Elektroporatsioon

Elektroporatsioon on elektrijuhtivuse tõus raku plasmamembraanis, mille on tinginud väline elektriväli. Tavaliselt on selle kasutusalaks molekulaarbioloogia eesmärgiga hõlbustada aine liikumist rakku. Selleks aineks võib olla näiteks molekulaarne proov, mis suudab muuta raku funktsiooni, või võõr-DNA. Samas on see meetod leidnud kasutust ka meditsiinis ja kosmeetikatööstuses.
Elektroporatsiooni kasutatakse laialdaselt loomarakkude, taimerakkude, bakterite ja pärmide transformatsioonis. Arvatakse, et elektriline impulss tekitab rakumembraanis ajutised poorid ning see võimaldab makromolekulide sisenemise rakku. Pärmirakkude elektroporatsiooniks kasutatakse logaritmilises kasvufaasis olevaid rakke. Elektrilise impulsi andmiseks rakkudele kasutatakse elektroporaatorit ja kas spetsiaalseid küvette või pannakse rakud elektroodide vahele Petri tassil. Parameetrid, mida varieeritakse, on elektriväli (kV/cm), mahtuvus (F) ja takistus (oom). Nende parameetrite väärtused sõltuvad kasutatavast protokollist ja pärmitüvest.
Kasutusalad.
Molekulaarbioloogia.
Molekulaarbioloogias kasutatakse elektroporatsiooni tihti transformatsiooniks nii bakterite, pärmide ja ka taimede puhul. Lisaks lipiidsele membraanile on bakteritel ka rakuseinad, mis erinevad lipiidsest membraanist ning koosnevad peptiidoglükaanist ja selle derivaatidest. Kui bakterid ja plasmiidid kokku segada, saab plasmiid transformeeruda rakku pärast elektroporatsiooni. Pärast seda peab rakke käsitlema hoolikalt niikaua, kuni nad on jälle suutelised jagunema ja tootma uusi rakke, mis sisaldavad reprodutseeritud plasmiidi. See protseduur on umbes 10 korda efektiivsem kui keemiline transformatsioon.
Protseduur on väga efektiivne võõrgeenide sisestamisel rakukultuuridesse, eriti imetajate rakkudesse. Näiteks on seda kasutatud nii geneetiliselt muundatud hiirte loomisel kui ka kasvaja ravimisel geeni- ja rakuteraapias. Nende katsete kaudu on tõestatud ka selle meetodi eelised "in vivo".
Meditsiin.
Esimesed uurimused teemal, kuidas elektroporatsiooni inimrakkude peal kasutada, viidi läbi uurimisrühma poolt Ida-Virginia Meditsiinikoolis ja Vana Dominioni Ülikoolis ning avaldati aastal 2003.
Esimene edukas tuumori ravimine hiirtes õnnestus aastal 2007, kus suudeti 12-l hiirel 13st lõpetada tuumori levimine. See õnnetus 80 pulsi abil, mida saadeti läbi membraani sagedusega 0,3 Hz ning seda 100 millisekundi jooksul, kusjuures elektrivälja suuruseks oli 2500 V/cm.
Elektroporatsiooni saab ka kasutada ravimite transpordiks rakku, milleks muidu kasutatakse transporti läbi rakumembraani. Seda protseduuri nimetatakse elektrokemoteraapiaks. Molekulid, mida transporditakse, on kemoterapeutilised agendid või geeni elektrotransfeerid (kui molekul, mida transporditakse, on DNA). Teadlased Karolisnka Instituudis ja Oxfordi Ülikoolis kasutavad elektroporatsiooni eksoomide peal, et toimetada siRNAd, kemoterapeutilisi agente ja valke spetsiifilistesse neuronitesse. Enne seda on süsteemi (verre) süstitud sama ainet, mida elektroporatsiooni abil toimetatakse. Eksoomid on võimelised läbima aju vere takistust ning selliste katsete kaudu on võimalik lahendada probleem, miks ravimid jõuavad halvasti närvisüsteemi. Selliseid avastusi saab kasutada selleks, et ravida Alzheimerit, Parkinsoni tõve ja ajuvähki.
Kosmeetikatööstus.
Kosmeetikas kasutatakse seda võimalust injektsioonivabas mesoteraapias, et transportida aineid ilma nõela ja valuta otse rakku elektrilise impulsi abil, mille juures kasutatakse epidermise juures olevaid poore, mida võivad läbida vees-lahustuvad molekulid. Selle meetodi juures on oluline järgida kosmeetikatoodete kvaliteetsust, meetodi korrektset kasutamist ja aega, millal elektrivälja nahale avaldatakse. Elektroporatsiooni õige kasutuse tulemused on kohe nähtavad. Näidustused, millega elektroporatsiooni abil tegeleda on järgmised:
Selle meetodi unikaalsed omadused on järgmised:
Käsitlusmeetodid molekulaarbioloogias.
Elektroporatsiooniks kasutatakse elektroporaatoreid – need on seadmed, mis tekitavad elektromagnetilise välja raku lahuses. Raku suspensioon pipeteeritakse klaas- või plastikküvetti, millel on külgedel kaks alumiiniumist elektroodi.
Bakteriaalse elektroporatsiooni jaoks kasutatakse tavaliselt 50 mikroliitrit rakususpensiooni. Vahetult enne poratsiooni segatakse see plasmiidiga, millega poratsiooni tahetakse teha. Segu pipeteeritakse küvetti, seatakse voolutugevus ja mahutavus ning küvett sisestatakse elektroporaatorisse. Kohe pärast poratsiooni lisatakse üks milliliiter vedelikku (tihti LB söödet) bakteritele ja segu inkubeeritakse bakterile optimaalsel temperatuuril tund või kauem, et rakud saaksid taastuda ning antibiootikumide resistentsus saaks uuesti tekkida. Pärast seda määritakse rakud agariplaatidele.
Elektroporatsiooni edu sõltub suuresti plasmiidi puhtusest, eriti on vajalik soola puudumine. Seega on enne poratsiooni tegemist väga oluline nii rakkude kui ka plasmiidi puhastamine. Lahused, millel on suur soolasisaldus, võivad põhjustada bakterite elususe langust ja selle kaudu nende hukkumist.
Elektroporaatorid.
Elektroporaatorid kuuluvad tavalise laborivarustuse hulka. Mõned neist võimaldavad katseid teha ka mitme prooviga korraga. Sellistele elektroporaatoritele on lisatud spetsiaalsed elektroodid, mis sobituvad hästi mitmetesse rakukultuuridesse. Samuti saab lihtsalt muuta elektroporaatorite parameetreid, mille abil teadlased saavad seada välja tugevust vastavalt nende uuritava raku tüübile. Suurt rolli mängib ka parameetrite seadmise juures see, kas rakul on rakusein või see puudub.
Elektroporaatoreid saab kasutada väga mitmete rakkude puhul – alustades "E.coliga" (transformatsiooni jaoks) ning lõpetades imetajate rakkudega, nagu näiteks neuronid, astrotsüüdid, neurogliia, lümfotsüüdid, monotsüüdid, fibroblastid, epiteel ja endodeel nii inimestel, hiirtel, rottidel kui ka ahvidel (transfektsiooni jaoks).
Füüsikaline mehhanism.
Elektroporatsiooni abil on võimalik rakku siseneda ka sellistel kõrgelt laetud molekulidel nagu seda on DNA, mis passiivse difusiooniga ei saaks kunagi rakku siseneda. Seda põhjusel, et rakku katab hüdrofoobne kest. See protsess saab toimuda, kuna membraan on täidetud nanomeetri suuruste avadega rakumembraanis. Elektroporatsiooni ajal molekulid ei muuda oma keemilist koostist, vaid vahetavad lihtsalt positsioone (Elektriline läbilöök, mille mehhanism on sama, lähtudes sellest, et nii elektroporatsiooni kui ka elektrilise läbilöögi puhul kasutatakse elektrivälja, siis elektrilise läbilöögiga kaasneb ka ainete keemilise koostise muutus). Pärast elektroporatsiooni avanevad poorid, mis toimivad juhtiva rajana, mis läbib topeltmembraani, kui see on täidetud veega.
Elektroporatsioon on mitmeastmeline protsess. Kõigepealt peab membraanile avaldama lühikest elektrilist pulssi. Tavalised parameetrid on 300–400 mV ja seda ajavahemikus alla ühe millisekundi. Pärast elektrilist pulssi on membraan laetud ioonide tõttu, mis asuvad teda ümbritsevad lahuses. Kui kriitiline väli on saavutatud, järgneb kiire ümberkorraldus lipiidide morfoloogias. Järgnev struktuuri nimetatakse veel ’’eelpooriks’’, sest see ei ole veel võimeline elektrit edastama, kuid tänu eelpoori tekkele saab tekkida elektrit edasikandev poor. Need poorid saavad parandada kaksikkihti või laieneda ja lõpuks murravad nad kaksikkihi. Protsessi tulemus sõltub elektrivälja suurusest, mehaanilisest stressist ja kaksikkihi energiast.