Dr. Anselmo S. Teixeira - Projeto de Tese - Alterações Biomoleculares dos Gliomas Cerebrais
Autor: fotos Honolulu  Mundial  Triathon outubro  2005 | Publicado: 2011-07-25T06:49:00-07:00

Dr. Anselmo S. Teixeira – Staff do Serviço de Neurocirurgia do INCA Projeto de Tese de Mestrado em Oncologia – Alterações Genéticas e Biomoleculares dos Gliomas CerebraisOrientador: Dr. Jose Cláudio CassalliINTRODUÇÃOCONCEITO E CLASSIFICAÇÃO DOS GLIOMASOs gliomas são os tumores cerebrais derivados da glia e os principais tumores malignos do Sistema Nervoso Central. A glia é formada por três tipos importantes de células derivadas do neuroectoderma durante o desenvolvimento embrionário, e compreendem os astrócitos, os oligodendrócitos e as células ependimárias, que revestem as cavidades ventriculares e o canal ependimário da medula raquiana. A OMS classifica os tumores da linhagem das suas células gliais do Sistema Nervoso Central em (tumores gliais/categorias I — IV) como já dito, tumores da linhagem, astrocitária, oligodendrocitária e da linhagem ependimária, [Anselmo, pode ter um tipo misto?](Sim Casali): Os gliomas mistos são os oligoastrocitomas e representam 5% de todos os gliomas. Seus componentes são os oligodentrócitos e astrócitos. Apresentam perda de heterogozidade (HOH) nos cromossomos 1p e 19q(em 40% dos casos), são menos agressivos e de bom prognósticos respondendo bem a radioterapia e a quimioterapia.  Caracterizam-se ainda por apresentarem deleção homozigótica do gene CDKN2A. O processo de carcinogênese dos gliomas está associada com uma ordenada acumulação de mutações, que levam a atipia celular, mitoses, necroses e/ou proliferação celular.. Mutações genéticas que promovem perda de 17p envolvendo o gene são mais freqüentes nos astrocitomas do que nos oligodendrogliomas. A progressão dos astrocitomas anaplásicos também envolve alterações em outros genes supressores tumorais, incluindo alterações do gene  13q.  O glioblastoma multiforme (GBM), Grau IV, apresenta alterações genéticas semelhantes e cerca de 70% apresentam LOH nos cromossomos 10 e 13, além de apresentarem amplificação do gene codificador do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)..:ASTROCITOMAS1 - Astrocitomas Pilocíticos: (não invasivo, OMS grau I) São tumores mais freqüentes entre 8 e 13 anos de idade podem estar localizados nos hemisférios cerebrais, no nervo óptico, no tronco cerebral e no cerebelo.2 - Astrocitomas: (OMS grau II) apresentam variantes: protoplasmática, gemistocística, fibrilar e misto. São tumores que se manifestam em adultos entre 30 e 40 anos de idade e acometem 25% de todos os gliomas.3 - Astrocitomas Anaplásicos: (G III), são tumores malignos que podem ser localizados também nos hemisférios cerebral, no diencéfalo, no nervo óptico, tronco cerebral e cerebelo.4 - Glioblastomas Multiformes: (GBMs), são os gliomas de mais alta malignidade, acometem adultos, entre 45 e 60 anos de idade. Apresentam variantes: glioblastoma de células gigantes e gliossarcomas.OLIGODENDROGLIOMASCorrespondem a 5% dos gliomas, têm origem na substância branca, adjacentes aos hemisférios cerebrais. A maior incidência ocorre nas 3ª e 4ª décadas de vida. São massas irregulares, de crescimento lento com áreas de necrose e degeneração cística dentro do tumor. Podem ainda apresentar hemorragias e calcificações, sinal que é muito comum. São tumores de linhagem oligodendrocítica, são classificados de acordo com a OMS em Oligodendrogliomas G II (baixa malignidade), e Oligodendrogliomas Anaplasicos, maligno grau III.EPENDIMOMASSão tumores derivados das células do tecido glial que reveste as cavidades ventriculares do encéfalo e do canal ependimário da medula espinhal. São neoplasias das células ependimárias, portanto estão em relação topográfica com os ventrículos na maioria das vezes. Podem originar-se nos ventrículos laterais no IVº ventrículo ou ainda na medula espinhal. Macroscopicamente, apresentam-se como massas acinzentadas, bem delimitadas, que podem ter aspecto em couve-flor (papilífero), podem ainda emergirem dos ventrículos e infiltrarem o tecido cerebral adjacente. Ocorrem tanto nas crianças quanto nos adultos com certa freqüência, São Classificados pela OMS em Ependimomas Grau II, com suas variantes: celular, papilar, epitelial, de células claras, como também os ependimomas mistos, bem como os Ependimomas Anaplásicos Grau III..(*)TEORIA DA TUMORIGÊNESE NAS ETAPAS DOS GLIOMAS A transformação das células neuronais normais em células neoplásicas no cérebro humano normal ocorre como resultado da acumulação de uma série de alterações genéticas. Estas alterações genéticas incluem a perda, ganho ou amplificação de cromossomos diferentes que levam a alterações na expressão de proteínas que desempenham um papel importante na regulação da proliferação celular, e são descritas a seguir:  I - Fatores de crescimento (GF) são peptídeos quer se acoplam, aos receptores de membrana e desencadeiam uma cascata de sinalização nuclear controlando processos celulares importantes, como angiogênese, proliferação e morte. São os seguintes fatores: 1 PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas e seu receptor),2. EGF (fator de crescimento epidérmico),3. TGF (fator de crescimento de transformação),4. IGF (fator de crescimento tipo insulina I e II) são dois: IGF I e IGF II,5. FGF. (fator de crescimento fibroblástico, e incluem o aFGF, bFGFe VEGF (fator de crescimento endotelial vascular).II – Mutações somáticas1. Proto-oncogenes e Oncogenes que podem sofrer mutações, translocação e deleção,2. Genes supressores tumorais:TP53, PTPRD, PTEN O gene PTPRD (Receptor-type tyrosine-protein phosphatase delta) foi descoberto por pesquisadores da Universidade de Georgetown University Medical Center que são inativados numa forma de melanoma maligno e  nos Glioblastomas multiformes.III - Alterações cromossômicas numéricas ou estruturais: tais como deleções, rearranjos, amplificações.. Com base nas aberrações cromossômicas nos Gliomas, foi proposto um modelo de progressão maligna. A teoria de múltiplas etapas estipula que múltiplos fatores são necessários para o desenvolvimento dos tumores conforme mostra a gênese dos tumores na figura abaixo.(*)Tabela 1 – Eventos genéticos freqüentemente observados na tumorigênese dos GBMs desde as células precursora – (Tumores do Sistema Nervoso Central) – José Cláudio Casali da Rocha (livro) (*)                                                            Tabela 1Principais Alterações Genéticas Encontradas nos Gliomas do SNCTipo de Tumor Alta Freqüência Baixa FreqüênciaGBM de novo (primário) LOH 10q  Mutação TP53  Alterações PTEN   Amplificação EGFR   Deleções CDKN2AGBM secundário LOH 9p, 10q, 17p   Mutação PTEN   Mutação TP53  Amplificação EGFR   Amplificação PDGFR-a Deleções (CDKN2A), ARF e CDKN2BOligodendroglioma LOH 1p  LOH 10q   LOH 19q Alterações PTENOligodendroglioma anaplásico LOH 1p   LOH 10q   LOH 19q   Alterações PTEN  Deleções CDKN2A Oligoastrocitoma  Mutação TP53 ——Uma diversidade de outras alterações genéticas ocorrem ao nível cromossômico como as (perdas de 17p, 13q, 9p, 19, 10, 22q, 18q e ampliação de 7 e 12q), alterações que  também têm sido observadas nos gliomas. São modificações moleculares que  levam as alterações na expressão de diversos genes, proteína 53 (p53), retinoblastoma (RB), interferon  alfa e beta (INF), AMP cíclico, ciclinas dependentes de quinases 2 (CDKN2), receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR),fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), MDM2, GL1, CDK4 e SAS durante a gênese e a evolução dos gliomas nos  seres humano. Estudos recentes sugerem que a expressão alterada de vários outros genes  como exemplos: MET; CDK4: MYC; fator transformador de crescimento beta (TGF beta); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); além de moléculas de adesão celular como (PHR-CAM); moléculas de adesão celular neuroglial (NCAM L1); p21waf1/Cip1; TRKA; genes de reparo mismatch (MMR); C4-2; D2-2: além de diversas proteínas como  por exemplo, as catepsinas, tenascina, metaloproteases de matriz, inibidora tecidual das metaloproteinases, o óxido nítrico sintase, as integrinas, os  receptores de interleucina-13 (IL-13R), connexinas43, receptores ativadores de uroquinase do plasminogênio (uPARs), bem como as proteínas da matriz extracelular e proteínas de choque térmico que também estão associados com a gênese de gliomas humanos. Em conjunto, estes achados apontam para a acumulação de múltiplas mutações genéticas juntamente com grandes mudanças na expressão de gene na etiologia dos Gliomas humanos. como relatado acima, existe diversas alterações genéticas na gênese dos gliomas que, no nosso projeto de pesquisa  estudaremos especificamente o subgrupo dos  Gliobastomas e dos Astrocitomas Anaplásicos, com a finalidade de identificar neuromarcadores preditivos da sobrevida dos pacientes portadores desses tumores, uma vez que apenas um subconjunto dos pacientes com GBMs e Astrocitomas Anaplásicos, recentemente diagnosticados exibem uma resposta à terapia padrão.Não encontramos até o momento um painel de biomarcadores com poder de preditivo para distinguir os GBMs e os Astrocitomas Anaplásicos sensíveis e refratários ao tratamento com a temozolamida (TMZ).Uma análise dos genes consistentemente associados com a evolução dos pacientes portadores dos glioblatomas, revelou um consenso de sobrevivência na expressão gênica de 38 gene-set, sendo que os piores resultados foram associados ao aumento de expressão desses tumores de um pool de  38 genes associados à diferenciação mesenquimal  e a angiogênese tumoral.Amostras de GBMs e Astrocitomas Anaplásicos, fixado com formalina incorporado a parafina (FFPE), quando utilizadas em tempo real pela técnica do  (PCR) reação em cadeia da polimerase – transcriptase-reversa resultou em um subconjunto de 9 genes que, aparentemente. Estes 9 genes foram validados em um conjunto adicional de amostras independentes(*).A análise multivariada confirmou que este conjunto de 9 gens foi um fator preditor independentes dos resultados após ajuste para os fatores clínicos e metilação da metil-guanina-promotor-transferase. Este conjunto dos 9 genes também foram positivamente associados com marcadores para células tronco de gliomas , incluindo CD133 e nestin.Em suma, um fator preditor multagênico do resultado em GBM foi identificado, o que nos parece perfeitamente aplicável à rotina das amostras processadas (FEPE).O perfil 9 genes tem um grande potencial para aplicação clínica tanto para otimização da terapia em GBM e dos Astrocitomas Anaplásicos, bem como a identificação de novas terapias alvos para os tumores refratários ao tratamento padrão(*). MATERIAL E MÉTODOSBANCO NACIONAL DE TUMORES E DNA DO INCA (BNT) O Instituto Nacional de Câncer, que foi estabelecido como Centro de Referência de Alta Complexidade do Ministério da Saúde pela portaria 2.439/GM/2005, iniciou a implantação do Banco Nacional de Tumores e DNA (BNT e DNA). O Banco Nacional de Tumores e DNA (BNT) é resultado de iniciativa da Coordenação de Pesquisa do Instituto Nacional de Câncer (INCA) com o apoio financeiro da Swiss Bridge Foundation e FINEP. Tem como objetivo organizar uma rede brasileira para a coleta de amostras tumorais e pareadas normais, além de sangue de pacientes portadores dos tumores mais prevalentes no país. Faremos uma análise retro prospectiva, identificando os tumores operados há um ano, obtendo o DNA de tumores em lâminas de parafinas que não foram tratados com a temozolamida (TMZ),lâminas estas que estão nos arquivos do Serviço de Patologia do INCA. Faremos uma comparação com um estudo prospectivos identificando dos GBMs, do nosso BNT, analisando o papel primário de um pool 9 gene com a finalidade de compararmos as alterações genéticas da nossa população confrontando com os resultados observados na literatura dos GBMs e dos Astrocitomas Anaplásicos que forem operados no serviço de Neurocirurgia do INCA. (*)MATERIAL E MÉTODOCOLETA DO MATERIALNo momento do atendimento ambulatorial em que o paciente é encaminhado  para sua primeira consulta, aqueles os quais forem suspeitos de serem portadores de um processo expansivo maligno e que  apresentam probabilidades de serem submetidos a um procedimento cirúrgico, seja ele diagnóstico ou terapêutico, serão convidados a doar parte do tumor. A coleta de material excedente é autorizada pelo paciente obedecendo os critérios que já vem sendo adotado no INCA pelo BNT e DNA.Uma plataforma de bioinformática foi especialmente desenvolvida para atender a organização e o armazenamento de dados da rede do BNT. A equipe do BNT desenvolveu protocolos de coleta, armazenamento e transporte das amostras que garantem ao pesquisador o controle de qualidade total para as pesquisas na área de genômica e proteômica. O projeto conta com a colaboração da CONPREV, DIPAT, do corpo de enfermagem do INCA e de todos os serviços médico-cirúrgicos dos hospitais do INCA. Sendo o se responsável, o Dr. Prof. José Cláudio Casali da Rocha que coordena uma serie de outros profissionais.(*).O Banco Nacional de Tumores e DNA, rotineiramente vêm fazendo coletas de espécimes (tumores) de uma rede nacional em todos os serviços de cirurgia, seguindo os protocolos padronizados, com a finalidade de reunir informações para traçar o perfil da população brasileira, possibilitando estudos voltados ao aprimoramento da assistência aos portadores de câncer no país. (BRASIL 2005). Hoje, o BNT já tem uma variedade de espécimes de vários tumores dos Serviços de Cirurgias dos Hospitais do INCA. Pretendemos, além das amostras dos gliomas coletado com o Consentimento Livre e Esclarecido, dos pacientes e/ou o seu responsável, analisaremos também, sangue dos nossos pacientes para avaliação das alterações genéticas e biomoleculares tanto dos tumores quanto do DNA do sangue dando, continuidade as nossas pesquisas, conforme algumas trabalhos já publicados por nós e pelo grupo de Gliomas (*)PACIENTES ELEGIVEISPacientes matriculados na seção de Neurocirurgia e, todos os casos deverão ser discutidos na Mesa Redonda do Serviço de Neurocirurgia sob a chefia do Dr. Hélio Lopes.A liberação da medicação deverá ocorrer com a anuência da chefia da Onclolgia Clinica (Dr. Daniel Herchenhorn) ou o seu representante (Dr. Gelcio Mendes). Seis meses após  o inicio do nosso trabalho, será avaliado a inclusão de pacientes com ressecção incompleta da lesão.(*)Ref. Strupp, R, et al. Radioterapy plus concomitant and adjuvant temozolamide for glioblastoma. NEJM 352 (10): 987-96, 2005  - Será colocado nas referências........ O pacientes elegíveis para o trabalho, conforme acordado na reunião da comissão de Padronizaçãode Fármacos realizada no dia 16 de junho de 2009, com as chefias das clínicas relacionadas, (Oncologia Clínica e Neurocirurgia)m foi acordado que seriam tratados dois novos pacientes/mês,  num total de até 24  pacientes novos por ano,                                                                                                  podendo o (n) ficar entre 30 e 50 pacientes anuais, desde que sejam incluídos os  pacientes portadores de astrocitomas anaplásicos.CRITÉRIOS CLINICOSPacientes portadores de glioblastomas multiforme com:Performance starus O ou 1 (KPS> ou = a 70),Idade máxima de 70 anos,Ressecção macroscópica completa (> ou = 98% detectada por Ressonância Magnética pós operatória,PROTOCOLOQuimioradioterapia adjuvante,Radioterapia 60 Gy durante 6 (seis) semanas no INCA,Quimioterapia durante o curso da radioterapia com Temozolamida (TMZ) Temodal®, agente alquilante oral de segunda geração, de amplo espectro de atividade anti-tumoral e relativa toxicidade.O Temodal® é o medicamento de primeira escolha no tratamento quimioterápico de astrocitomas anaplásicos e dos glioblastomas multiformes. A temozolamida é um antineoplásico alquilante na apresentação de comprimidos cuja forma farmacêutica é (derivado 3-metil de mitozolamida). Os efeitos adversos estão relacionados aos alvos de q2ualquer agente allquilante, como alterações da medula óssea, do sistema linfóide, das atividades testiculares e gastrointestinaisNo curso do tratamento quimioterápico, os pacientes serão medicados com Temozolamida 75mg/m2 diariamente, durante 6 (seis) semanas e, após o término do tratamento com a radioterapia farão o uso do TMZ durante 4 (quatro) semanas  na dose de 150 mg/m2 por 5 (cinco) dias e a cada 21 dias em 6 (ciclos).(*) JUSTIFICATIVAConforme descrevemos nos tópicos anteriores, uma soma dos dados sobre os desequilíbrios genéticos nos gliomas foi acumulada por hibridação genômica comparativa (CGH). Com a finalidade de distinguir de forma significativa coincidentemente, pretendemos verificar as alterações genéticas bem como a super-expressão de fatores que levam o desenvolvimento dos gliomas. Todas as aberrações ao nível de mais de 850 bandas cromossômicas impressionantemente visualizadas nos atuais estudos padrões de pesquisas dos gliomas,  como as alterações que ocorrem no lócus dos genes envolvidos mostram que as alterações mais freqüentes de ganhos ocorreram nos cromossomos 7p12, 8q24.1, e 12q, 13q.15 (loci de EGF-R, C-MYC e CDK4, respectivamente) e perdas em 9p.21 (o lócus da p.15 e p.16) e 10q23.3, e o gene PTEN onde os genes estão alocados. Nos gliomas, a maioria dos cromossomos, variavelmente mostra números de cópias em escalas com diferentes aberrações. Quando analisamos esses trabalhos de pesquisas em gliomas encontramos sempre alterações nos cromossomos 7, 10 e 9 nos astrocitomas bem como e nos ependimomas, alterações no cromossomo 18. Temos alguns trabalhos publicados e apresentados em congressos juntamente com Grupo de Estudos de Tumor Cerebral, constituído segundo portaria nº. 134 de 29 de junho de 1999, pelo então Diretor Geral do Instituo Nacional de Câncer — INCA e, publicada no BS/SAG/MS nº27no dia 02 de Julho de 1999. O nosso Grupo fez várias pesquisas nesse período que foram publicados cujas alterações serão avaliadas e comparadas com os novos casos com o perfil 9 gene, bem como analisaremos a sobrevida dos paciente já que os mesmos não foram tratados com temozolamida (TMZ) e temos como resgatar os dados dos pacientes num estudo retro prospectivo.Os referidos trabalhos seguem referidos abaixo. 1 -Dna release Line — 1 retrotransposon. Could it be possible?(*) 2 - Análise das alterações genéticas do CDKN2 em tumores cerebral dos pacientes do INCA em outubro de 1999(*). Analise Molecular do CDKN2 (p16) em gliomas associados com os dados clínicos (*)3 -Detecção de anticorpos anti-P53 em plasma de pacientes com tumor do cérebro (*). 4 - Análise de microssatélite em gliomas através do seqüenciador automático(*). Associação entre instabilidade microssatélite (MI) e perda da heterogozidade (LOH) na região 9p21-22 (CDKN2 e p16 (*). 5 - Detenção de mutações na p53 e K-Ras por PCR-SSCP em tumores cerebrais dos pacientes do INCA 1998 (*). 6 - Análise de Metilação de CDKN2 nos tumores cerebral dos pacientes do INCA agosto de 1998 (*), entre outros trabalhos entre outros.Estes estudos anteriores juntamente com análise de DNA da expressão gênica do perfil 9 gene, ainda no estudo prospectivos, serão coletadas das lâminas e blocos de parafinas que estão arquivadas no serviço de patologia do INCA, e analisaremos a sobrevida dos pacientes que se encaixarem no perfil referido 9 gene set.(*)A partir de então, faremos uma linha de corte, onde passaremos a analisar todos  os casos de GBMs que estão no BNT e os casos operados até o final do  ano de 2010 pelo serviço de Neurocirurgia e se necessário incluiremos também os casos até o mês de julho de 2011 em função do (n) mínimo de 50 tumores que deverá entrar no nosso estudo prospectivo.Isto posto, faremos comparações com os estudos já existente de sobrevida dos GBMs tratados com temozolamida (TMZ) e veremos se os nossos casos além das mesmas alterações apresentam as mesmas respostas dos casos da literatura sobre o TMZ e ainda analisaremos a possibilidade de encontrarmos outros biomarcadores como fatores preditivos uma vez que o genoma da nossa população é bem diferente das demais populações mundial.Pretendemos ainda tornar mais preciso o prognóstico dos tumores estudados,Favorecer a aplicação de protocolos experimentais de tratamentos em que o prognóstico global obtido através de indicadores molelculares selecionados juntamente com os dados clínicos desfavorável,Compreender melhor os mecanismos moleculares envolvidos no processo da tumorigênese do gliomas da nossa população.Hoje, na realidade , uma análise “genética” da nossa população continua “negra e mestiça”*)s censos dos brasileiros mostram que a nossa população se classifica como branca em (49,9%), uma outra poarte como poarda na proporção de ( e um número muito reduzido é classificado como preto (6,3%).O fato é que  quando a nossa população foi analisada “geneticamente”, o Brasil mostra uma esmagadora maioria de mestiços e não branca como mostram os censos feitos e, na realidade, (86%) tem mais de (10%) de genes africanos e, apenas (14%) dos brasileiros são geneticamente branco. *Feito estas colocações acredito ainda que possamos descobrir novos biomarcadores específicos para os tumores que serão avaliados.EQUIPE1) Staffs do Serviço de Neurocirurgia,2)  Serviço de Oncologia, Dr. Gelcio Mendes3) Centro de Pesquisa do INCA,4) Colaboração externa .- em busca de interesse para fomento da pesquisa.............BIBIOGRAFIAA ser incluída posteriormente.