Métodos para quantificar o crescimento microbiano
Autor: Marcelo | Publicado: 2012-05-23T06:13:00-07:00





Métodos diretos 

&nbsp; &nbsp;&nbsp; Existem diferentes métodos para
quantificar o crescimento microbiano; Alguns determinam o número de
células e outros analisam a massa total da população, que e
diretamente proporcional ao numero de células. A quantificação de
uma população geralmente é realizada considerando o numero de
células em 1 mL do meio liquido ou 1g do material solido. Mas como
populações bacterianas são muito grandes, são usadas pequenas
amostras dessas para contagem por métodos diretos ou indireto.
Depois, o resultado é colocado em formulas matemáticas para
calcular o valor final.&nbsp;
&nbsp;


1) Contagem em placa


&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; É a técnica mais utilizada na determinação do
tamanho de uma população bacteriana.

&nbsp;Vantagem: as células
viáveis (vivas) são quantificadas.

&nbsp;Desvantagem: tempo de incubação
longo, em geral 24h, para o aparecimento das colonias visíveis em
placa.&nbsp;

&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Esse tempo pode impedir o uso dessa técnica em áreas como
controle da qualidade do leite pois não é possível manter o lote
por um período longo. Esse método considera que cada colônia é
originada do crescimento e da multiplicação de uma bactéria. Isso
nem sempre é verdade, uma vez que as bactérias frequentemente
crescem em cadeias ou em grumos. Para refletir essa realidade, as
contagens em placas são feias nas chamadas unidades formadoras de
colônias (UFC).

&nbsp; &nbsp; &nbsp; Para realizar esse método, é essencial
que somente um numero limitado de colonias cresça em cada placa.
Quando muitas colonias estão presentes, ocorre saturação impedindo
o crescimento de algumas colonias e dificultando a contagem. Pela
convenção do Food and Drug Administration, órgão
norte0americano que controla alimentos e medicamentos, deve-se
realizar a contagem em placas que contenham de 25 a 250 colonias, mas
microbiologistas preferem de 30 a 300 colonias.

&nbsp;&nbsp;&nbsp; &nbsp; Quando essa metodologia é
empregada, deve-se utilizar o método da diluição seriada para
garantir que o numero de colonias na placa permaneça na faixa
desejada.


&nbsp;Diluição seriada: Exemplo:
amostra de leite com 10 mil bactérias / mL. A inoculação de 1 mL
dessa amostra em uma placa com meio de cultivo resultará no
crescimento de 10 mil colônias e será impossível fazer a contagem.
Mas se 1 mL de leite for transferidos para um turbo contendo 9 mL de
água estéril (diluição), cada mL da amostra deste tubo conterá
1000 bactérias. Esse numero ainda é grande para fazer a contagem.
Portanto, uma nova diluição seriada deverá ser realizada,
transferindo 1 mL (com 1000 bactérias) para um novo tubo com 9mL de
água estéril).; nesse ultimo tubo, cada mL conterá 100 bactérias,
que quando inoculado deverá originar 100 colônias, que podem ser
facilmente contadas.

Existem dois métodos para se realizar a contagem de
bactérias em placa: método de espalhamento em placa e método pour
plate.



Método pour plate: No método pour plate o
inoculo pode ser realizado com um volume te 1 ml ou 0,1 mL da
diluição bacteriana diretamente na placa de Petri. O meio de
cultivo, mantido em banho-maria a 50 ºC para impedir a solidificação
do ágar, é vertido sobre a amostra, que será misturada por
agitação suave da placa. Após solidificação do ágar, a placa é
incubada na temperatura de crescimento da bactéria. Nesse método o
crescimento das colônias das bactérias ocorre dentro do meio de
cultivo e na superfície do meio de cultivo.&nbsp;

Desvantagem: Microrganismos sensíveis ao calor
podem ser danificador pelo agar fundido (liquido a 50 ºC) e podem
ficar impossibilitador de formar colonias, quando algumas meio de
cultivo diferenciais são usados, a aparência característica de uma
colonia na superfície do meio é essencial para que haja o
diagnostico e as colonias formadas abaixo da superfície não são
apropriadas para estes testes.







Método de espalhamento em placa: método mais
usado. O inóculo de 0,1 mL é adicionado a superfície do meio
contendo agar ja solidificado. O inoculo é, então, espalhado
uniformemente na superfície com a alça de Drigalski. Esse método
não tem as desvantagens do me´todo pour plate porque as colonias
crescem somente na superfície do meio e não entram em contato com o
agar fundido (liquido a 50 ºC).

2) Filtração&nbsp;
&nbsp;

&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Aplicado para contar amostras
em que o numero de bactérias é muito pequeno, como lagos e fontes
de água. Esse método permite que a bactérias seja concentrada
sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos
(bactéria não passa pelos poros) após passagem de um volume de 100
mL de água. Essa membrana é transferida para uma placa de Petri com
um suporte embebido em nutriente líquido, que permite que as
bactérias se desenvolvam sobre a membrana. Esse método é usado
para detecção e registro de coliformes (indicadores de poluição
fecal) em amostras de alimentos e águas. Coliformes podem ser
identificador por meios de cultivo diferenciais.

3) Método do Número Mais Provável (MNP)

&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; É uma técnica estatística com base no
seguinte princípio: quanto maior o numero de bactérias em um a
amostra, maior será o numero de diluições necessárias para
eliminar totalmente o crescimento em tubos com meio de cultura.
&nbsp; &nbsp; &nbsp; Esse
método é o mais usado quando as bactérias a serem contadas não
cresceriam em meio sólido (como bactérias quimioautotróficas
nitrificantes), ou quando o crescimento de bactérias em um meio
liquido diferencial é usado para identificar os microrganismos (como
coliformes em água, que seletivamente fermentam lactose produzindo
ácido). O método fornece somente uma estimativa de 95% de
probabilidade de a população bacteriana conter um numero de
bactérias e que o NMP da tabela é estatisticamente o numero mais
provável.&nbsp;

4) Contagem Direta ao Microscópio

&nbsp;&nbsp;&nbsp; Nesse método um volume conhecido de solução
bacteriana é colocado em uma área definida de uma lamina especial
de microscópio denominada célula de contagem Petroff-Hausser.
Desvantagem: Dificuldade para contar bactérias móveis, células
mortas acabam sendo contadas como as vivas, necessário um grande
numero de células de bactérias (cerca de 10 milhões de bactérias
por mL) Para ter uma contagem satisfatória.
Vantagem: para quantificar as bactérias por esse método não ha
necessidade de períodos de incubação, portanto, ela pode ser usada
quando se necessita de resultados imediatos.