Isotermiline tiitrimis-kalorimeetria

Isotermiline tiitrimis-kalorimeetria ("isothermal titration calorimetry, ITC") on meetod molekulaarsete komplekside tekkimise ja lagunemise käigus neelduva või eralduva soojuse mõõtmiseks. Uuritavad valdkonnad on näiteks valk-valk interaktsioonid, valk-membraan interaktsioonid, ensüümikineetika ja molekulaardünaamiliste simulatsioonide tulemuste eksperimentaalne kinnitamine.
Termodünaamika.
Molekulidevahelist termodünaamikat iseloomustavad parameetrid on stöhhiomeetria (formula_1), assotsiatsioonikonstant (formula_2), vabaenergia (formula_3), entalpia (formula_4) ja entroopia (formula_5). Need parameetrid on omavahel seotud:
formula_6. ITC abil on võimalik neid parameetreid mõõta.
Rakendusalad.
Ravimikandidaatide hindamine.
Isotermilise tiitrimis-kalorimeetria mõõtmistulemusi saab kasutada ravimikandidaatide võrdlemiseks. Väärtus formula_3 iseloomustab küll ravimi- ja valguvahelist afiinsust, ent erineb sarnaste ravimikandidaatide seast parima leidmiseks sageli liiga vähe. Seetõttu on molekulide võrdlemisel oluline arvesse võtta nii vabaenergia entalpilist kui ka entroopilist komponenti.
Valguga seonduva ravimikandidaadi entroopilise komponendi optimeerimiseks piisab sageli arendatavale ühendile hüdrofoobse osa lisamisest või põhistruktuuri jäigemaks muutmisest. Selle meetodi kasutamist piirab aga ühendi vesilahustuvuse vähenemine. Valk-ligand seondumisel sõltub parameeter formula_4 molekulide vahel tekkivate ja katkevate mittekovalentsete sidemete arvust. Seega, kui mõõdetakse soodne (negatiivsem) formula_4, viitab see tugevamale valk-ligand seosele.
Eelnevast lähtuvalt on ravim-valk interaktsiooni formula_4 komponendi mõju tõstmine keerulisem kui formula_5 mõju suurendamine. Seetõttu hinnatakse soodsama entalpiaga ühendeid paremaks. Seega saab ITC-d kasutada soodsama entalpiaga ravimikandidaadi väljaselgitamiseks.
Ensüümikineetika iseloomustamine.
Traditsioonilised ensüümikineetika iseloomustamise meetodid põhinevad kromogeense, fluorogeense või raadioisotoobiga märgistatud ligandi kasutamisel. ITC selliseid piiranguid substraadile ei sea. Erinevalt kolorimeetrilistest meetoditest saab ITC-ga ensümaatilisi muundumisi jälgida ka hägustes või mitmefaasilistes reaktsioonides.
Makromolekulaarsete komplekside uurimine.
Isotermilist tiitrimis-kalorimeetriat on kasutatud translatsiooni lõpetamise mehhanismi uurimiseks.
Seade.
ITC seade koosneb kahest ühesugusest anumast, mis on ümbritsetud isoleeriva materjaliga. Mõlemal anumal on andurid, mis reguleerivad küttekehade sisse- ja väljalülitamist nii, et temperatuur anumates oleks võrdne. Katse läbiviimiseks täidetakse proovianum uuritava aine (makromolekuli) lahusega ning võrdlusanum vee või puhverlahusega. Enne titrandi lisamist soojendatakse võrdlusanumat. See aktiveerib proovianuma tagasiside-küttekeha. Nii saadakse energiakogus ajaühiku kohta, mis kulub anumate ja lahuste temperatuuri hoidmiseks.
Molekulaarse seondumise mõõtmiseks lisatakse proovilahusele kindlate koguste (alikvootide) kaupa titranti. Selle mõjul soojus kas vabaneb või neeldub ja proovi temperatuur muutub. Eksotermilise reaktsiooni puhul vähendatakse tagasiside-küttekeha kulutatavat energiat, aga endotermilise puhul energiat suurendatakse. See soojushulk ajaühiku kohta (μcal/s) ongi ITC seadme mõõtmistulemus.
Soojuse muut proovis on võrdeline seotud titrandi osakaaluga.
Katse käik.
Proovi ettevalmistamine.
"Ka" mõõtmiseks on oluline, et uuritavate proovide kontsentratsioonid oleks väga täpselt määratud. Ka on tähtis, et proovi-lahuse kontsentratsioon valitaks nii, et proov seonduks titrandiga järk-järgult, mitte ei küllastuks uuritav aine titrandi esimese lisamisega.
Proovi- ja võrdlusanuma täitmine.
Võrdlusanum peaks olema täidetud vee või naatriumasiidi 0,01% lahusega. Kui masinaga töötatakse pidevalt, peaks võrdlusanuma lahust vahetama vähemalt kord nädalas. Proovianuma täitmisel on oluline, et sinna ei satuks õhumulle.
Titrandi lisamise süstla täitmine.
Titrandi lahuse kontsentratsiooni peaks valima nii, et viimase alikvoodi lisamise järel on titrandi kontsentratsioon ligikaudu 2x suurem kui uuritava molekuli kontsentratsioon.
Katse parameetrite valik.
ITC seadme tarkvara abil saab muuta alikvootide arvu, lisamise kiirust ja mahtu. Reaktsiooni entalpia mõõtmiseks peaks esimeste alikvootide lisamisel kogu ligand seonduma uuritava ainega. Ka peaks alikvoote lisama pärast uuritava aine küllastumist ligandiga. Küllastumisjärgsete proovide lisamisest eraldunud või neeldunud energia näitab lahuse lahjendamise soojusefekti.
Kontrollkatsed lahjendamise soojusefektide väljaselgitamiseks.
Esialgse katse tulemused võib kanda graafikule normaliseerituna: kilokalorit mooli lisatud ligandi ning ligandi ja uuritava aine molaarsuhte vahelise seosena. Saadavat isotermi mõjutab ka lahuste lahjendamisega ning lahuse segamisega kaasnev soojusefekt. Seega peab tegema järgmised kontrollkatsed:
Nende katsete tulemuste abil saab leida korrektse seondumise isotermi.
Andmeanalüüs.
Esmalt väljendatakse saadud seondumissoojused titrandi kontsentratsiooni funktsioonina. Seejärel piikidealune ala integreeritakse kas piikhaaval ja käsitsi või tarkvara abil. Ligandita makromolekuli kontsentratsioon väheneb iga järjestikuse titrandi lisamisega kuni järjestikused piigid saavad ühekõrguseks. Need piigid (soojushulgad) tekivad lahustumisest ja muudest mehaanilistest efektidest ja sellepärast peab need lahutama kõikidest teistest piikidest. Korrektsete andmete saamiseks on tähtis valida esimeste andmepunktide põhjal õige algtase ("baseline").
Pärast algtaseme ja mehaaniliste efektide suhtes korrigeerimist iseloomustab i-nda piigi alust ala ja reaktsioonis neeldunud või eraldunud soojust võrrand
formula_12
kus formula_13 on lisatud lahuse ruumala ja formula_14 on markomolekuliga seotud ligandi kontsentratsiooni tõus pärast i-ndat lahuse lisamist. Reaktsiooni entalpia, seondumiskonstandi ja stöhhiomeetria arvutamiseks tuleb võrrand viia funktsionaalsele kujule, mis sõltub uuritavate ainete seondumismehhanismist.
Kõrge seondumisafiinsusega reaktsioonide uurimine.
On teada, et ITC-ga reaktsiooni mõõtmiseks peab parameeter formula_15 olema väiksem kui 1000. See seab Ka-le piiri 108-109 M−1 juurde. Kõrgemate c väärtuste juures kaotab piikide jaotus iseloomuliku S-kuju.
Kõrgema Ka puhul kasutatakse asendus ("displacement") ITC tehnikat, kus uuritav makromolekul on juba enne tiitrimist seotud mõne madalama afiinsusega ligandiga. Selle tehnika puhul on vajalikud kolm erinevat tiitrimist:
Protoneerimise roll seondumisenergia mõõtmisel.
Paljude seondumisreaktsioonide puhul seondub või vabaneb ligandilt või valgult prootoneid. Sel juhul on reaktsioon pH-sõltuv ja seondumisentalpia sõltub puhvri ionisatsioonientalpiast. Prootonite energeetilise rolli hindamiseks tuleks katsed teha erinevate ionisatsioonientalpiatega (ΔHion) puhvrites. Seondumise mõõdetud entalpia on kahe näitaja summa.
formula_16
Seondumisenergia formula_17 sõltub pH-st, aga mitte puhvrist endast. 
Teine komponent on prootoni ionisatsioonienergia formula_18 ja liidetud prootonite arvu formula_19 korrutis. Kui formula_20, siis on reaktsiooni mõõtmise tulemus prootonite vahetumisest sõltuv.