Kaspaasid

Kaspaasid (ingl k "caspases", lühend sõnadest "cysteine-dependent aspartate-directed proteases") on ensüümide perekond, mis osaleb rakusurma ja põletikuliste protsesside reguleerimises.
Tegemist on tsüsteiinproteaasidega, mis kasutavad Cys-jäägi nukleofiilset tioolrühma katalüüsifunktsiooni täitmiseks ning hüdrolüüsivad sihtvalkudes peptiidsidet alati substraatvalkude koostisse kuuluva Asp-jäägi C-terminaalselt poolt.
Ehitus ja aktivatsioon.
Kaspaasid sünteesitakse rakkudes mitteaktiivsete eelvormidena ehk zümogeenidena (prokaspaasidena), mille molekulmass jääb vahemikku 32–57 kDa. Tüüpiline zümogeen koosneb kolmest eri funktsionaalsusega osast:
Suurt ja väikest alaühikut ühendab lühike aminohappeline järjestus (nn linker), mida saab omakorda proteolüütiliselt lagundada. Zümogeenid on mitteaktiivsed, kuna nende aktiivtsentri konformatsioon ei ole piisavalt stabiilne. Aktivatsioon toimub kahe või enama zümogeenimolekuli vastavalt di- või oligomeerumise ja järgneva proteolüütilise lõikamise teel; seejuures võivad oligomeere omavahel moodustada ka erinevad kaspaasid.
Evolutsiooniline konserveeritus.
Kaspaasid on evolutsiooniliselt väga säilunud ning sarnase struktuuri ja toimemehhanismiga proteaasid esinevad praktiliselt kõigis hulkraksetes loomades. Näiteks on varbussi CED-3 ja äädikakärbse Dronc ning DrICE funktsionaalselt sarnased imetajate kaspaasidele. Kõigis neis ensüümides on säilinud tsüsteiin-aspartaatne aktiivtsenter ning kahest alaühikust (p20/p10) koosnev struktuur.
Kaspaaside olemasolu kõigis loomades viitab, et apoptoosi mehhanism on loomariigi evolutsioonis kujunenud väga varakult ning jäänud enamasti muutumatuks. Teaduskirjanduses on välja pakutud, et kaspaaside apoptootiline funktsioon on arenenud sünkroonis vajadusega rakkude diferentseerumise järele organismide arengus, kuivõrd kaspaasid mängivad olulist rolli ka diferentseerumises. Hiljem on kaspaasidele lisandunud muud funktsioonid nagu osalemine põletikulistes protsessides (kuna kaspaaside vahendatud proteolüütilise lõikamise tulemusena vabastatakse tsütokiinid IL-1β ja IL-18) ja koespetsiifilised rollid (nt CASP14, mis kaitseb epidermise rakke vedelikupuuduse ja UV-kiirguse eest).
Kaspaasidega mõnevõrra sarnasteks funktsioonide poolest peetakse ka metakaspaase – see ensüümide rühm leidub seentes, taimedes, protistides ja bakterites (ehk organismides, kus tavalisi kaspaase ei esine). Metakaspaasid on samuti tsüsteiinproteaasid, kuid need lõhustavad peptiidsidemeid hoopis Arg-jäägi või Lys-jäägi (mitte Asp-jäägi) järel. Kuigi hiljuti on näidatud, et metakaspaaside ja kaspaaside rollid eri organismides on mõnevõrra kattuvad, on teadusrühmi, kes kritiseerivad metakaspaaside ja kaspaaside kui ensüümirühmade nimetuste sarnasusi. Seejuures juhitakse tähelepanu asjaolule, et apoptoos on omane vaid loomadele ning kaspaaside keskne ülesanne on siiski apoptoosi vahendamine.
Allpool artiklis käsitletakse konkreetsemalt inimese kaspaase.
Inimese kaspaasid.
Inimese genoomis on kodeeritud kaksteistkümne funktsionaalse kaspaasi ("CASP1"-"CASP10", "CASP12" ja "CASP14") järjestused. Need ensüümid jagunevad ehituse ja funktsiooni alusel kolme suuremasse rühma:
Rühmaväliseks liigitatakse CASP14, mis tegutseb peamiselt epidermise keratiniseerumise protsessides ega ole seotud apoptoosiga.
Ensümaatiline aktiivsus ja substraadid.
Kaspaasid on tsüsteiiniproteaasid, mille aktiivtsentris paikneb tsüsteiini- ja histidiinijäägist koosnev katalüütiline tandem (näiteks kaspaas-1 puhul on tegemist aminohappejääkidega His237 ja Cys285 – seda nummerdust kasutatakse allpool ka katalüüsimehhanismi kirjeldamisel). Kaspaasid hüdrolüüsivad subtraatvalgu polüpeptiidahelat alati pärast aspartaadijääki. Kaspaasi sidumistasku asetab lõigatava peptiidsideme (ingl k "scissile bond") katalüütiliste aminohappejääkide lähedusse. Gly238 ja Cys285 peptiidahela amiidid annavad vesiniksidemeid lõigatava peptiidsideme karbonüülrühma hapnikuga. Selle tulemusel muutub karbonüülrühma süsinik elektrofiilseks ja vastuvõtlikuks nukleofiilse rünnaku suhtes, mida sooritab läheduses paiknev katalüütilise Cys285 tioolrühm. Enne nukleofiilset rünnakut või selle käigus annab Cys285 tioolrühm oma prootoni His237 külgahela imidasoolile, mille protoneeritud vorm toimib katalüüsi lõppetapis happena, protoneerides lõigatavale peptiidsidemele järgneva aminohappe α-amino­rühma.
Kui lagundatava peptiidsideme suhtes N-terminaali pool paiknevad olevad aminohappejäägid tähistada P1, P2 jms (kus number suureneb lagundatavast peptiidsidemest kaugenedes), siis määravad substraadi äratundmist kaspaaside poolt substraadis aminohappejäägid asendites P4-P1 (ning P1 on alati Asp). Efektorkaspaasid (eriti kaspaas-3 ja kaspaas-7) eelistavad substraatide koosseisus tetrapeptiidi Asp-Glu-Val-Asp (ühetäheliste lühenditena DEVD), mille puhul toimub lõikus pärast viimast aspartaati. DEVD järjestuse põhjal on disainitud ka mitmed teaduslikes uuringutes kasutatavad fluorestseeruvad kaspaasi-sensorid, mis konkureerivad rakkudes substraatidega ja käituvad seega inhibiitoritena. Seejuures võivad sensorid olla sünteetilised, sisaldades väikese molekulmassiga fluorofoore (selliste ühendite seas on ka pöördumatuid inhibiitoreid), või geneetiliselt kodeeritud, sisaldades fluorestseeruvaid valke.
Kuigi DEVD on enim uuritud motiiv kaspaaside substraatides, teostavad kaspaasid organismis sadade erinevate valkude proteolüüsi, mille hulka kuuluvad struktuursed valgud (nt tuumaümbrise lamiinid, tsütoskeleti aktiinid), DNA parandusega seotud valgud ja mitokondriaalsed valgud. Selle substraadikogumi kooskõlastatud lagundamine annab apoptootilisele rakule iseloomuliku morfoloogia.
Kaspaaside roll apoptoosis ja teistes rakusurma vormides.
Kaspaasid on keskse tähtsusega programmeeritud rakusurma (apoptoosi) läbiviimisel, kuid neil on roll ka põletikulises rakusurmas (püroptoosis) ja mitmetes teistes rakusurma vormides:
Kaspaaside seos haigustega.
Kaspaaside aktivatsioon on rangelt reguleeritud, et vältida juhuslikku rakusurma. Olulisemad regulatsioonitasandid on:
Siiski esineb patoloogiate kontekstis häireid kaspaaside taseme või aktiivsusega, kusjuures kaspaaside roll haiguslike protsesside vahendamisel oleneb ka konkreetsest kaspaasist, vaadeldavast koest või kaspaasidega vastastikmõjusid loovate muude valkude eskpressioonitasemest rakus.
Kaspaasid ja vähk.
Apoptoosi vältimine on vähi üks peamisi tunnuseid. Paljud kasvajarakud ekspresseerivad vähenenud tasemel kaspaase või nende aktivatsioonikomponente (nt APAF1, inglisekeelsest "apoptotic protease activating factor 1"). See muudab vähirakud resistentseks signaalidele, mis kutsuvad tervetes rakkudes esile rakusurma; seega käsitletakse kaspaase sageli pigem kasvaja supressorgeenidena. Samas on hiljutised uuringud näidanud, et teatud kaspaaside aktivatsioon võib olla seotud pigem rakkude kuju muutumise ja liikuvuse tagamisega (nt epiteel-mesenhüüm-ülemineku käigus), mis pigem aitavad kaasa vähirakkude levimisele.
Kaspaasid ja neurodegeneratiivsed haigused.
Kaspaaside ülemäärane aktivatsioon, eriti kaspaas-6 ja kaspaas-3 puhul, on seotud Alzheimeri, Parkinsoni ja Huntingtoni tõve patogeneesiga. Näiteks on kaspaasid võimelised osaliselt lagundama beeta-amüloidi eelvalku ABPP, tau-valku või huntingtiini, soodustades toksiliste laguproduktide kuhjumist. Rakusurma-välises kontekstis võib aga kaspaaside kontrollitud aktivatsioon mängida rolli närvisüsteemi plastilisuses (neuronite diferentseerumisel ja sünapside ümberkujundamisel).
Kaspaasid ja maksahaigused.
Maksal on suur regeneratiivne võime, kuid krooniline või ulatuslik maksarakkude apoptoos võib viia põletiku, fibroosi ja lõpuks tsirroosi või elundipuudulikkuseni. Maksa peamiste funktsionaalsete rakkude ehk hepatotsüütide apoptoosi vahendavad suuresti kaspaas-8 (surmaretseptori rada) ja kaspaas-9 (mitokondriaalne rada), mis koonduvad efektorkaspaasidele, eeskätt kaspaasile-3 ja kaspaasile-7.
Viirusliku B-hepatiidi puhul toimub nekroosifaktori TNFα tootmise suurenemine. Hepatotsüüdid, mis puutuvad kokku TNFα-ga, läbivad seega surmaretseptori vahendatud apoptoosi. Alkohol ja mõningad ravimid (nt paratsetamool) muudavad hepatotsüüdid nendele surmasignaalidele tundlikumaks. Mittealkohoolse steatohepatiidi ja rasvmaksa kontekstis põhjustab vabade rasvhapete kuhjumisest tingitud lipotoksiline stress mitokondrite funktsioonide häirumist ja rakusisestest radadest käivitatud apoptoosi. Samuti tekib rakusisestest radadest käivitatud apoptoos isheemia-reperfusioonikahjustuse korral (nt siirdamise või kirurgilise sekkumise järel), kuna reperfusioon põhjustab pärast ajutist isheemiat oksüdatiivset stressi ja mitokondriaalset kahjustust. Kui maksas paiknevad Kupfferi rakud ja stellaatrakud fagotsüteerivad surevatest hepatotsüütidest pärinevaid apoptootilisi kehi, aktiveeruvad fibrogeneetilised signaalirajad (nt TGF-β). Seega ei ole apoptoos pelgalt haiguse tagajärg, vaid ka maksafibroosi progresseerumise põhjuslik tegur, mis võimendab kahjustusi näiteks tsirroosi korral.
Kaspaaside aktiivsuse pärssimine nendes olukordades vähendab hepatotsüütide kadu ja parandab näiteks ka siiratud maksa ellujäämist loomkatsetes. Seepärast arendatakse kaspaasi inhibiitoreid, mis blokeeriksid kaspaaside vahendatud apoptoosi. Siiski kaasnevad selle strateegiaga teatud riskid:
Kaspaaside inhibiitorid ja nende kasutusalad.
Kaspaaside inhibiitorid on olulised nii eksperimentaalsete töövahenditena rakusurma fundamentaalteaduslikes uuringutes kui ka ravimikandidaatidena haigustes, millega kaasneb liigne apoptoos või põletik.
Kaspaaside aktiivtsentriga seonduvad peptiidipõhised inhibiitorid on siiani kõige laialdasemalt kasutatavad kaspaaside inhibiitorid laboratoorsetes alusuuringutes. Need jäljendavad kaspaaside looduslikke substraate: aminohapete tunnusjärjestusele (nt aspartaati sisaldavad tetrapeptiidid DEVD, LEHD, VEID) järgneb sageli elektrofiilne reaktiivne rühm, mis kovalentselt modifitseerib aktiivtsentri tsüsteiini (seega on tegemist pöördumatute inhibiitoritega). Levinumad elektrofiilsed rühmad on fluorometüülketoon (tähistatakse sageli FMK), klorometüülketoon (CMK) ja atsüüloksümetüülketoon (AOMK); viimane rühm on näidanud suurimat selektiivsust just kaspaaside tsüsteiini suhtes (kuna tsüsteiinproteaase on teisigi). Peptiidipõhiste inhibiitorite N-terminaal on sageli modifitseeritud (nt bensüüloksükarbonüüli või kinoliini fragmendiga), mis lisatava fragmendi hüdrofoobsuse tõttu võib parandada ühendite võimet läbida rakkude plasmamembraani. Seda tüüpi inhibiitorid ei erista samas erinevaid kaspaase ning inhibeerivad kõiki perekonnaliikmeid – seetõttu nimetatakse neid ka pan-inhibiitoriteks. Näiteks Q-VD-OPh on pöördumatu peptiidipõhine kaspaaside pan-inhibiitor, mida on kasutatud madalate mikromolaarsete kontsentratsioonide juures loommudelites.
Ületamaks peptiidipõhiste inhibiitorite problemaatilist võimet läbida rakumembraani, vähest selektiivsust kõrgetel kontsentratsioonidel ja madalat bioloogilist stabiilsust, on kaspaaside inhibiitorite kliinilisteks rakendusteks püütud lühendada molekulides aminohappelisi järjestusi ning asendada aminohapped analoogsete struktuuridega, mis on füsioloogilises keskkonnas püsivamad. Näiteks laia toimespektriga kaspaasiinhibiitor emricasan on läbinud II faasi kliinilise uuringu maksahaiguste (mittealkohoolne steatohepatiit, C-hepatiit, maksafibroos) raviks. Belnacasan on aga eelravim, mille metaboliseeritud vorm on selektiivne kaspaasi-1 ja kaspaasi-4 inhibiitor; ühend on läbinud II faasi kliinilised uuringud epilepsia, psoriaasi ja teiste põletikuliste haiguste raviks.
Kaspaaside inhibiitoritena on testitud ka mittepeptiidseid aineid, millest mõningad seonduvad ensüümide aktiivtsentriga ja mõningad hoopis aladesse, mida kaspaas võiks kasutada vastastikmõjude moodustamiseks teiste kaspaasidega (nn allosteerilised inhibiitorid). Siiski ei ole 2025. aasta novembri seisuga ükski kaspaasiinhibiitor saanud ravimina heakskiitu.