本方法は、まず、標的mRNAから逆転写して一本鎖DNA断片を調製する。次に、遺伝子に特異的なプライマーを一本鎖DNAにアニールさせる。そして、これらの遺伝子はPCRサイクルの間に伸長される。このサイクルの後、テンプレートを交換し、先のプライマー伸長から得られた短い断片を他の一本鎖DNA断片にアニールする。このプロセスは、全長の一本鎖DNAが得られるまで繰り返される。
この方法は、配列の相同性がほとんどない遺伝子間で組換えを生じさせるものである。これらのキメラは、いくつかの制限部位を含むリンカー配列を介して融合される。このコンストラクトはDNaseIで切断される。断片はS1ヌクレアーゼで平滑末端化される。これらの平滑末端端フラグメントは、ライゲーションによって環状配列にまとめられる。この環状コンストラクトを、リンカー領域に制限部位が存在する制限酵素を使用して線状化する。この結果、5'末端と3'末端への遺伝子の寄与が、出発時の構築物と比較して逆転したキメラ遺伝子のライブラリーが得られる。
この方法では、複数の親遺伝子から複数のクロスオーバーを持つ遺伝子のライブラリーが得られる。この方法では、親遺伝子間の配列の同一性は必要ないない。しかし、すべてのクロスオーバー位置に1~2個の保存アミノ酸が必要である。まず、親遺伝子の配列をアライメントし、クロスオーバー部位となるコンセンサス領域を特定する。その後、制限部位を含む特定のタグを組み込み、Bac1による切断でタグを除去することにより、末端が凝集した遺伝子が得られる。これらの遺伝子断片を適切な順序で混合してライゲーションし、キメラライブラリーを形成する。
この方法は、まず相同な遺伝子のアライメントを行い、次に多型の領域を特定する。次に、遺伝子の上鎖を小さな変性オリゴヌクレオチドに分割する。下側の鎖もオリゴヌクレオチドに切断され、足場となる。これらの断片は溶液中で結合され、トップ鎖のオリゴヌクレオチドはボトム鎖のオリゴヌクレオチドに組み合わされる。これらの断片間の隙間はポリメラーゼで埋められ、ライゲーションされる。
この方法は、相同性を持たない複数のDNA断片を、1回のPCRでシャッフルするものである。その結果、異なる構造単位をコードするモジュールが組み合わされ、完全なタンパク質が再構築される。
この方法は、まず、ウラシルdNTPを使用して、組み換えが必要な遺伝子断片を増幅することから始まる。この増幅液には、プライマー、PfuTurbo、Cx Hotstart DNAポリメラーゼも含まれている。増幅された生成物は、次にUSER酵素とインキュベートされる。この酵素は、DNAからウラシル残基を除去して1塩基対のギャップを作ることを触媒する。USER酵素で処理した断片を混合し、T4 DNAリガーゼでライゲーションし、Dpn1切断でテンプレートDNAを除去する。得られた一本鎖の断片はPCRで増幅され、大腸菌に形質転換される。
この方法では、制限部位の外側を切断する2型制限酵素を用いることで、少なくとも9種類の断片をアクセプターベクターに組み換えることができる。まず、断片を別々のベクターにサブクローニングし、両側にBsa1フランキング配列を作成する。次に、これらのベクターをII型制限酵素Bsa1で切断し、4ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを生成させる。相補的なオーバーハングを持つ断片はハイブリダイズされ、T4 DNAリガーゼを用いてライゲーションされる。最後に、これらのコンストラクトは大腸菌に形質転換され、発現レベルのスクリーニングが行われる。
この方法は、構造要素やタンパク質ドメイン全体の組み換えに使用することができる。この方法は、ホスホロチオエート化学に基づいており、ホスホロチオジエステル結合を特異的に切断することができる。プロセスの最初のステップは、ベクターバックボーンと一緒に組み換える必要があるフラグメントの増幅から始まる。この増幅は、5'末端にホスホロチオール化ヌクレオチドを持つプライマーを用いて達成される。増幅されたPCR産物は、エタノール-ヨウ素溶液中で高温で切断される。次に、これらの断片は室温でハイブリダイズされ、大腸菌に形質転換され、あらゆるニックが修復される。
このシステムは、大腸菌の自然な部位特異的組換えシステムをベースにしている。このシステムはインテグロンシステムと呼ばれ、自然な遺伝子シャッフルを生じさせる。この方法を用いて、trp欠損大腸菌において、個々の組換えカセットまたはtrpA-E遺伝子と調節エレメントをインテグロンシステムで送り込むことにより、機能的なトリプトファン生合成オペロンを構築し最適化した。
この方法では、5'または3'末端の単一ブロック配列、ステムループ領域の相補配列、PCRのプライマー結合部位となるD分岐領域を含む一本鎖DNA鎖を生成する。5'側と3'側の両半鎖が等量ずつ混合され、ステム領域での相補性によりハイブリッドが形成される。3'半鎖の5'末端がリン酸化されたハイブリッドは、0.1 mM ATPの存在下でT4 DNAリガーゼを用いて5'半鎖の3'末端と結合される。ライゲーションした生成物を2種類のPCRで増幅し、pre 5' halfとpre 3' halfのPCR生成物を生成する。これらのPCR産物は、ビオチン標識されたステム配列を含むプライムの5'末端へのアビジン-ビオチン結合を介して一本鎖に変換される。次に、ビオチン標識された5'ハーフストランドとビオチン標識されていない3'ハーフストランドは、次のYライゲーションサイクルの5'と3'のハーフストランドとして使用される。
半合理的設計は、タンパク質の配列、構造、機能に関する情報を、予測アルゴリズムと組み合わせて使用する。これらを組み合わせて、タンパク質の機能に最も影響を与える可能性の高い標的アミノ酸残基を特定する。これらの重要なアミノ酸残基を変異させることで、より優れた特性を持つ可能性の高い変異タンパク質のライブラリーを作成する。
半合理的酵素工学とde novo酵素設計の進歩は、研究者に生体触媒を操作する強力で効果的な新しい戦略を提供する。配列と構造に基づくアプローチをライブラリ設計に統合することは、酵素の再設計のための素晴らしいガイドとなることが証明されている。一般に、現在の計算機によるデノボやリデザインの手法は、触媒性能において進化的変異導入とは比較にならない。実験的な最適化は、指向性進化を利用して生み出されるかもしれないが、構造予測の精度のさらなる向上と触媒能力の向上は、設計アルゴリズムの改良によって達成されるであろう。将来的には、タンパク質ダイナミクスを統合することで、さらなる機能強化がシミュレーションに含まれるかもしれない。
生化学的・生物物理学的研究と予測フレームワークの微調整は、個々のデザイン特徴の機能的意義を実験的に評価するために有用である。これらの機能的貢献の理解を深めることで、将来の設計を改善するためのフィードバックが得られるだろう。
計算機によるタンパク質設計は、タンパク質工学が生体高分子を操作する方法を根本的に変えたが、指向性進化がタンパク質工学の選択法として取って代わることはないだろう。仮説駆動型タンパク質工学のための予測的フレームワークを組み込んだ方法を用いることで、より小さく、より焦点を絞った、機能的に豊かなライブラリーが生成されるかもしれないない。新しい設計戦略と技術の進歩により、従来のプロトコールからの脱却が始まっている。例えば、指向性性進化は、フォーカスされたライブラリーの中でトップレベルの性能を持つ候補を特定するための最も効果的な戦略である。全遺伝子ライブラリー合成は、ライブラリー調製のためのシャッフリングや変異導入プロトコルに取って代わりつつある。また、何百万もの候補をスクリーニングし、選別するという途方もない努力の代わりに、特異性の高い低スループットスクリーニングアッセイがますます適用されるようになっている。これらの開発により、タンパク質工学は指向性進化を超え、生物触媒を調整するための実用的でより効率的な戦略へと移行しつつある。
タンパク質が指向性進化、合理的設計、半合理的設計を受けたら、どの変異体がより優れた特性を示すかを決定するために、変異タンパク質のライブラリーをスクリーニングする必要がある。ファージディスプレイ法は、タンパク質をスクリーニングするための一つの選択肢である。この方法では、変異型ポリペプチドをコードする遺伝子とファージのコートタンパク質遺伝子を融合させる。ファージ表面に発現したタンパク質変異体は、in vitroで固定化されたターゲットとの結合によって選択される。次に、選択されたタンパク質変異体を持つファージを細菌中で増幅し、ELISA法により陽性クローンを同定する。これらの選択されたファージは、DNAシークエンシングが行われる。
細胞表面ディスプレイシステムは、変異ポリペプチドライブラリーのスクリーニングにも利用することができる。ライブラリーの変異遺伝子を発現ベクターに組み込んで、適切な宿主細胞に形質転換する。これらの宿主細胞は、さらにハイスループットなスクリーニングにかけられ、所望の表現型を持つ細胞を同定することができる。
in vitroでのタンパク質翻訳や無細胞翻訳を利用するために、セルフリーディスプレイシステムが開発されてきた。これらの方法には、mRNAディスプレイ、リボソームディスプレイ、共有結合および非共有結合のDNAディスプレイ、in vitroコンパートメント化などが含まれる。
酵素工学は、酵素の構造(すなわち機能)を変更したり、単離された酵素の触媒活性を変更して、新しい代謝物を生成したり、新しい(触媒)反応の経路を可能にする応用であり また、ある特定の化合物を他の化合物に変換する(生体内変換)。これらの製品は、化学物質、医薬品、燃料、食品、農業用添加物などとして有用である。
酵素リアクター  は酵素的手段によって所望の変換を行うために使用される反応媒体を含む容器から構成されている。このプロセスで使用される酵素は、溶液中で遊離している。また、微生物は本物の酵素の重要な起源の1つである。
コンピューティングの手法により、Top7と名付けられた新しいフォールドを持つタンパク質や 、非天然分子のセンサーが設計されている 。融合タンパク質の設計により、クリオピリン関連周期性症候群の治療薬としてFDA(米国食品医薬品局)の認可を得た「リロナセプト」が誕生した。
もう一つの計算手法であるIPROは、Candida boidiniiのキシロース還元酵素の補酵素特異性を変えることに成功した。  IPRO(Iterative Protein Redesign and Optimization)は、タンパク質を再設計し、本来の基質や新規の補酵素に対する特異性を高める、または与えるものである。これは、指定された設計位置の周囲でタンパク質の構造を繰り返しランダムに摂動させ、ロータマーの最も低いエネルギーの組み合わせを特定し、新しい設計が以前のものよりも低い結合エネルギーを持つかどうかを決定することによって行われる。
計算支援設計は、高度に秩序化されたナノタンパク質集合体の複雑な特性を設計するためにも使用されている。 大腸菌バクテリオフェリチン(EcBfr)は、2つのオリゴマー状態を持つことで構造的に不安定で不完全な自己組織化挙動を示すタンパク質ケージであり、本研究のモデルタンパク質である。計算機解析やホモログとの比較から、このタンパク質は2回対称軸上の2量体界面が平均より小さく、その主な原因は2つの水架橋アスパラギン残基を中心とした界面水ポケットの存在であることが判明している。EcBfrの構造安定性を向上させるエンジニアリングの可能性を検討するため、半経験的計算法を用いて、野生型EcBfrに対する二量体界面における480種の変異体のエネルギー差を仮想的に探索した。この計算科学的研究は、水架橋アスパラギンにも収束する。この2つのアスパラギンを疎水性アミノ酸に置き換えると、α-ヘリカルモノマーにフォールディングされ、ケージに組み上がるタンパク質が得られることが、円二色性と透過電子顕微鏡で証明された。熱変性と化学変性の両方で、すべての再設計されたタンパク質は、計算と一致し、安定性が向上していることが確認された。また、3つの変異のうち1つは、溶液中で高次のオリゴマー化状態にシフトすることが、サイズ排除クロマトグラフィーとネイティブゲル電気泳動の両方から示された。
細菌チャネルタンパク質(OmpF)の1nmの細孔を、任意のサブnmサイズに縮小するインシリコ手法、PoreDesignerの開発に成功した。設計した細孔を生体模倣ブロックポリマーマトリックスに組み込んで輸送実験を行ったところ、塩を完全に排出することができた。