Tsükliinisõltuvad kinaasid

 
Tsükliinisõltuvad kinaasid (Cdk – "cyclin-dependent kinase") on proteiinkinaasid, mis fosforüülides valke täidavad keskset rolli rakutsükli regulatsioonis ja mis on aktiivsed vaid kompleksis tsükliiniga. Cdk-d on põhilised rakutsükli regulaatorid kõigis uuritud eukarüootides. Cdk-d on suhteliselt väikesed valgud (34–40 kDa) ja sisaldavad aktiivtsentrile lisaks väheseid struktuure. Eri rakutsükli faasides on aktiivsed erinevad tsükliin-Cdk kompleksid, mis fosforüülivad eri valke ja tagavad sellega kindla valkude aktiivsuse mustri, mida vastavas rakutsükli staadiumis vaja on. Cdk-de tase püsib rakutsükli jooksul võrdlemisi stabiilsena ning tsükliin-Cdk komplekside aktiivsus eri faasides on reguleeritud tsükliinide taseme kõikumisega.
Imetajate Cdk-d ja tsükliinid.
Enamik teadaolevatest tsükliin-Cdk kompleksidest on seotud rakutsükli kontrollimisega. Loomarakkudes leidub vähemalt üheksa Cdk-d, millest neli (Cdk1, 2, 3 ja 4) on otseselt seotud rakutsükliga. Imetajate rakkudes suudab Cdk1 koos tsükliin A2 ja B1-ga ka üksi rakutsüklit kontrollida. Normaalsetes tingimustes osaleb regulatsioonis aga rohkem erinevaid Cdk-tsükliin komplekse.
Cdk aktiivsuse regulatsioon.
Cdk kinaasne aktiivsus muutub rakutsükli jooksul oluliselt, kuigi valgu tase püsib suhteliselt stabiilsena – aktiivsuse regulatsioon toimub post-translatsiooniliselt. Cdk aktiivsuse regulatsioonis on neli põhilist mehhanismi: tsükliini seondumine, aktiveeriv või inhibeeriv fosforüülimine ja seondumine Cdk inhibiitoritega. Eelnevate staadiumite Cdk-d aktiveerivad järgnevate transkriptsiooni. Kuna mõned rakutsükli faaside üleminekud peavad olema järsud, peab regulatsioon võimaldama S- ja M-Cdk-de kiiret ja ühest aktivatsiooni, et alustada replikatsiooni või mitoosi.
Tsükliin-Cdk seondumine.
Ensümaatilise aktiivsuse saavutamiseks peab Cdk olema seondunud tsükliiniga. Inimese Cdk2-l blokeerib aktivatsiooniling (T-ling) tsükliini puudumisel valkude seondumise aktiivtsentrisse ning seondunud ATP on substraadi fosforüülimise jaoks valesti orienteeritud. Tsükliini ja Cdk seondumises on olulised mitu struktuuri, tähtsaim on interaktsioon Cdk2 PSTAIRE heeliksi ja tsükliin A heeliksite 3 ja 5 vahel. Seondumine tsükliiniga mõjutab oluliselt Cdk konformatsiooni: osa T-lingust muutub beetaleheks, mille tulemusena orienteerub ATP aktiivtsentris katalüütiliseks reaktsiooniks sobivalt ja T-ling muutub lamedaks, võimaldades valkudel seonduda aktiivtsentrisse. Lisaks paraneb ligipääs aktiveerivale treoniinile Thr160, mida fosforüülivad Cdk-sid aktiveerivad kinaasid, suurendades oluliselt Cdk-de aktiivsust . Tsükliin A struktuuri Cdk2-ga seondumine ei mõjuta – tsükliin A on nagu karkass, millega seondub vormitava struktuuriga Cdk2. Tsükliinide taseme kontroll toimub transkriptsiooni ja valgu degradatsiooni tasemel.
Regulatsioon Cdk/tsükliini fosforüülimise kaudu.
Kuigi juba tsükliini seondumine aktiveerib Cdk-d oluliselt, on paljude Cdk-de täielikuks aktivatsiooniks vaja kindla aminohappe fosforüülimist (Thr160 inimese Cdk2-l). Aktiveeriv fosforüülimine ei mõjuta aktiivtsentri struktuuri oluliselt, kuid soodustab substraatide seondumist Cdk-ga. Selgroogsete rakkudes on Cdk-d aktiveerivaks kinaasiks Cdk7, millel on piisav aktiivsus kogu rakutsükli vältel, et mitte olla piiravaks teguriks Cdk aktiivsusele.
Inhibitoorsel fosforüülimisel – kui fosforüülitakse konserveerunud türosiin (Tyr15) ja loomadel lisaks lähedalasuv treoniin (Thr14) – on oluliselt suurem roll Cdk aktiivsuse regulatsioonis. Inhibitoorse fosforüülimise tulemusena muutub tõenäoliselt ATP fosfaatide orientatsioon. Selline regulatsioon on oluline mitoosi alguse ajastamises: enne mitoosi hoiab kinaas Wee1 mitootilisi tsükliin-Cdk komplekse fosforüülituna ning kompleksid on inaktiivsed. Vastureaktsioonina defosforüülivad inhibitoorseid fosforüülimissaite pidevalt Cdc25 perekonna fosfataasid. Wee1 ja Cdc25 võimaldavad mitootiliste tsükliinide kiiret aktivatsiooni: M-Cdk-d fosforüülivad nii Wee1 kui ka Cdc25-t, põhjustades sellega Wee1 inaktivatsiooni ja Cdc25 aktiivsuse tõusu. Kui M-Cdk-de hulk rakus jõuab piisava tasemeni, et Wee1 ei suuda neid hetkeks fosforüülitult inaktiivsena hoida, põhjustab väike M-Cdk aktiivsus positiivse tagasisidega (aktiveerivad oma aktivaatori ja inhibeerivad inhibiitori) kõikide inaktiivsete komplekside defosforüülimise ja selle kaudu järsu ülemineku mitoosi.
Cdk inhibiitorid.
Tsükliinisõltuvate kinaaside inhibiitorid (CKI-d) on valgud, mis seonduvad Cdk-ga (või tsükliini või tsükliin-Cdk kompleksiga), blokeerides ensüümi kinaasset aktiivsust. Cdk aktiivsus on jagunevates rakkudes enamasti blokeeritud G1-faasis, kui on vaja rakkude stabiilset kasvu uue rakutsükli ettevalmistamiseks. CKI-d on vajalikud ka rakutsükli peatamiseks G1-s, kui keskkonnatingimused ei ole sobilikud. Ka regulatsioon inhibiitori kaudu võimaldab rakutsüklis järske üleminekuid: järgneva faasi tsükliinide hulk tõuseb suhteliselt aeglaselt tänu aktiveerunud transkriptsioonile, kuid inhibiitor seob sünteesitud tsükliinid inaktiivsesse kompleksi. Kui Cdk aktiivsus tõuseb mingi tasemeni, siis lagundatakse või modifitseeritakse inhibiitor, mille tagajärjel tsükliin-Cdk kompleks vabaneb . Kinaasikompleksi vabanemist kiirendab positiivne tagasiside – vabanenud kompleksid fosforüülivad inhibiitorit, suunates selle lagundamisele.
Cks1.
Tsükliin-Cdk kompleksis on Cdk karboksüterminaalse osaga seondunud veel kolmas valk – Cks1. Cks1 on väike valk (9–17 kDa), mis võimaldab kompleksil efektiivselt fosforüülida mitme fosforüülimissaidiga substraate. Cks1 sisaldab katioonset taskut, mis seob negatiivselt laetud fosfaatrühma . Seondudes juba fosforüülitud aminohappega, suurendab Cks1 ühe valgu multifosforüülimise tõenäosust. Multifosforüülimine suurendab signaali edasilevimise tõenäosust ja kiirust. Näiteks kui valk on suunatud fosforüülimise kaudu degradatsiooni, siis signaali edasiliikumiseks peab fosforüülitud aminohappega enamasti seonduma fosfaatrühma siduv valk, mis ubikvitinüleerimise kaudu suunab valgu proteosoomi. Kui valgus on vaid üks mitteoptimaalne seondumiskoht, siis on seondumine aeglasem ja vähem efektiivne, kui aga näiteks kuus, siis toimub seondumine kiiremini ja valk degradeeritakse samuti kiiremini.
Substraadid.
Cdk-d on seriin-treoniinkinaasid – nad fosforüülivad valkudes seriine ja treoniine. Cdk fosforüülimissaidi üldine konsensusjärjestus on [S/T*]PX[K/R], kus S/T on seriin või treoniin, P on proliin, X suvaline aminohape ja K/R tähistavad positiivselt laetud aminohappeid lüsiini ja arginiini. 
Substraatidega võivad seonduda ka tsükliinid, võimaldades sellega tsükliin-spetsiifilist fosforüülimist. S-faasi tsükliini A-ga seondudes fosforüülib Cdk2 valku p107, aga kompleksis mitootilise tsükliini B-ga ei seondu p107-ga. Niisugune S-faasi tsükliinide spetsiifilisus tuleneb tsükliinil asuvast hüdrofoobsest alast, mis interakteerub substraatidel oleva RXL motiiviga (järjestus arginiin, suvaline aminohape ja leutsiin). Mõnel juhul on tsükliin-spetsiifiline fosforüülimine seotud ka tsükliini võimega lokaliseerida seondunud Cdk-d mingisse kindlasse raku ossa, kus vastavat substraati leidub.
"Saccharomyces cerevisiae" Cdk1.
Pagaripärmi rakutsüklit kontrollib vaid üks Cdk, mis tsükli jooksul seondub üheksa erineva tsükliiniga. Tsükliinid Cln1-3 on aktiivsed G1- ja G1/S-faasis, Clb5 ja 6 S-faasis, Clb3 ja 4 G2/M üleminekul ning Clb1 ja 2 mitootilistes rakkudes . Igas faasis on vaja fosforüülida vaid kindlaid valke ja midagi valel ajal fosforüülides võib see põhjustada rakule suuri kahjustusi. Näiteks DNA sünteesi alustamiseks peavad S-faasi tsükliin-Cdk kompleksid fosforüülima replikatsiooni alguspunktiga seondunud valke. Kui seda teevad G1-faasi tsükliin-Cdk kompleksid, võib toimuda liiga varajane DNA süntees ja selle tõttu ka osaliselt mitmekordselt replikatsioon. Selliste vigade vältimiseks mõjutavad tsükliinid Cdk-le seondumisega kinaasi aktiivtsentri konformatsiooni ja selle kaudu sobilike substraatide valikut. Pärm, millel pole G1- ja S-faasi tsükliine, on võimeline jagunema, kuid teeb seda aeglasemalt, aga mõlema mitootilise tsükliini deletsioon on pärmile letaalne. Mitootilised tsükliin-Cdk kompleksid on üldjuhul võimelised fosforüülima ka eelnevate komplekside substraate. Järjestikused tsükliinid mõjutavad Cdk aktiivtsentrit, tõstes kinaasi afiinsust Cdk konsensusjärjestuse suhtes.