Afiinsuskromatograafia

Afiinsuskromatograafia on biokeemias kasutatav meetod, mida kasutatakse ainete eraldamiseks, lähtudes nendele ainetele ainuomastest keemilistest ja immunoloogilistest vastasmõjudest. Meetodi eripäraks on selle suur selektiivsus. Afiinsuskromatograafia on vedelikukromatograafia üks alaliik, mille puhul eraldatavad ained seonduvad esmalt kolonnist täidiseks olevale maatriksile seotud ligandiga ning eraldatakse seejärel kolonnist.
Ajalugu.
1910. aastal rakendas Emil Starkenstein esimest korda afiinsuskromatograafiat amülaasi selektiivsel seondumisel tärklisega. Meetodi tegi sel ajal keeruliseks püsiva maatriksi ja selle külge kinnitunud ligandi saamine, mistõttu see meetod ei saanud laboratoorses praktikas eriti populaarseks. 1967. aastal avalikustasid Rolf Axén, Jerker Porath ja Sverker Ernback meetodi, mille järgi primaarsed aminorühmad võiksid seostuda polüsahhariidi maatriksitega, mis on eelnevalt aktiveeritud tsüanobromiidiga. Varem ei olnud võimalik näiteks proteiin-proteiin-interaktsioone uurida, kuid see meetod võimaldas avastada valgulisi biomarkereid. See tehnoloogia levis laialdaselt ning seda kasutatakse siiani igas laboris, kus tegeletakse biomolekulidega.
Kasutusalad.
Afiinsuskromatograafiat saab kasutada
ainete, näiteks valkude ja ensüümide eraldamiseks ja puhastamiseks mitmesugustest segudest ja lahuse puhastamiseks keskkonna vahetamisel;
lisandainete kontsentratsioonide vähendamiseks segudes;
bioloogiliselt aktiivsete ainete iseloomustamiseks .
Põhimõte.
Eraldatav aine ei tohi väljuda kolonnist. Ülejäänud mitteseonduvad lisaained eemaldatakse kolonni pesemise teel. Huvipakkuv aine seondub selektiivsele substraadile (ligandile), mis on kovalentselt kinnitatud kolonnitäidise ehk inertse kandja külge. Lisaainete väljapesemisel kolonnist peab eraldatav aine jääma ligandiga seotuks.
Proovi ettevalmistamine.
Afiinsuskromatograafiaks valmistatakse uuritavat valku sisaldav proov. Esmalt määratakse kindlaks bioloogiline kude, milles asub huvipakkuv valk. Kui on tegemist rakusisese valguga, tuleb lõhkuda rakumembraanid, rakuvälise valguga ei pea seda tegema. Vajaduse korral tuleb proov tsentrifuugida või filtreerida, et vältida ummistusi kolonnis. Kui prooviga on kõik nimetatud etapid läbitud, võib proovi kolonni sisestada.
Olemus.
Inertne kandja ehk maatriks.
Afiinsuskromatograafias kasutatakse graanulikujulist maatriksit, kuhu seonduvad kovalentsete sidemetega kindlad ligandid. Maatriksi efektiivseks toimimiseks on vajalik selle mittelahustuvus puhvri keskkonnas, keemiline ja mehaaniline stabiilsus. Need omadused peavad olema tagatud piisavalt efektiivse voolukiiruse jaoks. Samas peavad maatriksi osakesed omama suurt pinda, kuhu kinnitada afiinsust tagavad ligandid. Maatriks tehakse tavaliselt näiteks poorsest materjalist agaroosist, klaasist, polüakrüülamiidist või tselluloosist. Osad maatriksid võivad olla saadaval koos kindla afiinsusligandiga, mis on juba immobiliseeritud (näiteks proteiin A). Mittepoorsed materjalid sisaldavad osakesi, mille diameeter on 1–3 µm. Sellised mittepoorsed materjalid võimaldavad küll ainete suhteliselt kiiret puhastamist, kuid tänu väiksele eripinnale on nende abil saavutatav eraldamise efektiivsus väiksem.
Afiinsuse tagab ligand.
Selektiivse substraadi (ligandi) valikul tuleb meeles pidada seda, et ta peab omama spetsiifilist ja pöörduvat afiinsust puhastatava aine suhtes. Ligandil peaksid olema funktsionaalsed rühmad, mis võimaldavad tema kovalentset kinnitumist inertsele maatriksile. Ligandi valikul tuleb arvestada selle ja eraldatava aine vahelise kompleksi dissotsiatsioonikonstandiga (Kd), mille väärtus puhtas lahuses peaks olema vahemikus 10−4–10−8 M.
Siduv õlg.
Afiinsuskromatograafia efektiivsemaks tegemiseks kasutatakse selle modifitseerimist – maatriksi ja ligandi vahele lisatakse õlg, mis koosneb süsinikest ja/või teistest aatomitest. Siduv õlg suurendab sidumise tõenäosust, sest muidu asuksid sihtmolekulid sügaval ja oleksid steerilise takistuse tõttu raskesti kättesaadavad. Õlg tagab, et ei tekiks steerilist takistust ligandi ja afiinsuskromatograafia kolonni osakeste vahel. Siduv õlg ei tohi proovi ja ligandi vahelist vastasmõju ei keemiliselt ega struktuurselt mõjutada.
Afiinsuskromatograafia läbiviimine.
Esmalt valmistatakse ette selektiivne kolonn, mille ligikaudsed mõõtmed on teada. Selleks valitakse välja ligand, mis immobiliseeritakse maatriksile ja määratakse kindlaks kolonni mõõdud. Seejärel süstitakse eelnevalt ettevalmistatud proov silmusesse, kus ta juhitakse automatiseeritud programmiga kolonni. Proovi sisestamise, kolonni pesemise ning voolutuspuhvri kiiruste detekteerimine toimub reaalajas automaatselt. Liiga suure proovi sisestamise kiiruse korral ei seondu eraldatav aine ligandile kvantitatiivselt. Kolonni pesemise kiirus peab seega olema optimaalne, et seostunud proteiin ei väljuks kolonnist koos lisaainetega. Proovi pesemise juures on oluline ka pesemispuhvri pH. Puhvrid ei tohi segada ligandi seostumist maatriksiga.
Läbivoolava kolonni asemel võib afiinsuskromatograafia põhimõtteid rakendada ka katseklaasis. Sellisel juhul lisatakse algne segu tahkele faasile, segatakse ja seejärel eraldatakse tahke faas. Vedelik eemaldatakse, tahke faas pestakse, tsentrifuugitakse, lisatakse elueerimispuhver, tsentrifuugitakse uuesti ja eemaldatakse elueerimispuhver.
Vahel need protseduurid kombineeritakse. Seondumine viiakse läbi katseklaasis, kuid tahke faas on uuritava molekuliga pakitud kolonni külge. Pesemine ja elueerimine viiakse läbi kolonnis.
Kasutusvõimalused.
Kõikides afiinsuskromatograafia alaliikides seondub valguga spetsiifiliselt afiinsusligand, mis on omakorda seotud inertsele maatriksile. See ligand seob puhastatavat valku ning kõik muud komponendid, mis proovis leiduvad, läbivad kolonni ilma sellele seondumata. Kõikige meetodite juures on vaja kolonn tasakaalustada puhvriga, et puhastatav valk saaks seostuda afiinsusligandiga. Afiinsuskromatograafial on mitmeid rakendusvõimalusi, näiteks puhastatakse sellega nukleiinhappeid ja proteiine.
Immunoafiinsus-kromatograafia.
Immunoafiinsus kromatograafia (lühendatult IAC) põhineb antigeeni-antikeha vahelisel afiinsusreaktsioonil. Statsionaarne faas sisaldab antigeeni või antigeeniga sarnast reagenti, samas on võimalik kasutada statsionaarses faasis ka antikehasid. Bioloogiliselt seotud toimeainet kasutatakse valikuliseks puhastamiseks või kindla koostisosa uurimiseks. Antikehade selektiivse ja tugeva sideme moodustumine on suurendanud huvi vastavate ainete vastu. Selle meetodiga on näiteks võimalik eraldada vereseerumist antikehi.
Rekombinantsete valkude puhastamine.
Immobiliseeritud metalli ioonidel põhinevat afiinsuskromatograafiat (lühendatult IMAC) kasutatakse aminohappe, histidiini seondumisel metallidele. Proteiinid, mis on afiinsed metalli ioonide vastu, jäävad kolonni. Kolonn sisaldab immobiliseeritud metalli ioone. Histidiini sisaldavate proteiinide ja peptiidide puhastamiseks kasutatakse koobaltit, niklit või rauda. Väga paljud looduslikult esinevad proteiinid ei oma afiinsust metalli ioonide suhtes. Immobiliseeritud metalli ioonide asemel saame kasutada rekombinantse DNA tehnoloogiat.
Valkudele pannakse külge märgised, mille abil puhastatakse valgud üksteisest. Kõige rohkem kasutatakse afiinsuskromatograafiat rekombinantsete proteiinide puhastamiseks. Kindla afiinsusega valgud on ära märgistatud, et määrata nende puhtus.
Lektiinidel põhinev afiinsuskromatograafia.
Lektiinid on glükoproteiinid või proteiinid, millel on selektiivne afiinsus sahhariidi molekuli või sahhariidi rühmade vastu. Lektiine kasutatakse lektiinide afiinsuskromatograafias kindlate suhkrute eraldamiseks proovist.
Meetodi eelised ja puudused.
Ainete lahutuvus on afiinsuskromatograafia korral väga hea. See teeb kõnealusest meetodist pehme analüüsimeetodi. Suure lahutuvuse korral ei teki analüüsi käigus fragmente, mis võiksid analüüsi segada. Samuti on eeliseks suurte proovikoguste kasutamise võimalus, kuid meeles peab pidama kolonni ruumala ning aktiivsete sidumiskohtade arvu. Kui proovi võetakse liiga palju, siis on oht, et huvipakkuval ainel ei ole kuskile seonduda (varieerides kolonni ruumalaga, saame olla kindlad, et uuritav valk seondub ligandiga täielikult). Afiinsuskromatograafia võimaldab puhastada aineid &gt;95% puhtusega, mistõttu võib seda pidada usaldusväärseks analüüsimeetodiks.
Afiinsuskromatograafia kiirust võib pidada võrdlemisi mõõdukaks, võrreldes teiste vedelikukromatograafia meetoditega.