DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS : MÉTODOS DE RASTREAMENTO
Autor: Ciências Bio | Publicado: 2012-05-22T21:19:00-03:00


DIAGNÓSTICO                DE DOENÇAS GENÉTICAS: MÉTODOS DE RASTREAMENTO

Uma                ampla variação de técnicas são utilizadas                para a identificação de doenças genéticas.                Todos os métodos têm vantagens e desvantagens e requerem                considerável habilidade e experiência para serem realizados.                Não existe uma padronização ou preferência                geral por um método, mas os laboratórios devem ser                conhecedores das limitações e sensibilidade dos métodos                por eles usados.
A apresentação a seguir é uma síntese                das diferentes estratégias, baseadas na análise do                DNA, utilizadas para o diagnóstico de doenças genéticas.

Doenças                Genéticas: Padrões de Herança Simples ou Complexo


Autossômicas                    Recessivas - os genes estão presentes nos autossomas                    e os indivíduos afetados tem duas cópias do gene                    mutante. Ex: Fibrose Cística.
                    Autossômicas Dominantes - os genes também estão                    nos autossomas, mas basta uma cópia do gene mutante para                    causar a doença. Ex: Doença de Huntington.
                    Ligadas ao Cromossomo X - os genes agem como mutações                    dominantes no sexo masculino. Ex: Distrofia muscular de Duchenne.
                    Poligênicas ou Multifatoriais- resultam de mutações                    em genes diferentes ou surgem da interação de                    fatores ambientais com múltiplos genes. Ex: Doenças                    cardíacas coronárias, câncer e esquizofrenia.



Aconselhamento                Genético

O                aconselhamento genético é o conjunto de informações                dado à família com relação ao risco                de recorrência , prognóstico e possíveis tratamentos                de uma determinada doença genética.

Testes                Genéticos


                    Citogenético
                    DNA
                    Metabólico



                                   

               





Métodos                de Análise do DNA (Diagnóstico Molecular)

As                técnicas mais comuns de diagnóstico molecular são:


                    amplificação enzimática do DNA (PCR)
                    digestão da fita de DNA genômico ou produto de                    PCR com enzimas de restrição
                    separação eletroforética do DNA ou do produto                    de PCR
                    hibridação do DNA ou fragmentos de PCR com sondas                    oligonucleotídicas.



Aplicações                da PCR

1.                A PCR permite a rápida amplificação                de um gene específico ou de um exon de um determinado gene                como a primeira etapa para rastreamento de mutações                não caracterizadas:


                    PCR para amplificações de exons específicos                    do DNA genômico
                    RT-PCR para análise de transcritos 



2.                A PCR permite a rápida genotipagem de marcadores polimórficos:


Como                    uma alternativa de RFLP                    pelo desenho de primers flanqueadores de sítio de restrição                    polimórfico, permitindo a amplificação                    da região do polimorfismo e digestão do produto                    da PCR com a enzima de restrição sítio                    específica.
                    Pelo desenho de primers de seqüências que flanqueiam                    repetições em tandem ou seja Short tandem repeat                    polymorphisms (STRs),                    conhecidas como microssatélites, que são seqüências                    curtas de 1-4 nucleotídeos de comprimento, que se repetem                    diversas vezes em tandem e que geralmente são caracterizadas                    por muitos alelos.



3.                A PCR pode ser usada para ensaio de mutações                conhecidas 


A                    discriminação alélica pelo tamanho: pequenas                    deleções ou insersões em alelos que podem                    ser detectadas por PCR, por exemplo, deleções                    no alelo mais comum que causa a fibrose cística (DF508)
                    A suscetiblidade a enzima de restrição: mutações                    que mudam um sítio de restrição podem ser                    detectadas como descrito anteriormente, pela digestão                    do produto de PCR com a enzima de restrição específica



4.                PCR alelo-específico (teste de ARMS)                


Mutações                    conhecidas podem ser identificadas pelo desenho de três                    primers, um específico para o alelo mutante, o outro                    específico para o alelo selvagem e o terceiro é                    específico da região flanqueadora (conservada)                    do exon e que será o primer que vai encaminhar a amplificação                    da fita no sentido direto. O desenho é feito de maneira                    que o primer específico para o alelo mutante termina                    com a base mutada na extremidade 3’ e o primer específico                    para o alelo selvagem termina com a base normal em sua extremidade                    3’, funcionando como uma sonda alelo específica.                    Este método é usado para detectar mutações                    específicas e foi chamado de sistema de amplificação                    de mutação refretária.



5.                A PCR pode ser usada para rastreamento de mutações                e polimorfismos de DNA


A                    detecção de variação de seqüências                    no DNA é importante para a identificação                    de mutações que causam doenças em um determinado                    gene, bem como para a detecção de polimorfismos                    de DNA. Uma vez que uma grande fração das variações                    genéticas são devido às diferenças                    produzidas pela mudança de base única na seqüência                    de DNA, o uso de técnicas capazes de detectar substituições                    de uma única base quando se procura mutações                    e seqüências polimórficas foi um avanço                    tecnológico para a pesquisa destas variações.                    Alguns destas técnicas de rastreamento são: DGGE,                    SSCP,                    DHPLC.



Cromatografia                Líquida Desnaturante de Alta Performance (DHPLC)
                              DHPLC                é uma cromatografia líquida baseada no método                de pareamento de íons em fase reversa sob condições                desnaturantes. Seu princípio é:

                  formação de heteroduplexes através da hibridação                  após o aquecimento e esfriamento dos produtos de PCR.
                  separação dos heteroduplexes e homoduplexes sob                  condições parciais de desnaturação


                
                

Método                Citogenético

A                observação microscópica de cromossomos normais                e anormais permitiram a construção de mapas citogenéticos                do genoma de muitas espécies. Estes mapas mostram a localização                relativa de características morfológicas dos cromossomos                (ex; centrômeros, marcadores citogenéticos ou bandas)                e lesões cromossômicas visíveis. O conceito                de mapa citogenético tem sido estendido para incluir a ordem                de seqüências de DNA derivadas de arranjos físicos                dos seus sítios de hibridação. O novo método                de FISH ( hibridação in situ fluorescente) é                o meio mais direto de localizar marcadores moleculares e genéticos                no mapa citogenético permitindo a integração                entre mapas genéticos e moleculares.



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Sondas                cosmídeos - sondas de seqüência única,                que se ligam em pequenos segmentos de determinados cromossomos,                úteis para o estudo de microdeleções.



Painting                probes - sondas específicas de regiões muito                separadas ao longo de um único cromossomo, dando a ilusão                de "pintar" o cromossomo inteiro, usadas para a identificação                de material extra (ex: translocação)

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Sondas                DNA Alfa-Satélite - composto de elementos com seqüências                altamente repetitivas encontrados próximos dos centrômeros                (ex: duplo sinal significa a presença de dois centrômeros).


                



&nbsp;Fonte : 



Giselda                MK Cabello, MSc.
Responsável pelo Projeto Fibrose Cística
Laboratório de Genética Humana
Departamento de Genética/IOC/FIOCRUZ
gkalil@ioc.fiocruz.br