Polymeraasiketjureaktio

PCR eli polymeraasiketjureaktio () on yksi tärkeimmistä molekyylibiologian menetelmistä, jolla esimerkiksi yksittäinen geeni tai mikä tahansa DNA-pätkä voidaan monistaa eksponentiaalisesti. PCR suoritetaan elävien solujen ulkopuolella laboratoriossa (in vitro), käyttäen erityistä PCR-laitetta. PCR:n avulla hyvin pienestä DNA-määrästä saadaan muutamassa tunnissa monistettua miljardikertainen määrä samaa DNA:ta.
PCR-tekniikkaa käytetään moniin tarkoituksiin, muun muassa perinnöllisten sairauksien etsimiseen, yksilöiden tunnistamiseen geneettisten sormenjälkien avulla, infektiosairauksien diagnosointiin ja geenien kloonaamiseen.
Polymeraasiketjureaktioon perustuvat monet muut molekyylibiologian menetelmät, kuten qPCR, RT-PCR ja nämä yhdistävä RT-qPCR.
Historia.
Ensimmäisen PCR:n kaltaisen menetelmän kuvasi norjalainen Kjell Kleppe tutkimusryhmänsä kanssa jo vuonna 1971, jolloin Kleppe julkaisi yhdessä Nobel-palkitun H. Gobind Khoranan kanssa artikkelin "Repair replication of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases" "Journal of Molecular Biologyssa". Artikkelissaan he käytännössä kuvasivat PCR:n perusteet. Artikkeli perustui Kleppen kokeisiin, joissa hän oli ensin kaksin- ja sitten nelinkertaistanut pienen synteettisen DNA-pätkän kahden alukkeen ja DNA-polymeraasin avulla. Kleppen työ jäi kuitenkin vähälle huomiolle ja vasta Kary Mullis ja hänen työtoverinsa Cetus Corporationissa kehittivät menetelmää niin pitkälle, että PCR-tekniikasta tuli laboratoriotyöskentelyn arkea. Kary Mullis sai vuonna 1983 aloittamastaan työstä Nobelin kemianpalkinnon vuonna 1993.
PCR:n osat.
PCR-reaktion tilavuus on useimmiten hyvin pieni, noin 10–150 μl. Useimmiten monistettavan alueen koko on alle 10 kbp, mutta reaktion komponentteja muuttamalla myös jopa 40 kbp:n mittaisten alueiden monistaminen on mahdollista. Yksinkertaisimmillaan tavallinen PCR-reaktio sisältää seuraavat osat:
Templaatti-DNA () on monistusreaktion kohde. Monistettava DNA voi olla esimerkiksi genomista, mitokondriaalista tai plasmidi-DNA:ta. Templaatin puhtaus ja hyvä laatu ovat ensiarvoisen tärkeitä reaktion onnistumiselle. Alukkeet () puolestaan ovat synteettisiä, 15–50 nukleotidia pitkiä DNA-jaksoja, jotka tunnistavat monistettavan DNA-alueen päät ja kiinnittyvät niihin emäsparisäännön mukaisesti. Kaksi aluketta rajaa monistettavan alueen sen 5'- ja 3'-päistä, joista lähtien polymeraasientsyymi () monistaa halutun DNA-pätkän.
"Thermus aquaticus" -bakteerista eristetty "Taq"-polymeraasientsyymi on yksi yleisimmin käytetyistä entsyymeistä. Myös muita polymeraasientsyymejä käytetään säännöllisesti, varsinkin kun halutaan monistaa joko pidempiä alueita tai monistuksen nopeutta tai virheettömyyttä halutaan kasvattaa. Polymeraasientsyymi rakentaa uuden DNA-juosteen yksittäisistä dNTP-molekyyleistä (dATP, dTTP, dCTP ja dGTP), joiden konsentraatio reaktiossa on yleensä yhtä suuri.
Näiden reaktion välttämättömien osasten lisäksi PCR-reaktiossa käytetään lisäksi usein myös muita aineita, joiden tarkoituksena on muuttaa reaktion olosuhteita suotuisemmiksi. Puskuriliuoksen tehtävänä on muuttaa reaktion olosuhteet otollisiksi DNA:n monistumiselle ja stabiloida polymeraasientsyymiä. Liuoksen tarkka koostumus on entsyymispesifi ja se on siksi useimmiten myös valmistajayhtiön patentoima. Ionien konsentraatiot puolestaan vaikuttavat reaktion tarkkuuteen. Yleisimmin kationien lähteenä käytetään magnesiumkloridiliuosta (MgCl2), mutta myös mangaani-ionien (Mn2+) käyttö on mahdollista. Ionien konsentraation kasvaessa reaktion spesifisyys laskee.
PCR:n kulku.
Polymeraasiketjureaktiossa toistetaan yksinkertaisimmillaan kolmea vaihetta:
Reaktion aikana DNA:n vastinjuosteet irtoavat toisistaan, alukkeet liittyvät yksijuosteiseen DNA:han ja polymeraasi luo alukkeista alkaen uuden vastinjuosteen. Näitä vaiheita peräkkäin toistamalla monistettavan alueen kopiomäärä kasvaa eksponentiaalisesti.
Denaturaatiovaiheessa reaktioseos kuumennetaan 94–98 °C:seen noin 30 sekunnin tai pisimmillään yhden minuutin ajaksi riippuen käytettävän DNA-templaatin kompleksisuudesta. DNA denaturoituu ja sen vastinjuosteet irtoavat toisistaan korkean lämpötilan vaikutuksesta. Reaktion ensimmäisenä vaiheena voidaan usein myös käyttää niin kutsuttua alkudenaturaatiota, jossa lämpötila nostetaan 94-98 asteeseen kahdeksi minuutiksi. Tämän vaiheen tarkoituksena on varmistaa kaikkien DNA-molekyylien täydellinen denaturaatio.
Alukkeiden liittymisvaiheessa PCR-reaktioseoksen lämpötila lasketaan alukkeiden nukleotidisekvenssistä riippuen noin 45–65 °C:seen. Lämpötila on riippuvainen alukkeiden "sulamislämpötilasta" ("Tm"), joka puolestaan on suoraan verrannollinen alukkeen emäskoostumukseen. Liittymisvaiheessa tutkittavalle DNA-kohdalle spesifiset alukkeet kiinnittyvät yksisäikeiseen DNA:han emäsparisäännön mukaisesti. Koska DNA-polymeraasi vaatii alukkeen läsnäolon DNA-juosteessa ennen kuin se voi aloittaa toimintaansa, rajaavat alukkeet siten monistettavan alueen.
Ekstensiovaiheessa DNA-polymeraasi aloittaa vastinjuosteen luomisen yksisäikeiselle DNA:lle. Pidentymisvaihe tapahtuu useimmiten 72 °C:ssa, joka on monien polymeraasientsyymien optimaalinen toimintalämpötila. Pidentymisvaiheen kesto määritetään haluttavan PCR-tuotteen pituuden ja kompleksisuuden mukaan. Näitä syklejä toistetaan useita, keskimäärin noin 25–45 kappaletta, joiden jälkeen suoritetaan vielä noin kymmenen minuutin pituinen loppuekstensio samassa lämpötilassa. Loppuekstension tarkoituksena on varmistaa, että polymeraasientsyymi rakentaa kaikki aloitetut DNA-kopiot loppuun asti. Koska DNA:n määrä kaksinkertaistuu jokaisessa syklissä, niin esimerkiksi 28 syklin kuluttua yhdestä DNA molekyylistä on näin tuotettu 228 eli noin 270 miljoonaa kopiota.