Ensüümikineetika

Ensüümikineetika uurib keemilist reaktsiooni, mida katalüüsib ensüüm. Eksperimendiga mõõdetakse reaktsiooni kiirust ning selle sõltuvust kontrollitavatest parameetritest, nagu temperatuurist või kontsentratsioonist. Kui mudel ühtib tulemusega, saadakse informatsiooni reaktsiooni mehhanismist. Nõnda paraneb arusaam ensüümi käitumisest bioloogilises süsteemis. Siiski ei määra matemaatiline võrrand ühest mehhanismi. Tihti annavad eri mudelid samasuguse võrrandi.
Ensüüm kui katalüsaator.
Iseeneslik protsess kulgeb konstantse rõhu ning temperatuuri tingimustes Gibbsi energia miinimumini. Samas ei piisa negatiivsest Gibbsi energia tõusust formula_1, et reaktsioon kulgeks mõõdetava kiirusega. Üleminekut takistab vaheoleku potentsiaalibarjäär. Kineetilise seina kõrgus sõltub konkreetsest mehhanismist, kusjuures loodus eelistab kergema vastupanu teed. Seetõttu saab reaktsiooni kiirendada, kui teisendatakse reaktsiooni elementaaretappe. Katalüsaator seda võimaldabki: reagent seostub kiirendajaga madalama Gibbsi tekkeenergiaga kompleksi. Täiendavalt nõutakse, et reaktsiooni standardne Gibbsi energia muut säiliks, kui katalüsaatorit lisatakse. Ekvivalentne on kehtestada, et katalüsaator osaleb reagendi ja produktina võrdses koguses.
Ensüümiks kutsutakse kõrgmolekulaarset katalüsaatorit bioloogilises süsteemis. Bioloogiline katalüsaator koosneb liht- või liitvalgust. Kui rakendada denatureerivat keskkonda, väheneb ensüümi katalüüsiv toime. Ensüümi võimet reaktsiooni läbi viia iseloomustatakse ensüümi katalüütilise aktiivsusega, mis defineeritakse kui
formula_2
kus formula_3 märgib ensüümi. Enpleetia tähendab 'ainehulka või aine hulka'. Argikeeles kasutatakse mõistet "moolide arv", kuid selle kasutamist soovitab IUPAC vältida.
Katalüütilise aktiivsuse SI-põhiühikuna kasutatakse mooli sekundi kohta, st formula_4, mida kutsutakse kataliks, tähis formula_5.
Peale ensüümi kuuluvad bioaktiivse ühendi klassi hormoonid, vitamiinid ning ribosüümid.
Ensüümi ehitus.
Tavaline ensüüm sisaldab kahte struktuuri: üldvalgulist osa ning aktiivtsentrit. Üldvalguline osa moodustab ensüümi selgroo, hoiab konformatsiooni, toetab substraadi sidumist ning mõjutab aktiivsust. Aktiivtsenter tagab ensüümi suure selektiivsuse. Selles ruumipiirkonnas toimub keemiline reaktsioon.
Mõnel ensüümil on veel regulatoorne tsenter, kus muudetakse ensüümi kuju ja aktiivsust.
Inhibiitor.
Inhibiitor on molekulaarüksus, mis vähendab keemilise reaktsiooni kiirust. Loodus valib madalama barjääriga mehhanismi. Seetõttu ei toimi inhibiitor negatiivse katalüsaatorina, potentsiaaliseina ei kõrgendata. Tihti seostub inhibiitor substraadiga, vähendades reaktsiooniks vaba lähteaine hulka. Kui inhibiitor poeb substraadi asemel aktiivtsentrisse, räägitakse ensüümiinhibiitorist. Inhibiitori mõju on pöörduv.
Seostugu inhibiitor katalüsaatori aktiivtsentrisse, võisteldes koha eest substraadiga. Kui side on nõrk ning protsess pöörduv, kusjuures pole erilist eelistust substraadi või inhibiitori seas, räägitakse konkureerivast inhibitsioonist.
Matemaatiline kirjeldus.
Henri-Michaelise-Menteni mudel.
Victor Henri, Leonor Michaelis ning Maud Leonora Menten (HMM) uurisid üleminekut
formula_6
kus
Kiirusevõrrand tuletatakse kahe klassikalise viisiga: kiire tasakaalu eeldusega ning statsionaarse oleku meetodiga.
Kiire tasakaal.
Eeldatakse, et vahekompleksi ja lähteainete vahel saabub kiire tasakaal. Seesugust lihtsustust kutsutakse kiire tasakaalu eelduseks. Henri-Michaelise-Menteni mudeli järgi on pöördreaktsiooni määr tühine. Reaktsioonivõrrand uuesti:
&lt;chem&gt;E + S &lt;=&gt;[k_1][k_{-1}] ES -&gt;[k_2] E + P&lt;/chem&gt;.
Ensüümi analüütilist kontsentratsiooni tähistatakse kui &lt;chem&gt;[E]_k&lt;/chem&gt;. Massi jäävuse seaduse alusel
&lt;chem&gt;[E]_k = [E] + [ES]&lt;/chem&gt;. (1)
Massitoimeseadusest määratakse üldkiirus:
formula_11 (2)
Jagada võrrandi (1) mõlemat poolt ensüümi analüütilise kontsentratsiooniga (2).
formula_12 (3)
Kuna esimese ülemineku jaoks eeldatakse kiiret tasakaalu, võib lähendusena kirjutada
formula_13 (4)
Asendada võrrand (4) tulemus võrrandisse (3).
formula_14 (5)
Korrutada võrrandi (5) parema poole lugejat ning nimetajat suurusega formula_15.
formula_16 (6)
Nimetajas kutsutakse substraadieelset liidetavat Michaelise-Menteni konstandiks. Henri-Michaelise-Menteni kiire tasakaalu mudeli raames tähistatakse konstanti kui formula_17. Võrrandit (6) kirjutatakse tihti vormis
formula_18 (7)
kus formula_19.
Statsionaarne olek.
Statsionaarse oleku ehk püsioleku lihtsustus on vähem piiratud kui kiire tasakaalu eeldus. Statsionaarsuse raamistikus saavutab keskne kompleks kiiresti teatava kontsentratsiooni. Sellest tasemest edasi muutub keskse kompleksi formula_20 kontsentratsioon aeglaselt. Täpsemini peavad lähteainete ja produktide tekkimis-reageerimiskiirused olema palju suuremad kui kesksel kompleksil. Aeglasti teiseneva kontsentratsiooniga seisundit nimetataksegi statsionaarseks olekuks. Seisundi saavutamist kutsutakse eelstatsionaarseks olekuks (ingl "pre-steady-state kinetics"). Statsionaarse oleku seletust rakendasid esimesena Briggs ning Haldane.
Tekkigu statsionaarne olek tühise ajaga. Alustatakse võrrandist
&lt;chem&gt;E{} + S &lt;=&gt;[\mathit{k_1}][\mathit{k_{-1}}]{} ES -&gt;[\mathit{k_2}]{} E{} + P&lt;/chem&gt;.
Seoseni (3) on kõik sarnane.
formula_12 (3)
Aktiveeritud vaheühend tekib ühe protsessi käigus.
&lt;chem&gt;E{} + S -&gt;[\mathit{k_1}] ES&lt;/chem&gt;
Kompleks laguneb kahel viisil.
&lt;chem&gt;ES -&gt;[\mathit{k_{-1}}]{} E{} + S&lt;/chem&gt;
&lt;chem&gt;ES -&gt;[\mathit{k_2}]{} E{} + P&lt;/chem&gt;
Statsionaarses olekus seetõttu
formula_22 (8)
millest
formula_23 (9)
Asendatakse tulemus (9) võrrandisse (3).
formula_24 (10)
Jagada ja korrutada võrrandit (10) kiiruskonstantide murruga.
formula_25 (11)
Viimaks jõutakse tulemuseni
formula_26 (12)
Kiire tasakaalu ja statsionaarse oleku konstant formula_27 kuju mõttes ühtib, kuid Michaelise-Menteni konstandid mitte. Teisisõnu,
formula_28 (13)
Terminoloogia.
Henri-Michaelise-Menteni mehhanism viitab otseselt keemilisele üleminekule
&lt;chem&gt;E{} + S &lt;=&gt;[\mathit{k_1}][\mathit{k_{-1}}]{} ES -&gt;[k_2]{} E{} + P&lt;/chem&gt;.
Sageli kutsutakse seda reaktsiooni lühemini Michaelise-Menteni mehhanismiks või "keemiliseks" võrrandiks. Ettevaatlikkusele manitseb järgmiste terminite kasutus:
Viimased neli on üldisemad kui HMMi mehhanism. Öeldakse, et reaktsioon allub Henri-Michaelise-Menteni (Michaelise-Menteni) võrrandile, kui kiirus avaldub kujul
formula_29 (T).
Konstandid formula_30 ega formula_31 ei tohi sõltuda substraadi formula_8 kontsentratsioonist. Henri-Michaelise-Menteni võrrand (T) kirjeldab mitut erisugust mehhanismi. Reaktsioon järgib Henri-Michaelise-Menteni (Michaelise-Menteni) kineetikat, kui selle uurimisel jõutakse Henri-Michaelise-Menteni võrrandini (T). HMMi mehhanism on kõige lihtsam Henri-Michaelise-Menteni kineetika erijuht.
Kahepoolse pöörduvusega keskne kompleks.
Kahepoolse pöörduvusega keskse kompleksi ensüümikineetika all peetakse silmas reaktsiooni
&lt;chem&gt;E{} + S &lt;=&gt;[\mathit{k_1}][\mathit{k_{-1}}]{} ES &lt;=&gt;[\mathit{k_2}][\mathit{k_{-2}}]{} E{} + P&lt;/chem&gt;.
Statsionaarne olek.
Ensüümi analüütiline kontsentratsioon avaldub kui
formula_33 (14)
Kogu reaktsiooni kiirus on massitoimeseaduse alusel
formula_34 (15)
Statsionaarse oleku tingimusest keskse kompleksi &lt;chem&gt;[ES]&lt;/chem&gt; jaoks
formula_35 (16)
ehk samaväärselt
formula_36 (17)
Asendada võrrand (17) seosesse (15), mis on võrdusega (14) läbi jagatud.
formula_37 (18)
Lugeja viimast liiget teisendades nähtub, et
formula_38. (19)
Korrutada viimase tulemuse mõlemat poolt ensüümi analüütilise kontsentratsiooniga &lt;chem&gt;[E]_k&lt;/chem&gt;.
formula_39 (20)
Kui defineeritakse siin samuti Michaelise-Menteni konstandid, siis
formula_40 (21)
Van Skyke'i – Culleni võrrand.
Van Slyke ja Cullen uurisid pöördumatut reaktsiooniahelat
&lt;chem&gt;E{} + S -&gt;[\mathit{k_1}]{} ES -&gt;[\mathit{k_2}]{} E{} + P&lt;/chem&gt;.
Pseudostatsionaarne olek.
On ilmne, et seesuguses süsteemis pole püsiv statsionaarne olek mõeldav. Substraadi hulk erandita väheneb ja tasakaalu ei saavutata. Seetõttu eeldatakse, et reaktsiooniahelaga paralleelselt kulgeb lähteainet regenereeriv süsteem. Võrrandit uuritakse tõenäosuste kaudu.
Esinegu lahuses kõigest üks ensüümiosake. Tõenäosus ensüümikompleksi tekkeks pseudostatsionaarses olekus on siis
formula_41 (22)
Ümarsuluga rõhutatakse, et molekulaartasandil pole tegu konstantidega. Seetõttu on summaarne kiirus
formula_42 (23)
Kui pseudostatsionaarse seisundini jõutakse kiiresti, siis võib ensüümikompleksi kontsentratsiooni lugeda tühiseks. Seetõttu
formula_43. (24)
Ensüümiosakeste paljususe korral enam kiiruskonstant ajast ei sõltu. Nõndaviisi saadakse summaarseks kiiruseks analüütilise kontsentratsiooni formula_44 puhul
formula_45 (25)
Jällegi on märgata, kuidas Michaelise-Menteni konstandi formula_46 tähendus mudelist sõltub.
Kahepoolse pöörduvusega kaks keskset kompleksi.
Realistlikum mudel arvestab produkti ning ensüümi kompleksi:
&lt;chem&gt;E{} + S &lt;=&gt;[\mathit{k_1}][\mathit{k_{-1}}]{} ES &lt;=&gt;[\mathit{k_2}][\mathit{k_{-2}}]{} EP &lt;=&gt;[\mathit{k_3}][\mathit{k_{-3}}]{} E{} + P&lt;/chem&gt;.
Kingi-Altmani graafiline Crameri-meetod statsionaarse oleku jaoks.
Kahekordse tasakaalu ning kahe keskse kompleki korral peaks lahendama kahe lineaarse mittehomogeense diferentsiaalvõrrandiga süsteemi. King ja Altman töötasid välja graafilise meetodi, kuidas üldistada statsionaarse oleku tuletuskäiku. Seesugune Crameri reeglil põhinev lahendus kehtib ka siis, kui süsteem sisaldab formula_47 erinevat ensüümset molekulaarüksust.
Esialgu moodustatakse baaskujund. Baaskujundi igasse nurka asetatakse ensüüm või mõni ensüümikompleks. Kõnealusel juhul saadakse seetõttu kolmnurk.
Edasi kirjutatakse eraldi välja iga viis saada ensüümi või ensüümikompleksi. Näiteks vaba ensüümi saab jadast &lt;chem&gt;EP -&gt;[\mathit{k_{-2}}]{} ES -&gt;[\mathit{k_{-1}}]{} E&lt;/chem&gt;, selle vastandjadast &lt;chem&gt;ES -&gt;[\mathit{k_2}]{} EP -&gt;[\mathit{k_3}]{} E&lt;/chem&gt; või korraga mõlemast kesksest kompleksist: &lt;chem&gt;ES -&gt;[\mathit{k_{-1}}]{} E &lt;-[\mathit{k_3}]{} EP&lt;/chem&gt;. Korrutamis- ning liitmisreegli järgi saab nüüd ensüümi suhtelise kontsentratsiooni:
formula_48 (27)
Samuti avaldatakse ensüümikomplekside suhtelised kontsentratsioonid.
formula_49 (28)
formula_50 (29)
Summaarne reaktsioonikiirus jagatuna ensüümi analüütilise kontsentratsiooniga on
formula_51 (30)
Pärast võrrandite (27)–(29) asendamist seosesse (30), lihtsustamist ja teisendamist johtub, et
formula_52 (31)
Clelandi koefitsiendivormis esitub võrrand (31) kui
formula_53 (32)
Ühe konkureeriva inhibiitoriga HMMi kineetika.
Pildil on kujutatud konkureerivat inhibitsiooni, millele rakendatakse edasi kiire tasakaalu lihtsustust.
Täht formula_54 tähistab inhibiitorit.
Kiire tasakaal.
Kiire tasakaalu meetod üldistub lihtsasti, kui produkti tekkimise samm on pöördumatu. Alustatakse reaktsiooni kiiruse avaldisest.
formula_55 (33)
Ensüümi analüütiline kontsentratsioon sisaldab siin ensüümi-inhibiitori kompleksi.
formula_56 (34)
Jagada võrrandi (33) mõlemat poolt ensüümi analüütilise kontsentratsiooniga seosest (34).
formula_57 (35)
Vaadata analoogia püstitamiseks seost (5).
formula_58 (5)
Kui defineerida
formula_59 (36)
siis saadaksegi
formula_60 (37)
Teisendada võrrandit (37) nii, et kuju oleks paremini seostatav võrrandiga (7). Jagada võrrandi (37) lugejat ning nimetajat konstandiga formula_61. Asendada sisse konstandid võrrandist (7).
formula_62 (38)
Tuua nimetajas Michaelise-Menteni konstandi formula_17 sulu ette.
formula_64 (38)
Liiget formula_65 tuntakse kui efektiivset Michaelise-Menteni konstanti formula_66.
formula_67 (39)
Inhibiitori juuresolekul kehtib alati suhestus
formula_68 (40)