Mikrosatelliit

Mikrosatelliidid on lühikesed tandeemselt korduvad nukleotiidsed järjestused, 2–5 aluspaari pikad ning korduste arv jääb enamasti 5–50 vahele. Mikrosatelliidid asuvad inimese genoomis paljudes kohtades, tüüpiliselt mittekodeerivatel aladel, geenidel vahel või intronites. Nad on kõrge mutatsioonisagedusega ning populatsioonis suure varieeruvusega.
Struktuur.
Mikrosatelliidid on tandeemsed kordused, mis koosnevad kahest kuni viiest nukleotiidist. Kahest nukleotiidist koosnevat järjestust nimetatakse dinukleotiidseks mikrosatelliidiks (näiteks ACACACACA). Kolme nukleotiidi sisaldavat korduvat järjestust nimetatakse trinukleotiidseks kordusjärjestuseks (näiteks AGCAGCAGCAGC). Neljast ja viiest nukleotiidist koosnevad tandeemset kordust nimetatakse vastavalt tetra- ja pentanukleotiidseks mikrosatelliidiks. Lühikesed tandeemsed kordused on laialt levinud üle genoomi, kõikides kromosoomides. Kuna mikrosatelliidid asuvad enamasti mittekodeerivatel aladel, on seal võimalik mutatsioonide kuhjumine ning suur varieeruvus erinevate indiviidide vahel. See võimaldab uuritavaid järjestusi kasutada edukalt isikute tuvastamiseks ning genoomi kaardistamiseks. Mikrosatelliite võib leiduda ka intronites ja geenide koodonites. Mutatsioonid korduvates segmentides võivad mõjutada valkude funktsiooni. Mikrosatelliitide mutatsioonid võivad sellistel juhtudel esile kutsuda fenotüübilisi muutusi ja haigusi.
Mutatsiooni mehhanism.
Erinevalt punktmutatsioonidest, mis mõjutavad ainult üksikut nukleotiidi, kaotavad või loovad mikrosatelliitide mutatsioonid terve korduva üksuse. Selliste mutatsioonide põhjuseks on replikatsiooni libisemine, mis on omakorda põhjustatud DNA-ahelate omavahelisest ebakõlast meioosi ajal. Igas mikrosatelliidis toimub enamasti libisemine umbes korra 1000 pooldumise järel.
Libisemise tagajärjel tekkinud muutused korduvas DNAs on tuhat korda tõenäolisemad kui punktmutatsioonid teistes genoomi osades. Mutatsioonid liidavad või eemaldavad tavaliselt ainult ühe korduse. Mutatsioonisagedus sõltub liikidest ning järjestuste suurusest.
Mikrosatelliitide mutatsioonide bioloogiline mõju.
Suurem osa mikrosatelliite asuvad mittekodeerivatel aladel ning neid ei ekspresseerita. Ülejäänud asuvad aga regulatoorses või isegi kodeerivas piirkonnas – mikrosatelliitide mutatsioonid sellistel juhtudel võivad esile kutsuda fenotüübilised muutused ja haigused.
Mõju valkudele.
20–40% imetajate valkudest sisaldavad korduvaid aminohappelisi järjestusi, mida kodeerivad lühikesed korduvad järjestused. Enamik valke kodeerivaid mikrosatelliite koosnevb kolmest nukleotiidist, sel juhul ei toimu raaminihke mutatsioone. Igalt kolmest nukleotiidist koosnevalt korduvalt järjestuselt transkribeeritakse sama aminohapet.
Mutatsioonid korduvates segmentides võivad mõjutada valkude keemilisi ning füüsikalisi omadusi ning seeläbi muuta ka valkude käitumist. On teada, et geeni Runx2 tandmeeselt korduvate regioonide korduste muutus kutsub esile kodustatud koerte nägude pikenemise, seejuures on järjestuste pikkus ning näo pikkus omavahel korrelatsioonis. Samuti on täheldatud, et pikkuse muutus polüalaniini segmendis, mis asub HoA13 geenis, viib HFG-sündroomini.. Evolutsioonilised muutused, mis on tingitud replikatsiooni libisemisest, leiavad aset ka lihtsates organismides. Näiteks pärmirakkudes toimuvad lühikeste korduste muutused viivad rakumembraani proteiinide muutusteni. Samuti mõjutavad mikrosatelliidid patogeensete bakterite pinnal asuvaid proteiine, mis aitab neil peremehe immuunsüsteemiga toime tulla ning isegi evolutsioneeruda.
Mõju geeniregulatsioonile.
Mikrosatelliitide pikkuste muutus promootorites ning teistel cis-regulatoorsetel aladel võib muuta geeniekspressiooni kiirelt, põlvkondade vahel. Inimese genoom sisaldab palju lühikesi tandeemseid kordusi regulatoorsetes piirkondades.
Mõju intronitele.
Mikrosatelliidid, mis asuvad intronites, mõjutavad samuti fenotüüpi. Tandeemsed kordused Asparagiini süntetaasi esimeses intronis võivad tekitada lümfoplastilist leukeemiat. On täheldatud, et vähenenud korduste arv EGFR geenis põhjustab osterosarkoomat.
Mõju transposoonidele.
Peaaegu 50% inimese genoomist on pakitud erinevatesse transposonaalsetesse elementidesse ja mitmeid neist sisaldavad tandeemselt korduvat DNA-d. On tõenäoline, et mikrosatelliidid nendes kohtades on samuti seotud geeni ekspressiooni regulatsiooniga.
Mikrosatelliitide analüüs.
Mikrosatelliidid on laialt kasutuses DNA testides, enamasti põlvnemise testimiseks ning kohtuekspertiisis. Lühikesi tandeemseid korduseid kasutatakse ka veel genoomi kaardistamiseks. Geenide aheldatust ning geneetilisi markereid, mis põhinevad korduvatel järjestustel, saab uurida, et määrata uuritava geeni asukohta. Lisaks saab neid kasutada geeni duplikatsiooni ning deletsiooni tundmaõppimiseks.
Amplifikatsioon.
Mikrosatelliite saab amplifitseerida polümeraasi ahelreaktsiooni kaudu, kasutades unikaalseid külgnevate alade järjestusi praimeriteks. DNA denatureeritakse korduvalt kõrgel temperatuuril, et eraldada kaksikahel, seejärel jahutatakse, et praimerid saaksid seonduda nukleotiidse järjestusega. Selle protsessi tagajärjel toodetakse piisavalt DNA-d, et seda oleks võimalik vaadelda agaroosi või polüürakrüülamiid geelil. Amplifikatsiooniks on vaja ainult vähest hulka DNA-d, sest termostabiilne Taq polümeraas moodustab suurel hulgal replitseeritud segmenti. Praimereid, mis külgnevad mikrosatelliitide lookustega on lihtne kasutada, aga korralikult funktsioneerivate praimerite väljatöötamine on tihtipeale pikk ja kulukas protsess.
Praimerite disain.
Kui otsida mikrosatelliitide markereid spetsiifilistest genoomi regioonidest, näiteks mõnest kindlast geeni eksonist, võib praimerid disainida manuaalselt. Tuleb otsida genoomsest DNA-st lühikesi korduvaid järjestusi. Seda saab otsida visuaalselt või kasutada automatiseeritud tööriistu nagu näiteks "RepeatMasker". Kui potentsiaalselt sobivad mikrosatelliidid on tuvastatud, kasutatakse külgnevaid järjestusi, et disainida oligonukleotiidsed praimerid, mis amplifitseerivad kindlat korduvat järjestust ahelreaktsioonis. Juhuslikke mikrosatelliidiseid praimereid võib toota, kui kloonida suvalisi DNA segmente uuritavates liikides. Suvalised segmendid sisestatakse plasmiidsesse – või bakteriofaagi vektorisse. Seejärel viiakse vektor bakterisse. Tekkinud kolooniatest on võimalik vaadata fluoresseeruvaid oligonukleotiide sisaldavaid järjestusi, mis hübridiseeruvad korduvatele järjestustele.
Piirangud.
Mikrosatelliidid on mitmekülgsed molekulaarsed markerid, eriti sobilikud populatsioonide analüüsiks. Korduvate järjestustega tuleb aga arvestada ka piirangutega. Praimereid, mis on toodetud kindlale liigile, saab tihtipeale kasutada ka temale lähedal asuvate liikidega töötamisel, kuid sama lookuse amplifitseerimine kahaneb geneetilise distantsi suurenemisega. Punktmutatsioonid praimeri seondumissaitides lähedastes liikides võib viia "null alleelideni", kus lühikesi korduvaid järjestusi ei kordistata. Järjestuste erinevus külgnevates alades viib kehvade praimerite seondumiseni. Suuremad alleelid, mis sisaldavad rohkem aluspaare, on mutatsioonidele vastuvõtlikumad. Väiksemad alleelid enamasti suurenevad ning suuremad alleelid vähenevad.
Kasutus kriminalistikas.
Mikrosatelliitide analüüs sai populaarseks 1990. aastatel. Seda kasutatakse laialt isikute tuvastamiseks. Mikrosatelliidid, mida tänapäeval kasutatakse kohtuekspertiisis, on tetra- või pentanukleotiidsed kordused. Need annavad kõrge kvaliteediga veatu tulemuse, olles samaaegselt piisavalt vastupidavad, et üle elada lagunemise. Lühemad korduvad järjestused võivad paarduda valesti ning anda valesid tulemusi. Pikemad järjestused seevastu on haavatavamad keskkonna lagunemisele ja ei amplifitseeru nii hästi PCR programmis. Eemaldades tuumast DNA, viiakse läbi analüüs ning seeläbi amplifitseeritakse spetsiifilist polümorfset DNA regiooni. Kui polümeraasi ahelreaktsioon on valmis, siis tulemused määratakse geelelektroforeesi või kapillaarse elektroforeesi meetodiga. Reaktsiooni lõppedes visualiseeritakse ja analüüsitakse tulemusi.