CLAE
Autor: Elizabete Araujo | Publicado: 2017-08-07T17:04:00-07:00



Em toda análise química, a validade dos resultados obtidos depende da qualidade e da integridade da amostra a ser analisada. Na maior parte dos casos, a amostra tem mais de um componente ou apresenta interferentes capazes de afetar o sinal analítico. (Vogel, 2008). Por isso, muitos métodos são empregados para compensar ou reduzir o efeito desses interferentes, ou ainda, separar as diversas espécies químicas presentes na amostra antes de sua análise. (Skoog, 2009).

Visando esses aspectos, a cromatografia é hoje um método empregado de forma ampla, pois permite a separação dos componentes de uma amostra e, quase que simultaneamente, a identificação e a quantificação dos mesmos. (Skoog, 2009).



As técnicas cromatográficas, de forma geral, baseiam-se na repartição dos analitos entre duas fases, uma estacionária e outra móvel. (Cromatografia, princípios básicos, 2003). Assim, os componentes de uma mistura são separados com base nas diferenças de velocidade com que são transportados por uma fase móvel através de uma fase estacionária, processo denominado eluição. (Skoog, 2009). Sendo que, essas velocidades diferentes são resultado das interações distintas entre os analitos presentes na amostra e o par de fases. (Cromatografia, princípios básicos, 2003).&nbsp;



São diversas as técnicas cromatográficas existentes atualmente e suas classificações são feitas quanto à superfície de eluição, a natureza da fase móvel, a natureza da fase estacionária e os tipos de equilíbrio entre as fases. (Skoog, 2009). A técnica que aqui será abordada é a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).



A CLAE foi desenvolvida na década de 1960 e representou um avanço em relação à cromatografia líquida clássica, que a antecedeu, por ser muito mais rápida e eficiente. (Skoog, 2009). Diferentemente da CLAE, o método clássico consiste na separação dos componentes de uma amostra por meio da utilização de colunas abertas, com diâmetros relativamente grandes, empacotadas com uma fase estacionária sólida por onde uma fase móvel líquida arrasta os analitos sob a ação da gravidade. (Vogel, 2008).



Já a cromatografia líquida de alta eficiência utiliza uma coluna fechada contendo partículas muito finas e emprega altas pressões para forçar a passagem da fase móvel (HARRIS, 2005). Nesse tipo de cromatografia em coluna, a fase móvel é líquida e a fase estacionária consiste de um sólido, de um líquido adsorvido em um sólido ou de um sólido com fase quimicamente ligada. (Skoog, 2009). Já a amostra é previamente dissolvida na fase móvel, por isso o analito é chamado também de soluto.



Como já citado anteriormente, as fases estacionárias utilizadas na CLAE devem apresentar partículas muito pequenas, normalmente de diâmetro entre 3 e 40μm. Isso porque quanto menor for as partículas da fase estacionária, melhor é o processo de difusão das moléculas do analito dentro da coluna cromatográfica (durante a eluição), pois o contato do soluto com as fases móvel e estacionária torna-se mais efetivo, aumentando a eficiência da coluna; além disso, permite que análises complexas sejam feitas com apenas pequenas quantidades da amostra. (Avanços na Cromatografia Líquida; Pelotas, 2009).



Outro aspecto importante da CLAE é que a eluição não é realizada sob a ação da gravidade, como no método clássico, mas sim a partir de instrumentos capazes de fornecer pressões de bombeamento bem elevadas sob a fase móvel, e é isso que permite a utilização de partículas tão pequenas no interior da coluna e a alta velocidade da corrida cromatográfica. (Skoog, 2009).

A escolha das fases móvel e estacionária depende de vários fatores como a natureza dos analitos e os objetivos da análise. Porém, de uma maneira geral, a fase móvel deve ser de alto grau de pureza ou de fácil purificação, deve dissolver a amostra sem decompor seus componentes, não deve decompor nem dissolver a fase estacionária, deve apresentar baixa viscosidade e baixo ponto de ebulição, ser compatível com o tipo de detector utilizado, permitir a recuperação da amostra se desejada, de preferência apresentar baixa toxicidade e, em caso de misturas, ter miscibilidade completa. (Slide, Rosangela).



As Fases estacionárias na CLAE devem resistir a pressões relativamente altas, resultando em enchimento estável e colunas eficientes de partículas pequenas. Os Sólidos rígidos a base de sílica são os recheios mais usados atualmente. Outro critério importante é o tamanho das partículas, pois esse fator controla o processo de difusão das moléculas da amostra e quanto menor o diâmetro mais fácil será a saída da fase móvel com a amostra. Além disso, as partículas da fase estacionária precisam ser regulares no seu formato, pois, para se a obter distribuição homogênea do recheio em toda extensão da coluna, o que aumenta a eficiência da separação, as partículas devem ter a menor variação de diâmetro possível. Por isso as partículas esféricas são melhores do que as irregulares, mas estas têm menor custo. (CEFET - RJ).



As fases móvel e estacionária normalmente devem apresentar características de polaridade contrastantes, de modo que a amostra possa interagir de forma diferente com ambas. Quando se utiliza uma fase estacionária mais polar que a fase móvel a CLAE é classificada como normal, contudo quando a fase móvel é mais polar que a fase estacionária denomina-se a técnica cromatográfica como reversa. (Slide, Rosangela).



Os mecanismos que permitem a separação dos analitos durante a corrida cromatográfica dependem da natureza das fases móvel e estacionária e são classificados em adsorção, partição, troca iônica, exclusão por tamanho e bioafinidade. Sendo que, cada um destes pode acontecer isoladamente ou em conjunto, levando assim a separação dos componentes da amostra. (Slide, Rosangela).



A adsorção baseia-se na interação superficial dos componentes presentes na amostra com a fase estacionária, processo que se dá na interface entre a fase móvel e o recheio da coluna. Já a partição consiste na dispersão seletiva de uma espécie química presente na amostra entre a fase móvel e a fase estacionária, a qual consiste de um filme líquido que envolve o suporte sólido. (Slide, Rosangela).



A troca iônica fundamenta-se na adsorção reversível e diferencial de analitos iônicos presentes na amostra por uma carga fixa (grupo funcional) da fase estacionária. A exclusão por tamanho, por sua vez, parte do princípio da presença de uma fase estacionária porosa que separa os componentes da amostra mecanicamente, as moléculas menores atravessam os poros e levam mais tempo para eluir, enquanto as moléculas maiores são carregadas pela fase móvel. (Slide, Rosangela).



Por fim, o fenômeno da bioafinidade está relacionado com a ocorrência de uma ligação molecular específica e reversível entre o soluto e o ligante fixado à fase estacionária em determinadas condições de pH e temperatura, método bastante empregado na separação de macromoléculas biológicas. (Cromatografia, princípios básicos, 2003).



&nbsp;À medida que os analitos eluem da coluna cromatográfica ocorre a detecção dos mesmos e é feita uma representação da eluição denominada cromatograma, no qual para cada analito é representado um pico.&nbsp;



No cromatograma é possível observar o tempo de retenção de cada componente da amostra, ou seja, o tempo que cada espécie química levou para eluir, desde a entrada da amostra na coluna cromatográfica. Assim, a caracterização e a identificação das substâncias presentes na amostra podem ser feitas mediante a comparação dos tempos de retenção obtidos com o tempo de retenção de uma amostra padrão (conhecida) nas mesmas condições experimentais.

Entretanto, mesmo as moléculas de uma única substância não eluem de uma mesma coluna cromatográfica na mesma velocidade devido a fenômenos de dispersão que ocorrem com as partículas do analito, fazendo com que as mesmas percorram caminhos diferentes durante a corrida e eluam com tempos de retenção diferentes. A diferença no tempo de retenção entre a primeira e a última molécula de uma mesma substância a sair da coluna é denominada largura de banda do pico. (Slide, Rosangela).

Outro fator importante é o tempo de retenção corrigido (Tr´)., o qual é obtido a partir da subtração entre o tempo de retenção total e o tempo gasto para as moléculas da fase móvel percorrer a coluna (tempo no qual o analito encontra-se na fase móvel e movimenta-se com a mesma velocidade desta, T0), assim, o tempo de retenção corrigido equivale à parte do tempo em que as moléculas do analito ficaram retidas na fase estacionária. (Slide, Rosangela).

Já a quantificação de cada componente é feita mediante o emprego de uma curva de calibração que relacione o sinal analítico com a concentração dos analitos presentes na amostra.. Esse sinal analítico dependerá dos equipamentos acoplados à coluna cromatográfica. Os equipamentos básicos utilizados na CLAE estão evidenciados na figura 1.



Figura 1 – Equipamento básico de CLAE. a) reservatório da fase móvel; b) bomba de alta pressão; c) válvula de injeção; d) coluna; e) detector e f) registrador.

O Reservatório da fase móvel é constituído de um ou mais reservatórios de vidro ou plástico inerte, cada um deles contendo 500 mL ou mais de um solvente. Como os gases dissolvidos e os particulados interferem negativamente na reprodutibilidade das analises e no tamanho das bandas de eluição, geralmente o reservatório da fase móvel está acoplado com um sistema de desgaseificação e filtração(Vogel,2008) . A remoção de gases dissolvidos é realizada a partir de desgaseificadores, os quais podem ser compostos por sistemas de aplicação de vácuo, sistemas de destilação, um dispositivo de aquecimento e agitação ou um sistema de sparging, no qual a provocação de pequenas bolhas de um gás inerte (em geral hélio) insolúvel na fase móvel arrasta os gases dissolvidos para fora da solução. (Skoog, 2009). &nbsp;O sistema de bombeamento da fase móvel é formado por uma ou mais bombas de alta pressão conectada aos recipientes de fase móvel &nbsp;e &nbsp;controladores de pressão e de vazão, variáveis dependentes do funcionamento das bombas. Estas são de grande importância para uma boa análise cromatográfica, pois a partir destas pode-se diagnosticar problemas no equipamento, como entupimentos ou vazamentos. (Cromatografia, princípios básicos, 2003). A bomba de alta pressão é um dispositivo imprescindível para a realização da cromatografia líquida de alta eficiência, pois sua função é impulsionar a fase móvel. (Cromatografia, princípios básicos, 2003). Sem essa impulsão o processo seria muito lento, pois o tamanho reduzido das partículas do interior da coluna faz com que estas exerçam alta resistência à passagem da fase móvel. (Avanços na Cromatografia Líquida; Pelotas, 2009).&nbsp;



O sistema de introdução da amostra é um dos mais importantes, por que muitas vezes o fator limitante na precisão das medidas na CLAE é a reprodutibilidade da introdução das amostras na coluna recheada (Vogel ,2008). O método mais empregado é um sistema com alça de amostragem. As válvulas de injeção usadas possuem uma alça de amostragem para a introdução da amostra com uma seringa e duas posições, uma para o preenchimento da alça e outra para sua liberação para a coluna. Existem alças de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alças na faixa de 5-50 µL para injeções analíticas e 0,5- 2 mL para preparativas ( Degani, et al , 1998). O sistema analítico é composto da coluna cromatográfica e o termostato, a coluna contém a fase estacionária e é o local por onde a fase móvel arrasta os analitos, efetuando a separação. &nbsp; As colunas cromatográficas são geralmente construídas a partir de tubos de aço inoxidável uniformes e polidos, algumas vezes são feitas a partir de tubos de vidro de paredes grossas e de tubos poliméricos, como polieteretercetona (PEEK) Geralmente o diâmetro interno varia de cerca de 0,45 cm para separações analíticas e na faixa de 2,2 cm para preparativas. O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm e preparativas em torno de 25-30 cm ( Degani, et al , 1998). Essas colunas são reaproveitáveis, sendo empacotadas com suportes de alta resolução, não sendo necessária sua regeneração após cada separação. O termostato é utilizado para manter a temperatura estável a fim de se obter separações reprodutíveis.&nbsp;

O sistema de detecção é composto de um detector, que é um dispositivo conectado na saída da coluna para perceber a presença de componentes e emitir um sinal elétrico a ser registrado na forma de um pico cuja área é proporcional a quantidade do componente analisado (Argenton, 2010) Os detectores podem ser de propriedades macroscópicas, os quais medem as alterações de propriedades físicas provocadas pelo soluto na fase móvel, como o índice de refração e a condutividade; ou de propriedades do soluto, os quais respondem a uma determinada propriedade física ou química do soluto, e, idealmente, de maneira independente da fase móvel, como os espectrofotométricos e os de fluorescência. (Vogel, 2008).

Detectores de propriedades do soluto, como o utilizado, são em geral mais sensíveis e de maior faixa de aplicação que os detectores de propriedades macroscópicas, apesar de que, na maioria dos casos, mesmo os detectores de propriedades do soluto respondem às propriedades da fase móvel, portanto, é preciso a utilização de solventes que interfiram o mínimo possível nessa detecção. (Vogel, 2008). O detector mais utilizado para separações por CLAE é o detector de ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de indíce de refração, e eletroquímicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, através da rotação de seus estereoisômeros frente à luz plano-polarizada. O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um microcomputador que pode construir o método e avaliar os sinais de resposta.



Uma série de parâmetros cromatográficos são importantes para serem utilizados na

identificação dos compostos separados, avaliar o desempenho cromatográfico e auxiliar na

otimização do processo de separação. Os principais parâmetros cromatográficos a serem discutidos são: o fator de retenção, o fator de separação, o número de pratos teóricos e a resolução.&nbsp;

O fator de retenção ou capacidade ,k, &nbsp;de um componente é determinado pela razão das quantidades das suas moléculas que ficam retidas na fase estacionária, nS, ou percorrendo a fase móvel, nM. O fator de retenção também está relacionado á razão dos tempos que as moléculas ficam na fase estacionária e na fase móvel ( Collins, et al, 2006). A capacidade em suma, descreve a velocidade com que dado composto migra ao longo da coluna e evidencia o quanto aquele sistema cromatográfico pode reter o analito. &nbsp;



k = t’r / to&nbsp;

O fator de separação ou seletividade, , é a medida de separação de dois solutos, e pode ser calculada pela razão entre os respectivos fatores de retenção dos solutos, que representam os tempos de retenção ajustados de ambos(Argenton, 2010). O fator de separação sempre trata com dois picos adjacentes e indica por exemplo &nbsp;se determinado sistema cromatográfico (FM e FE) consegue separar efetivamente dois analitos (Collins, et al, 2006)..

&nbsp;= t’r2 / t’r1&nbsp;

O número de pratos teóricos é o número indicativo da performance da coluna, ou seja, a medida da largura do pico em relação ao seu tempo de retenção. Um prato pode ser considerado equivalente a uma etapa de equilíbrio entre as duas fases, análogo ao prato da destilação (Argenton, 2010) .Assim quanto maior o número de pratos, mais equilíbrios existirão, maior será a eficiência e, portanto a melhor separação. Este é o parâmetro que mais precisamente define a qualidade de um sistema cromatográfico (Collins, et al, 2006)..&nbsp;

N = 16 ( tr / Wb) 2&nbsp;

O número de pratos obtidos pode ser afetado por diversos fatores, incluindo as condições de análise, o tamanho da amostra, o tipo de soluto, e principalmente, o comprimento da coluna. Para eliminar a influência dos diferentes tipos de comprimento da coluna na comparação do número de pratos em colunas diferentes, utiliza-se para avaliação comparativa entre as colunas a razão entre o comprimento da coluna, L, e o número de pratos, N. Desta forma, obtém-se a altura equivalente de um prato, H (Collins, et al, 2006).

H = L/N

A Resolução fornece uma medida quantitativa da habilidade da coluna em separar duas substâncias (Collins, et al, 2006). A otimização da resolução está relacionada com os parâmetros experimentais na equação geral da resolução.

R = (√N/4) (k/k+1) ( -1/)

Por esta equação percebe-se que a resolução está relacionada à eficiência, representada pelo número de pratos, N, à distribuição dentro da coluna, evidenciada pelo fator de retenção, k e à seletividade, representado pelo fator de separação, . Alterando-se um dos três fatores, altera-se a resolução, principalmente a eficiência e seletividade. A má eficiência e a má seletividade resulta em uma má resolução, pois as bandas serão largas e irão sobrepor-se; Quando há uma boa seletividade, uma boa separação dos picos, pode-se compensar a má eficiência, o alargamento da banda; mas &nbsp;o ideal, é uma boa seletividade e uma boa eficiência, ou seja, picos separados e bem definidos (Collins, et al, 2006).&nbsp;

Existe outra equação para se obter a resolução, apresentada logo abaixo.

Rs = 2 ( tr2 - tr1 )/(Wb1 + Wb2)



Assim , para se obter uma melhor capacidade pode-se ajustar a polaridade do solvente; para melhorar a seletividade pode-se mudar a fase móvel, otimizar o empacotamento e mudar a fase estacionária, enquanto que para melhorar a eficiência pode-se diminuir a vazão da fase móvel, aumentar o comprimento da coluna, trocar de par cromatográfico ou optar por suportes mais finos (Slide Rosangela)

http://www.crq4.org.br/sms/files/file/conceitos_hplc_2010.pdf- argenton