Varbuss

Varbuss (ka "sireuss"; "Caenorhabditis elegans"; lühend "C. elegans") on mullas elav nematood ehk ümaruss, kes on laialdaselt kasutusel mudelorganismina. Tänapäeval uuritakse varbusside abil näiteks vananemist, vähki ja neuroloogilisi haigusi.
Ussikeste pikkus on umbes 1 mm ja läbimõõt 65 µm. Nad on euteelilised organismid – täiskasvanud hermafrodiitne isend koosneb 959 keharakust ja isane isend 1031 rakust.
Esimesena kirjeldas varbussi Émile Maupas 1900. aastal. Laborisse jõudsid nad 1950. aastatel, kuid populaarseks molekulaar- ja arengubioloogia mudelorganismiks muutis varbussid alles Sydney Brenneri töö 1970. aastatel. 1980. aastatel pani John Sulston kokku tervikliku sügoodi arenguliinide kirjelduse ja 1986. aastal kirjeldati ära ussikese närvirakkude vahelised ühendused. See on seni ainus loom, kelle neuronite täpne ühenduste võrk on teada. 1998. aastal esitleti varbussi sekveneeritud genoomi, mis tegi sellest esimese sekveneeritud genoomiga hulkrakse organismi.
Varbussi laialdane kasutamine katseloomana tuleneb tema paljudest soodsatest omadusest laboritöö jaoks. Neid on odav pidada ja nad võtavad vähe ruumi. Nad taluvad hästi säilitamist ja omavad arvukat järglaskonda. Kiire elutsükkel, läbipaistvus ja väike genoom lihtsustavad selle uurimist. Samuti pole varbussiga töötamiseks vaja eetikakomisjoni luba. Vabalt on saada suurel arvul mutante.
Bioloogia.
Umbes 99,95% varbussi looduslikust (metsiktüüpi) populatsioonist on hermafrodiidid (XX kromosoomidega), isaseid leidub üliharva.
Täiskasvanud hermafrodiitsel varbussil on 959 somaatilist rakku, täiskasvanud isasel isendil aga 1031. Seejuures on esindatud enamik loomadel esinevatest peamistest koetüüpidest. 959 raku seas on 302 neuronit, 111 lihasrakku, 34 soolestiku rakku ja 213 epidermise rakku.
Genoom.
Varbussi genoom jaotub kuue tuumakromosoomi (autosoomid I, II, III, IV, V ja sugukromosoom X) ja mitokondriaalse genoomi vahel. See koosneb 100,27 miljonist aluspaarist (väljendatakse ka kujul 100 Mbp; inimese genoomi suurus on ligikaudu 3000 Mbp). On tähelepanuväärne, et varbuss oli esimene hulkrakne organism, mille genoom sekveneeriti. Järjestust esitleti 1998. aastal, kuid allesjäänud lüngad said täidetud alles 2002. aastaks.
Varbussil on 2017. aasta alguse seisuga teada 20 240 valke kodeerivat geeni. Tuvastatud RNA geenide hulk on viimastel aastatel oluliselt kasvanud (eriti tänu 2006. aastal avastatud uuele 21U-RNA geenide klassile) ja arvatakse, et see sisaldab tuhandeid RNA geene. Alles 2005. aastal peeti nende arvuks 1300. Mitokondriaalseid geene on 36 ja mitokondri genoom on 13 794 nukleotiidi pikk (13,8 kbp).
Inimese genoomi kaardistamisel leiti, et selles on oluliselt vähem geene kui oli seni arvatud. Leid andis põhjust arvukateks võrdlusteks inimese genoomi ja paljude lihtsate organismide genoomide vahel, millest üsna sageli tõsteti esile just antud millimeetripikkust nematoodi. Hiljem on leitud, et enam-vähem sama geenide arvu kõrval erineb suuresti aga alternatiivne splaissing, mis toimub ainult 10% varbussi geenidelt, kuid inimeste puhul on see näitaja erakordselt kõrge – on leitud, et kuni 94% inimese geenidest toodab alternatiivne splaissingu abil mitut valgusaadust.
Varbussil on viis paari autosoome ja üks paar sugukromosoome. Erinevalt hermafrodiitidest (XX) on isastel ainult üks sugukromosoom (X0).
Areng ja paljunemine.
Rakkude jagunemine.
Kui koorudes on igal hermafrodiitsel varbussil 558 somaatilist rakku, siis täiskasvanuna on neid juba 959 (millele lisandub määramatu arv sugurakke). Seejuures sureb arengu käigus 131 rakku apoptoosi teel. Kuna kogu rakujagunemise protsess toimub alati ühetaoliselt ja et ussike on läbipaistev, on osutunud võimalikuks kõigi nende rakkude arengu jälgimine ning protsessi täpne kirjeldamine. Sellega sai hakkama John E. Sulston 1980. aastatel, kui ta pani kokku tervikliku sügoodi arenguliinide kirjelduse.
Pärast viljastumist lõigustub sügoot asümmeetriliselt mitu korda, mille käigus tekivad kuus "rajajat" ("founder") rakku. Üks neist (P4) säilitab totipotentsuse ja annab aluse sugurakkude liinile. Tähega "E" märgitud rakust saab jagunemise käigus soolestik ja "D"-nimelisest rakust kujunevad nematoodi keha seina lihased. Ülejäänud kolmest (AB, MS ja C) rakust arenevad valdavalt närvi- ja lihasrakud.
Joonisel on esitatud neli esimest jagunemist, totipotentsed rakud on märgitud punaselt.
&lt;/table&gt;
Arenguseisak.
Munad muneb hermafrodiitne "C. elegans". Pärast koorumist läbivad nad neli larvi ehk vastse staadiumit (L1–L4). Kui populatsioon on liiga tihe või pole piisavalt toitu, võib varbuss larvi kolmandas staadiumis (L3) moodustada dauer vastse, mis on resistentne stressifaktoritele ning ei toitu ega vanane. Tegemist on arenguseisakuga, mis tekib vastusena sobimatutes keskkonnaoludes eralduma hakkavale feromoonile.
Dauer vastne võib elada mitu kuud (s.t ületada mitu korda varbussi tavalise eluea) ja tingimuste paranedes arenguseisakust väljuda, kestuda ning areneda neljanda arenguastme vastseks (L4), mille käigus algab seemnerakkude tootmine.
Säärane võime muuta ebasobivates keskkonnaoludes enda eluea pikkust, pakub laialdast huvi teadlastele ja tänu geneetilistele uuringutele on sellest ka üsna palju teada.
Esimene eluea pikkust kontrolliv geen, mis varbussilt leiti, oli "age-1" – proteiinkinaas, mis omab olulist rolli insuliini ülekanderajas. Sama mehhanismiga on seotud ka "daf-2" ("dauer formation") geen, mis on insuliini retseptori homoloog. Seda, et mõlemad geenid toimivad ühe süsteemi alusel, tõestab aga see, et mutandid, kellel oli kadunud nii "age-1" kui "daf-1" geeni funktsioonid, elavad sama kaua kui mutandid, kellel on kadunud nendest geenidest ainult ühe funktsioon.
Geenide "age-1" ja "daf-2" normaalseks funktsiooniks on nematoodi eluea kestuse vähendamine tingimustes, kus toitu on piisaval kogusel. Mutantidel, kellel ei toimi "age-1" geen, on eluiga keskeltläbi 60 % pikem kui selle geenivariandi normaalse esinemisega isenditel. Varbussidel, kellel esinevad muudatused "daf-2" geenis, suunduvad aga alati L3 staadiumis puhkeolekusse ja seda ka piisava toidukoguse juuresolekul. Kui aga sellised mutandid jõuavad L4 arengustaadiumisse, arenevad nad enamasti normaalse välimusega ja kaks korda pikema elueaga täiskasvanud isenditeks. Sellest võib eeldada, et "daf-2" ei ole seotud mitte arenguseisakusse minekut põhjustavate morfoloogiliste muudatustega, vaid just eluea pikkusega.
Muudatusi elueas, mida need kaks geeni põhjustada võivad, saab ära hoida mutatsiooniga geenis "daf-16", mille normaalne talitus peaks tagama eluea pikenemise olukorras, kus toitu ei ole piisavalt.
Seemne- ja munarakkude tootmine.
Hermafrodiitne varbuss toodab nii seemne- kui ka munarakke. Esimestest diferentseeruvatest idurakkudest, mis arenevad ussi vastseeas (L1–L4), moodustuvad spermid, mis säilivad emakas. Kui aga vastne muutub pärast neljandat kestumist täiskasvanuks, lõppeb seenerakkude teke ja hakkavad moodustuma munarakud ehk ootsüüdid, mille hiljem seemnerakud viljastavad.
Seemnerakke säilitatakse algselt samas kohas, kus hakkavad hiljem paiknema ootsüüdid. Ootsüütide tekkel suruvad nad aga spermid seemnehoidlatesse. Seal hakkab toimuma ka munarakkude viljastumine.
On leitud kaks mehhanismi, mis kontrollivad vastse neljanda kestumise ajal toimuvat üleminekut spermatogeneesilt ovogeneesile. Neist esimesel juhul toimub üleminek erinevate mRNA-de valikulise represseerimise abil, mille puhul saavutatakse seemnerakkude tootmine "tra-2" mRNA allasurumisega. Kui seda ei toimuks, siis seemnerakke ei saaks moodustuda ja varbuss oleks emane. Munarakkude tootmise alustamiseks on aga tarvis represseerida "fem-3" mRNA translatsioon ja takistada seeläbi isase keharakkude ja seemerakkude tootmise eest vastutava valgu FEM-3 sünteesi.
Lisaks kirjeldatud moodusele toimub varbussides translatsiooni mahasurumine ka "antisense" RNA abil. Sellisel juhul on kasutusel üheahelalised RNA ahelad, mis võivad seonduda mRNA-ga viisil, mil moodustub täpselt paardunud kaksikheeliks ja seeläbi blokeeritakse ahelalt toimuv valgusüntees.
"C. elegans"i vastsele on tarvis valku LIN-14, mida ei ole vaja aga täiskasvanud isenditel. Selle valgu translatsiooni represseerimine toimub geeni "lin-4" kaudu, mis aga ei kodeeri valku, vaid kahte erinevat lühikest RNA molekuli, mis võivad "lin-14" mRNA-ga seondudes takistada tolle abil toimuvat valgusünteesi. See avastus leidis esmamainimist 1993. aastal ning viis hiljem mikro-RNA (miRNA) avastamisele.
Kui algselt arvati teaduskogukondades, et mikro-RNA-d võivad olla iseloomulikud vaid ümarussidele, siis hiljem tuvastati, et need lühikesed RNA lõigud on väga olulised paljude organismide arengus kui ka üldises toimimises ning ainuüksi inimeste DNA kodeerib enam kui 2000 erinevat mikro-RNA molekuli.
Paljunemine.
Hermafrodiit muneb oma 2–3 nädala pikkuse elu vältel iseviljastumisel peaaegu 300 muna. Kui toimub aga paaritumine isase ussiga, võib hermafrodiit toota üle tuhande järglase.
Kasutamine teadustöös.
Esimest korda tõi varbussid laborisse USA nematoloog Ellsworth Dougherty 1950. aastatel. Koos Sydney Brenneri uurimistööga muutus "C. elegans" aga 1974. aastal populaarseks molekulaar- ja arengubioloogia mudelobjektiks ning on seda tänapäevani.
Pärast sügoodi arenguliinide tervikliku kirjelduse koostamist 1980. aastatel kasvas veelgi nematoodi kasutamine teaduslikus uurimistöös, kuna paranesid võimalused, millega saab jälgida rakkude jagunemist ja diferentseerumist elunditeks ja elundkondadeks. 1998. aastal, mil sekveneeriti esimese hulkrakse loomana varbussi kogu genoom, mis sisaldab ligi sada miljonit aluspaari (viimased lüngad geenide järjestuses täideti 2002. aastal), avardusid nematoodi rakendamise võimalused veelgi.
Varbussi muudavad ideaalseks uurimisobjektiks paljud omadused: näiteks on seda ussikest väga lihtne ja odav kasvatada, see on läbipaistev, ta talub hästi külmutamist, katseteks ei ole vaja taotleda luba ning ta koosneb vaid 959 rakust, millest umbes 300 on närvirakud.
Eestis on varbusse uuritud Tartu Ülikooli loodus- ja tehnoloogiateaduskonnas Kaja Reisneri osalusel ja Tallinna Tehnikaülikoolis. Tartu Ülikoolis on vaadeldud eelkõige rasvhapete ja endokannabinoidide rolli "C. elegans"`is. Liisa Parts on Oxfordi Ülikoolis uurinud varbusside põhjal pestitsiidiresistentsust.
Kasvatamine laboritingimustes.
Varbussi kasvatamiseks laboris valmistatakse Petri tassile agarist, peptoonist, kolesteroolist ja mõnedest sooladest tehtud sööde, kuhu külvatakse ussikese söök – kolibakterid ("Escherichia coli"). Nematood tõstetakse tassile ja kui tass on täitunud ussidega, tõstetakse ussid ümber uutele alustele. Ussikese areng kestab toatemperatuuril (20 °C) umbes neli päeva, temperatuuril 25 °C kolm päeva.
Apoptoos.
John E. Sulston, kes töötas Sydney Brenneri juhtimise all Cambridge'i Ülikooli molekulaarbioloogia laboris "C. elegans"i arengu ja organogeneesi alal, täheldas, et iga üksik ussike läbib täpselt ühesuguse rakkude jagunemise ja diferentseerumise protsessi ning, et alati ootas varbussi viljastatud munarakust täiskasvanud isendiks kasvades toodetud 1090 rakust 131 apoptoos ehk programmeeritud rakusurm (PCD, "programmed cell death").
Püüdes tabada rakusurma geneetilisi tagamaid jätkas H. Robert Horwitz S. Brenneri ja J. E. Sulstoni tööd varbussi geneetika ja rakkude sugupuu alal. Tema tööd saatis edu ning ta avaldas 1986. aastal artikli, milles kirjeldas kahte "surmageeni" ("ced-3" ja "ced-4"), mis vastutavad otseselt rakkude apoptoosi eest. Ta on samuti tuvastanud geeni "ced-9", mis hoiab "surmageenidega" seondudes rakke suremast, ning hulgaliselt teisi geene, mis osalevad rakusurma reguleerimises. Pärast nende geenide tuvastamist varbussil sai võimalikuks sama funktsiooniga geenide otsimine inimese genoomis.
2002. aastal said Sydney Brenner, H. Robert Horvitz ja John E. Sulston oma geneetikaalase töö eest organite moodustumise geneetiliste mehhanismide ja rakusurma uurimisel Nobeli meditsiiniauhinna.
RNA-uuringud.
RNA interferents.
2006. aastal anti Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhind RNA interferentsi (RNAi) avastamise eest varbussil Andrew Fire'le ja Craig C. Mellole. Avastuse kohta kirjutatud artikkel avaldati 1998. aastal.
Varem oldi sama nähtust tähele pandud mitmetel taimedel ja seenel "Neurospora crassa". Hiljem leiti seda aga ka paljudel loomadel. Näiteks harilikul äädikakärbsel ("Drosophila melanogaster"), hiirtel ja sebrakalal ("Danio rerio").
Mello ja tema grupp leidsid, et pikka kaheahelalist RNA-d (dsRNA) "C. elegans"i süstides osutub võimalikuks põhjustada vastava mRNA järjestuse spetsiifilist degratsiooni. Nõnda on põhimõtteliselt võimalik inhibeerida iga geeni ekspressiooni soovitud ajal. See meetod võimaldab efektiivselt tagada aktiivsete geenide vaigistamist.
Mikro-RNA.
Mikro-RNA (miRNA) kirjeldati esimest korda 1993. aastal seoses Victor Ambrose laborites tehtud ja "C. elegans"iga seotud uuringutega. Need üheahelalised, tavaliselt 21–23 nukleotiidi pikad RNA ahelad, mis reguleerivad geenide ekspresseerumist, nimetati mikro-RNA-ks aga alles 2001. aastal, kui leiti, et eri organismide genoomid kodeerivad suurt hulka regulatoorse funktsiooniga väikeseid RNA molekule. 2000nde lõpuks jõuti arusaamisele, et miRNA-d reguleerivad enam kui 30% imetajate geenidest.
Victor Ambros ja Gary Ruvkun pälvisid avastuse eest 2024. aastal Nobeli füsioloogia- või meditsiiniauhinna.
Organismi eluea pikkuse uuringud.
Viimastel aastakümnetel on molekulaargerontoloogid püüdnud identifitseerida üksikuid geenimutatsioone, mis pikendavad laboris kasvatatavate katseloomade eluiga. Üks selles vallas populaarsemaid mudelorganisme on jällegi "C. elegans".
Näiteks on leitud, et insuliini koguse vähenemine organismis võib kaasa aidata organismi eluea pikenemisele. Algul seostati seda organismi suurema vastupanuvõimega väliskeskkonna oksüdatiivsele stressile, kuid hiljem on kaheldud, kas oksüdatiivne stress üldse vananemises rolli mängib ja olulisemaks on peetud kasvuprotsesside aeglustumist. Insuliini kasutamist mõjutavatest geenidest on vast enimuuritud "age-1", mis on insuliiniedastusraja katalüütiline allüksus, ja "daf-2", mis on insuliini edastusega seotud transkriptsioonifaktori "daf-16" moodustumist reguleeriv insuliiniretseptor.
Teada on rohkem kui 100 ühendit, mis varbusside eluiga tõstavad, kuid neist suurema osa puhul ei ole teada, milline on nende mõju elusorganismile tervikuna.
GFP.
2008. aasta Nobeli auhinda keemias jagasid Osamu Shimomura, Martin Chalfie ja Roger Y. Tsien rohelise fluorestseeriva valgu, mida tuntakse eelkõige ingliskeelse lühendi GFP ("green fluorescent protein") järgi, avastamise ja kasutuselevõtu eest.
Shiomura eraldas 1960. aastatel GFP Põhja-Ameerika läänerannikul elutsevalt meduusilt "Aequorea victoria" ja avastas, et see helendab ultraviolettkiirguses roheliselt. Chalfie, kes uuris "C. elegans"i, käis aga välja idee, et ühendada GFP tootmist suunav geen mõne teise varbussis toodetava valgu geeniga. Selle abil oleks võimalik ussikese valgustamisel GFP-ga märgistatud geen üles leida ja uurida, kas see on sisse lülitatud, ning kui see toodab valku, siis välja selgitada, kus toda toodetakse ja kuhu see edasi liigub. Kui aga oleks tarvis samal ajal uurida mitut protsessi, on ühest värvist vähe. Siin tuli appi Tsien, kes töötas korallidest leitu põhjal välja mitu uut valku, mis helendavad näiteks siniselt, punaselt ja kollaselt.
Närvisüsteem ja selle uuringud.
"C. elegans" on üks lihtsaima ehitusega organisme, millel esineb närvisüsteem. Hermafrodiidil on 302 neuronit (närvirakku) ja 56 gliiarakku (isastel on neuroneid 381 ja gliiarakke 92), mis moodustavad lausa 37% hermafrodiidi somaatilistest rakkudest. Nende mustri kaardistasid teadlased täies mahus juba 1986. aastal ja sealt alates on varbusse kasutatud palju ka närvisüsteemiuuringutes.
Ussikese neuronid on morfoloogia ja ühenduste järgi jaotatud 118 klassi. Neil on lihtne ehitus ja vähe või üldse mitte harusid. Närvide kimbud on paigutunud pikisuunas ja ringikujuliselt ning nad külgnevad sageli epiteelkoega. Üldiselt on neuronid lokaalselt arvukate ühendustega, mis seovad neid paljude oma naabritega. Lihasrakkudes on jätked, mis ulatuvad motoneuraalsete aksoniteni. Enamik tüüpilise looma ehituslikult erinevatest sünaptilistest ühendustest on esindatud ka varbussil. Kokku esineb ligikaudu 5000 keemilist sünapsi, 2000 neuromuskulaarset ühendust ja 600 aukliidust ("gap junction").
Kui üks põhilisi uuringusuundasid tegeleb närvisüsteemi arengu ja geenide vaheliste seoste leidmisega, siis katseid on tehtud ka teistes valdkondades. Näiteks 2010. aastal näidati, et ussikese käitumist saab mõjutada, kui siduda närvisüsteemiga magnetväljale reageerivaid nanoosakesi ja neid omakorda mõjutada. Levinud on ka ussikeste kasutamine sõltuvuste uurimiseks.
Meediakajastus.
Lisaks arvukatele teadusartiklitele ületas "C. elegans" uudisekünnise seoses kosmosesüstiku Columbia katastroofiga 2003. aasta 1. veebruaril, kui ussikesed osutusid ainsateks organismideks, kes katastroofi üle elasid. Varbussid, kes elasid alumiiniumkanistrisse suletud Petri tassidel, leiti mitu nädalat pärast katastroofi toimumist ja nende elusolek sai kinnitust 28. aprillil 2003, kui kanistrid Kennedy Kosmosekeskuses avati. Süstiku stardil 16. jaanuaril sisaldasid Petri tassid 10–500 ussi, aga leidmisel oli neid 0 – 27 000 ja arvatavasti oli tegu juba üsna mitmenda põlvkonnaga.
Veel on need ussid kõneainet pakkunud 2009. aastal, kui sai teatavaks plaan neid kosmosesse saata, et uurida gravitatsiooni puudumise mõju muskulatuuri arengule ja füsioloogiale üldiselt. Nottinghami Ülikooli korraldatud projektis oli erilise tähelepanu all lihaste kõhetumine ehk atroofia. Ussikesed alustasid teekonda rahvusvahelisse kosmosejaama 16. novembril 2009.