Transmissioonelektronmikroskoop

Transmissioonielektronmikroskoop ehk läbivalgustav elektronmikroskoop ehk läbivkiirguse elektronmikroskoop ("transmission electron microscope", TEM) on mikroskoop, mis võimaldab kujutise saada tänu uuritavat proovi läbivale elektronide voole. Üliõhukest lõiku läbivad elektronid interakteeruvad viimasega, tekib kujutis, mida fookustatakse ja suurendatakse ning projitseeritakse fluorestseeruvale ekraanile, fotoplaadile või digikaamera sensorile.
TEM võimaldab saavutada oluliselt tugevama suurenduse kui valgusmikroskoobid tulenevalt elektronide väikesest lainepikkusest. Tänu sellele on võimalik uurida isegi aatomite paiknemist aines, mis oleks valgusmikroskoobiga mõeldamatu. See on muutnud TEM-i üheks oluliseks analüüsivahendiks nii bioloogias kui ka materjalide uurimisega tegelevates füüsikaharudes, kuna selle pakutavate suurenduste abil on võimalik ühtviisi edukalt näha nii viirusi kui ka materjalide peenstruktuure.
Esimese transmissioonelektronmikroskoobi konstrueerisid Max Knoll ja Ernst Ruska 1931. aastal. 1933 ületati valgusmikroskoobiga saavutatav võimalik lahutuvus ja 1939 jõudsid nad esimese tööstuslikult tootetava TEM-i ehitamiseni.
TEM-i põhjal on välja töötatud ka täiendavaid tehnikaid (STEM, HRTEM jt), mille abil on võimalikuks saanud tehnika veelgi mitmekülgsem kasutamine ja struktuuride uurimine, mida teistel viisidel ei ole mingil moel võimalik teha.
Ajalugu.
Algne arendustegevus.
Ernst Abbe käis välja teooria, et mikroskoopide lahutusvõime on piiratud objekti vaatlemiseks kasutatava valguse lainepikkusega. Selle tõttu ei ole valgusmikroskoopidega võimalik saada mõnest mikromeetrist suuremat suurendust. Arengud ultraviolettkiirgust kasutavate mikroskoopide juures, mille taga seisis August Köhler, lubasid saavutada veel kuni kaks korda paremat suurendust. Samas nõudis see aga ka klaasist kallima kvartsi kasutamist, kuna UV-kiirgus klaasis neeldub. Tol ajal levis arvamus, et mikromeetrist väiksemate suurusjärkude poole püüdlemine on lainepikkuse seatud piirangute tõttu lihtsalt võimatu.
Juba 1858. aastal oli Julius Plücker kindlaks teinud, et "katoodikiirte" (elektronide) suunamiseks saab kasutada magneteid. Seda efekti oli 1897. aastal Ferdinand Braun rakendanud primitiivsete ostsilloskoopide (täpsemalt katoodkiirte ostsilloskoopide ("Cathode-ray oscilloscope"; CRO)) ehitamiseks.
Samuti oli juba varem kinnitust leidnud, et katoodkiiri saab magnetvälju kasutades fookustada nii, nagu läätsede abil on võimalik fookustada valgust, ning hiljem arendas seda teooriat edasi Hans Busch, kes näitas, et läätsevalmistajate kasutatav võrrand on kohandatav ka elektronidele. 1927 tõestasid Clinton Davisson ja Lester Germer eksperimentaalselt, et elektronidel on laineline iseloom ja et suurema energiaga elektronidel on lühem lainepikkus kui väiksema energiaga elektronidel.
Berliinis õppis Ruska Adolf Matthiase käe all kõrgepinge tehnoloogiaid ja nende rakendusi elektrijaamades. Kui 1928. aastal pani Berliini Tehnikaülikooli professor Adolf Matthias eesotsas Max Knolliga kokku meeskonna teadlastest, kes hakkaksid uurima ostsilloskoopide täiustamise võimalusi, siis kuulusid sellesse rühma ka mitmed doktoriõppe üliõpilased, kelle hulgas olid ka Ernst Ruska ja Bodo von Borries. Eesmärgiks välja töötada ostsilloskoope, mida saaks kasutada väga kiirete elektriliste protsesside registreerimiseks elektrijaamades ja kõrgepingeliinides. Keskenduti peamiselt elektronkiirte parema fookustamise saavutamisele – seda tänu läätsede ehituse parandamisele – ning nõnda püüti leida sobilikke parameetrid, mida optimeerides saaks luua paremaid ostsilloskoope.
Oma viimasel ülikooliaastal esitas Ruska 1929. aasta mais väitekirja, milles ta rehkendas ja testis elektronläätsede abil suurenduste saavutamist. Nõnda õnnestus tal kätte saada esimene teadaolev elektronmikroskoobi abil saadud pilt – anoodi apertuurist katoodkiirte torus. Toimiva elektronmikroskoobi ehitamiseni läks aga veel hulk aega. Valgusmikroskoobi eeskujul loodud ja kahe järjestiku paikneva elektronläätsega valmistatud mikroskoop, mis tõestas, et ka magnetväljade abil suunatud elektronidega on võimalik suurendus saada, suutis pakkuda ainult tagasihoidlikku 15-kordset suurendust. Elektronidest eralduv soojus oli aga nii tugev, et põletas läbi kõik objektid, mida uurida püüti.
Arendustööd jätkati ja 1931. aastal suutis see rühm teadlasi enda loodud mikroskoobiga edukalt kätte saada suurenduse vaskvõrgule asetatud lõigust. Ruska ja Knoll võtsid kasutusele mõiste "elektronmikroskoop" ning seda aparaati, mis kasutas elektrone ja nende fookustamiseks kahte elektromagnetilist läätse, on üldiselt on tunnustatud kui esimest transmissioonelektronmikroskoopi. Samal aastal patenteeris Siemensi teadusdirektor Reinhold Rudenberg elektronmikroskoobi elektrostaatilised läätsed.
Eraldusvõime parandamine.
Tol ajal alles hakati jõudma nii kaugele, et mõista elektronide laineomadusi. 1927 avaldas Louis de Broglie oma kvantfüüsikateose, kus selgitas aineosakeste laineomadusi (Nobeli auhind 1929). Ruska rühm ei olnud sellest siiski teadlik kuni 1932. aastani, mil leiti selle põhjal, et elektronide oluliselt väiksem lainepikkus võrreldes footonitega peaks teoreetiliselt lubama kuni aatomisuuruste objektide eristamist. Sama aasta aprillis pakkus Ruska välja uue elektronmikroskoobi konstruktsiooni, mis võimaldaks proovide sisestamist mikroskoopi endasse. Uue seadmega õnnestus jagu saada difraktsioonist ja saada rahuldav suurendus alumiiniumlehest, kuid valgusmikroskoobi pakutavate suurenduste ületamisega siiski veel toime ei tuldud. Selleni jõuti alles 1933. aasta septembris, kasutades puuvillakiude, mida pildistati kiirelt enne, kui nad elektronkiirgusest püsivalt kahjustatud said.
1934 sai Ladislaus Marton esimese mikrofoto bioloogilisest objektist ning kolm aastat hiljem ka esimesed elektronmikroskoopilised kujutised bakteritest.
Kuna kõrgkooli instituudil puudusid vajalikud vahendid, et tegelda elektronmikroskoopide edasiarendamisega, läks Ruska tööle elektronoptika tööstusse. Ta töötas 1933–1937 Fernseh Ltd’s Steglitz-Zehlendorfis Berliinis, kus tegutses televisioonisignaali vastuvõtjate ja transmitterite kallal ning sekundaarse võimendusega fotoelementide väljatöötamise juures. Huvi jätkata peenlahutuslike elektronmikroskoopide väljatöötamist viis ta koostöös Bodo von Borries'ga 1936–1937 Siemens &amp; Halskesse. 1937 seati Berliini Spandau linnaosas sisse elektronoptikalabor, kus tegeldi arendustööga kuni 1939. aastani, mil saadi valmis esimene tööstuslikult toodetava ja teaduse vajadustele vastav elektronmikroskoop (pildil). Alustati tööstuslikku tootmist ja selliseid mikroskoope hakati nimetama Siemensi supermikroskoopideks. Ernst Ruska vend meditsiinidoktor Helmut Ruska töötas samal ajal koos kolleegidega välja kasutusalasid meditsiinis ja bioloogias. Edasist tööd takistas aga Teise maailmasõja algus ja labori häving õhurünnaku tagajärjel.
Samal ajal tegelesid elektronmikroskoopide väljatöötamisega ka Albert Prebus ja James Hillier Toronto Ülikoolis ning panid 1938. aastal kokku esimese TEM-i Põhja-Ameerikas. 1940 suundus Hillier tööle ettevõttesse Radio Corporation of America (RCA), kus kõrvuti firma muude tegevusaladega asuti tegelema ka elektronmikroskoopidega ja kus aja jooksul registreeriti tema nimele üle 40 patendi.
Edasine arendustegevus.
Pärast teist maailmasõda jätkas Ruska tööd Siemensis elektronmikroskoopide väljatöötamisel ja konstrueeris esimese sellise mikroskoobi, millega on saavutatud 100 000-kordne suurendus. Tol ajal välja kujunenud alusstruktuur elektronmikroskoobi ehituses on jäänud suures osas tänapäevani muutumatuks. Elektronmikroskoopiaalase tootmise ja arendustegevuse etteotsa tõusid Manchester Suurbritannias, Siemens Saksamaal, RCA Ameerika Ühendriikides ja Jaapan.
Esimene rahvusvaheline elektronmikroskoopiaalane konverents peeti Delftis 1942. aastal ning sellest võttis osa üle saja osavõtja. Hilisem, esimeseks ametlikuks ja rahvusvaheliseks nimetatud konverents toimus 1950 Pariisis ning järgmine 1954 Londonis.
TEM-i kõrvalt tehti tutvust ka skaneeriva transmissioonelektronmikroskoopiaga (STEM), kuid see arendati kasutuskõlbulikuks alles 1970. aastatel, kui Albert Crewe Chicago Ülikoolist ehitas valmis uudse väljaemissiooni kahuri ja tõi mängu uued kõrgekvaliteedilised objektiivid, mis võimaldasid moodsa STEM-i konstrueerimist. Selle abil demonstreeris Crewe, et nii saab pildile püüda isegi üksikuid aatomeid, kasutades rõngakujulise tumevälja kujutisi ("annular dark-field imaging"; ADF). Crewe töötas koos oma kaastöölistega välja külma väljaemissiooni ("field emission") allika ja pani kokku STEM-i, mille abil suudeti visualiseerida üksikuid raskeid aatomeid õhukestes süsinikusubstraatides.
Taustainfo.
Elektronid.
Teoreetiliselt on valgusmikroskoobi maksimaalne võimalik lahutavus ("d") määratud valgusosakeste lainepikkusega (λ) ja numbrilise apertuuriga ("NA").
formula_1
Ekraan.
Kuna elektronide voogu ei ole võimalik otse palja silmaga vaadata, siis tekitatakse kujutis fluorestseeruvale ekraanile, mis on valmistatud 10–100 μm läbimõõduga tsinksulfaadi osakestest. Ekraani saab vaadata läbi spetsiaalse klaasiga kaetud akna, mille ees kasutatakse vaadeldavast täiendava suurenduse saavutamiseks veel ettelükatavat binokulaari. Ekraani all paikneb kas analoog- või digifotoaparaat kujutise jäädvustamiseks ja kuhu elektronkiirgus pääseb ekraani eest äratõstmisel.
Komponendid.
Vaakumsüsteem.
Suurendamaks elektronide läbitava vaba tee pikkust on elektronmikroskoopides vaakum – rõhk on viidud tavaliselt nõnda madalale nagu 10−4 paskalit. Seda on vaja kahel põhjusel: esitaks aitab see ära hoida kaarlaengu katoodi ja anoodi vahel ning teiseks vähendab see võimalust, et elektronid võiksid kokku põrgata gaasi aatomitega (seda kokkupõrgete sagedust kirjeldabki mõiste elektronide vaba tee pikkus).
Kuna uuritavate proovide TEM-i lisamiseks peab objektihoidja olema eemaldatav ja vanematel TEM-idel olevad fotojäädvustussüsteemid eeldavad fotoplaatide väljavahetamist ning paratamatult vajab sellise mikroskoobi katood aeg-ajalt asendamist uuega, ei ole transmissioonelektronmikroskoobi puhul tegemist püsivalt vaakumisse suletud süsteemiga – selle külge on ühendatud pumbad ja kompressor vaakumi tekitamiseks ning hoidmiseks ja eemaldatavate osade juures paiknevad õhulukud.
Võrk ja objektihoidja.
Kui valgusmikroskoopias kasutatakse uuritava materjali alusena klaasplaate, siis elektronmikroskoopias see võimalik ei ole. Proovide tarvis on siin kasutusel vastavad "võrgud", mida valmistatakse enamasti mittemagnetiseeruvatest metallidest nagu näiteks vask, kuld ja plaatina, millele pole probleemiks eemale juhtida elektronidega pommitamisel tekkivat soojust ega elektrostaatilist laengut.
Nimetatutest odavaim on vask, mis on selliste võrkude materjalina ka kõige populaarsem. Kui aga võrgul oleks tarvis teha veel täiendavaid keemilisi reaktsioone, siis tuleks kasutada inertsemaid aluseid, nagu juba mainitud kuld ja plaatina või hoopis molübdeen või vanaadium. Odavuse tõttu leiavad kasutamist ka roostevaba teras ja nikkel, kuid need metallid tuleb eelnevat demagneetida.
Üheks võrkusid iseloomustavaks suuruseks on mesh, mis mõõtühikuna näitab silmade arvuga tolli kohta. Antud juhul on see enamasti 150–300. Seejuures varjavad suuremate silmadega võrgud vähem proovi aga väiksemasilmalised toetavad seda paremini. On kasutusel palju erinevaid võrkude tüüpe, mille materjal ja konstruktsioon sõltuvad eelkõige sellest, mida nendega uuritakse. Levinud on isegi võrgusuurused metallist alused, kus keskosa on kaetud spetsiaalse kilega (formvar, kolloodion), millele lõik toetub ja kus seega puuduvad uuritavaid struktuure varjata võivad metallosad. Seerialõikude meetodi kasutamisel on sellised alused aga lausa asendamatud.
Võrkude standardne läbimõõt on 3,05 mm, mille järgi on kohandatud ka proovide hoidmiseks kasutavad objektihoidjad. Vahel leiavad kasutust ka 2,3 mm võrgud, aga seda pigem mineraloogias, kus mineraalide uurimisel võib tarvis minna suurema kaldenurga rakendamist ning kus kasutatavad materjalid võivad olla üliharuldased.
TEM-i sisestatud proovi on samuti võimalik vaatlusel liigutada, et leida ja paremini vaadelda huvipakkuvaid piirkondi, ning seda saab teha nii laiust kui ka pikkust pidi. Samuti võib olla võimalik liigutada proovi ka kõrguse osas ning kallutada seda mõne kraadi võrra. Selle mehhanismi keerukusest peaks aimu andma asjaolu, et isegi kõrgematel suurendustel peab proov liikuma võimalikult sujuvalt ning seda situatsioonis kus vahemaid soovitavasse suunda on võimalik mõõta mikromeetrites.
Elektronläätsed.
TEM-is ei saa kasutada klaasist või kvartsist läätsi, kuna need neelaksid elektrone. Küll saab aga elektronkiirt mõjutada magnetväljaga, kuna elektronide näol on tegu laetud osakestega.
TEM-i kolonni on paigutatud mitmed elektromagnetilised läätsed ehk elektronläätsed: kondensorläätsed, objektiivlääts, vahelääts ja projektorlääts, ning nad on loodud töötama sarnasel põhimõttel nagu optilised läätsed, et nad fookustaksid paralleelsed kiired mingile kindlale punktile optilisel teljel. Seega vastavalt vajadusel nad kas koondavad või hoopis hajutavad elektronmikroskoobi kolonni läbivat elektronkiirt.
Suurem osa TEM-ides kasutatavatest elektronläätsedest koosneb elektrit läbilaskvatest keerdudest ehk poolidest, milles tekib elektri toimel magnetväli, mis paneb nad tööle kui kumerad läätsed. Tekitatav magnetväli peab olema radiaalselt sümmeetriline, kuna kõrvalekalded sellest põhjustavad aberratsioone nagu astigmatism, mis süvenevad veelgi sfäärilise ja kromaatilise aberratsiooni mõjul.
Muutes voolu parameetreid on võimalik saavutada lõplik suurendus ja lahutusvõime. Objekti teravustamine viiakse läbi voolutugevuse muutmisega objektiivläätse poolis ja suurendust saab muuta voolutugevuse muutmisega projektorläätse poolis.
Elektronläätsi valmistatakse rauast, raua-koobalti või nikli-koobalti sulamitest nagu permalloi. Need on valitud nende magnetiliste omaduste tõttu nagu magnetilise küllastumus, hüsterees ja läbitavus.
Uuritavate proovide ettevalmistamine.
Uuritavate proovide ettevalmistamine transmissioonelekronmikroskoopiaks on üsna pikk ja keeruline protsess. See hõlmab nii materjali ettevalmistamist lõikamiseks, lõikamist ennast kui ka viimasele eelnevat või järgnevat kontrasteerimist (vastab valgusmikroskoopias kasutavale värvimisele), et (raku)struktuure paremini välja tuua. Sõltuvalt uuritavast materjalist ja kasutavast tehnikast tuleb valida antud momendil optimaalne töötlus.
Fikseerimine.
Preparaat peab olema fikseeritud, et seda oleks üldse võimalik lõigata, ja veetustatud, et vaakumis sealt muidu aurama hakkav vesi proovi lõhki ei kisuks. Fikseerimine käib üsna sarnaselt valgusmikroskoopias kasutatavate meetoditega; selleks saab kasutada nii orgaanilisi solvente, ristsidemeid tekitavaid aineid, sisestamist parafiini kui ka külmlõikude tegemist. Viimasena mainitu on nimetatuist parim, kuna muudab uuritavaid struktuure minimaalselt, aga seab ühtlasi tingimuse, et preparaat ei tohi mingil juhul üles sulada ning seega peab TEM võimaldama preparaati vedela lämmastikuga pidevalt jahutada.
Lõikamine.
50–125 kV kiirenduspinge korral suudavad elektronid läbida kuni 150 nm paksusega lõike aga parema lahutusvõime saamiseks peaks preparaadi paksus olema veelgi väiksem, nii 40–80 nm. Kuigi kohati on isegi võimalik, et uuritav materjal on juba oma olekult nii õhuke, et laseb elektrone läbi – seda võib esineda aga ainult materjaliteaduses (nanotorud, pulbrid jms) ning mitte bioloogias ja seetõttu on reeglina vajalik objektide lõikamine soovitud paksusega lõikudeks, mis standardselt on 50–70 nm. See tähendab, et isegi inimese erütrotsüüdist, mis on 6–8 µm läbimõõduga ja 2 µm paks, on võimalik saada kuskil 30–160 lõiku.
Kuna lõigud tulevad üliõhukesed, peab lõigatav olema spetsiaalselt ette valmistatud. Kohati on vajalik ka enne vastavaid üliõhukesi lõike tegeva ultramikrotoomi kasutamist eelnevalt nõndanimetatud poolpakse lõike (läbimõõduga 0,5–2 mm) teha, et valgusmikroskoobi abil sobiv koht üliõhukeste lõikude tegemiseks kindlaks määrata.
Ultramikrotoomi all toimub lõiketera edasilükkamine üldiselt kas soojuspaisumise või mehaaniliste meetodite abil ning seda, kui õhukesi lõike on võimalik valmistada, määrab lisaks mikrotoomile ka lõiketera kvaliteet. Parimad on teemantnoad, kuid laialdast kasutust leiavad ka klaasist valmistatud lõiketerad, mis on oluliselt odavamad ning mida saab otse laboris valmistada.
Proovi pinnale laengute tekkimise vältimiseks kaetakse neid vahel üliõhukese, vaid mõne nanomeetrise elektrit juhtiva kihiga, milleks sobib hästi näiteks süsinik. Seda saab teha nii vaakumaurustus- kui ka kihtsadestusmeetodil.
Kontrasteerimine.
Bioloogiliste objektide koostised on valdavalt elektrone üsna sarnaselt neelavad keemilised elemendid ja see tingib vajaduse parema pildi saamiseks objekte raskmetallisooladega immutada ehk teisisõnu kontrasteerida, mis vastab valgusmikroskoopias kasutatavale värvimisele. Kontrasteerimine võib olla nii positiivne kui ka negatiivne: esimesel juhul kasvatatakse bioloogilise objekti ja/või tema komponentide võimet elektrone neelata ning teisel juhul suurendatakse hoopis objekti ümbritseva ala elektrontihedust.
Kontrasteerimisel leiavad enim kasutust osmiumtetraoksiid (OsO4), mis suurendab sisemembraanistiku elektrontihedust ning värvib rakkudes paiknevaid lipiide. Palju kasutatakse uranüülatsetaati, mis kujutab endast atsetaatvormis uraani soola ja mis "värvib" nukleiinhappeid sisaldavaid struktuure, fosfolipiide ja taimede rakuseinu, ning pliisoolasid, mis suurendavad enamiku rakukomponentide elektrontihedust. Taimerakkude seinte esiletoomiseks leiab kasutust ruteenimpunane, mis kontrasteerib raku pinnal olevaid mukopolüsahhariide. Fosfovolframhapet saab abiks võtta, kui on tarvis kontrasteerida aluselisi valke, glükoproteiide ja polüsahhariide.
Transmissioonelektronmikroskoopiast Eestis.
Tartu Ülikoolis on kaks töötavat transmissioonelektronmikroskoopi, millest vanem pärineb 1990. aastate algusest ja uuem 2010. aastatest. Uuemat kasutatakse loodus- ja tehnoloogiateaduskonnas ning vanemat arstiteaduskonnas. Varem kasutati LOTE-s 1980. aastatel Rootsist saadud TEM-i.
TEM (mudel EM-125) on olemas ka Tallinna Tehnikaülikooli materjaliuuringute keskuses.