Mikrobiologia

Mikrobiologia on pieneliöitä tutkiva biologian haara. Se tutkii bakteerien, arkkien, sienten, virusten, levien ja alkueläinten rakennetta, elintoimintoja ja niiden hyödyntämistä. Mikrobiologialla on runsaasti käytännön sovelluksia esimerkiksi lääketieteen, elintarviketeknologian ja ympäristöteknologian aloilla. Mikrobiologiaa hyödynnetään myös bakteerien avulla tapahtuvassa kompostoinnissa, joidenkin kaivosten mineraalituotannossa sekä teollisuudessa orgaanisten yhdisteiden tuotannossa.
Historia.
Mikrobien löytäminen.
Mikrobeja on käytetty hyödyksi tuhansia vuosia esimerkiksi oluenvalmistuksessa ja leivonnassa. Myös tautien tarttumisen periaatteet on pääpiirteissään tiedetty useissa varhaisissa sivilisaatioissa. Itse mikrobeja ei kuitenkaan vielä tunnettu - vasta vuonna 1546 Girolamo Fracastoro julkaisi tutkielmansa "De contagione", jossa hän esitti elävien olentojen olevan sairauksien takana. Mikrobiologialle antoi alkusysäyksen mikroskoopin keksiminen noin sata vuotta myöhemmin. Nuori englantilainen tiedemies Robert Hooke (1635-1703) löysi ja kuvaili ensimmäisenä sienisolun alkeellisen mikroskoopin avulla ja julkaisi löydöksensä vuonna 1665 teoksessa "Micrographia". Samoihin aikoihin myös hollantilainen Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) ryhtyi valmistamaan mikroskooppeja Hooken havaintojen innoitettua häntä. Leeuwenhoek havaitsi ensimmäisenä mikroskooppiset eliöt (joita hän kutsui nimellä "animalcules") ja vuodesta 1673 alkaen ryhtyi kirjoittamaan havainnoistaan kirjeitä Royal Society of London -järjestölle. Hän sai ensimmäisenä ihmissilmälle näkyviksi muun muassa bakteerit, siittiöt, verisolut, mikroskooppiset sukkulamadot ja paljon muuta. Hooken ja Leeuwenhoekin tutkimukset aloittivat uuden aikakauden mikrobiologiassa.
Jo satoja vuosia aiemmin (mm. antiikin Roomassa) oli yleisesti hyväksytty ajatus, että eräät eliöt syntyisivät itsestään epäorgaanisesta aineksesta, erityisesti pilaantuvasta. Tätä kutsuttiin nimellä alkusynty eli spontaani sikiäminen ("generatio spontanea") ja eräs esimerkki siitä oli kärpäsentoukkien ilmaantuminen pilaantuvaan lihaan. Mikroskoopin keksiminen tavallaan vain vahvisti tätä käsitystä - sen alla avautui kokonainen uusi maailma, johon eliöt näyttivät ilmaantuvan aivan itsestään. Kärpäsentoukkien osalta italialainen fyysikko ja luonnontieteilijä Francesco Redi (1626-1697) kumosi spontaanin sikiämisen teorian osoittamalla, että kärpäsentoukkia ilmestyi lihaan vain, jos kärpäset pääsivät laskemaan siihen munansa. Muiden eliöiden osalta väittely jatkui vuoteen 1745 saakka, jolloin englantilainen luonnontieteilijä John Needham (1713-1781) tuki tätä teoriaa edelleen. Oli yleisesti tiedossa, että keittäminen tuhosi mikrobit. Niinpä hän keitti lihalientä, sulki sen pulloon ja odotti - koska lihaliemestä löytyi pieneliöitä, hän päätteli niiden ilmestyvän sinne spontaanin sikiämisen kautta. Italialainen pappi Lazzaro Spallanzani epäili Needhamin kokeen tuloksen johtuvan siitä, että mikrobit olivat päässeet lihaliemeen ilmasta keittämisen jälkeen, mutta ennen kuin astian kansi oli suljettu. Hän testasi teoriaansa muuntelemalla Needhamin koetta siten, että imi astiasta ilman pois ennen kuin keitti lihaliemen astiassa. Mikrobikasvua ei esiintynyt, mutta spontaanin sikiämisen kannattajat väittivät sen ainoastaan todistavan, että spontaani sikiäminen ei voinut tapahtua ilman ilmaa.
Moderni mikrobiologia.
Spontaanin generaation kumosi vuonna 1859 ranskalainen kemisti Louis Pasteur (1822-1895), joka taivutti keittoastian kaulan joutsenen kaulan muotoon lihaliemen keittämisen jälkeen. Näin ilma pääsi pulloon mutta mikrobit eivät eikä lihaliemessä näin ollen esiintynyt kasvua. Kun lihaliemen pintaa sen sijaan nostettiin pullon kaulan alimman osan tasolle, mikrobit pääsivät laskeutumaan lihaliemeen ja syntyi kasvustoa. Näin hän paitsi kumosi spontaanin sikiämisen myös osoitti, että mikrobeja on kaikkialla, jopa ilmassa. Muut tutkijat tosin saivat edelleen jatkotutkimuksissaan tästä poikkeavia tuloksia ja lopullinen kuolinisku spontaanille sikiämiselle annettiin vasta vuonna 1876, kun löydettiin lämmönkestävät itiöt - osa tutkijoista oli keittänyt lihalientä liian vähän aikaa, jolloin kaikki itiöt eivät kuolleetkaan keittämisen aikana. Pasteur kehitti tämän kokeen pohjalta myös menetelmän elintarvikkeiden säilömiseksi, pastöroinnin, jota käytetään edelleen.
Britanniassa "generatio spontanea" -teoria eli noin kymmenen vuotta kauemmin kuin mantereella. Siellä vasta John Tyndall todisti ilmassa olevan hiukkasia, jotka heijastavat valoa ja aiheuttavat mikrobikasvua.
Modernin mikrobiologian isä yhdessä Pasteurin kanssa oli saksalainen lääkäri Robert Koch (1843-1910). Hän tutki pernaruttoa ja onnistui vuonna 1876 ensimmäisen kerran kuvaamaan infektiotaudin vaiheet aukottomasti sekä mikrobin osuuden sen synnyssä. Tutkimiensa tautien perusteella hän laati Kochin postulaatit. Nämä ja Pasteurin löydökset ovat edelleen mikrobiologian kaksi kulmakiveä. Tästä alkoi mikrobiologian kultainen kausi, jonka aikana useat taudit todettiin mikrobien aiheuttamiksi. Samoihin aikoihin Pasteurin johdolla kehiteltiin ensimmäiset rokotteet.
Lääketieteellinen mikrobiologia.
Pasteurin tulosten pohjalta brittiläinen kirurgi Joseph Lister (1827-1912) keksi parantaa leikkaussalin aseptiikkaa tappamalla mikrobit fenolilla, jolloin haavatulehdukset vähenivät murto-osaan. Nykyisin fenoli on korvattu turvallisemmilla aineilla. Mutta kuitenkin jo ennen Listeriä olivat välillisen tartunnan vaarat havainneet Ignaz Semmelweis ja Oliver Wendell Holmes. Molemmat totesivat lapsivuodekuumeen johtuvan siitä, että lääkärit eivät pesseet käsiään potilaitten välillä. Ensin puhkottiin mätäpaiseita ja sitten autettiin synnytyksessä.
1900-luvulta lähtien mikrobiologian kehitys on ollut huimaa. Tähän ovat vaikuttaneet esimerkiksi parantuneet kuvantamismenetelmät (mm. elektronimikroskooppi), kehittyneet viljelymenetelmät ja erityisesti geeniteknologia.
Mikrobien laboratoriset tutkimusmenetelmät.
Mikroskopia.
Mikroskopia on menetelmien yläkategoria, joiden tarkoituksena on tutkia mikrobisolun rakennetta.
Mikroskopia jaetaan käytännössä kahteen alalajiin valomikroskopiaan ja elektronimikroskopiaan.
DAPI-värjäys.
Mikrobeja käsitellään ns. DAPI-värjäyksellä preparaatille, jotta niiden erotettavuus epifluorenssimikroskoopilla saavutetaan. DAPI-värjäys perustuu fluoresoivien aineiden DNA:han kiinnittymiseen. Fluoresoivat aineet jättävät DNA-rakenteeseen jäljen, joka mikroskoopilla UV-valossa katsottaessa erottuu taustastaan helposti havaittavissa olevana kirkkaana ja hohtavansinisenä. Koska värjäys on voimakasta, sitä pitää laimentaa melko paljon ennen preparaatin valmistamista, jotta yksittäiset solut eivät "huku hohtavansiniseen massaan".
Plate Count -menetelmä.
Plate Count -menetelmä arvioi näyteliuoksessa olevien elävien mikrobien lukumäärän. Se perustuu oletukseen, että jokainen elävä solu on suotuisissa olosuhteissa aktiivinen jakautuen kokonaiseksi pesäkkeeksi, ja että jokainen pesäke on lähtenyt kasvamaan yhdestä mikrobista. Jotta pesäkkeiden määrä olisi laskettavissa, nämä yksittäiset pesäkkeet erotetaan toisistaan laimentamalla näyteliuosta tarpeeksi ennen (malja)viljelyä. Inkuboituaan tarpeeksi kauan yhdestä solusta kasvaneet pesäkkeet ovat ihmissilmällä laskettavissa olevia pisteitä.
Plate Count on melko herkkä, ja siksi luotettava menetelmä. Se on paljon käytetty koska se huomioi ainoastaan elävien solujen lukumäärän. Mikrobien kasvuun vaikuttaa merkittävästi kasvualusta.
MPN -menetelmä.
Lyhenne MPN tulee sanoista "most probable number", eli todennäköisin lukumäärä. MPN-menetelmä pyrkii ilmaisemaan sitä konsentraatioiden rajaa, jolloin vielä havaitaan mikrobien kasvua näytteen laimennussarjassa. Näytettä siis laimennetaan ja siitä pipetoidaan tietty tilavuus kasvualustaa sisältäviin koeputkiin. Kasvu kyetään havaitsemaan kasvuputkien mahdollisina samentumina. Positiivisten putkien määrän ja putkien kokonaismäärän perusteella on mahdollista laskea tilastollisin menetelmin alkuperäisen näytteen todennäköisin mikrobimäärä. MPN-menetelmä on kovin työläs, koska pienillä putkimäärillä ei saavuteta tarkkoja tuloksia. Tilastollisen otannan kasvaessa myös testin tarkkuus paranee. Näistä syistä johtuen MPN-menetelmää ei käytetä ilman hyvää syytä.
Perinteisesti MPN-menetelmä toteutettiin tavallisissa koeputkissa. Nykyään laskenta kuitenkin suoritetaan yleensä mikrotiitterilevylle. Muitakin vastaavia koeputkien korvaavia ratkaisuita on kehitetty. Yhteistä niissä on kuitenkin se, että näytetilavuutta ja työn määrää on vähennetty tuntuvasti. Monissa menetelmissä myös, kortti, kammio, levy tai muu kasvatusastia on kertakäyttöinen. Tällöin vältytään astioiden autoklavoinnilta ja tiskaukselta. Haittapuolena on kuitenkin laboratorioissa jo entuudestaan suuren jätteen määrän kasvattaminen.