Lac-operon

"Lac"-operon ehk laktoosioperon on operon, mis on vajalik laktoosi transpordiks ja metabolismiks bakteris "Escherichia coli" ja paljudes teistes sooles elevates bakterites. Laktoosioperon koosneb kolmest struktuurgeenist, promootorist ja operaatorist. Kolm struktuurgeeni on "lacZ", "lacY" ja "lacA".
Laktoosioperoni geeniregulatsioon oli esimene välja töötatud geeniregulatsiooni mehhanism ja seetõttu on seda ka väga palju uuritud. Kasutatakse prokarüootse geeniregulatsiooni näitena.
Struktuur.
"Lac"-operon koosneb kolmest struktuurgeenist ning operaatorist, promootorist ja regulaatorist. Kolm struktuurgeeni on:
Laktoosi metabolismiks on vaja kahte ensüümi – permeaasi, mis transpordib laktoosi rakku ja β-galatosidaasi, mis lõikab laktoosi molekuli, et toota glükoosi ja galaktoosi. Transatsetülaasi pole laktoosi metabolismiks vaja. Kõik kolm geeni transkribeeritakse ühte mRNA molekuli.
Neljas geen on "lacI" (ingl k "inducibility"), mis kodeerib laktoosi repressorvalku ja kinnitub "Lac" operaatorile. "LacI" asub küllaltki lähedal teistele laktoosioperoni geenidele, kuid lähedus pole selle funktsioonile tähtis. Laktoosioperoni repressor on valk, mis koosneb neljast identsest alaühikust. Igal tetrameersel molekulil on neli allosteerilist saiti. Promootoril on RNA polümeraasi kinnitumissait, sellega initsieeritakse transkriptsioon ja geenid ekspresseeritakse.
Regulatsioon.
"E. coli" eelistab süsinikuallikana glükoosi, alles selle puudumisel võetakse laktoos kasutusele. Kui on mõlemad saadaval rakule, kasutatakse esmalt siiski glükoos ära ja alles siis lülitatakse sisse "lac"-operon. Selline süsteem on välja kujunenud kuna glükoosi metabolism toodab rakule rohkem energiat kui laktoosi metabolism.
Laktoosioperoni promootoril on kaks seondumissaiti. Üks nendest on RNA polümeraasi seondumiskoht ja teisele seondub CAP ja cAMP kompleks. Seda kompleksi on vaja "lac"-operoni transkriptsiooniks. Kui glükoosi tase rakus tõuseb, siis cAMP tase langeb ja seetõttu ka CAP ja cAMP kompleksi hulk. See omakorda põhjustab promootori inaktivatsiooni ja transkriptsiooni ei toimu. CAP ja cAMP kompleksil on seega positiivne kontroll laktoosioperoni ekspressioonile. "Lac"-operoni repressor on ekspresseeritud kuni laktoos puudub rakust. Repressorvalk seondub operaatorile ja RNA polümeraas ei pääse sealt läbi. Kui aga rakus on laktoosi, siis see seondub repressoriga ning viimane laseb lahti operaatorist. Siis saab RNA polümeraas seonduda promootorile ja transkribeerida vajalikke geene. Seega on "lac"-operoni regulatsioon väga hea näide negatiivsest kontrollist ehk repressioonist.
Laktoosianaloogid.
Laktoosi asemel võivad repressoriga seonduda ka struktuurselt sarnased molekulid ehk laktoosianaloogid. "Lac"-operoniga töötamise jaoks on leitud mitmeid laktoosi tuletisi, mis on üldiselt asendatud galaktosiidid. Selline on näiteks isopropüül-β-D-tiogalaktosiid (IPTG). See seondub repressorile ja inaktiveerib selle, aga ta ei ole lähteaine β-galatosidaasile. IPTG-d on hea kasutada "in vivo" katsetes indutseerijana, kuna "E. coli" ei metaboliseeri seda ja IPTG kontsentratsioon jääb konstantseks, seega on stabiilne ka geenide ekspressioon.
Mõned ühendid näitavad β-galaktosidaasi aktiivsust värvi muutes. Selline on näiteks ONPG (o-nitrofenüül- β-D-galaktopüranosiid), mis muidu on värvitu, aga selle produkt ONP (o-nitrofenüül) on kollane. ONPG-d on lihtne kasutada, kuna peab ainult jälgima, kui kiiresti lahus kollaseks muutub (ONPG laguneb), ja seejärel mõõtma spektrofotomeetriga.
Värvi muutuse järgi saab määrata β-galaktosidaasi aktiivsust ka X-galiga (5-bromo-4-kloro-3-indolüül- β-D-galaktopüranosiid). See on kiire meetod, kus geeni ekspressioon väljendub tumesinise värvusena.
Ajalugu.
Jacques Monod uuris, kuidas erinevate suhkrute kombinatsioonid toimivad toitainete allikana "E. coli"s ja "B. subtilis"es. Ta sai teada, et kui kasvatada bakterit mitme erineva suhkruga, siis tavaliselt oli bakteril ka mitu kasvufaasi. Näiteks, kui glükoos ja laktoos olid mõlemad bakterile kättesaadavad, metaboliseeriti esimesena glükoos ja alles siis laktoos. Monad nimetas sellist süsteemi diauksiaks.
François Jacob ja Monod vaatasid "E. coli" laktoosi metabolismi süsteemi, et välja uurida, kuidas toimib ensüümide induktsioon ehk kuidas rakk teab milliseid ensüüme kindlatest substraatidest sünteesida. Nad indutseerisid β-galaktosidaasi ja permeaasi ensüümi. Viimane on vajalik laktoosi transpordiks rakku. Nad said aru, et iga ensüüm on kodeeritud erineva geeniga. Jacob ja Monod identifitseerisid kolm geeni: Z geen, mis kodeerib β-galaktosidaasi, Y geen, mis kodeerib permeaasi ja A geen, mis kodeerib transatsetülaasi. Nad avastasid, et need kolm geeni on kromosoomis lähedalt seotud.
1966. aastal isoleerisid Walter Gilbert ja Benno Müller-Hill repressori, kui nad jälgisid, kuidas seondub indutseerija IPTG'ga. Nad näitasid, et repressor on valk, mis koosneb neljast samasugusest alaüksusest. Igal molekulil on neli IPTG-seondumise kohta. Gilbert avastas ka operaatori järjestuse, lõhkudes DNaasiga DNA, mis oli repressoriga seotud. Sealt õnnestus tal saada lühikesi DNA ahelaid, mis olid muidu repressor molekuliga kaitstud. Operaatori järjestus kinnitati ja leiti, et see asus natuke enne Z struktuurigeeni.
Kasutus molekulaarbioloogias.
Laktoosioperoni geene saab kasutada molekulaarbioloogias reportergeenina bakterite selektsiooniks. Selline on näiteks kaksikhübriid analüüs, mida kasutatakse valk-valk interaktsioonide või valk-DNA interaktsioonide avastamiseks. Näiteks saab testida seostumisi transkriptsionaalse aktivaatori ja spetsiifilise promootori järjestuse vahel. X-gal'i sisaldavatel LB plaatidel saab jälgida valgete rakukolooniate muutumist tumesiniseks. Veel saab kasutada tetrasooliumi laktoosi, MacConkey agarit ja ONPG vedelagarit.