Kirby-Baueri meetod

Kirby-Baueri meetod on testimismeetod, mida kasutatakse antibiootikumide bakteritele avaldatava toime testimiseks.
Selle meetodi puhul asetatakse kindla antibiootikumikontsentratsiooniga paberkettad söötmeplaadile, millele on külvatud kindla tihedusega bakterikultuur (tavaliselt umbes 109 rakku ml kohta). Antibiootikumil lastakse söötmesse imbuda ja seejärel inkubeeritakse mikroobikultuuri sobilikul temperatuuril. Järgnevalt hinnatakse kasvuvabade ehk inhibitsiooni tsoonide suuruse põhjal, kus antibiootikum bakterite kasvu pärsib, selle mõju konkreetsetele mikroobidele. Vajalik on arvesse võtta ka antibiootikumide erinevat võimet kasvusöötmesse difundeeruda. Nii saab ühel Petri tassil samal ajal katsetada mitme antibiootikumi toimet.
Täpsemate tulemuste saamiseks ning tolerantsuse määramiseks võidaks kasutada ka Kirby-Baueri meetodi edasiarendust – TDtesti ("Tolerance Disk Test").
Testimismeetod.
Meetod hõlmab protsessi, kus esmalt külvatakse Petri tassil olevale tardsöötme pinnale uuritav bakterikultuur. Seejärel asetatakse sellele antibiootikumist läbi immutatud filterpaber. Kultuurile on võimalik asetada ka mitu paberketast, mis kõik sisaldavad erinevat antibiootikumi või sama antibiootikumi erinevas kontsentratsioonis. Tassid inkubeeritakse kohe või vähemalt 30 minuti jooksul.
Pärast söötme ööpäevast inkubeerimist on näha, kas filtri ümber on tekkinud ring, mida nimetatakse ka inhibitsioonitsooniks. Inhibitsioonitsoon, piirkond, kus bakterite kasv on pärsitud, on tingitud antibiootikumi kontsentratsioonigradiendist – antibiootikumi kontsentratsioon on kõige kõrgem ketta läheduses ning väheneb sellest kaugenedes. Bakterikultuur, millel esineb vastava antibiootikumi suhtes resistentsus, on võimeline söötmel asetseva ketta vahetus läheduses ellu jääma – inhibitsioonitsooni ei teki.
Pärast inkubeerimise lõppu mõõdetakse Petri tassi alumiselt küljelt või söötme kohalt tsooni diameeter koos kettaga. Kui tsooni diameeter ei ületa ketta laiust, on tegu sellele antibiootikumile resistentse kultuuriga. Vastavalt diameetri laiusele on võimalik tabeli abil määrata rakkude resistentsustaset. Siinkohal peab aga silmas pidama, et tabeliväärtused on sobilikud ennekõike kiiresti kasvavatele patogeenidele ("Staphylococci, Enterobacteriaceae"). Aeglasemalt kasvavate kultuuride puhul (nt "Haemophilus") on tsooni diameeter suurem võrdväärse inhibitsiooni kontsentratsiooni juures. Tsooni diameetrit on võimalik määrata veel 6–8 tundi pärast proovi inkubeerimist.
Kirby-Baueri meetodit kasutatakse laialdaselt mikrobioloogia laborites, sest protsessi läbiviimine on lihtne ning tulemused saadakse tavaliselt juba 24–48 tunni jooksul.
Kirby-Baueri meetodi puudused.
Kirby-Baueri meetodi puhul on täheldatud aga mõningaid puudusi, mille tõttu on tulemused semikvantitatiivsed. Meetod ei erista selgelt antibiootikumitundlikke ja tolerantseid liike, vaid määrab ära ainult nende võimaliku resistentsuse vastavale antibiootikumile.
Antibiootikumitolerantsuse üheks põhjuseks on aga bakterite võime püsida muutumatu kasvu faasis ehk puhkefaasis ehk soikeseisundis. Antibiootikumid, mille sihtmärgiks on bakterite kasvufaasi protsessid (DNA replikatsioon, rakukesta moodustumine), ei ole võimelised selliseid baktereid tapma, sest viimased kohanevad antibiootikumi keemilise koostise asemel hoopis ravimi mõju kestusega, püsides samaaegselt puhkefaasis. Nii ei teki vastava antibiootikumi vastu resistentsust, vaid bakterid on võimelised ravikuuri edukalt üle elama muutumatu kasvu faasi abil.
TDtesti kasutamine.
Seepärast kasutatakse täpsemate tulemuste saamiseks ning ka tolerantsuse määramiseks TDtesti meetodit. Sarnaselt Kirby-Baueri meetodiga asetatakse antibiootikumi sisaldav filterpaber agarile. Antibiootikumi agaril hajumisel tõuseb järsult selle kontsentratsioon söötmel ning hakkab seejärel aeglaselt langema. Antibiootikumi kontsentratsiooni agaril mõõdetakse MIC ("Minimum Inhibitory Concentration") ühikutes.
MIC määrab madalaima antibiootikumi kontsentratsiooni, mille puhul bakterite nähtav kasv on inhibeeritud. Äkiline kontsentratsioonitõus pärsib bakterite kasvu ning ketta ümber tekib inhibitsioonitsoon. Kontsentratsiooni langemisel alla MIC väärtuse on bakterid taas võimelised kasvama.
TDtesti puhul lisatakse agaril asetsevale filtrile pärast ööpäevast inkubeerimist bakterikultuuri kasvuks vajalikku söödet (nt glükoosi). Lisaetapp aitab eristada antibiootikumitundlikke ja tolerantseid baktereid, sest elimineerib Kirby-Baueri meetodile omase pärast antibiootikumi kontsentratsiooni langust esineva toitainete ammendumise, mida põhjustavad inhibitsioonitsoonist väljaspool kasvavad rakud. Tänu söödet sisaldavale kettale on tsoonis ellujäänud tolerantsed bakterid võimelised taastuma ning moodustama kolooniaid. Esimesed kolooniad võivad ilmneda juba paari tunni jooksul pärast söötme agarile asetamist.
Tulemused.
Kirby-Baueri meetodi puhul on antibiootikumitundlike ja tolerantsete bakterite inhibitsioonitsoonid sarnased ning tolerantsete bakterite olemasolu agaril ei ole võimalik määrata. Tänu TDtestil teisel etapil lisatavale söötmele muutuvad nähtavaks ka antibiootikumi suhtes tolerantsed bakterid. Samuti on inhibitsioonitsoonis olevate kolooniate arvu järgi määratav bakterite kvalitatiivne tolerantsi määr:
Persisterid.
TDtestiga on võimalik eristada ka tolerantsete bakterite alamliike – persistereid, kellel võib kõrge antibiootikumi tolerants esineda näiteks tänu hipA7 geenis olevale mutatsioonile, mis põhjustab stressivastuse hüperaktivatsiooni ning pärsib bakterirakkude kasvu. Suurem osa populatsioonist, kellel puudub vastav mutatsioon, hukkub läbi antibiootikumi beetalaktaamse tsükli. Mutatsiooni kandvad bakterirakud on aga tänu soikeseisundile võimelised letaalsetes tingimustes ellu jääma. Põhjuseks on beetalaktaamide toime vaid aktiivses kasvufaasis olevatele bakteritele. Seepärast on soikeseisundis olevatel bakterirakkudel, mis kasvu alles hiljem initsieerivad, suurem võimalus ellu jääda.
Viies ellujäänud bakterirakkude järglased uuesti kokku sama antibiootikumiga, on nad selle suhtes sama tundlikud kui nende eellased. See tõestab, et bakterirakkudes pole tekkinud geneetilist muutust.
Persisterrakkude olemasolu organismis võib põhjustada infektsioone ning on üheks põhjuseks bakterirakkude antibiootikuresistentsuse esinemisele, mis omakorda raskendab efektiivset infektsiooniravi. Tänu persisterite muutumatu kasvu faasile on nad võimelised taluma ka karbapeneeme, mis tapavad bakterirakke, inhibeerides nende rakuseina sünteesi, ning mida kasutatakse oma efektiivse mõju tõttu laialdaselt tõsisemate infektsioonide raviks.
Persisterid on üheks suureks probleemiks ka tuberkuloosi ravimisel, mille puhul organismi immuunsüsteem on nõrk ning infektsiooni võib põhjustada juba ühe bakteriraku olemasolu. Samuti põhjustavad nad kroonilisi kuseteede infektsioone.