Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
Autor: Paula | Publicado: 2009-09-29T10:00:00-03:00

É um teste imunoenzimático que utiliza anticorpos secundários marcados com uma enzima para detectar anticorpos contra um antígeno específico. O antígeno é imobilizado em placas de poliestireno. A presença de antiocorpos no soro teste é relevada pela ação da enzima conjugada ao anticorpo secundário, ela reage com um cromógeno produzindo cor. O teste possui muitas variações e pode ser também utilizado para detectar antígenos.Principais tipos: Indireto, Sanduíche, Competição e Captura.Leia mais...Os sistemas Elisa são largamente usados nos laboratórios de Microbiologia, permitindo a detecção de antígenos ou anticorpos em relação a um vasto número de agentes infecciosos (bacterianos, fúngicos, parasitários e víricos), hormônios e vários tipos de proteínas.Exemplos: Doença de Gumboro, Bronquite Infecciosa das Galinhas, Newcastle, Encefalomielite Aviária, Doença de Chagas, HIV, Leishmaniose visceral, Hepatite-B triagem de doadores, dosagem de hormônios como T3, T4, LH, FSH, βhCG entre ontros.O kit Elisa tem todos os reagente que vc precisará. Aqui tem um exemplo de kit do HIV.Ele contém uma placa, um controle positivo e outro negativo, um anti-anticorpo conjugado a uma enzima, uma solução de parada, um substrato, e uma solução tampão.Elisa Indireto passo à passo:1- Placa sensibilizada com um antígeno:No Elisa indireto a placa que vem no kit está sensibilizada com o antígeno (no exemplo partículas virais do vírus HIV). O que se procura são os anticorpos produzidos pelo organismo que se vai testar.Nesta placa foi colocado uma solução contendo o antígeno e esta foi incubada por um tempo (este tempo varia a depender do antígeno e sua afinidade com a placa). Depois foi retirado o excesso de solução.Depois o laboratório coloca o bloqueio. Que é uma outra solução contendo proteína de alto peso molecular para ocupar todos os "espaços" que sobraram (ex: BSA). Incuba-se e retira-se o excesso. A placa já vem pronta para o uso.A finalidade do bloqueio é evitar que outras proteínas contidas no soro se fixem à placa no momento do teste. Se os anticorpos do soro teste se ligarem a placa, o resultado vai trazer uma alta titulação falsa.2- A amostra a ser testada é colocada na placa.Procuramos um determinado anticorpo (Ac) contido no soro (neste caso anticorpos contra o HIV). Incuba-se para que haja este encontro e se forme um complexo antígeno-anticorpo.(Neste caso a 37ºC que é a temperatura do corpo humano, onde a reação ocorre naturalmente).No caso do Lupus Eritrematoso Sistêmico também é a 37ºC e por 15 minutos. Tem outras reações que também ocorrem naturalmente no corpo humano e que também são incubadas a essa temperatura.Cada kit já possui os seus resultados padronizados. Por isto deve ser seguido à risca. O teste é muito sensível as variações do manipulador. Ele pode dar resultados diferentes se for deixado por mais ou menos tempo.3- Lava-se:Este procedimento pode ser feito várias vezes. Pode ser feito com uma solução de lavagem, uma solução tampão, água destilada ou até água da torneira. Isso varia a depender do teste.4- Coloca-se o anti-anticorpo:Um anti-anticorpo é um Ac que reconhece a fração FC de um anticorpo. Ele é feito através da introdução dessa fração em uma outra espécie (um rato de laboratório, por exemplo) então este animal produz anticorpos que reconhecem Ac humanos. Uma anti-IgG humana. Mas pode ser uma anti-IgG bovina, caprina, canina, entre outras). Uma anti-IgG é espécie específico.Esta anti-IgG vem conjugada com uma enzima. (ex. peroxidase, catalase, fosfatase alcalina, existem vários tipos).Isso é incubado para que ocorra a reação.5-Lava-se novamente.6- Adiciona-se uma solução reveladora e um substrato.O substrato é um cromógeno que reage com a enzima produzindo cor. Esta cor pode ser quantificada com um espectrofotômetro.7- Aguarda-se alguns minutos (o tempo certo que vem no kit) e adiciona-se uma solução de parada. Ela serve para que a realção pare de ocorrer. Caso contrário ela continuaria ocorrendo, indo ficar com a cor mais intensa. E isso seria mais um grande erro de manipulação pois os resultados estão padronizados.A placa deve ser lida em um leitor de Elisa. O leitor de Elisa é um espectrofotômetro que vai calcular a absorbância de cada amostra. Joga-se os valores encontrados no computador e um determinado programa te dá os resultados.