Kahedimensionaalne tuumamagnetresonantsspektroskoopia

Kahedimensiooniline tuumamagnetresonantsspektroskoopia (2D TMR) on tuumamagnetresonantsspektroskoopia (TMR) väljund, kus mõõdetud spekter esitatakse kahe sagedustelje abil. Tihti ei piisa molekuli struktuuri kindlaksmääramisel ainult ühedimensioonilisest spektrist. Kahedimensiooniline spekter võimaldab saada uuritava aine kohta rohkem informatsiooni. See on vajalik tööriist, mis lihtsustab uuritava aine struktuuri kindlakstegemist. Enne 2D-eksperimentide kasutuselevõttu ei olnud mõeldav keerukate biomolekulide (RNA, DNA) struktuuri kindlakstegemine TMRiga. Kõige levinumateks ja kasulikumateks peetakse eksperimente, kus on tegemist korrelatsiooniga. Mõõdetud piikide korreleerumise järgi saab kindlaks teha uuritava molekuli struktuuri. 2D TMRi hulka kuuluvad näiteks korrelatsioonispektroskoopia (COSY) ja tuuma Overhauseri efekti spektroskoopia (NOESY).
Olemus.
Iga eksperiment koosneb raadiosageduslike lainete pulssidest, mille vahel on kindlaks määratud ooteajad. Erinevaid TMR eksperimente saabki eristada pulsside ajastuse, nende sageduse ja intensiivsuste järgi. Peaaegu kõigil 2D-eksperimentidel on neli etappi: ettevalmistusperiood, kus magnetisatsiooni koherentsus luuakse raadiosageduslike lainete pulsside järjestusega; evolutsiooniperiood ehk kindel ajavahemik, mil ühtki pulssi ei rakendata ning tuumaspinnid saavad vabalt pretsesseeruda (roteeruda); segunemisperiood, kus järgmise pulsijärjestuse kasutamine manipuleerib koherentsust ning saadakse mõõdetav signaal; detekteerimisperiood, kus vaba induktsiooni hääbumisest saadud proovi signaali mõõdetakse ajast sõltuva funktsioonina (ajafunktsioonina) sarnaselt nagu 1D FT-NMR puhul.
2D TMRi eksperimendi käigus saadud kaks dimensiooni on sagedusteljed, mis väljendavad keemilist nihet. Kumbki sagedustelg on seotud ühe või kahe ajamuutujaga: evolutsiooniaeg ja detekteerimisaeg. Mõlemad teisendatakse ajast sõltuvast funktsioonist sagedusest sõltuvaks funktsiooniks. Seda on võimalik teha 2D Fourier’ teisendusega. Üks kahedimensiooniline eksperiment saadakse järjestikuste ühedimensiooniliste eksperimentidega, millel on erinev, kuid kindlaks määratud evolutsiooniaeg järjestikustes eksperimentides. Lisaks registreeritakse kogu detektsiooniperioodi kestus iga eksperimendi käigus.
Lõpptulemuseks saadakse 2D spekter, mis kirjeldab intensiivsuse väärtust iga sageduse muutuja paari jaoks. Spektri piikide intensiivsuseid saab esitada kolmanda dimensiooni kasutuselevõtuga. Enamasti kasutatakse kolmanda mõõtme asemel intensiivsuse väljendamiseks kontuurjooni või erinevaid värve.
Homonukleaarsed sidemepõhised korrelatsioonimeetodid.
Homonukleaarsete sidemepõhiste korrelatsioonimeetoditega ilmneb magnetisatsiooni ülekanne sama tüüpi tuumade vahel läbi J-lõhenemise. Uuritavad tuumad paiknevad teineteisest kuni mõne sideme kaugusel.
Korrelatsioonispektroskoopia (COSY).
Tavalises COSY eksperimendis nii ettevalmistus- (p1) kui ka segunemisperioodid (p2) koosnevad üksikust 90° pulsist. Nende vahel on evolutsiooniaeg t1 ja resonantssignaal proovist mõõdetakse detekteerimisperioodi käigus aja t2 jooksul.
Esimene ja kõige populaarsem kahedimensiooniline TMR-eksperiment on homonukleaarne korrelatsioonispektroskoopia (COSY) järjestus, mida kasutatakse omavahel lõhestunud spinnide identifitseerimiseks. COSY koosneb üksikust raadiosageduslikust pulsist (p1), millele järgneb evolutsiooniaeg (t1), millele omakorda järgneb teine pulss (p2) ning mõõteperiood (t2).
Kahedimensiooniline spekter COSY eksperimendist näitab ühe konkreetse isotoobi sagedusi. Kõige tihemini kasutatakse vesinikku (1H) mõlemal teljel. On ka välja mõeldud tehnikaid, et saada heteronukleaarne korrelatsioonispekter, kus teljed vastavad erinevatele isotoopidele, näiteks 13C ja 1H. COSY spektris on kaht tüüpi piike. Diagonaalsetel piikidel on samad sageduskoordinaadid mõlemal teljel ja need paiknevad spektri diagonaalil. Ristpiikidel on aga erinevad väärtused iga sageduskoordinaadi suhtes ning need ei paikne diagonaalil. Diagonaalsed piigid vastavad piikidele, mis saadakse 1D-TMR mõõtmise käigus, ristpiigid aga näitavad tuumasid, mis on omavahel seotud ja lõhestavad teineteist. 1D TMR spektris näitab lõhestumisi multiplettide kuju.
Ristpiigid saadakse magnetisatsiooni ülekandest. Nende olemasolu näitab, et kaks tuuma erineva keemilise nihkega lõhestavad teineteist. See kajastub spektris piigina, mille koordinaadid saadakse vastavatest keemilistest nihetest. Igast lõhenemisest saadakse spektrisse kaks piiki, mis on sümmeetrilised diagonaali suhtes. Ristpiikide kasutamine on oluline struktuuranalüüsis, sest nende kaudu saab kindlaks määrata, missugused aatomid on omavahel otseselt või läbi mõne keemilise sideme seotud.
Paremal on näide COSY TMR spektrist. Horisontaal- ja vertikaalteljel on näha spektrit, mis vastab tavalisele ühedimensioonilisele vesinikuspektrile (1H TMR). Suur osa piikidest paikneb diagonaalil, ristpiigid paiknevad sümmeetriliselt diagonaalist all- ja ülespool.
Täiskorrelatsioonispektroskoopia (TOCSY).
TOCSY eksperiment sarnaneb COSYga, selles mõõdetakse üksteist lõhestavate prootonite ristpiike. Ristpiike mõõdetakse nii otseselt kui ka kaudselt lõhestavate tuumade vahel. Nii muutub meetod kasulikuks suuremate vastastikku seotud spinn-lõhenemiste võrgustike tuvastamisel. See võime saavutatakse segamisperioodi vältel korduva pulsside seeria sisestamisel, mis põhjustab isotroopset segunemist. Mida pikem on isotroopse segunemise aeg, seda kaugemate sidemeteni saab polarisatsioon levida. Näiteks oligosahhariidides on iga suhkrujääk isoleeritud spinn-süsteem, mis teeb võimalikuks kindla suhkrujäägi juurde kuuluvate prootonite eristamise.
TOCSYst on olemas ka ühedimensiooniline versioon, kus ühe prootoni kiiritamisel paljastatakse ülejäänud osa spinn-süsteemist. Hiljutised arengud tehnikas hõlmavad 1D-CSSF-TOCSY pulsijärjestust (keemilise nihke selektiivne filter – TOCSY), millega saab kõrgema kvaliteediga spektri ja mis võimaldab usaldusväärselt määrata lõhestumiskonstante ning kindlaks teha stereokeemiat.
Kõrvuti paiknevate 13C-süsinike korrelatsioonispektroskoopia (INADEQUATE – Incredible natural-abundance double-quantum transfer experiment).
Tegemist on meetodiga, mida kasutatakse enamjaolt 13C lõhenemiste leidmiseks kõrvuti paiknevate süsiniku aatomite vahel. Kuna looduslikult on 13C esinemissagedus umbes 1%, siis kahe molekulis paikneva 13C aatomi jaoks on leidumistõenäosus umbes 0,01%. Tõenäosus, et kaks 13C aatomit paiknevad molekulis kõrvuti, on 100 korda väiksem. Väike leidumistõenäosus muudab eksperimendi ajakulukaks, sest prootonspektriga võrdväärselt hea spektri saavutamiseks tuleb mõõteandmeid koguda kordades kauem.
Vältimaks üksikute 13C aatomite signaale, kasutatakse korrelatsioonivaliku meetodeid. Kaht 13C aatomit sisaldavate molekulide signaalid on umbes 100 korda nõrgemad kui need, mis saadakse vaid üht 13C aatomit sisaldavast molekulist. Kahekordse kvandi ülekandel saadavat spektrit registreerides saab keskenduda vaid huvipakkuvatele kaht 13C aatomit sisaldavatele molekulidele.
Heteronukleaarsed sidemepõhised korrelatsioonimeetodid.
Heteronukleaarses korrelatsioonispektroskoopias tuleneb signaal kahe erineva tuuma omavahelisest lõhestamisest. Tihti kasutatakse ühe tuumana vesinikku (1H spektrit). Enamasti on magnetiliselt aktiivsed heterotuumad väikse loodusliku sisaldusega. See põhjustaks vesinikuspektris palju signaale molekulidest, kus pole aktiivseid heterotuumi, mis teeb omakorda kasutuks oodatud lõhestunud signaalide jälgimise. Ebavajalikke signaale on võimalik maha suruda, kasutades pöördkorrelatsioonieksperimente (HSQC, HMQC ja HMBC). Ajaloolistel põhjustel kutsutakse pöördeksperimentideks neid meetodeid, kus detektsiooniajal salvestatakse prootoni, mitte heterotuuma spektrit. Tavaline heteronukleaarne korrelatsioonispekroskoopia, kus registreeritakse heterotuuma spektrit, kannab nime HETCOR.
Heteronukleaarne ühe sideme korrelatsioonispektroskoopia (HSQC).
HSQC detekteerib korrelatsioone kahe erineva tuuma vahel, mis paiknevad üksteisest ühe sideme kaugusel. Sel meetodil saadakse üks piik tuumade paari kohta, mille koordinaadid on vastavate aatomite keemilised nihked.
HSQC toimib magnetisatsiooni ülekandel I-tuumalt (tavaliselt prooton) S-tuumale (tavaliselt heteroaatom), kasutades INEPT pulsijärjestust. Prootonil on suurem tasakaaluoleku magnetisatsioon ning nõnda saadakse tugevam signaal. Seejärel magnetisatsioon areneb ja viiakse tagasi mõõtmiseks tuuma P. Lisaks võidakse kasutada spinn-kaja meetodit, mis eraldab signaalid ning lihtsustab spektrit multiplettide muutumisest üheks piigiks. Ebavajalikud paardumata signaalid eemaldatakse eksperimendi teist korda läbiviimisel, kus ühe kindla pulsi faas on vastupidine. Niimoodi saadakse soovitud piikidele vastandväärtused, kuid mitte ebavajalikele piikidele. Kahe spektri omavahelisel lahutamisel saadakse ainult soovitud piigid.
Heteronukleaarne mitme kvandi korrealtsioonispektroskoopia (HMQC) võimaldab saada täpselt samasuguse spektri kui HSQC, kuid teise meetodiga. Need kaks meetodit annavad sarnase tulemuste kvaliteedi väikese kuni keskmise suurusega molekulide korral, kuid HSQC annab suuremate molekulide korral parema tulemuse.
Heteronukleaarne mitme sideme korrelatsioonispektroskoopia (HMBC).
HMBCga on võimalik detekteerida korrelatsioone 2–4 sideme kauguselt. HSQC ja HMQC järjestused sisaldavad kindlat ooteperioodi pulsside vahel, mis võimaldab tuvastada ainult teatud vahemikku kindla lõhenemiskonstandi suhtes. Ühe sideme korrelatsioonimeetodite jaoks pole tegemist probleemiga, sest lõhenemiskonstandid on üsna samas järgus. Mitme sideme kaugusel paiknevate aatomite lõhenemiskonstandid aga võivad olla üsna erinevad ning neid pole võimalik kõiki salvestada ühe HSQC või HMBC eksperimendiga.
HMBC puhul piisab takistuste ületamiseks ühe ooteperioodi väljajätmisest HMQC järjestusest. See suurendab lõhenemiskonstantide ulatust, mida on võimalik detekteerida, ning lisaks vähendab signaalikadu relaksatsioonist. HMBC meetodit saab modifitseerida nii, et ühe sideme signaalid on alla surutud ning spektrisse jäävad ainult mitme sideme kaugusel olevate tuumade signaalid.
Ruumipõhised korrelatsioonimeetodid.
Ruumipõhiste korrelatsioonimeetoditega on võimalik tuvastada korrelatsioone tuumade vahel, mis asuvad üksteisele lähedal, hoolimata sellest, kas nende vahel on või ei ole keemiline side. Spinn-võre relaksatsiooniga sarnast mehhanismi kasutab tuuma Overhauseri efekt (NOE), kus lähestikku paiknevad aatomid (umbes 5 Å) ristrelakseeruvad.
Tuuma Overhauseri efekti spektroskoopia (NOESY).
NOESY korral kasutatakse segunemisperioodi ajal Overhauseri ristrelakseerumist tuumaspinnide vahel, et saaksid tekkida korrelatsioonid. Tulemuseks saadakse COSYga sarnane spekter diagonaal- ja ristpiikidega, kusjuures ristpiigid ühendavad nende tuumade resonantsi, mis paiknevad pigem ruumiliselt lähedal, mitte mõne sideme kaugusel. NOESY spektris on lisaks telgpiigid, mis ei anna lisainformatsiooni ning neid saab kõrvaldada lisaeksperimendiga, kus pööratakse esimese pulsi faas vastupidiseks.
NOESY tähtsus seisneb suurte biomolekulide uurimisel (valkude TMR). Veel kasutatakse NOESYt molekuli stereokeemia määramisel (solvendis lahustununa).
Pöörleva raami tuuma Overhauseri efekti spektroskoopia (ROESY).
ROESY on sarnane NOESYga, kuid algne olek on teine. Selle asemel, et mõõta ristrelaktseerumist algfaasi "z"-magnetisatsioonist, pööratakse tasakaalu magnetisatsiooni "x"-telje suhtes. Välise magnetvälja mõjul spinn lukustatakse, et see ei saaks pretsesseerida. Niisugune meetod on kasulik kindlate molekulide jaoks, mille pöörlemise korrelatsiooniaeg langeb vahemikku, kus NOE on liiga nõrk selle detekteerimiseks. Enamasti on tegemist molekulidega, mille molekulmass on umbes 1000 daltonit. ROESY puhul on sõltuvus korrelatsiooniaja ja ristrelaksatsiooni määra konstandi vahel erinev. NOESY korral ristrelaktsatsiooni määra konstant muutub positiivsest negatiivseks korrelatsiooniaja tõustes, mispuhul saadakse vahemik, kus see on nullilähedane. ROESY puhul ristrelaksatsiooni määra konstant on alati positiivne.
Rohkemadimensioonilised meetodid.
Võimalik on läbi viia ka 3D- ja 4D-eksperimente. Selleks saab näiteks pulsijärjestust kasutada järjest kahe või kolme 2D-eksperimendi jaoks. Paljud tihti kasutatavatest 3D-eksperimentidest on kolmikresonantsi eksperimendid, mida kasutatakse tihti valkude TMRis.