Geelelektroforees

Geelelektroforees on elektroforeesi rakendus, mida kasutatakse erinevate elektriliselt laetud molekulide (DNA, RNA, valgud) eraldamiseks pikkuse, laengu või konformatsiooni järgi agaroosist, polüakrüülamiidist või mõnest muust polümeerist geelimaatriksis. Negatiivselt laetud nukleiinhapete (DNA, RNA) molekulid liiguvad agaroosgeelis elektrivälja rakendamisel katoodilt anoodile, kusjuures laengut kandva osakese liikumiskiirus on võrdeline elektrivälja tugevusega ja osakese ioonlaenguga ning pöördvõrdeline keskkonna viskoossusega. Agaroosgeelis saab eraldada valke vaid laengu järgi, sest geelipoorid on valkude suuruse järgi eraldamiseks liiga suured (sel juhul kasutatakse polüakrüülamiidgeeli).
Geelelektoforeesi kasutatakse kõige sagedamini laborites polümeraasi ahelreaktsiooni abil amplifitseeritud DNA kontrollimiseks (kvalitatiivne, kvantitatiivne), kuid see võib olla ka ettevalmistav etapp kloonimisele, DNA sekveneerimisele, restriktsiooni fragmentide pikkuste polüformismile (RFLP, ingl.k "restriction fragment length polymorphism"), Southern blotting analüüsile jne. Valkude geelelektroforeesi kasutatakse sageli kombinatsioonis nn Western blot'iga, aga ka ettevalmistava etapina proteoomikas enne massispektromeetrilist analüüsi.
Põhimõte.
Lihtsustatult toimub geelelektroforeesil elektrivälja toimel geelimaatriksis elektriliselt laetud makromolekulide eraldamine/lahutamine. Geeli kaevukestesse/hammastesse kantud proovis olevad lühikesed molekulid liiguvad läbi geeli pooride kiiremini kui pikemad ning seega peatuvad pikemad molekulid lähemal alguskohale (hambale). Lisaks molekulide erinevale suurusele mõjutab nende liikumist ka konformatsioon – nt DNA tsirkulaarsed molekulid liiguvad kas aeglasemalt (ingl.k. "open circular") või kiiremini (ingl.k. "supercoiled") kui sama pikad lineaarsed molekulid. Valkude puhul kasutatakse ruumilise struktuuri efekti elimineerimiseks seetõttu sageli denatureerivat elektroforeesi, mis võimaldab valke lahutada vaid molekulmassi alusel. Analüüsitavate molekulide suuruse määramiseks voolutatakse oma proove paralleelselt nn. suurusmarkeriga (ingl.k. "ladder"), mis kujutab endast kindlaksmääratud suurusega molekulide segu. Uuritava molekuli suurusest lähtuvalt valitakse sobiv suurusmarker.
Geelimaatriksid.
Agaroos.
Agaroos on merevetikates leiduv polüsahhariid, mille peamisteks komponentideks on β-D-galaktopüranoos ja 3,6-α-L-galaktopüranoos. Agaroosi laialdast kasutamist on tinginud asjaolu, et võrreldes teiste polümeeridega on geeli moodustumine füüsikaline, mitte keemiline protsess. Agaroosgeeli poori suurus on varieeruv.
Kõige sagedamini kasutatakse geele, mille agaroosi sisaldus on 0,7–2%. Suurte DNA fragmentide (5–10 kbp, ingl.k. bp-"base pair", k-"kilo") eraldamiseks kasutatakse 0,7% geeli, lühikeste DNA fragmentide (0,2–1 kbp) eraldamiseks aga 2% geeli. Üle 3% agaroosi sisaldusega geelid on mõeldud eriti väikeste DNA fragmentide eraldamiseks ning selle asemel on enamasti mõistlik kasutada hoopis polüakrüülamiidgeeli. Väiksema agaroosisisaldusega geelid on haprad ning kergesti purunevad ning neid kasutatakse harva.
Polüakrüülamiid.
Polüakrüülamiid on stabiilne, keemiliselt suhteliselt inertne, elektriliselt neutraalne ja hüdrofiilne aine, mida kasutatakse valkude geelelektroforeesiks. Polüakrüülamiidgeele valmistatakse vaba radikaalse polümerisatsiooni teel akrüülamiidist ja N,N’-metüüleen-bis-akrüülamiidist (viimase molekulis on kaks kaksiksidet ning polümerisatsiooni käigus võimaldab see tekkivaid polümeeriahelaid ristsidestada). Polümerisatsiooni käivitajateks ja katalüsaatoriteks on ammooniumpersulfaat (APS) ja tetrametüületüleendiamiin (TEMED), mis on vabade radikaalide allikad. Polümerisatsioonikiirus sõltub monomeeri ja vabade radikaalide kontsentratsioonist, temperatuurist ja reagentide puhtusest. Geeli valmistamisel tuleb jälgida ohutustehnika nõudeid, sest akrüülamiid ja tema lahused on potentsiaalsed neurotoksiinid. Polüakrüülamiidgeeli poori suurus on määratud monomeeride kontsentratsiooniga geelis (6–15%). Väikeste valkude lahutamiseks kasutatakse kõrgema kontsentratsiooniga geele.
Tärklis.
Tärklis on taimedes leiduv polüsahhariid, mis koosneb kahest glükoosi polümeerist: amüloosist ja amülopektiinist. Tärklisegeeli tegemiseks segatakse soojendatud puhver hüdrolüüsitud kartulitärklisega, mille tulemusel saadakse mittetoksiline maatriks valkude eraldamiseks suuruse ja laengu järgi. Tavaliselt kasutatakse 5–12% geeli.
Geeliolekud.
Natiivne.
Natiivne geelelektroforees võimaldab eraldada väikeses koguses valgukomplekse, säilitades nende aktiivsuseks vajalikud tingimused. Sel meetodil on palju rakendusi, nagu füsioloogiliselt oluliste valkude identifitseerimine, oligomeersete järjestuste määramine ja valgu kokkupakkimise vigade avastamine. Natiivse geelelektroforeesi unikaalne külg on võimalus visualiseerida geelil valgu ensümaatilist aktiivsust. Seda meetodit rakendati esimest korda mitrokondriaalse oksüdatiivse fosforülaasi kompleksi (osaleb ATP sünteesis) uurimisel.
Denatureeriv.
Denatureeriva geelelektroforeesi korral makromolekuli natiivne/aktiivne struktuur ei säili. Näiteks SDS-PAGE (naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiid geelelektroforees) geelis toimub denaturatsioon pindaktiivse aine SDS abil. Abistamaks veelgi valgu lahtipakkimist, lõhutakse S-S sidemed ehk disulfiidsidemed redutseerivate ainete, nt ditiotreitooli või merkaptoetanooli abil (tekivad vabad tioolrühmad). SDS annab samas valkudele ka negatiivse laengu (töös kasutatavate puhvrite pH juures) ning negatiivselt laetud valkude eraldamine toimub suuruse järgi.
Koosluse DNA-lt amplifitseeritud ühepikkuste, kuid erineva järjestusega geenifragmentide lahutamiseks kasutatakse kas denatureeriva gradiendi geelelektroforeesi (DGGE) või temperatuuri gradiendi geelelektroforees (TGGE). DNA fragmentide eraldamise aluseks DGGE abil on põhimõte, et primaarjärjestus mõjutab domeeni sulamistemperatuuri (Tm) ja DNA fragmendi konformatsioon mõjutab tema liikumist geeli maatriksis. DNA molekul elektroforeesitakse läbi polüakrüülamiidgeeli, mis sisaldab DNA denaturantide (uurea ja formamiid) lineaarset gradienti. DNA molekul siseneb geeli kaheahelalisena ja liigub edasi vastavalt oma molekulmassile. Kui fragment jõuab geelis positsioonile, kus denaturandi kontsentratsiooni ja puhvri temperatuuri koosmõju moodustavad madalaima sulamisdomeeni Tm-i, domeen hargneb ja fragment takerdub oma hargnenud osaga geeli maatriksisse ning tema liikumine aeglustub. Kui denaturantide gradient on õigesti valitud, aeglustuvad teineteisest kas või ainult ühe aluspaari võrra erinevad fragmendid geelis erinevatel positsioonidel ja eralduvad teineteisest foreesi lõpuks. Meetodit kasutatakse laialdaselt mikroobiökoloogias ja mutatsioonide analüüsil.
Puhvrid.
Foreesipuhvrid.
Foreesipuhvreid on erinevaid ning nendega tagatakse elektroforeesi käigus stabiilne pH. See on oluline, sest DNA ja RNA laeng sõltub keskkonna pH-st. Nukleiinhapete eraldamiseks kasutatakse sageli Tris-atsetaat-EDTA (TAE) või Tris-boraat-EDTA (TBE), harvem on leidnud kasutust naatrium- või liitiumboraati (SB või LB) sisaldavad puhvrid. Liitiumboraat, mis pole veel nii palju uuritud, on ebaefektiivne pikemate kui 5 kbp fragmentide eraldamiseks, kuid samas jälle võimaldab ta kasutada umbes 7 korda suuremat pinget kui tavaliselt (kuni 35 V/cm, cm–elektroodide vaheline kaugus). Puhvrite puhul on ka väga oluline nende pH. Geelid valmistatakse tavaliselt TAE või TBE puhvris, mille pH on 8 (siis on DNA negatiivselt laetud).
Reeglina toimub TAE puhvris suuremate DNA fragmentide parem elektroforeetiline lahutumine samas kui TBE puhvris eristuvad hästi väikesed DNA fragmendid (2 kb ja lühemad). Seega eelistatakse kasutada TAE puhvrit suuremate DNA ahelate puhul ja TBE puhvrit lühemate DNA ahelate puhul. Traditsiooniliste Tris-puhvrite puuduseks on see, et nad on kallid ja nende valmistamine on suhteliselt keeruline.
Laadimispuhvrid.
DNA proovide kandmiseks geelile kasutatakse nn laadimispuhvrit, mis sisaldab glütserooli. See võimaldab proovi "vajumist" kaevukese põhja. Proovi visualiseerimiseks on laadimispuhvrisse lisatud ka negatiivselt laetud indikaatorvärve broomfenoolsininest ja/või ksüleentsüanooli, mis liiguvad elektriväljas võrdselt vastavalt umbes 300 ja 500 bp suuruste DNA-fragmentidega (sõltuvalt agaroosi kontsentratsioonist geelis).
Valkude laadimispuhver sisaldab samuti glütserooli, lisaks ka naatriumdodetsüülsulfaati (SDS), redutseerivaid reagente ja väikese molekulmassiga värvaineid (nt bromofenoolsinine), mis on foreesipuhvris negatiivselt laetud ja võimaldavad visualiseerida lahutatava segu frondi liikumist geelis foreesi käigus.
Visualiseerimine.
Pärast elektroforeesi geelid värvitakse ehk visualiseeritakse erineva liikumiskiirusega molekulid, kasutades selleks UV-valguses (fluorestseeruvaid) või loomulikus valguses nähtavaid värve. Nukleiinhapete visualiseerimiseks geelis kasutatakse fluorestseeruvaid värve nagu etiidiumbromiid (EtBr), SYBR® green, SYBR® gold, SYBR® safe, GelStar®, akridiinoranz jt. või loomulikus valguses nähtavaid värve, mis sisaldavad hõbedat, metüleensinine jt.
Kõige tavalisemaks värviks, mida kasutatakse DNA ja RNA molekulide nähtavaks tegemiseks geelis, on EtBr, mis interkaleerub nukleiinhapete lämmastikaluste vahele. Samas on EtBr tuntud ka kui mutageen. EtBr lisatakse geelile kas enne (vedelale jahutatud agaroosilahusele) või pärast elektroforeesi (värvimine värvi lahuses).
Kaheahelalise DNA värvimiseks kasutatakse ka SYBR Green I (Invitrogen), mis on palju kallim kui EtBr, aga samas ka 25 korda tundlikum. Kuna pole leitud andmeid SYBR Green I mutageensest ja toksilisest toimest inimesele, siis arvatakse, et ta on ohutum kui EtBr.
Valkude visualiseerimiseks geelis kasutatakse sageli värvi Coomassie Brilliant Blue või 50 korda tundlikumat hõbedaga värvimist (hõbenitraadiga töödeldud geelis muutuvad valgud nähtavaks, sest tekib hõbefosfaat, mis on mittelahustuv).
DNA visualiseerimiseks võib kasutada ka Southern blotting meetodit, kus DNA kantakse nitrotselluloosist membraanile, millele järgneb töötlus radioaktiivse prooviga ning radiogrammi salvestamine.
Värvitud geelidest tehakse pildid, kasutades digitaalset või polaroidkaamerat. Fluorestseeruvate värvide korral tuleb kasutada UV-lambiga pildistamisstatiivi. Kui geelil eraldatud fragmente soovitakse kasutada edasises töös, tuleb pildistamisel geeli võimalikult vähe aega valgustada UV-valgusega, sest UV kahjustab oluliselt DNAd.
Kasutusalad.
Geelelektroforeesi kasutatakse nii kliinilises meditsiinis kui ka loodusteaduste valdkondades (biokeemia, mikrobioloogia ja molekulaarbioloogia).
Geelelektroforeesi kasutatakse ühe etapina DNA analüüsil "DNA sõrmejälje" (ingl.k. "fingerprint") uurimiseks, näiteks isaduse tuvastamiseks, organismide evolutsiooni uurimiseks, kohtuekspertiisis jne. Meetodit rakendatakse ka valkude eraldamisel, puhastamisel ja testimisel ning lisaks meditsiiniliste uuringute osana ja põllumajanduses mitmesugustes analüüsides.
Eristatakse järgmisi geelelektroforeesi tüüpe: agaroosgeelelektroforees, polüakrüülamiidgeelelektroforees, isoelektriline geelelektroforees (IEF), denatureerivgradientgeelelektroforees (DGGE), temperatuurgradientgeelelektroforees (TGGE), naatriumdodetsüülsulfaatgeelelektroforees (SDS-PAGE), kahedimensionaalne geelelektroforees (kombinatsioon IEFst ja SDS-PAGEst) ja pulseeriva väljaga geelelektroforees.