Malarian antigeenin havaitsemistestit

Malarian antigeenin havaitsemistestit ovat ryhmä kaupallisesti saatavilla olevia malarian vasta-aineita tunnistavia pikatestejä. Niiden avulla malarian voi tunnistaa nopeasti myös henkilö, jolla ei ole laboratoriokoulutusta tai laboratoriolaitteita. Testejä on myynnissä yli 20 erilaista (WHO:n tuotetestaus 2008). Ensimmäinen malarian antigeeni, joka soveltui tällaisen testin kohteeksi, oli liukoinen glykolyyttinen entsyymi glutamaattidehydrogenaasi. Yksikään pikatestistä ei ole tällä hetkellä yhtä herkkä tai halpa menetelmä kuin verinäytteen analysointi mikroskoopilla. Suurin haittapuoli kaikkien nykyisten testimenetelmien käytössä on se, että tulos on pohjimmiltaan kvalitatiivinen: vasta-aineita joko on tai ei ole. Monilla trooppisen Afrikan endeemisillä alueilla parasitemian kvantitatiivinen arviointi (vasta-aineiden määrä) on kuitenkin tärkeää, koska suuri osa väestöstä saa positiivisen tuloksen millä tahansa kvalitatiivisella määrityksellä.
Antigeenipohjaiset malarian pikadiagnostiikkatestit.
Malaria on parannettavissa oleva sairaus, jos potilaat saavat varhaisen diagnoosin ja nopean hoidon. Antigeenipohjaisilla pikatesteillä (RDT-testeillä) on tärkeä rooli terveyspalvelujen tarjoamisen kannalta, koska monilla maaseudun klinikoilla ei ole mikroskooppeja tai analyysiin koulutettua henkilökuntaa. Lisäksi alueilla, joilla tauti ei ole endeeminen, laboratorioteknikoilla on hyvin vähän kokemusta malariaparasiittien havaitsemisesta ja tunnistamisesta. Trooppisiin maihin matkustaa vuosittain yhä suurempi määrä lauhkealta alueelta tulevia matkailijoita, ja monet heistä palaavat takaisin malariatartunnan saaneina. RDT-testejä pidetään edelleen perinteisen mikroskoopian täydennyksinä, mutta joidenkin parannusten myötä ne voivat hyvinkin korvata mikroskoopin. Testit ovat yksinkertaisia, ja ne voidaan tehdä paikan päällä kenttäolosuhteissa. Testeissä käytetään sormenpäästä tai laskimoverestä otettua verta, testi kestää yhteensä 15-20 minuuttia, eikä laboratoriota tarvita. Näiden pikatestien havaitsemiskynnys on 100 loista/µl verta, kun se verinäytteen mikroskopialla on 5 loista/µl verta.
pGluDH.
Tarkka diagnoosi on yhä tärkeämpää, kun otetaan huomioon Plasmodium falciparum -bakteerin lisääntyvä resistenssi ja klorokiinille vaihtoehtoisten lääkkeiden korkea hinta. Entsyymiä pGluDH ei esiinny isännän punasoluissa, ja Picard-Maureau ym. suosittelivat sitä Plasmodium-lajien merkkiaineeksi vuonna 1975. Malarian merkkiaineena käytettävä entsyymitesti soveltuu rutiinityöhön, ja se on nykyään vakiotesti useimmilla malariaa käsittelevillä osastoilla. Tiedetään, että pGluDH:n läsnäolo edustaa loisen elinkelpoisuutta, ja pGluDH:ta antigeeninä käyttävällä pikatestillä pystyttäisiin erottamaan elävät ja kuolleet organismit toisistaan. Kiinassa on kehitetty täydellinen RDT, jonka antigeeninä on pGluDH, ja sitä testataan parhaillaan kliinisesti. GluDH:t ovat kaikkialla esiintyviä entsyymejä, jotka toimivat tärkeässä haarautumiskohdassa hiili- ja typpiaineenvaihdunnan välillä. Plasmodioissa esiintyy sekä nikotiiniamidiadeniinidinukleotidista (NAD) [EC 1.4.1.2] että nikotiiniamidiadeniinidinukleotidifosfaatista (NADP) riippuvaisia GluDH-entsyymejä [EC 1.4.1.4]; NAD-riippuvainen GluDH on suhteellisen epävakaa eikä siitä ole hyötyä diagnostisissa tarkoituksissa. Glutamaattidehydrogenaasi tarjoaa hapettuvan hiililähteen, jota käytetään energian tuotantoon, sekä pelkistyneen elektronin kuljettajan, NADH:n. Glutamaatti on pääasiallinen aminon luovuttaja muille aminohapoille myöhemmissä transaminaatioreaktioissa. Glutamaatin moninaiset tehtävät typpitasapainossa tekevät siitä portin vapaan ammoniakin ja useimpien aminohappojen aminoryhmien välillä. Sen kiderakenne on julkaistu. GluDH:n aktiivisuutta P.vivaxissa, P.ovalessa ja P. malariaessa ei ole koskaan testattu, mutta koska GluDH on tärkeä haarautumisentsyymi, jokaisessa solussa on oltava suuri GluDH-pitoisuus. On hyvin tiedossa, että entsyymeillä, joilla on suuri molekyylipaino (kuten GluDH:lla), on useita isotsyymeitä, mikä mahdollistaa kantojen erottelun (jos käytetään oikeaa monoklonaalista vasta-ainetta). Isäntä tuottaa vasta-aineita loisen entsyymiä vastaan, mikä osoittaa matalaa sekvenssi-identiteettiä.
Histidiinipitoinen proteiini II.
Histidiinirikas proteiini II (HRP II) on histidiini- ja alaniinipitoinen, vesiliukoinen proteiini, joka on lokalisoitunut useisiin solukompartimentteihin, mukaan lukien loisen sytoplasma. Antigeenia ilmentävät ainoastaan P. falciparum -trofotsoiitit. P. falciparum -bakteerin HRP II:n on todettu osallistuvan hemozoiinin, loisen tuottaman ferriprotoporfyriini IX:n (Fe(3+)-PPIX) inertin, kiteisen muodon, biokiteytymiseen. Loinen erittää huomattavan määrän HRP II:ta isännän verenkiertoon, ja antigeeni voidaan havaita erytrosyyteistä, seerumista, plasmasta, aivo-selkäydinnesteestä ja jopa virtsasta erittyvänä vesiliukoisena proteiinina. Nämä antigeenit säilyvät verenkierrossa sen jälkeen, kun loistauti on hävinnyt tai vähentynyt huomattavasti. HRP2-pohjaisten testien muuttuminen negatiivisiksi kestää yleensä noin kaksi viikkoa onnistuneen hoidon jälkeen, mutta voi kestää jopa kuukauden, mikä heikentää niiden arvoa aktiivisen infektion havaitsemisessa. Vääriä positiivisia testituloksia on raportoitu potilailla, joilla on nivelreumapositiivinen reumafaktori. Koska HRP-2:ta ilmentää vain P. falciparum, nämä testit antavat negatiivisen tuloksen näytteissä, jotka sisältävät vain P. vivaxia, P. ovalea tai P. malariae:ta; monet muut kuin falciparum-malariatapaukset saatetaan siksi diagnosoida virheellisesti malarianegatiivisiksi (joillakin P. falciparum -kannoilla ei myöskään ole HRP II:ta). PHRP2-pohjaisten RDT-testien tulosten vaihtelevuus liittyy kohdeantigeenin vaihtelevuuteen.
pLDH.
P. falciparum -laktaattidehydrogenaasi (PfLDH) on 33 kDa:n kokoinen oksidoreduktaasi [EC 1.1.1.27]. Se on glykolyyttisen reitin viimeinen entsyymi, joka on välttämätön ATP:n tuottamiselle ja yksi P. falciparumin runsaimmin ilmentämistä entsyymeistä. P. vivaxin, P. malariaen ja P. ovalen Plasmodium LDH (pLDH) on 90-92-prosenttisesti identtinen P. falciparumin PfLDH:n kanssa. pLDH:n pitoisuuksien on havaittu vähenevän veressä nopeammin hoidon jälkeen kuin HRP2:n. Tässä suhteessa pLDH on samanlainen kuin pGluDH. Kineettiset ominaisuudet ja herkkyys kofaktorin sitoutumiskohtaan kohdistuville inhibiittoreille eroavat kuitenkin merkittävästi toisistaan, ja ne voidaan tunnistaa mittaamalla inhibiittoreiden dissosiaatiovakioita, jotka eroavat toisistaan jopa 21-kertaisesti.
pAldo.
Fruktoosibisfosfaatti-aldolaasi [EC 4.1.2.13] katalysoi glykolyysin ja energiantuotannon avainreaktiota, ja sitä tuottavat kaikki neljä lajia. P.falciparum-aldolaasi on 41 kDa:n proteiini, ja sillä on 61-68 %:n sekvenssiyhtäläisyys tunnettujen eukaryoottisten aldolaasien kanssa. Sen kiderakenne on julkaistu. P41:n vasta-aineiden esiintyminen malariaa vastaan osittain immuunien aikuisten ihmisten seerumissa viittaa siihen, että p41 osallistuu loista vastaan suojaavaan immuunivasteeseen.