Pöördtranskriptaas

Pöördtranskriptaas on ensüüm, mille abil sünteesitakse RNA matriitsahelalt komplementaarne DNA (cDNA) ahel. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks ning valdavalt seostatakse seda retroviirustega. Lisaks retroviirustele kasutavad pöördtranskriptaasi ka mõned teised viirused, näiteks B-hepatiidi viirus, mis kuulub sugukonda "Hepadnaviridae." Sellepärast on pöördtranskriptaasi inhibeerivad ühendid laialdaselt kasutusel antiretroviraalsete ravimitena. Pöördtranskriptaasi on seostatud ka kromosoomide otsade ehk telomeeride replikatsiooni protsessiga ning osade mobiilsete geneetiliste elementidega (retrotransposoonid).
Pöördtranskriptsiooni kasutatakse laialdaselt molekulaarses kloneerimises RNA-lt DNA saamiseks, RNA sekveneerimises, polümeraasi ahelreaktsioonis (PCR) või genoomses analüüsis.
Enim uuritud pöördtranskriptaasid:
Ajalugu.
Pöördtranskriptaasi avastas Howard Temin Wisconsini ülikoolis respiratoor-süntsütiaalse viiruse (RSV) virionidest ning David Baltimore isoleeris selle 1970. aastal kahest RNA kasvajaviirusest: R-MLV ja samuti RSV. Nende saavutuste eest anti neile 1975. aastal ühine Nobeli auhind füsioloogia või meditsiini kategoorias (koos Renato Dulbeccoga). Algul oli pöördtranskriptsiooni idee väga ebapopulaarne, kuna see oli vastuolus molekulaarbioloogia keskse dogmaga, mis väidab, et DNA-d transkribeeritakse RNA-ks ning seda omakorda valguks. Alles pärast pöördtranskriptaasi avastamist hakati aktsepteerima ideed, et geneetilist informatsiooni on võimalik üle kanda ka RNA-lt DNA-le.
Pöördtranskriptaas viirustes.
Pöördtranskriptaasi kasutavad viirused replikatsioonil. Pöördtranskribeerivad RNA-viirused (näiteks HI-viirus) kasutavad ensüümi, et pöördtranskribeerida oma RNA genoom DNA-ks. Saadud DNA on võimalik seejärel integreerida peremeesorganismi genoomi ning läbi selle saab viirus enda genoomi replitseerida. Pöördtranskribeerides DNA-viiruseid, näiteks hepadnaviirust, on võimalik kasutada saadud RNA-d matriitsahelana uute DNA ahelate kokkupanemisel. Pöördtranskriptaasi puudumisel ei oleks viirused võimelised enda genoomi replitseerima.
Pöördtranskriptsiooni protsess.
Pöördtranskriptaas kasutab RNA matriitsahelat, et sünteesida kaheahelaline DNA. Viirustes, kus pöördtranskriptaasil on puudu DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, on võimalus, et kaheahelalist DNA-d sünteesitakse peremeesorganismi kodeeritud DNA polümeraas δ abil. Polümeraas tuvastab ekslikult viraalse DNA-RNA kui praimeri ning sünteesib kaheahelalise DNA samal mehhanismil nagu praimeri eemaldamiselgi, kus uus sünteesitud ahel vahetab välja algse RNA matriitsahela. Pöördtranskriptsiooni puhul on vigade ehk mutatsioonide tekkimise tõenäosus suur. Need mutatsoonid võivad põhjustada ravimiresistentsust.
Retroviiruste pöördtranskriptsioon.
Retroviirused kasutavad pöördtranskriptaasi üheahelalise genoomse RNA transkribeerimiseks kaheahelaliseks cDNA-ks, et see integreerida peremeesgenoomi. Nende genoom koosneb kahest positiivse laenguga üheahelalisest RNA molekulist (ss-RNA ehk "single-stranded RNA"), millel on 5’-"cap" ja 3’-polüadenenüleeritud saba. Retroviirusteks on näiteks inimese immuunpuudulikkuse viirus (HIV) ja inimese T-lümfotroopne viirus (HTLV). Kaheahelalise DNA süntees toimub tsütosoolis järgmiste protsesside tulemusena:
Kaheahelalise DNA sünteesi käigus toimub ka ahela ülekanne, mil lühike DNA (algse RNA-sõltuva DNA sünteesi produkt) translokeerub aktseptor-regiooni genoomi teises otsas. Pöördtranskriptaas töötleb seda ala hiljem tänu oma DNA-sõltuvale DNA aktiivsusele. Retroviraalse RNA praimeri seondumise ala PBS regiooni 5' otsas asub U5 ning sellest 3' otsas paikneb "juhtiv" ala. tRNA praimer on 14. ja 22. nukleotiidi vahel lahti harutatud ning moodustab viraalse RNA PBS regiooni aluspaaridega dupleksi. PBS paiknemine viraalse RNA 5’-otsa lähedal on ebatavaline, kuna pöördtranskriptaas sünteesib DNA-d praimeri 3’-otsast 5’-3’-suunas (vaadeldes RNA matriitsi). Seega praimer ja pöördtranksriptaas peavad ümber paiknema viraalse RNA 3’-otsa. Nende ümberpaigutumine hõlmab mitut etappi ja kasutab mitmeid ensüüme, sealhulgas DNA polümeraas, ribonukleaas H (RNaas H) ja vajalik on polünukleotiidide lahtikeerdumine.
HI-viiruse pöördtranskriptaas omab samuti ribonukleaasset aktiivsust, mis lagundab cDNA sünteesi käigus viraalse RNA. Lisaks on HIV pöördtranskriptaasil DNA-sõltuv DNA polümeraasne aktiivsus, mis kopeerib cDNA senssahela antisenss-DNA ahelaks, et sünteesida kaheahelaline viraalse DNA vaheühend vDNA.