RRNA modifikatsioonid

rRNA modifikatsioonid on muudatused nukleotiidides, mis on sünteesijärgselt ehk posttranskriptsiooniliselt rRNA ahelas läbi viidud. rRNA sisaldab looduslikult palju erinevaid modifikatsioone. Selliste modifikatsioonide uurimine on sattunud tähelepanu alla meditsiinis, kuna on andmeid, et nad võivad osaliselt vastutada mitmete patogeensete bakteritüvede antibiootikumide resistentsuse eest. Modifikatsioonide koondumine struktuurselt olulistesse kohtadesse viitab omakorda sellele, et modifikatsioonid võivad optimeerida rRNA struktuuri, et saavutada kiire ja efektiivne valgusüntees. .
Modifikatsioonid.
rRNAst on leitud kolme tüüpi modifikatsioone: (1) Uridiini pööramine pseudouridiiniks (Ψ); (2) riboosi 2’hüdroksüül rühma metülatsioon (Nm); ja (3) lämmastik aluse erinevatest positsioonidest metüleerimine (mN). rRNA modifikatsioonide arv varieerub erinevatel organismidel. Näiteks E. coli rRNA sisaldab 36 modifikatsiooni (11 Ψ, 4 Nm ja 21 mN), kõige primitiivsema bakteri, Mycoplasma, rRNA sisaldab ainult 14 modifitseeritud nukleotiidi ja Homo sapiensi rakkude rRNA-s on kokku 212 rRNA modifikatsiooni. Üldiselt sisaldab fülogeneetilisel puul kõrgemal paikneva organismi rRNA rohkem modifikatsioone kui madalamal paiknev. Suurem osa rRNA modifikatsioone paiknevad erinevatel organismidel samas kohas rRNA struktuuris. Aga "E. coli" rRNA-s leiduvaid modifikatsioone on leitud ka imejate rakkude rRNA-dest. Modifitseeritud nukleotiidid ei ole juhuslikult lokariseeritud. Seda määrab rRNA tertsiaarstruktuur, mille modifikatsiooni klaster on suuresti konserveerunud kohtadesse millele on omistatud funktsionaalselt oluline rolli. Modifikatsioonid bakteris on vahendatud ainult valgu ensüümide poolt, mis on koha- või regioonispetsiifilised. Siiski paljude modifikatsiooni ensüümide täpne substraadi ära tundmise mehhanism on teadmata. Eukarüootides eksisteerib giid-RNA süsteem, kus väiksed snoRNA-d määravad ära modifikatsiooni tekkimise koha ja selle sünteesimiseks vajaliku RNA-valgu kompleksi. Eukarüoodid ja arhed kasutavad sarnast snoRNA süsteemi, mis kontrollib rRNA modifitseerimist. Suure osa snoRNA-dest, mis kontrollivad rRNA modifikatsioonide tekkimist, võib rakust eemaldada ilma suuremat kahju tekitamata (deletsioon ei ole laboritingimustes tappev).
Valgud.
Iga rRNA modifikatsiooni sünteesimiseks kasutatakse ainult selleks mõeldud valku. "E. coli" rakkudes on 32 rRNA modifikatsiooni valku, 25 nendest on metüültransferaasid ja 7 pseudouridiini süntaasid. Rakkude jaoks on eriotstarbeliste valkude tootmine kulukas, mistõttu võib juba nende olemasolust järeldada valkude loodud modifikatsioonide olulisust raku elutegevusele. Rakkude jaoks on eriotstarbeliste valkude tootmine kulukas, mistõttu võib juba nende olemasolust järeldada valkude loodud modifikatsioonide olulisust raku elutegevusele. Enamik "E. coli" modifikatsioone on praeguseks hästi uuritud. Kõige levinum ja uuritavam modifikatsioon on pseudouridiin (Ψ). Pseudouridiin on ribonukleiinhappes esineva nukleosiidi uridiini isomeer. Ψ erinevus uridiinist seisneb tema lämmastikaluse ning suhkru vahelises sidemes. Pseudouridiine sünteesivad ensüümid, mida nimetatakse pseudouridiini süntaasideks (Ψ-süntaasid), kusjuures sünteesiks ei vajata lisaenergiat ega muid lisategureid. RNA polümeraas sünteesib pseudouridiine pärast RNA sünteesi (transkriptsioonijärgselt) nii prokarüootides kui ka eukarüootides.
rRNA struktuuri uuringutes on kindlaks tehtud, et nukleosiidi modifikatsioonid on kontsentreerunud rRNA funktsionaalselt olulistesse osadesse. Ümber mRNA, ribosoomi A ja P saidi ümbrusse (A saiti seondub translatsiooni käigus aminoatsüül-tRNA-ga ja P saiti peptidüül tRNA). Modifikatsioonid on klasterdanud ka peptidüültransferaasse tsentri ümbrusse, peptiidi väljumise tunneli lähedale ja neid on leitud ka alaühikutevahelistest sildadest.
Kasutamine.
"In vitro" ribosomaalse alaühikute rekonstrueerimine, kus kasutatakse "in vitro" transkribeeritud, modifitseerimata rRNA-d on aidanud selgitada rRNA modifikatsiooni funktsionaalset rolli. Sellised ribosoomid on funktsionaalselt küll aktiivsed, kuid nende aktiivsus on oluliselt madalam võrreldes ribosoomidega, mille rRNA sisaldab modifikatsioone. Ei ole tehtud katseid rakkudega, millel puuduvad kõik rRNA modifikatsiooni ensüümid. On teada, et mutatsioon folD geenis, mis viib S-adenosüül-L-metioniini (SAM) vähenemisele (SAM on vajalik paljude metülaaside tööks), põhjustab tRNA struktuuri lõdvenemist. Selle põhjal arvatakse, et rRNA modifikatsioone on vaja pigem rRNA struktuuri optimeerimiseks („fine-tuning“) mitte aga rRNA funktsionaalsuse saavutamiseks. .
rRNA modifikatsioonid optimeerivad ribosoomi vastastikust interaktsiooniligandidega. Mõned nukleotiidid lokaliseeruvad P-saidi koodoni ja P-saidi tRNA lähedal. P-saidi koodon on kontaktis 16S rRNA nukleotiidiga m4Cm1402 ja m3U1498, mis omavahel annavad hüdrofoobse kontakti. Nukleosiid m4Cm1402 kaasatakse interaktsiooni koos fosfaadiga teise ja kolmanda koodoni vahel. Teise grupi modifitseeritud nukleotiididest annavad kontakti antikoodoni dupleksiga P-saidi tRNA-ga. Muudetud nukleotiidid mängivad rolli ka rRNA konformatsiooni stabilatsioonis. Hüdroksüülgrupi metülatsioon eemaldab ühte potentsiaalse vesenik side doonorit ja tekib võimalus hüdrofoobilise kontakti. .
Suur osa rRNA modifikatsioone on nagu antibiootikumidevastane kaitsemehhanism bakterites. rDNA operoonis on palju koopiad, mistõttu on raske produtseerida resistentsus mutatsioone. Loomulike antibiootikumide tootjad kasutavad rRNA metülatsioone kaitsmaks nende endi ribosoome antibiootikumi inhibeeriva toime eest. Sellist mehhanismi on leitud erinevatest aminoglükosiidi tootjatest. Geenid, mis kodeerivad rRNA metüültransferaase, mis vastutavad antibiootikumiresistentsuse tekkimise eest, levivad kergesti ka kliinilistele patogeenidele. See võimalus teeb bakteriaalsed haigused ka oluliselt ohtlikumaks. .
On vaja mainida, et mõlema modifitseeritud nukleotiidide ja antibiootikumide seondumissait lokaliseerub ribosoomi funktsionaalsetes tsentrites. On aga ka olukordi, kus antibiootikumid vajavad rRNA modifikatsioone, et pärssida valgusünteesi nagu näiteks "kasugamycin" (antibiootikum, mis osaleb translatsiooni initsiatsioonis).
Modifikatsioonid rRNAs võivad olla ka „kvaliteedimärk“ ribosoomi biosünteesis. Kõige parem näide on RluD (pseudouridiini süntaasi vastutav "E. coli" 23S rRNA-s), mis on vajalik normaalse ribosoomi kokku panekuks. .
Sõltuvalt struktuurist võivad erinevad modifikatsioonid olla vajalikud rRNA struktuuri stabilatsiooniks, ribosoomi ja ligandi seondumise optimeerimiseks, rRNA kaitsmiseks rakule tundmatu antibakterialse Rnaasi eest või translatsiooni faktori seondumiseks ja translatsiooni regulatsiooniks.
Uuringud Eestis.
rRNA modifikatsiooni uurimisel on Eestis keskendutud ensüümidele. Modifikatsioone ei sünteesita rRNA-sse korraga, vaid erinevates ribosoomide sünteesi etappides. Modifikatsioonid on jagatud 3 rühmaks: varased, keskmised ja hilised. RlmH modifikatsiooni ensüümiga on uuritud Eestis ja on teada, et see on spetsiifiline 70S ribosoomide suhtes. Tavaliselt on modifitseeritud ensüümi substraadiks kas suur või väike alaühik.