Transposoonmutagenees

Transposoonmutagenees on protsess, mille kaudu transponeeruv DNA element ehk transposoon siseneb juhuslikku kohta genoomis rikkudes geeni lugemisraami või häirides selle funktsiooni. Rikutud geenide pärandumisel järgmisele põlvkonnale tekivad mutatsioonid.
Transposoonide määratlemisel ei ole teadlaste seas täielikku üksmeelt ning esineb laiem definitsioon, mis hõlmab transponeeruvaid elemente kõikides organismides ja kitsam definitsioon, mis tõstab transposooni nimetuse kaudu esile ainult bakterites paiknevad Tn transposoonid.
Transponeeruvate elementide põhjustatud mutagenees esineb looduses kõikides organismides. Transposoonmutageneesist rääkides mõeldakse eelkõige bakterites toimuvat mutageneesi, mida põhjustavad Tn transposoonid.
Transposoonmutageneesi kasutatakse bakterigeneetikas laboratoorse meetodina. Transposoonmutageneesi abil on võimalik uurida mitmesuguseid rakulisi protsesse.
Transposoonmutageneesil on ka oma osa multiresistentsete bakteritüvede tekkimisel, mis on tänapäeval suureks probleemiks haiglates, kus levivad bakterid, mida ühegi antibiootikumiga ei ole võimalik hävitada.
Avastamine.
Esimene, kes transposoonmutageneesi uuris, oli ameeriklane Barbara McClintock, kes 1940. aastate lõpus avastas transponeeruvad elemendid maisist maisiterade värvuse ja mustri geneetilisel analüüsil. Barbara McClintock lükkas transponeeruvate elementide ("hüppavate geenide") avastusega ümber tolleaegse uskumuse, et geenid on kromosoomis kindlalt paigas ega liigu sealt kuskile. Alles uute meetodite kasutuselevõtmisel 1960. ja 1970. aastatel saadi kinnitavaid tõendeid liikuvate DNA elementide esinemise kohta ka teistes organismides, kui avastati transposoonid viirustes ja bakterites. 1983. aastal pälvis Barbara McClintock Nobeli auhinna transponeeruvate elementide avastamise eest maisis.
Transposoonid.
Transposoonid on liikuvad DNA elemendid, mis on võimelised ühe raku piires ümber paigutuma. Need võivad "hüpata" erinevate kromosoomi osade vahel, või ühest DNA molekulist teise. Transposoonidest rääkides mõeldakse eelkõige transponeeruvaid elemente bakterites (Tn transposoonid), eukarüootsetes organismides nimetatakse neid teisiti. Näiteks äädikakärbsel ("Drosophila melanogaster") on transponeeruvad P elemendid, maisis Ac ja Ds elemendid, Mariner-tüüpi elemendid esinevad nematoodidel, seentel ja inimestel.
Transposoon koosneb kahest põhiosast: transposooni otstest ning transponeerumiseks vajalike valke kodeerivatest geenidest. Transposooni otsad kujutavad endast pöördkordusjärjestusi (IR-"inverted repeat"). Tavaliselt sisaldavad transposoonid ka muid geene, näiteks antibiootikumide või raskmetallide resistentsusgeene ning kataboolseid geene. Komplekssetel transposoonidel on lisaks mõlemas otsas IS elemendid, mis muudavad nad liittransposoonideks, sest IS elemendid on samuti transponeeruvad. IS elemendid on väikseimad (700–2500 aluspaari) mobiilsed DNA elemendid ning nad kodeerivad ainult transpositsiooniks vajalikke valke. IS elemendid võivad olla transposoonis orienteeritud samasuunaliselt (näiteks IS1 Tn9-s) või vastassuunaliselt (näiteks IS50 Tn5-s).
Transponeerumise mehhanismid.
Transpositsioon võib toimuda kahel viisil. Replikatiivsel transpositsioonil toimub transpositsiooni käigus transponeeruva elemendi replikatsioon, nii et lõpptulemusena jääb koopia transposoonist nii doonori kui ka retsipiendi molekuli, näiteks Tn3 tüüpi elementidel. Teiseks võimaluseks on "lõika ja kleebi" ("cut and paste") printsiip, kus transposoon lõigatakse doonormolekulist välja.
Transposooni liikumist katalüüsib ensüüm nimega transposaas, mis lõikab transposooni välja, aitab sellel seostuda sihtmärk-DNA molekuliga ja teeb sihtmärkjärjestusse "kleepuvate otstega" katked, mis on vajalikud transposooni sisenemiseks. Kleepuvateks otsteks nimetatakse DNA ahela otstes olevaid lühikesi üksikahelalisi lõike. Kleepuvatest otstest allesjäävatele üksikahelalistele sihtmärk-DNA lõikudele sünteesib komplementaarsed ahelad DNA polümeraas ja DNA ahelate otsad ühendab ligaas. Selle tulemusena tekivad sihtmärkjärjestusse 2–14 aluspaari pikkused duplikatsioonid kummalegi poole inserteerunud transposooni.
Transposoonide "hüppamiseks" on vaja transposaasi, mis katalüüsib transposooni liikumist ühest molekulist teise, ja transposooni otsmisi järjestusi, millele seondub transposaas, et "hüppamist" läbi viia. Transposaasi geen ei pea olema transposooni enda koosseisus, vaid võib eraldi esineda plasmiidis või kromosoomis ja ikkagi transposooni liikuma panna.
Transposoonide sisenemine on enamasti juhuslik, sest transposoonid ei vaja "hüppamiseks" homoloogiat transposooni ja sihtmärkjärjestuse vahel erinevalt homoloogilisest rekombinatsioonist. Transposoonide sisenemisega sihtmärk-DNA-sse võib kaasneda geenide lugemisraamide või regulatoorsete piirkondade juhuslik "ära rikkumine". Transposoonide transponeerumine võib põhjustada ka suuremaid geneetilisi ümberkorraldusi, mille tulemuseks on transposoonile külgnevate DNA lõikude ümberpöördumine (inverteerumine) või väljalangemine (deleteerumine). Kui kaks rekombineeruvat transposooni on kromosoomis vastupidises orientatsioonis, siis toimub nende vahele jääva segmendi inversioon, kui samasuunaliselt, segment deleteerub. Transposoonid võivad põhjustada ka kromosoomidevahelisi ümberkorraldusi (nii homoloogiliste kui ka mittehomoloogiliste kromosoomide puhul). Sel juhul tekib tütarkromatiidide vahelise ristsiirde tulemusena kaks produkti: kromosoom, milles transposoonidevaheline ala on kahekordistunud ja kromosoom, millest see on kaotsi läinud. Mõnede transposoonide otstes on otsast väljapoole suunatud promootorjärjestused, mis võivad aktiveerida transposooniga külgnevate geenide transkriptsiooni.
Mobiilsete elementide (transposoonide ja IS elementide) transponeerumine toimub bakterirakus tavaliselt väga madala sagedusega. Vastasel korral suureneks rakkudes transpositsiooniga kaasnevate geneetiliste ümberkorralduste sagedus, mille tulemusena võivad välja lülituda rakule eluliselt tähtsad geenid. Näiteks, kodeerib Tn5 repressorvalku, mis pärsib Tn5 transpositsiooni toimumist. Repressori translatsioon algab transposaasi geeni seest ja seetõttu puudub tal täispika transposaasi N-terminaalne järjestus, mis ilmselt on transpositsiooni toimumiseks vajalik järjestus.
Kasulik või kahjulik?
Transposoonid on mutageenid, mis tagavad organismide geneetilise mitmekesisuse. Tekkinud mutatsioonid võivad olla bakterile kasulikud, andes neile eelise muteerumata bakterite ees ja sellega soodustades muteerunud bakterite levikut. See tähendab, et osadel ümberkorraldustel on organismile positiivne valikuväärtus ja sel juhul jääb mutatsioon genoomis püsima. Enamik mutatsioone, mis transposoonide sisenemine genoomi põhjustab, on siiski bakterile kahjulikud. Seega on transposoonid kui parasiidid, mis paljunevad organismis raku sisemiste ressursside arvelt ja kutsuvad genoomis esile enamasti kahjulikke muutusi.
Transposoonmutageneesi läbiviimine bakteris.
Minitransposoon.
Minitransposoonid on biotehnoloogiliselt konstrueeritud hõlbustamaks transposoonmutageneesi laboratoorseks läbiviimiseks. Minitransposoonid sisaldavad ainult transpositsiooni jaoks vajalikke otsmisi pöördkordusjärjestusi ja antibiootikumi resistentsusgeeni. Minitransposooni puhul on oluline, et selle koosseisus ei oleks transposaasi kodeerivat geeni. Transposaasi geeni puudumine muudab minitransposooni sisestamise stabiilseks, sest ilma transposaasita ei ole transposoon võimeline edasi "hüppama".
Minitransposoon on näiteks mini-Tn5, mis on konstrueeritud nii, et see sisaldab transpositsiooni jaoks vajalikke 19 aluspaari pikkusi Tn5 otsmisi pöördkordusjärjestusi. Nende vahele on konstrueeritud erinevaid resistentsusgeene, näiteks kanamütsiini, klooramfenikooli, tetratsükliini, streptomütsiini resistentsusi kodeerivaid geene. Erinevad resistentsusgeenid võimaldavad kasutada mini-Tn5 transposooni transposoonmutageneesiks mitmesugustes organismides.
Plasmiidse vektori valik.
Plasmiid on rõngakujuline kaheahelaline DNA molekul, mis sisaldab autonoomset paljunemist võimaldavaid geneetilisi elemente (eelkõige replikatsiooni alguskohta e originit). Plasmiidi replikatsioon toimub peremeesraku ensüümsüsteemi abil. Vektori all mõistetakse DNA "kandurmolekuli", mille koosseisu saab sisestada uuritava DNA järjestusi ja mille abil saab uuritavat DNA-d paljundada peremeesorganismis. Lisaks originile sisaldavad plasmiidsed vektorid selektiivset markerit (näiteks ampitsilliini resistentsust tagavat geeni) ja unikaalseid restriktaaside lõikamiskohti, mis esinevad plasmiidis ainult üks kord.
Transposoonmutageneesi läbiviimiseks mingis bakteritüves on kõigepealt vajalik transposoon bakterirakkudesse sisestada. Selleks kasutatakse erinevaid plasmiidseid vektoreid, millesse on kloneeritud minitransposoon, näiteks pUTmini-Tn5. Oluline on, et minitransposooni kandev plasmiidne vektor ei replitseeruks bakteritüves, kus transposoonmutageneesi läbi viiakse. See omadus on vajalik selleks, et minitransposooni kandev plasmiid võimaldaks ainult minitransposooni ülekannet bakterirakkudesse, kuid ei jääks uuritavasse tüvesse püsima. Seetõttu kasutatakse minitransposooni kandvate plasmiididena suitsiidplasmiide. Suitsiidplasmiidid on nimetatud selle järgi, et nad suudavad replitseeruda vaid kindlalt selleks konstrueeritud bakteritüvedes. Nende viimisel teistesse tüvedesse ei ole suitsiidplasmiidid võimelised replitseeruma ning need elimineeruvad.
Kolmikristamine.
Kolmikristamise käigus toimub minitransposooni kandva plasmiidi konjugatsioon doonortüvelt retsipienttüvesse, mida vahendab abistajatüvi.
Minitransposooni kandev plasmiid sisestatakse bakteritüvesse, kus soovitakse transposoonmutageneesi läbi viia, konjugatsiooni teel. Konjugatsiooniks nimetatakse bakteri DNA vahetut ülekannet doonortüvest retsipienttüvesse (vastuvõtjatüvesse), mis eeldab rakkudevahelist kontakti. Minitransposooni kandev plasmiid asub bakteritüves, mis on konjugatsiooni protsessis doonortüveks. Samasse plasmiidi on sisestatud transponeerumiseks vajalik transposaasi kodeeriv geen. Doonortüve kromosoomi on viidud geen, mis kodeerib plasmiidi replikatsiooniks vajalikku valku. Kuna see tüvi ei ole ise võimeline konjugatsioonil plasmiidi teise organismi üle kandma, kasutatakse lisaks veel nn helper- ehk abistajatüve, mis sisaldab minitransposooni konjugatsiooniks vajalikke valke kodeerivat plasmiidi. Retsipienttüved, kus transposoonmutageneesi teostada, võivad kuuluda paljude bakteriliikide hulka, näiteks "Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Erwinia carotovora". Minitransposooni kandva doonortüve, helpertüve ja retsipienttüve rakud kasvatatakse eksponentsiaalsesse kasvufaasi ning segatakse kokku mitteselektiivsele tardsöötmele ristumisplärakaks. Eksponentsiaalne kasvufaas on ajavahemik, kus uusi baktereid tekib ajaühikus proportsionaalselt olemasolevate bakterite hulgaga.
Transposoonmutantide selektsioon.
Pärast konjugatsiooni toimumist plaaditakse kolme bakteri segu minimaalselektiivsöötmele, mille tingimused võimaldavad vaid transposoonmutandi kasvu. Minitransposooni kandvat plasmiidi sisaldava doonottüve ja helperplasmiidi sisaldava abistajatüve rakud ei ole võimelised kasvama minimaalsöötmel, mis ei sisalda ühtegi aminohapet, sest need on auksotroofsed proliini suhtes. Seega jäävad selektiivsöötmel ellu ja moodustavad kolooniaid vaid need retsipienttüve rakud, mille genoomi on juhuslikult lülitunud minitransposoon. Selektsiooniks kasutatakse antibiootikumi, mille resistentsusgeeni kannab konkreetne minitransposoon. Minitransposooni kandev doonorplasmiid elimineerub ja kuna transponeerumiseks vajalikku transposaasi ei kodeerita minitransposooni poolt, vaid plasmiidilt, siis ei saa minitransposoon hiljem enam esmasest sisenemiskohast edasi "hüpata".
Transposooni sisenemiskoha tuvastamine.
Minitransposooni sisenemiskoha identifitseerimiseks genoomis kasutatakse mitut meetodit.
Kloneerimisvõte.
Üks klassikalistest metoodikatest on transposoonmutandist kromosomaalse DNA eraldamine ja sellest minitransposooni sisaldava DNA lõigu kloneerimine koos seda ümbritseva DNA-ga. Kloneerimist hõlbustab minitransposooni koosseisus olev antibiootikumi resistentsusgeen, mis võimaldab antibiootikumi selektsiooni abil antud DNA regiooni sisaldavat plasmiidi teistest eraldada. Pärast kloneerimist määratakse sekveneerimisega minitransposooni sisenemiskoha DNA järjestus ja võrreldakse seda DNA andmebaasis olevate järjestustega selleks, et teada saada, millisesse geeni või regulatoorsesse piirkonda minitransposoon on inserteerunud.
ARB-PCR.
Teine, enamkasutatud meetod minitransposooni sisenemiskoha kindlakstegemiseks on ARB-PCR. Selleks kasutatakse praimerite komplekti, millest üks praimer on disainitud komplementaarsena minitransposooni otsale, teine praimer, nn kõdupraimer, sisaldab oma järjestuses juhuslikke nukleotiide ja vaid 4–6-nukleotiidseid järjestusi – ankurjärjestusi, mis korduvad uuritava organismi genoomis sageli. Ankurjärjestuse abil seondub praimer erinevatesse genoomi regioonidesse ja juhul kui selle praimeri seondumine on piisavalt lähedal minitransposooni otsale, sünteesitakse PCR produkt minitransposooni otsa spetsiifilise praimeri ja kõdupraimeri abil. Seejärel määratakse saadud PCR produkti järjestus sekveneerimisega ja saadakse teada minitransposooni sisenemiskoht genoomis.
Kasutusalad.
Transposoonmutageneesi kasutatakse bakterigeneetikas laboratoorse meetodina mutantsete bakteritüvede saamiseks. Transposooni sisenemise abil genoomi saab välja lülitada juhuslikke geene ning jälgida, kas ja kuidas bakter sellise olukorraga toime tuleb, või avastada geene, mille rikkumine mõjutab oluliselt mutatsioonisagedust. Üldjuhul on transposoonmutageneesi läbiviimise eesmärgiks uurida teatud geeni või valgu funktsiooni.
Transposoonmutagenees on alternatiivne meetod insertsioonilisele mutageneesile onkogeenide identifitseerimiseks selgroogsetes loomades. Sel juhul konstrueeritakse selline transposoon, mis häirib geeni funktsiooni maksimaalselt (näiteks "Sleeping Beauty"). Täpsemalt sisaldab taoline transposoon signaale, et katkestada rikutud geeni ekspressioon sisenemiskoha lähedalt ja seejärel taaskäivitada teise katkestatud geeni ekspressioon.
Multiresistentsed bakteritüved.
Antibiootikumide kasutuselevõtmisest alates on bakterid arendanud omale kaitsemehhanisme, mis võimaldaksid neil antibiootikume sisaldavas keskkonnas toime tulla. Tänapäeval on meditsiinis suur probleem patogeensete bakteritega, mis on endale hankinud erinevaid resistentsusgeene, olles sel viisil resistentsed mitmele antibiootikumile korraga st multiresistentsed. Multiresistentsed patogeensed bakterid põhjustavad haiglates, kus kasutatakse palju antibiootikume, raskeid epideemiaid, mille kontrolli alla saamine on järjest raskem.
Enamus transposoone kannavad antibiootikumide resistentsusgeene. Seega soodustab transposoonide "hüppamine" ühest DNA molekulist teise (plasmiidist kromosoomi ja vastupidi) resistentsuse kiiret levikut bakteripopulatsioonis. Multiresistentsus levib näiteks R-plasmiidide (R-"resistance") abil. R-plasmiidid on kahekomponendilised, koosnedes ülekandefaktorist RTF ("resistance transfer factor"), mis annab plasmiidile võime konjugatsiooni teel üle kanduda, ja R-determinandist, mis sisaldab resistentsusgeene. Enamasti paiknevad resistentsusgeenid transposoonides, mis on läinud R-plasmiidi koosseisu. Kuna R-plasmiidid pole liigispetsiifilised, võivad nad üle kanduda eri liiki bakteritele. See on peamine multiresistentsete bakterite kiire leviku põhjus.