Manipulação dos bioespécimes: a importância atual da fixação adequada na avaliação prognóstica do câncer de mama
Autor: Raul Carlos Rodrigues | Publicado: 2014-08-05T11:40:00-07:00

Revista Onco

DESDE OS PRIMÓRDIOS DA MEDICINA, O RELATO E A DESCRIÇÃO DAS ENTIDADES ANATÔMICAS HOJE CONHECIDAS ERAM FEITOS EM ESPÉCIMES a fresco. O advento do formaldeído, descrito pelo químico russo Aleksandr Butlerov (1828-1886) e identificado definitivamente pelo químico alemão August Wilhelm von Hofmann, permitiu a preservação e o estudo perene de tecidos, órgãos, lesões e, principalmente, das células. Comparada a ou tros campos da medicina, a patologia é recente.Passou a ser considerada uma área distinta com os estudos de Virchow, quando descreve as células como entidades funcionais (Cellularpathologie, 1858), logo depois da histologia. Essa última foi fundada oficialmente por John Hughes Bennett, de Edimburgo, que enquanto estudava fisiologia foi apresentado ao microscópio.No começo do século 20, as colorações básicas como hematoxilina e eosina, a preservação de fragmentos em parafina e o correto encadeamento de reações químicas básicas se desenvolveram rapidamente.O período da Segunda Guerra Mundial foi muito profícuo para a patologia, sobretudo para a patologia mamária. A descrição de várias entidades, como o carcinoma lobular, por exemplo, já ocorre nessa época.Por mais de 100 anos, o formol cumpriu seu papel de preservar os tecidos morfologicamente.Na década de 1980, uma nova abordagem se delineou em espécimes cirúrgicos: a imuno-histoquímica.Mais do que a identificação de proteínas específicas em tecidos, auxiliando no diagnóstico diferencial de um número cada vez maior de entidades, passou a ter valor preditivo e prognóstico, quando a serviço de receptores hormonais em câncer de mama, por exemplo. Hoje a fixação adequada dos fragmentos passou a ser uma questão pré-analítica importante. A descrição, a associação com pior prognóstico e mais tardiamente a elaboração de terapias-alvo para outros marcadores tumorais, de mama, trato gastrointestinal e pulmão, por exemplo, agregam maior importância ao procedimento de fixação neste século.O formaldeído O formaldeído, ou formol, como conhecemos, é uma molécula simples de dois átomos de hi drogênio, um de oxigênio e um de carbono. Liga-se a pontes de hidrogênio e progressivamente fixa as proteínas contidas nas células. O tecido é penetrado em uma velocidade média de 1,0 cm por hora, o que indica que um espécime mantido em ar am biente irá se decompor rapidamente. Em geral, o formol está disponível em estado absoluto e para utilizá-lo deve ser diluído a uma concentração de 10%. Idealmente a solução de formaldeído a 10% deve ser equilibrada quanto ao pH, tornando assim uma solução de formaldeído tamponado. Essa versão, com pH corrigido, é muito útil pois previne a interferência do formol no nível osmótico e o depósito de pigmentos fórmicos passíveis de ocorrer em soluções de pH abaixo de 6.Formolização adequada As peças cirúrgicas e pequenas amostras devem ser mergulhadas em formol imediatamente após serem removidas do órgão de origem. A autólise inicia-se 30 minutos após a remoção do espécime e esse fenômeno comprometerá sua avaliação morfológica. Detalhes importantes, como estrutura nuclear, arquitetura, são progressivamente afetados pela autólise. O grau nuclear, por exemplo, se torna virtualmente impossível de ser ava liado em peças autolisadas. Espécimes de maior vo lume, como os provenientes de mastectomia, devem ser parcialmente seccionados em cortes paralelos com espessura entre 2 ou 3 cm, com o cuidado de não seccionar a peça completamente e mantendo a sua orientação anatômica, para que todo o tecido seja fixado em intervalo adequado.Dessa forma, todo o tecido removido não sofrerá autólise ao decorrer do tempo. Preferencialmente, esse procedimento deve ser orientado pelo pato logista, para adequar sua prática ao exame macroscópico subsequente.Efeito da formolização em exames subsidiários Enquanto a preservação inadequada compromete a avaliação histopatológica, a morfologia não é afetada por excesso de formolização. Exposição prolongada ao formol não altera a arquitetura do tecido. Peças antigas, mantidas anos em formol para uso didático, podem ser amostradas e subsequentemente microscopicamente avaliadas. Infelizmente, o mesmo não ocorre com a avaliação de proteínas ou de seus segmentos específicos pelas técnicas de imuno-histoquímica e hibri dização in situ.Os testes de imuno-histoquímica e hibridização in situ foram primariamente desenvolvidos em amostras a fresco. Atualmente, a quase totalidade dos testes de cunho diagnóstico, prognóstico e preditivo está disponível para ser realizada em amostras fixadas em formaldeído ou parafinadas.No entanto, a eficiência de alguns anticorpos na detecção de proteínas extranucleares pode ser comprometida tanto na vigência de preservação insuficiente como na fixação excessiva.Os principais problemas na fase pré-analítica que comprometem a qualidade do resultado obtido são a qualidade da fixação, o tempo de fixação e a manipulação adequada da amostra.O Colégio Americano de Patologistas e a Sociedade Americana de Oncologia Clínica desenvolveram recomendações e orientações para preparo e envio de material e amostras para exame anatomopatológico e imuno-histoquímico.Esses cuidados são primordiais para otimizar a eficiência de avaliação de fatores preditivos, a exemplo dos receptores de estrógeno, cuja expressão já está afetada após duas horas sem fi xação, até o seu total comprometimento após oito horas de isquemia.É importante ressaltar que a utilização de formol tamponado mini mizou muito o efeito e a fixação por tempo prolongado em estudo equivalente.Recomendações da ASCO/CAP &nbsp;Seccionar os espécimes cirúrgicos e colocá-los em formol em até uma hora após a exerese.Amostras de menor volume como espécimes de biópsia com agulha grossa ou biópsias cirúrgicas requerem uma fixação imediata e de no mínimo 8 horas e no máximo de 48/72h.&nbsp;Idealmente, deve-se anotar no pedido do exame a hora em que o material foi colocado na solução e utilizar o formol tamponado ou com pH variando de 7.0 a 7.4.Com o advento dos testes ISH (hibridização in situ) para o diagnóstico de amplificação do gene HER2, as questões práticas de mani pulação dos espécimes cirúrgicos foram estendidas para as condições desses testes também. Os resultados de testes FISH (hibridização in situ por fluorescência), CISH (hibridização in situ cromogênica) e SISH (hibridização in situ por prata) são afetados pelo tempo e pela qualidade da fi xação, do mesmo modo que o exame imuno-histoquímico tradicional. Nesses tipos de hi bridi zação o uso de etanol é especialmente danoso, sendo contraindicado, pois pode levar a resultados falso-po sitivos. A fixação em etanol é uma das dificuldades para a rea lização de testes de ISH em amostras de citologia, pois elas são frequentemente fixadas em soluções contendo etanol.Concluindo, a adequada padronização da fase pré-analítica é um procedimento simples, rápido e sem custo, mas que pode interferir diretamente na escolha da melhor opção terapêutica para o paciente.