ATAC-seq

ATAC-seq (ingl "Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing") on molekulaarbioloogia meetod, mis tuvastab kromatiini ülegenoomset ligipääsetavust. Meetodit kirjeldati esmakordselt aastal 2013.
Eesmärk.
Kromatiin on DNA ja sellega seonduvate valkude kompleks. DNA pakkimine kromatiiniks on vajalik, et see rakutuuma ära mahuks. Kromatiin võib olla avatud (eukromatiin) või suletud (heterokromatiin) seisus. Heterokromatiinis on DNA tihedalt pakitud, mistõttu on see inaktiivne. Eukromatiinis on aga DNA lõdvemalt pakitud - see on ligipääsetav erinevatele transkriptsioonifaktorile (TF), mis saavad läbi viia transkriptsiooni.
ATAC-seqi meetod on mõeldud transkriptsiooniliselt aktiivse ehk avatud kromatiini tuvastamiseks. Selleks kasutatakse muteeritud Tn5 transposaasi, mis üheaegselt nii fragmenteerib kui ka märgistab vastavad piirkonnad adapteritega. Tavalistel transposaasidel on loomult madal aktiivsus, ATAC-seqis kasutatakse muteeritud hüperaktiivset Tn5 varianti. ATAC-seqi puhul ei ole vaja sonikeerimise ega ka fenool-kloroformi eraldamise etappi (nagu Faire-seqis), kasutada antikehasid (nagu ChIP-seqis) või viia läbi sensitiivset ensümaatilist seedimist (nagu Mnase-seqis ja Dnase-seqis). Samuti piisab ATAC-seqi katse jaoks ainult 50 000 rakust (ChIP-seqi puhul on vaja vähemalt 1 miljon rakku). Kokkuvõttes saab ATAC-seqi ettevalmistused valmis vähem kui kolme tunniga, mis teeb antud meetodist kiirema ja odavama alternatiivi, võrreldes varasematega.
Meetodi kirjeldus.
ATAC-seqi katsele eelnevalt on vaja huvipakkuvad rakud eraldada ja loendada. Rakkude loendamine on kriitilise tähtsusega samm, sest sellest oleneb muuhulgas transpositsiooni efektiivsus. Kuigi ATAC-seqi saab teha minimaalselt 500 rakuga, siis kõige optimaalsem rakkude arv on 50 000. Seejärel rakud lüüsitakse ning eraldatakse tuumad. Puhastatud kromatiin fragmenteeritakse ja märgistatakse adapteritega, kasutades Tn5 transposaasi. Järgneb puhastusetapp, pärast mida kromatiini fragmendid amplifitseeritakse polümeraasi ahelreaktsiooni (ingl PCR - "polymerase chain reaction") abil ning kasutades triipkoodidega praimereid. Saadud raamatukogu analüüsitakse reaalaja PCRi (qPCR) või järgmise põlvkonna sekveneerimise meetoditega (ingl NGS - "next generation sequencing").
Andmeanalüüs.
ATAC-seqi andmete analüüsiks on loodud mitmeid erinevaid töövooge, mille ühisteks etappideks on joondamise-eelne kvaliteedikontroll, adapterite eemaldamine, järjestuste joondamine referentsgenoomile, PCR duplikaatide ja mitokondriaalsete järjestuste eemaldamine ning piikide (avatud alade) tuvastamine. Sellele järgnevad spetsiifilisemad analüüsid nagu erinevus kromatiini ligipääsetavuses kudedes/rakutüüpides, TF motiivide rikastusanalüüs või integreerimine RNA-seqi või ChIP-seqi andmetega.
Rakendused.
ATAC-seqi on kasutatud, et defineerida kromatiini ülegenoomset ligipääsetavust erinevates vähitüüpides. Samuti on leitud, et kollatähni kärbumise puhul langeb üleüldine kromatiini ligipääsetavus. ATAC-seq on näidanud, et kromatiini olek on vererakkude diferentseerumise ajal väga dünaamiline ning aidanud kaardistada transkriptsioonifaktorite seondumissaite.
Üksikraku ATAC-seq.
Originaalprotokolli mugavdamise teel arendati välja üksikraku ATAC-seq. Üksikute rakutuumade eraldamiseks kasutatakse mikrovedelikundust (ingl "microfluidics"), mistõttu saab ATAC-seqi reaktsioone läbi viia individuaalselt. Üksikud rakud saadakse, kas mikrovedelik-seadmete või tilga-põhiste meetodite (ingl "droplet-based methods") abil. Alternatiivselt saab kasutada ka kombinatoorset indekseerimist (ingl "combinatorial cellular indexing"), mis ei vaja üksikute rakkude eraldamist. Selle meetodi käigus märgistatakse rakud kordumatute triipkoodidega ning igas järgnevas voorus lisatakse uus triipkood, luues sellega iga raku jaoks ainulaadsed triipkoodide kombinatsioonid. Kombinatoorne indekseerimine võimaldab genereerida ühe eksperimendi raames 10 000 kuni 100 000 raku epigeneetilise profiili. Eelneva meetodi puuduseks on aga see, et see nõuab suures koguses eritellimusel valmistatud modifitseeritud Tn5 transposaasi. Uuema sci-CAR meetodiga (ingl "single-cell combinatorial indexing chromatin accessibility and mRNA") saab samaaegselt analüüsida nii üksikute rakkude transkriptoomi kui ka epigenoomi.
Puudused.
Kuigi ATAC-seq annab hea ülevaate epigeneetilisest maastikust, ei ole võimalik sellega kindlaks määrata täpset toimemehhanismi (näiteks millised kromatiini modifikatsioonid või transkriptsioonifaktorid huvipakkuvas regioonis esinevad). Tulemuste täpsemaks tõlgendamiseks saab ATAC-seqi korreleerida teiste meetoditega. Lisaks, originaalne ATAC-seqi protokoll on mõeldud rakkude hulgianalüüsiks, mis näitab kromatiini keskmist ligipääsetavust ühe proovi kohta. See aga eeldab, et ühes proovis olevate rakkude omavaheline varieeruvus on väike. Heterogeensuse tabamiseks saab kasutada näiteks üksikraku ATAC-seqi.