TOL-plasmiid

TOL-plasmiid on kataboolne plasmiid, mis kodeerib ensüüme, mis lagundavad tolueeni. TOL-plasmiid vahendab ka "m"- ja "p"-toluaadi ning "m"- ja "p"-ksüleeni lagundamist atseetaldehüüdiks ja püruvaadiks. Lühend "TOL" tuleb sõnast tolueen.
Esimene TOL-plasmiid pWW0 isoleeriti "Pseudomonas putida" mt-2-st, mida kirjeldasid Williams ja Murray 1974. aastal. Kuigi TOL-plasmiid pWW0 kandub üle peamiselt "Pseudomonas" liikide vahel, on leitud seda ka "Escherichia coli", "Erwinia chrysanthemi", "Hydrogenophaga palleronii", "Serratia" ja "Burkholderia" liikides. On leitud ka TOL-sarnast plasmiidi "Alcaligenes eutrophus"'es.
Iseloomustus.
TOL-plasmiid pWW0 on 116 580 aluspaari suurune. Sellest umbes 40 kiloaluspaari on vaja kataboolsete radade ning regulaatorgeenide toimimiseks. Plasmiid on iseülekanduv ning kuulub IncP-9 mittesobivusgruppi. Plasmiid pWW0 kandub edukalt üle biofilmis, erinevatel muldadel ja aedoa lehtedel. Ülekandumise määr sõltub doonortüve kasvust, substraadi kontsentratsioonist ja bakteri metaboolsest aktiivsusest.
Plasmiidi pWW0 nukleotiidsest järjestusest võib oletada, et plasmiidil on 148 avatud lugemisraami (ORFi). Neist 77 on sarnased järjestustele, mis on andmebaasides avaldatud. Neile on ennustatud ka funktsioone nagu näiteks plasmiidi replikatsioon, fenotüübilised tegurid, geeni regulatsioon ja ekspressioon, transpositsioon ning plasmiidi säilitamine ja ülekanne. Plasmiidi pWW0 replikatsioon on termosensitiivne.
Esmane TOL-plasmiidi pWW0 metaboolse raja iseloomustus saadi tänu kataboolsetele geenidele, mis asuvad sel plasmiidil. Eriti tänu katehhooli lagundamiseks mõeldud geenidele. Nimelt "Pseudomonas putida" mt-2 kromosomaalsed geenid kodeerivad "orto"-rada, kuid TOL-plasmiid kodeerib "meta"-rada. Neid radu indutseerivad erinevad substraadid. Näiteks, bensoaat lagundatakse "meta"-rada pidi, katehhool, mis on tolueeni lagundamise vaheühendiks, aga "orto"-rada pidi.
"xyl" geenid.
Tolueeni ja ksüleeni lagundamiseks vajalike ensüümide kodeerimise eest vastutavad "xyl" geenid.
"xyl" geenid asuvad kahe 1275 aluspaari suuruse IS-elemendi vahel (IS1246), võttes enda alla 39 kiloaluspaari. Kataboolne regioon ("xyl" geenid) võib plasmiidilt deleteeruda homoloogse rekombinatsiooni tõttu otsekorduste vahel. Selle tagajärjel tekib väiksem, kuid konjugatiivne 78 kiloaluspaari suurune Tol- plasmiid pWW0-8, mis ei oma fenotüübilist efekti. pWW0-8-l on ainult üks koopia IS-elementi IS1246.
pWW0-l on kaks suurt üksteise sees asetsevat transposooni. Tn4651 on 56 kiloaluspaari ning ümbritseb 39 kiloaluspaari suurust kataboolset ala. Tn4653 on 70 kiloaluspaari suurune ja ulatub Tn4651 sisse. Mõlemad on klass II transposoonid ("lõika ja kleebi"). Neil on ühised "tnpT", "tnpS" ja "res" geenid, kuid eraldi "tnpR" ja "tnpA" geenid. Kataboolsete geenide deletsiooni tõttu tekib transposoon Tn4652, mis ei oma fenotüübilist efekti.
Kataboolne rada.
Tolueeni ja teiste ühendite lagundamine on initsieeritud aromaatse ühendi metüülrühma progressiivse oksüdatsiooni poolt, et toota karboksüülhapet (ülemine rada). Viimane muudetakse Krebsi tsükli vaheühenditeks "meta"-lõikusraja abil.
TOL-plasmiidi pWW0 kataboolsed geenid on organiseeritud kahte operoni – ülemine ja alumine ehk "meta"-operon.
Ülemine operon.
Ülemine operon – "xylUWCMABN" – kodeerib tolueeni ja ksüleenide lagundamist bensoaatideks ja toluaatideks. Ülemine operon koosneb kolmest ensüümist: ksüleeni monooksügenaas (XO), bensüülalkohol dehüdrogenaas (BADH) ja bensaldehüüd dehüdrogenaas (BZDH). Ksüleeni monooksügenaasil on lai substraadi spetsiifilisus. Lisaks tolueenile oksüdeerib ksüleeni monooksügenaas ka bensüülalkoholi bensaldehüüdiks.
Nende ensüümide struktuurgeenid asuvad 8 kiloaluspaari suuruses alas, hõivates ainult 50% DNAst. XO, BZDH ja BADH struktuurgeenid on vastavalt "xylA", "xylC" ja "xylB". Geen "xylM" osaleb ka ksüleeni monooksügenaasi subühikute moodustamises. Geene "xylU" ja "xylW" ei ole vaja tolueeni ja ksüleeni metaboliseerimiseks. Geen "xylN" sünteesib 52 kDa suurust valku, mis hiljem töödeldakse 47 kDa suuruseks valguks.
Alumine ehk "meta"-operon.
Alumine operon – "xylXYZLTEGFJQKIH" – kodeerib bensoaadi ja toluaatide lagundamist Krebsi tsükli vaheühenditeks atseetaldehüüdiks ja püruvaadiks. Alumine operon moodustab 11 kiloaluspaari suuruse ala ning on üks suurimaid operone prokarüootides.
"Meta"-lõikuse operon koosneb 13st geenist. Geenid "xylXYZ" kodeerivad kolme toluaat 1,2-dioksügenaasi subühikut.
Geeni "xylE" produktiks on ensüüm katehhooli-2,3-dioksügenaas. Ensüüm koosneb neljast identsest subühikust, mille molekulmass on 35 kDa. TOL-plasmiidil pWW0 on ainult üks selline ensüüm. Teistel TOL-plasmiididel aga enamasti kaks.
Geen "xylF" kodeerib ensüümi 2-hüdroksümukonsemialdehüüdi hüdrolaas, mis kujundab ühte kataboolse raja osa. Selle ensüümi molekulmass on 65 kDa ning ensüüm on funktsionaalne dimeerina.
Geenid "xylT" ja "xylQ" funktsioonid pole teada.
Alumist rada kirjeldasid Sala-Trepat ja Evans kasutades "Azotobacter" tüvesid. Nad suutsid demonstreerida, et neid radu ühendab ühine vaheühend. Harayama jt näitasid, et erinevad algkomponendid metaboliseeritakse erinevates raja osades. Näiteks, "m"-toluaat lagundatakse "xylF" harus. Samas bensoaat ja "p"-toluaat lagundatakse "xylGHI" osas. Ensüümide afiinsused näitavad, missugune haru metaboliseerib mingit kindlat lähteühendit.
Geneetiline regulatsioon.
TOL-plasmiidil pWW0 on teada kaks regulaatorgeeni, milleks on "xylS" ja "xylR". Neid transkribeeritakse füüsiliselt lähedastel, kuid funktsionaalselt erinevatel promootoritel. Geeni "xylR" kodeeritud valgu XylR suuruseks arvatakse olevat 68 kDa. "xylS" geen kodeerib 36,5 kDa suurust valku.
Valk XylR on peamine TOL raja regulaator, mis kuulub suurde AAA+ ATPaaside perekonda. "Meta"-rajas osalev valk XylS kuulub XylS/AraC perekonda.
Kataboolsete operonide geneetiline regulatsioon väljendab nende biokeemilist organisatsiooni. TOL-plasmiidil pWW0 on kaks regulatoorset tsüklit. "Meta"-tsükkel reguleerib toluaadil kasvamist. Kaskaadne tsükkel, mis on kompleksne süsteem, reguleerib ksüleenil kasvamist. Lisaks kindlustab kaskaadne tsükkel ka ülemise ja "meta"-raja koordineeritud ekspressiooni.
"Meta"-tsükli funktsioon.
Kui rakud kasvavad näiteks glükoosil või glütseroolil, ekspresseeritakse "xylS" geeni vähesel määral σ70-sõltuvalt promootorilt Ps2-lt. Sünteesitakse väikeses koguses inaktiivset XylSi valku. Kui aga kasvukeskkonda lisatakse bensoaati, interakteerub XylSi bensoaadiga. Inaktiivne valk muutub aktiivseks XylSa-ks, mis stimuleerib transkriptsiooni "meta"-raja operoni promootorilt Pm-ilt.
Kaskaadse tsükli funktsioon.
Geen "xylR" on peamine regulaator, mis osaleb kataboolse raja transkriptsiooni kontrollis, kui rakud kasvavad ksüleeni juuresolekul. Geeni "xylR" transkribeeritakse kahelt σ70-sõltuvalt tandeemselt promootorilt. Valk XylR kontrollib ise oma sünteesi. Kui inaktiivne valk XylRi seondub tolueeni või ksüleeniga, muutub ta aktiivseks valguks XylRa. Aktiivne valk stimuleerib transkriptsiooni ülemise raja operoni promootorilt Pu. See protsess vajab σ54 sisaldavat RNA polümeraasi ning histoonilaadset valku IHF-i. Aktiveeritud XylR indutseerib transkriptsiooni ka teiselt σ54-sõltuvalt promootorilt Ps1, stimuleerides geeni "xylS" ekspressiooni. Seda protsessi abistab histoonilaadne valk HU. Kokkuvõttes ekspresseeritakse geeni "xylS" kahelt promootorilt: "xylS" promootorilt Ps2, mis ei sõltu valgust XylR, ja promootorilt Ps1, mis on XylR sõltuv. Kui geen "xylS" on üleekspresseeritud, toodetakse valku XylS liiga palju, mistõttu teatud hulk XylS valgust muutub aktiivseks, isegi kui puudub "meta"-rada aktiveeriv substraat.