RT-PCR

RT-PCR on laboratoriotekniikka, jolla monistetaan RNA:ta DNA:n muotoon. Aluksi menetelmässä käytetään käänteistranskriptaasia tuottamaan näytteen RNA:sta DNA:ta. Sitten DNA:ta monistetaan samalla tavoin kuin normaalissa polymeraasiketjureaktiossa eli PCR:ssä. RT-PCR:ää käytetään lääketieteessä leima-aineiden avulla toteamaan muun muassa RNA-virussairauksia, syöpiä ja autoimmuunisairauksia. Menetelmää käytetään myös muussa tieteellisessä tutkimuksessa. RT-PCR on lyhenne englanninkielen sanoista "reverse transcriptase polymerase chain reaction", eli käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktio.
RT-PCR:ssä saadaan signaalin voimakkuus (intensiteetti), joka on sitä vahvempi, mitä enemmän näytteessä on tunnistuksen kohteena olevaa RNA:ta. Signaali pohjautuu leima-aineiden fluoresenssiin tai muuhun tunnistustekniikasta riippuvaan havaittavaan muutokseen. RT-qPCR:ssä eli reaaliaikaisessa eli kvantitatiivisessa RT-PCR:ssä (q = eng. "quantitative") mukana on intensiteetin lisäksi toisena mittausulottuvuutena aika. RT-qPCR on menetelmänä lähes sama kuin qPCR (kvantitatiivinen eli reaaliaikainen PCR). Pelkässä qPCR:ssä ei kuitenkaan käytetä käänteistranskriptaasia, eli sillä voidaan tutkia vain DNA-näytteitä. RT-qPCR:ssä ja qPCR:ssä jokaisessa DNA:ta monistavassa vaiheessa mitataan leima-aineista saatu signaali. Signaalien muutos saadaan siis eri ajankohtina. qPCR:ää kutsutaan joskus virheellisesti RT-PCR:ksi, jossa "RT" on tässä tilanteessa lyhenne englanninkielen sanoista "real time". "RT"-liite on kuitenkin varattu vain käänteistranskriptaasia käyttäville menetelmille.
Menetelmä.
RT-PCR:ssä näytteeseen lisätty käänteiskopioijaentsyymi eli käänteistranskriptaasi tuottaa näytteessä olevia RNA-juosteita mallina käyttäen nukleotidijärjestykseltään tätä RNA:ta vastaavia eli komplementaarisia DNA-juosteita (cDNA). cDNA:n rakennusaineina käänteistranskriptaasi käyttää näytteeseen lisättyä neljää deoksiribonukleosiditrifosfaattia eli dNTP:tä, joissa emäkset ovat adeniini (dATP), tymiini (dTTP), guaniini (dGTP) ja sytosiini (dCTP).
Tämän jälkeen cDNA:ta monistetaan kuten normaalissa PCR:ssä. Näytteeseen lisätyt DNA-polymeraasit siis tuottavat kunkin cDNA:n rinnalle toisen DNA-juosteen dNTP:itä käyttäen. Muodostuu kaksoisjuosteisia DNA:ita. Näiden juosteet erotetaan yksijuosteisiksi DNA:iksi lämpöliikkeen avulla kuumentamalla näytettä hetken suunnilleen lämpötilaan 95 °C. Polymeraasit poikkeavat tyypillisistä DNA-polymeraaseista, sillä ne kestävät tämän kuumennuksen denaturoitumatta. Yleisesti käytetyt polymeraasit ovat "Thermus aquaticus" -bakteereista erotettuja "Taq"-polymeraaseja tai niihin pohjautuvia geenimuunneltuja polymeraaseja. Näyte viilennetään, jolloin polymeraasit tuottavat yksijuosteisten DNA:iden rinnalle lisää ketjuja ja muodostuu taas kaksoisjuosteisia DNA:ita. Kuumennuksen, viilennyksen ja monistuksen kiertoa toistetaan useasti, kunnes alkuperäiseen RNA:han pohjautuvaa DNA:ta muodostuu haluttu määrä. Monistuminen on eksponentiaalista, sillä kussakin uudessa kierrossa muodostuu 2-kertaa edellistä kiertoa enemmän DNA:ta.
Polymeraasit voivat kiinnittyä vain kaksoisjuosteiseen DNA:han. Siksi näytteeseen, jolle suoritetaan RT-PCR tai PCR, on lisätty myös lyhyitä keinotekoisesti tuotettuja DNA-pätkiä, niin sanottuja alukkeita. Alukkeiden pituus on usein noin 20–30 nukleotidia. Alukkeissa on tietty nukleotidijärjestys ja ne kiinnittyvät siksi vain tiettyihin DNA-jaksoihin yksijuosteisissa DNA:issa. Polymeraasi aloittaa monistuksen näistä kohdista liittäen uusia nukleotideja alukkeen 3'-pään jatkoksi. Synteesi pysähtyy yksijuosteisen DNA:n lopussa (5'-päässä).
RNA-sekvenssien tunnistusmenetelmät.
Yksijuosteisiin DNA:ihin voidaan liittää synteesiin vaadittujen alukkeiden lisäksi muita DNA-alukkeita. Näitä voidaan käyttää alkuperäisessä RNA:ssa olevien geenien tai muiden alueiden eli sekvenssien tunnistukseen. Kuten muutkin alukkeet, nämä tunnistusalukkeet kiinnittyvät vain tiettyihin alueisiin, jotka voivat olla esimerkiksi geenejä. "Taq"-tyypin polymeraasi pilkkoo tällaisen tunnistusalukkeen 5'-päätä jonkin verran 3'-pään suuntaan ennen kuin aluke irtoaa kokonaan. Polymeraasilla sanotaan siksi olevan 5'-3'-eksonukleaasiaktiivisuus. Tätä aktiivisuutta käytetään hyväksi esimerkiksi TaqMan-kauppanimellä myydyssä menetelmässä. Menetelmässä tunnistusalukkeen 5'-päässä voi olla fluoresoiva aine, jota sen 3'-päässä oleva aine estää fluoresoimasta. Polymeraasi vapauttaa fluoresoivan aineen, jolloin se alkaa fluoresoimaan havaittavasti. Mikäli tunnistusalue ei löydä sopivaa kiinnittymiskohtaa DNA:ssa, se ei kiinnity siihen, eikä siten pilkkoudu ja tuota fluoresenssia. Testi on tällöin siis negatiivinen eli geeniä tai muuta tutkimuksen kohteena olevaa aluetta ei ole RNA:ssa. TaqMan ei kuitenkaan ole ainoa tunnistusmenetelmä.
Käyttökohteet.
RT-PCR:ää käytetään tunnistamaan määrällisesti (kvantitatiivisesti) muun muassa mRNA:ta, jolloin saadaan selville jonkin tietyn geenin geeniekspression määrä kudoksessa tai yksittäisessä solussa. Menetelmä on siksi hyödyllinen työkalu tieteellisessä tutkimuksessa. Menetelmää käytetään myös lääketieteessä, sillä lääketieteen RT-PCR-protokollat tapauskohtaisesti nopeita (mittaukset vievät yleensä muutamia kymmeniä minuutteja), halpoja ja tarkkoja verrattuna muihin vaihtoehtoisiin menetelmiin.
Lääketieteessä RT-PCR:n avulla voidaan tunnistaa virusten RNA:ta ja todeta siten RNA-virustartunta, kuten HIV. Menetelmällä voidaan myös seurata HIV:tä tai jotain muuta RNA-virustautia potevan viruslääkehoidon teho. RT-PCR:llä voidaan myös tunnistaa kehon solujen tuottamaa mRNA:ta tai miRNA:ta. Näiden tuotto liittyy geeniekspressioon. Geeniekspressio muuttuu muun muassa tietyissä syövissä, autoimmuunisairauksissa, elinsiirtojen hyljintäreaktioissa ja tulehduksellisissa sairauksissa, joiden toteamiseen RT-PCR:ää voidaan ehkä soveltaa. RT-PCR-tutkimuksella voidaan tällaisen taudin toteamisen lisäksi joissain tapauksissa esimerkiksi arvioida, että sopiiko jokin tietty syöpähoito potilaan syöpään vai ei.
Käytännössä toimivan lääketieteellisen RT-PCR-protokollan kehittäminen vaatii tutkimusta virhediagnoosien välttämiseksi. Esimerkiksi eri ihmisillä voi perimästään riippuen olla joistakin geeneistä erilaisia mRNA:ita silmukoitumisen seurauksena. Menetelmän herkkyyden takia testattavat näytteet voivat saastua herkästi. RNA on myös verrattain epävakaa molekyyli ja voi hajota näytteen säilytyksen tai puhdistuksen aikana. Virukset mutatoituvat, jolloin tunnistusalukkeet eivät enää kiinnity niiden perimään. Tämä voi olla ongelma virustartuntojen toteamisen kannalta.