Next-generation Sequencing, estado da arte
Autor: Prós | Publicado: 2009-12-02T04:36:00-08:00

Em 1977, Frederick Sanger e Alan Coulson publicaram dois trabalhos onde reportavam metodologias eficazes para a determinação da sequência de DNA de organismos, abrindo as portas para uma completa revolução na biologia com o desvendamento da seqüência completa de genes e genomas (Sanger et al., 1977a; Sanger et al., 1977b). Em um desses trabalhos, o genoma completo do fago phi X174 era apresentado; tendo sido este o primeiro genoma de um organismo a ser completamente desvendado por seres humanos. Estes trabalhos renderam a Sanger seu segundo prêmio Nobel em química, entregue no ano de 1980. Sua esplêndida técnica de sequenciamento de DNA utilizando os chamados didesoxinucleotídeos imperou absoluta na ciência genômica ao longo dos 30 anos que se seguiram à sua publicação original. Não é exagero dizer, portanto, que Sanger tenha sido o verdadeiro pai das ciências genômicas; de fato, um dos maiores centros de genômica do mundo, localizado no distrito de Hinxton, ao lado de Cambridge, na Inglaterra, tem o nome dedicado a ele: o Wellcome Trust Sanger Institute –- onde realizei meu estágio de doutoramento sanduiche. Sanger portanto abriu as portas para toda a análise informacional em ciências genômicas e mostrou que era definitivamente possível compreender genomas ao soletrá-los unidimensionalmente através da sequência de bases químicas do DNA: A, C, T e G.Fred Sanger (1918-) é um bioquímico inglês e está entre as únicas 5 pessoas que já foram agraciadas com dois prêmios Nobel. Os dois prêmios de Sanger foram em química. O segundo prêmio Nobel de Sanger (1980) foi vencido devido ao fato de que ele foi capaz de descobrir o genoma completo de um vírus que infecta bactéria em 1977. Este primeiro genoma foi sequenciado devido a uma técnica inovadora inventada por Sanger. A técnica de sequenciamento por didesoxinucleotídeos continua sendo utilizada com sucesso, embora em 2005 tenha sido publicado o primeiro trabalho utilizando as novas técnicas de sequenciamento de genomas (next-generation sequencing), tema principal de trabalho deste blogue.Mas eis que a hegemonia de Sanger pode estar chegando ao fim. Com a corrida pelo genoma humano nos fins da década de noventa e começo do novo século (Davies, 2001), novas estratégias começaram a ser pensadas para a produção de sequências genômicas de forma ainda mais massiva do que utilizando os sequenciadores de eletroforese capilar baseados em didesoxinucleotídeos fluorescentes (Boysen et al., 1997). Empresas biotecnológicas e mentes inovadores rapidamente perceberam que surgimento de uma tecnologia de sequenciamento mais veloz certamente proporcionaria mais um salto ainda maior em nossa compreensão sobre os genomas de organismos. Foi em 2005 que os primeiros resultados dos esforços dos engenheiros em produzir máquinas ainda mais eficientes de sequenciamento de DNA foram sentidos (Margulies et al., 2005). A empresa 454 Life Sciences anuncia então sua técnica de sequenciamento por síntese, onde cada base era lida à medida que fosse adicionada à cadeia recém-formada de DNA (Schuster, 2008). No método de Sanger, a base lida era verificada pela marcação fluorescente e pelo peso molecular da molécula contendo a sequência parcial do DNA através de uma análise eletroforética. O novo método que a inserção de cada base parecia ser bastante mais confiável. No trabalho original publicado na revista Nature, os autores descrevem um "sistema de sequenciamente altamente paralelo e escalável com automatização significativamente maior do que os instrumentos padrão de eletroforese capilar" (Margulies et al., 2005). O equipamento da empresa 454 era capaz de produzir 25 milhões de pares de bases com precisão de 99% ou mais em apenas uma análise de quatro horas na máquina. Isso representava um aumento de 100 vezes na produção de sequências de DNA quando comparado à tecnologia mais moderna existente -- um melhoramento grandioso da tecnologia originalmente descrita por Sanger realizado nos fins da década de noventa (Venter et al., 1996; Boysen et al., 1997). E para provar seus resultados e sua ideologia de "uma nova revolução genômica" está para acontecer, o trabalho original da 454 Life Sciences apresentava o resequenciamento da bactéria Mycoplasma genitalium com altíssima acurácia (99.96%) e realizado em apenas uma corrida dessas máquinas inovadoras (Margulies et al., 2005).Todavia este trabalho foi recebido com cautela pela comunidade científica, que preferiu evidenciar as vantagens do sequenciamento Sanger sobre esta técnica do que abraçá-la sem hesitação. De fato, a nova técnica ainda produzia sequências pequenas e de difícil análise (Wommack et al., 2008). Enquanto a técnica de Sanger produzia seqüências de aproximadamente 750 pares de bases; a nova técnica gerava seqüências contendo apenas cerca de 100 ou 200 letras de DNA encadeadas (Margulies et al., 2005). Já em 2006, entretanto, novos trabalhos publicados principalmente na área da metagenômica (veja neste mesmo blogue outro texto sobre o assunto) demonstravam a versatilidade e eficácia da nova técnica de sequenciamento ao amostrar a diversidade microbiana observada em uma mina (Edwards et al, 2006) ou nas profundezas do mar (Sogin et al., 2006), além de genomas virais observados em oceanos (Angly et al., 2006). Além disso, ao longo dos últimos anos, a tecnologia de pirosequenciamento já evoluiu e a cada dia que passa o tamanho médio dos reads NGS alcança o tamanho médio conseguido por reads baseados na técnica de Sanger. A máquina Genome Analyser da empresa Illumina, uma das novas máquinas capazes de produzir dados genômicos em larga escala através de técnicas de sequenciamento por síntese. A cada execução da máquina com uma amostra diferente, milhões de sequências genômicas podem ser produzidas que ajudarão os pesquisadores na busca pela compreensão da biologia dos organismos -- busca esta que invariavelmente trás benefícios para a sociedade, como na descoberta de alvos para fármacos ou enzimas de utilização biotecnológica.Trabalhos subsequentes têm então demonstrado a extensa aplicabilidade de plataformas de sequenciamento de nova geração para a genômica em diversas áreas da pesquisa científica, como por exemplo: descobertas de rearranjos genômicos em tumores (Morozova e Marra, 2008a); genômica funcional (Morozova e Marra, 2008b); análise do transcriptoma em larga escala (Asmann et al., 2008); testes de diagnósticos moleculares (Voelkerding et al, 2009); variação genética em diversos organismos (Imelfort et al., 2009), incluindo humanos (Guryev e Cuppen, 2009); descoberta de vacinas (Dhiman et al., 2009); melhoramento genético de plantas cultivadas (Varshney et al., 2009) e muitos outros.Além disso, a produção e análise completa de genomas humanos, inaugura a era da genômica individual com a publicação do genoma diplóide de James Watson totalmente sequenciado por máquinas de nova geração (Wheller et al., 2008). O projeto 1000 genomas também apresenta o sequenciamento completo de diversos genomas individuais diplóides de seres humanos (http://www.1000genomes.org), indicando que em talvez menos de uma década já poderemos conhecer a sequência completa de nosso próprio genoma. E em mais alguns anos quiçá poderemos saber nossas susceptibilidades a diferentes drogas através de estudos de farmacogenômica; sendo que um médico poderá nos receitar apenas a quantidade adequada ao nosso metabolismo. Definitivamente estamos em uma era de avanço tecnológico nas áreas ligadas à genômica e precisamos produzir metodologias eficientes de análise computacional de dados se quisermos ser capazes de sair à frente nos esforços para conhecer a natureza molecular dos organismos vivos e explorar biotecnologicamente todas as suas possibilidades. Financiemos, portanto, e estudemos a bioinformática.== Referências bibliográficas ==* Angly FE, Felts B, Breitbart M, Salamon P, Edwards RA, Carlson C, Chan AM, Haynes M, Kelley S, Liu H, Mahaffy JM, Mueller JE, Nulton J, Olson R, Parsons R, Rayhawk S, Suttle CA, Rohwer F. The marine viromes of four oceanic regions. PLoS Biol. 2006 Nov;4(11):e368. PubMed PMID: 17090214; PubMed Central PMCID: PMC1634881.* Asmann YW, Wallace MB, Thompson EA. Transcriptome profiling using next-generation sequencing. Gastroenterology. 2008 Nov;135(5):1466-8. Epub 2008 Oct 9. Review. PubMed PMID: 18848555.* Boysen C, Simon MI, Hood L. Fluorescence-based sequencing directly from bacterial and P1-derived artificial chromosomes. Biotechniques. 1997 Dec;23(6):978-82. PubMed PMID: 9421619.* Davies K. (2001) Decifrando o genoma: a corrida para desvendar o DNA humano. COMPANHIA DAS LETRAS.* Dhiman N, Smith DI, Poland GA. Next-generation sequencing: a transformative tool for vaccinology. 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