Immunoloogiline kapillaarülekanne

Immunoloogiline kapillaarülekanne (inglise keeles "western blot") on valguanalüüsi meetod, mida kasutatakse valkude tuvastamiseks. Analüüsitakse tavaliselt puhastamata proove, mis sisaldavad polüpeptiide, mis takistavad valgu tuvastamist. Immunoloogilise kapillaarülekande käigus eraldatakse proovist valgud geelelektroforeesiga, seejärel kantakse need üle nitrotselluloosmembraanile, kus spetsiifilised antikehad kinnituvad uuritavale valgule. Seondunud antikehade tuvastamiseks kantakse membraanile sekundaarsed antikehad, mis on kovalentselt seotud kemoluminestsentsi tekitava ensüümiga. Ensüümidena kasutatakse sageli mädarõika peroksüdaasi (HRP) või aluselist fosfataasi (AP). Kinnitunud antikehadega seotud ensüüm reageerib substraadiga ning tekib luminestsents, mille tugevust saab mõõta, et kindlaks määrata uuritava valgu kogust proovis.
Termini "western blot" võttis esimesena kasutusele W. Neal Burnette. Meetod töötati välja George Starki laboris Stanfordis. "Western blot"'i nimetus viitab analoogsele Southerni kapillaarülekande meetodile, mis sai nimetuse selle avastaja Edwin Southerni järgi.
Immunoloogilise kapillaarülekande meetod on peamiselt kasutusel molekulaarbioloogia, biokeemia ja immunogeneetika valdkondades.
Tööpõhimõte.
Rakkude töötlemine.
Bioloogilise proovi ettevalmistamiseks lõhutakse rakud mehaaniliselt klaaskuulide abil. Rakkude lüüsimiseks ja valkude lahustamiseks kasutatakse erinevaid pesuaineid, soolasid ja puhvreid. Proteaasi ja fosfataasi inhibiitoreid lisatakse, et vältida proovide lagunemist rakuensüümide toimel. Rakkude ettevalmistustöö viiakse läbi jää peal, et vältida valkude degradatsiooni ja denatureerumist.
Geelelekroforees.
Proovist eraldatakse valgud geelelektroforeesiga. Valkude eristamiseks võib kasutada isoelektrilist punkti (pI), molekulmassi (kDa), elektrilaengut või kombinatsiooni nendest omadustest.
Enim kasutatakse elektroforeesiks akrüülamiidgeeli ja SDS-puhvrit. Negatiivselt laetud SDS-puhvriga kaetud valguproovid liiguvad läbi akrüülamiidgeeli positiivselt laetud elektroodide poole. Väiksemad valgud liiguvad geelis kiiremini, seetõttu on võimalik valke eraldada suuruse järgi. Akrüülamiidi kontsentratsioon geelis määrab valkude eraldumise üksteisest. Väikse kontsentratsiooni juures eralduvad geelis üksteisest paremini suure molekulmassiga valgud.
Proovid ja marker kantakse geeli hammastesse. Marker on kaubanduslikult kättesaadav valkude segu, mille kõikidel valkudel on molekulmassid määratud. Seejärel rakendatakse geelile elektriline pinge, misjärel valgud hakkavad sõltuvalt nende suurusest erineval kiirusel liikuma.
Ülekanne.
Elektroforeesil eraldunud valgufragmendid ("band"'id) kantakse elektrivoolu abil geelilt nitrotselluloosmembraanile. Valgud kanduvad membraanile samas asendis, nagu nad on geelil paigutunud. Ülekande jaoks asetatakse immunoloogilise kapillaarülekande masinale kõigepealt kolm ülekandepuhvris immutatud vatmanpaberit, nende peale asetatakse ülekandepuhvris immutatud nitrotselluloosmembraan, mille peale pannakse geel ja selle veel kolm ülekandepuhvris immutatud vatmanpaberit. Ülekanne toimub 10 V juures 15–45 minutit. Ülekandeaeg sõltub filtrile kantavate valkude suurustest.
Blokeerimine.
Pärast valkude ülekannet immutatakse membraan blokeerimispuhvriga, millega blokeeritakse mittespetsiifiliste valkude kinnitumine membraanile. Antikehade ja membraani vastastiktoimel peavad fotofilmil nähtavale ilmuma ainult uuritavad valgud. Mittespetsiifiliste sidemete blokeerimiseks kasutatav puhver sisaldab tavaliselt 3–5% veise seerumi albumiini (BSA) või lõssipulbrit, mis on lahustatud tris-puhverdatud soolalahuses (TBS) ja millele on lisatud väike hulk detergenti, näiteks Tween20 või Triton-X-100. Uuritavad valgud seonduvad blokeerimispuhvris nitrotselluloosmembraaniga. Pärast antikehade lisamist ei saa teised valgud membraanile seonduda. Blokeerimise abil saadakse fotofilmile puhas pilt, millelt on kõik teised valgud eemaldatud.
Uuritava valgu tuvastamine.
Valkude tuvastamiseks kasutatakse tavaliselt hiire monoklonaalseid või küüliku polüklonaalseid antikehasid. Monoklonaalsed antikehad on valguanalüüsi jaoks tõhusamad. Hiire monoklonaalsed antikehad seonduvad valkudele spetsiifilisemalt.
Primaarsed antikehad.
Membraani inkubeeritakse puhvris primaarse antikehaga, mis on spetsiifiline uuritava antigeeni (valgu) suhtes.
Sekundaarsed antikehad.
Pärast seondumata primaarsete antikehade mahaloputamist kantakse membraanile sekundaarsed antikehad. Sekundaarsed antikehad seonduvad primaarse antikehaga ja neile on liidetud biotiin või ensüüm. Antikehaga seondunud ensüümi, näiteks mädarõika peroksüdaasi, kasutatakse kemoluminestsentse agendi lõhestamiseks. Mida rohkem on proovile seondunud sekundaarseid antikehi, seda rohkem on ensüümi, mis luminestsentsi tekitab. Luminestsentsi saab mõõta valgu koguse määramiseks proovis.
Immunoloogilise kapillaarülekande otsese meetodi puhul kasutatakse spetsiifilise valgu tuvastamiseks ainult primaarset antikeha. Kaudse meetodi puhul kasutatakse nii primaarset kui ka sekundaarset antikeha.
Reporterensüümid.
Mädarõika peroksüdaas (HRP) on peamine reporterensüüm, mida kemoluminestsentsetes substraatides kasutatakse. HRP on väike (40 kDa), stabiilne ja odav ensüüm. Ensüümi ja produkti reageerimisel tekib valgussignaal, mis mõne minuti jooksul kaob.
Aluseline fosfataas (AP) on teine sageli kasutatav reporterensüüm. Erinevalt HRP-st on AP palju suurem (140 kDa), ebastabiilsem ja kallim. AP ja substraadi reageerimisel tekib signaal palju aeglasemalt kui HRP puhul. Tavaliselt kulub luminestsentsi tekkeks vähemalt 30 minutit. AP eeliseks on see, et signaal võib kesta kuni mõne päeva. Seetõttu on rohkem aega valguanalüüsi tingimuste optimeerimiseks.
Analüüs.
Pärast antikehadega inkubeerimist pestakse nitrotselluloosmembraan seondumata antikehade jääkidest puhtaks ning ilmutatakse film.
Kolorimeetriline analüüs.
Kolorimeetrilise analüüs põhineb sekundaarse antikehaga kovalentselt seotud reporterensüümi inkubeerimisest substraadiga, mis sellega reageerib. Sellega muudetakse lahustuv värvaine teist värvi lahustumatuks aineks, mis sadestub ensüümi juurde ja tekitab seeläbi kujutise nitrotselluloosmembraanile. Reaktsiooni lõpetamiseks pestakse membraan värvainest puhtaks. Valgufragmente saab hinnata spektrofotomeetri või densitomeetriga.
Kemoluminestsentsanalüüs.
Kemoluminestsentsanalüüs põhineb proovi inkubeerimises substraadiga, mis tekitab sekundaarse antikehaga ühendatud reporterensüümiga reageerides valgussignaali. Valgus jäädvustatakse fotofilmile. Kasutusel on ka CCD-kaamerad, mis teevad proovist digitaalse pildi. Pilti analüüsitakse densitomeetriga. Densitomeeter hindab suhtelist valgu hulka ning mõõdab kindla ajavahemiku jooksul optilist tihedust. Uuemat tüüpi densitomeetritega on võimalik analüüsida ka valkude molekulmasse.
Radioaktiivne analüüs.
Radioaktiivsete markerite puhul ei ole valgu tuvastamiseks vajalikud ensüümidega reageerivad substraadid. Membraan paigutatakse röntgenifilmile, millele tekivad markerite mõjul tumedad regioonid, mis vastavad uuritava valgu fragmentidele. Tänapäeval kasutatakse radioaktiivset meetodit valkude määramiseks vähem, sest radiatsioon on tervisele kahjulik. Radioaktiivse meetodi alternatiivina kasutatakse võimendatud kemoluminestsentsmeetodit ehk ECL-i ("enhanched chemiluminescence").
Fluorestsentsanalüüs.
Fluorestsentsmarkeri neelduvus ja ergastuvus on nähtavad fotosensori abil. CCD-kaamera, millel on sobiva neelduvusega filter, salvestab fluorestseeruva ainega markeeritud proovist digitaalse pildi. Selle meetodi abil saab kindlaks määrata ka valgu molekulmassi. Fluorestsentsmeetodit peetakse üheks parimaks kvantitatiivseks immunoloogilise kapillaarülekande analüüsimeetodiks, kuid see on vähem tundlik kui kemoluminestsentsmeetod.
SDS-PAGE.
Naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidgeelelektroforeesi ("sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electroforesis") ehk SDS-PAGE puhul eraldatakse valke geelil kahes dimensioonis ehk kahe tunnuse, näiteks isoelektrilise punkti ja molekulmassi alusel. SDSi lisamine geelile denatureerib valgu ning sellega neutraliseeritakse valkude laengu ja molekulmassi suhete erinevused. Seetõttu on võimalik eraldada valke nende suuruse, mitte laengu järgi. Valgud liiguvad geelis positiivselt laetud elektroodi suunas, sest nad on kaetud negatiivselt laetud SDS-puhvriga.
Immunoloogilise kapillaarülekande kasutamine meditsiinilises diagnostikas.
Immunoloogilist kapillaarülekannet kasutatakse HIVi testimiseks inimestel, et tuvastada viirusevastaseid antikehasid vereplasmas. HIViga nakatunud rakkude valgud eraldatakse SDS-geelil ning kantakse nitrotselluloosmembraanile. Testitava vereplasma valkudele lisatakse primaarset antikeha. Pärast inkubeerimist pestakse vabad antikehad maha ja inkubeeritakse membraani sekundaarse inimesevastase antikehaga, mis on seondunud signaali andva ensüümiga. Nähtavad fragmendid näitavad, milliste HIV-valkude vastu sisaldab patsiendi vereplasma antikehasid.
Lisaks kasutatakse immunoloogilise kapillaarülekande analüüsi veel veiste spongiformse entsefalopaatia ja puukborrelioosi testimiseks. Samuti leiab meetod kasutamist ka B-hepatiidi infektsiooni kinnitustestina.
Immunoloogilist kapillaarülekannet kasutatakse veterinaarmeditsiinis kasside immuunpuudulikkuse viiruse (FIV) testimiseks.