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L'utilisation des antirétroviraux permettant de bloquer la réplication du VIH a transformé le pronostic des malades infectés. Cependant, des problèmes nouveaux sont apparus tels que la toxicité médicamenteuse et l'émergence de résistance(s) aux antirétroviraux qui compromettent leur efficacité thérapeutique. Les tests de résistance permettent d'avoir une approche rationnelle pour le choix du traitement aussi bien chez les personnes nouvellement infectées que lors d'échecs thérapeutiques. Dans cette minirevue sont exposés les principes de ces tests, leurs limites et leurs indications pour le suivi des personnes infectées par le VIH.
L'échec virologique d'un traitement antirétroviral (diminution suboptimale de la virémie ou remontée de celle-ci sous traitement) est la conséquence de plusieurs facteurs non exclusifs tels qu'une observance défectueuse (le facteur le plus souvent impliqué), des facteurs pharmacologiques (malabsorption, interactions médicamenteuses), des mécanismes cellulaires (phosphorylation défectueuse des analogues nucléosidiques, efflux des antiviraux par des pompes type Pgp) et finalement une résistance aux antirétroviraux suite à des mutations de leurs cibles. C'est à ce dernier facteur et à ses implications pour le suivi des malades que cette minirevue s'adresse.
Le VIH est un rétrovirus et son cycle de réplication comporte donc une étape de transcription inverse au cours de laquelle son ARN génomique est traduit en ADN double brin, étape qui précède l'intégration de l'ADN (provirus) dans le génome de l'hôte.
La transcription inverse est assurée par une enzyme virale, la transcriptase inverse, dénuée d'activité de correction des erreurs. De ce fait, elle introduit entre une et quatre «erreurs» à chaque cycle de réplication (erreur égale incorporation dans la copie ADN d'une base nucléosidique ne correspondant pas à celle de l'ARN matrice). Il en résulte une très grande variabilité des séquences du virus. Un autre élément qui concourt à la variabilité des séquences est le grand nombre de cycles de réplication du virus, cent quarante par an.
Lors de la réplication virale, le virus sous sa forme de provirus intégré au génome de l'hôte, sert de matrice pour la synthèse des ARN messagers et de l'ARN génomique viral. Il y a ensuite synthèse des protéines virales sous forme de précurseurs polypeptidiques qui sont coupés par une protéase virale pour générer les différentes protéines virales. Après l'assemblage de ces protéines et l'encapsidation de l'ARN génomique, le virus bourgeonne à l'extérieur de la cellule infectée (CD4), ce qui entraîne en général la mort cellulaire. Un faible pourcentage des cellules infectées avec le provirus intégré, ne complète pas le cycle de réplication (en général des lymphocytes CD4 qui sont dits infectés d'une façon latente), ces cellules infectées constituent un réservoir.1 Les cellules infectées du réservoir peuvent être réactivées par exemple lors d'infections virales, bactériennes ou de toute autre stimulation lymphocytaire. Ce réservoir constitue les archives des différents virus «mutés» lors de la transcription inverse. On a d'ailleurs retrouvé des virus archivés, correspondant au virus présent au début de l'infection, plusieurs années après celle-ci. Il ressort de ces éléments que toutes les mutations associées à la résistance aux antirétroviraux sont présentes, à faible concentration avant même l'initiation du traitement, soit sous forme de virus circulants, soit sous forme d'archives biologiques dans les cellules CD4 infectées d'une façon latente.
Est-ce à dire que tous les antirétroviraux sont égaux et qu'une monothérapie induit systématiquement une résistance en quelques semaines ? Il faut nuancer cette assertion en fonction de l'activité des antirétroviraux et de la barrière génétique (correspondant, grosso modo, au nombre de mutations nécessaires sur sa cible pour que l'antirétroviral actif perde son efficacité). Cette barrière génétique varie pour les différents antirétroviraux. En effet, une seule mutation induit une résistance totale à certains antirétroviraux tels que la lamivudine (mutation M184V : nomenclature : à gauche l'abréviation pour l'acide aminé sauvage, au milieu la position de l'acide aminé sur la protéine ciblée et à droite l'abréviation pour l'acide aminé muté) et l'efavirenz (K103N) alors que pour d'autres antirétroviraux la combinaison de plusieurs mutations est nécessaire. Ceci est le cas en général pour les inhibiteurs des protéases.2 Si toutes les «mutations» associées aux antirétroviraux sont présentes avant l'initiation du traitement, il n'en est pas de même pour une combinaison de plusieurs mutations. L'indinavir en monothérapie sera donc, par exemple, beaucoup plus longtemps actif que la lamivudine car une résistance à l'indinavir requiert la présence de plus de deux mutations sur sa cible, la protéase virale et la probabilité d'avoir plusieurs mutations préexistantes associées à la résistance à l'indinavir est extrêmement faible. L'émergence de protéase avec trois mutations associées à la résistance à l'indinavir implique donc un processus de sélection sous traitement suboptimal, par exemple indinavir en monothérapie.
Il ressort de ces éléments que la meilleure façon d'assurer le succès du traitement à long terme et d'éviter l'émergence de virus mutants est d'associer plusieurs antirétroviraux avec des profils de résistance différents pour augmenter la barrière génétique. Par ailleurs, il faut idéalement assurer des concentrations de médicaments optimales dans tous les différents compartiments biologiques d'accès pharmacocinétique difficile pour éviter la sélection de virus résistants, par exemple dans le système nerveux central ou dans les organes génitaux masculins.
Lors de la recherche de nouveaux antirétroviraux, on cultive des cellules infectées en présence des substances potentiellement actives pour déterminer leur concentration inhibitrice. On procède par la suite à des cultures en présence de concentrations suboptimales des principes actifs puis on séquence les cibles virales sur les virus sélectionnés. Ce type d'expérience a permis d'établir que tous les antirétroviraux actuellement disponibles induisent des mutations sur leur cible, ceci après un nombre de cycles de réplication qui varie en fonction de leur efficacité et de leur barrière génétique. Il permet également de prédire dans une large mesure une éventuelle résistance croisée avec d'autres antirétroviraux et le profil attendu de résistance chez les personnes avec échec virologique bénéficiant d'un traitement comprenant le nouveau médicament.
L'idéal serait, comme en bactériologie, de cultiver le(les) virus du patient en présence de concentrations croissantes de la ou des substances actives pour déterminer la concentration de chaque drogue assurant une inhibition de 50 ou 90% de la multiplication du virus. Cette méthode a été utilisée par le passé en employant des cellules lymphomonocytaires humaines comme source à infecter par les virus contenus dans le plasma des malades. Cette méthode est cependant extrêmement longue car les virus demandent souvent une adaptation au milieu de culture et il faut ensuite procéder à leur titration préalablement aux essais en présence de doses croissantes de la drogue à tester. Pratiquement, cette approche a été abandonnée pour les applications cliniques. Une seconde approche consiste à amplifier par PCR le segment du virus qui est la cible des antirétroviraux (essentiellement les gènes de la transcriptase inverse et de la protéase mais aussi plus récemment le gène de l'enveloppe (T20)) et de les introduire dans un vecteur viral dont les conditions de culture sont standardisées (recombinant virus assay). Il s'agit en fait d'introduire dans le génome d'un virus prototype des gènes cibles des antiviraux correspondant à ceux du malade. On peut ensuite cultiver ce vecteur recombinant en présence de concentrations croissantes de différents antirétroviraux en utilisant des lignées cellulaires permissives. Par ailleurs, le vecteur contenant un signal spécifique, on peut mesurer son degré de multiplication après un temps donné et à partir de ces éléments déterminer la dose inhibitrice des antirétroviraux testés. Ces tests sont donc très proches des tests phénotypiques standards à l'exception du fait qu'ils ne comprennent pas l'ensemble du génome viral et ne peuvent pas par ce fait mesurer des interactions secondaires, par exemple une modification de l'activité des protéases mutées dans leur capacité de scinder les polyprotéines virales. Ces tests phénotypiques sont cependant indispensables pour déterminer l'impact d'une mutation donnée identifiée par le séquençage des gènes ciblés lors du développement de nouveaux antirétroviraux. Une utilisation potentiellement prometteuse de ces tests dans le domaine de la recherche clinique est l'évaluation de la capacité réplicative des virus porteurs de mutations multiples. Une diminution de la réplication des virus avec mutations multiples a d'ailleurs été suspectée/objectivée cliniquement puisque l'arrêt de tout traitement chez les malades avec des virus porteurs de mutations multiples est suivi d'une réapparition du virus sauvage et d'une augmentation concomitante de la virémie et d'une chute des CD4.
Une deuxième méthode pour déterminer la résistance aux antirétroviraux est basée sur le séquençage des gènes qui sont la cible des antirétroviraux ; on parle alors de tests génotypiques. Comme mentionné dans l'introduction, il y a une grande variabilité de séquences pour les génomes VIH et toutes les mutations associées à la résistance sont présentes sur quelques rares génomes viraux. Pour la névirapine par exemple, moins de 1/10 000 génomes des individus non exposés à ce médicament contient la mutation Y181I associée à la résistance à ce médicament. Quand on exécute un séquençage pour des indications cliniques, ces mutations ne sont pas mises en évidence car on procède à un séquençage de population où une mutation doit être représentée à plus de 10% pour être détectée. La même limitation s'applique d'ailleurs aux tests phénotypiques qui, eux aussi, «testent» la population dominante.
L'interprétation des tests de résistance génotypiques est basée sur des algorithmes qui tiennent compte au mieux de la complexité des séquences virales. Au cours des années, ces algorithmes se sont raffinés et l'on demande aujourd'hui une validation clinique.
Au départ, on a tenu compte des mutations induites par des doses suboptimales d'antirétroviraux dans des cultures cellulaires (mutation T215Y, L210W, D67N, K70L, M41L pour l'AZT, M184V pour la lamivudine, etc.). On a aussi constaté que ces mutations apparaissent au moment de l'échec virologique chez des malades traités par ces drogues.3 Certaines (184V), mais pas toutes, se traduisent aussi par une résistance dans les tests génotypiques. On tend actuellement à valider systématiquement les tests de résistance phénotypiques sur la base d'études cliniques avec les nouveaux antirétroviraux ; ce fut le cas, en particulier, pour l'abacavir et le ténofovir.4,5 On peut, de ce fait, définir sur une base statistique, des profils de mutations associées à une résistance à ces agents.
D'autres raffinements des tests génotypiques sont basés sur des observations cliniques et biologiques : la mise en évidence des mutations associées à la résistance au d4T est basée sur l'observation clinique de patients jamais traités par l'AZT mais seulement par d4T, plus en général 3TC, qui ont développé les mutations spécifiques (appelées TAM, thymidine analog mutations) originellement décrites lors d'une résistance à l'AZT.6 On considère donc aujourd'hui, que les mutations associées à la résistance à l'AZT induisent également une résistance au d4T, ce qui a partiellement été validé cliniquement mais ne peut que difficilement être validé par les tests phénotypiques vu leur trop grande variabilité pour l'évaluation d'activités antivirales faibles.
Un autre élément de complexité découle du fait qu'un certain nombre de mutations sont des marqueurs d'une (de) mutation(s) associée(s) à la résistance qui ont «reversés» vers une forme intermédiaire qui ne correspond donc ni à la forme sauvage ni à la forme mutée. Cette réversion se produit après l'arrêt du ou des antirétroviraux qui exerçaient une pression sélective. Ainsi, la forme sauvage pour la position 215 de la transcriptase inverse comprend une thréonine (T) qui, lors d'une résistance à l'AZT, mute en tyrosine (Y) ou phénylalanine (F). Si on arrête l'AZT après sélection de la mutation 215Y, on assiste souvent à une réversion soit vers la cystéine (C), l'acide aspartique (D) ou la sérine (S). Ces formes intermédiaires vers un retour à la forme sauvage ne sont pas mises en évidence par les tests phénotypiques car elles ne sont pas associées à une résistance, mais elles sont un marqueur pour l'existence de formes mutantes dans le réservoir ou sont transmises lors de l'infection aiguë. Elles sont donc actuellement considérées, dans plusieurs algorithmes d'interprétation des tests génotypiques, comme associées à une résistance
à l'AZT. Cet élément a été partiellement validé par des observations cliniques où l'on a observé un échappement au traitement pour des malades porteurs de virus avec ces formes intermédiaires.
Un aspect qui intéresse actuellement beaucoup les virologistes est l'hypersensibilité à un médicament en présence d'un virus muté, suite au traitement par un autre médicament. L'exemple le plus récent concerne le ténofovir en présence de la mutation M184V, induite par la lamivudine.
Finalement, il a été démontré que les profils de résistance peuvent être différents pour les virus de sous-type B et non B, comme par exemple le nelfinavir. Pour cette antiprotéase, un échec virologique se traduit, chez la grande majorité des malades avec sous-type B traités par le nelfinavir en première intention, par une mutation D30N alors que les malades avec un sous-type C et G développent une mutation L90M.
Actuellement, il est généralement recommandé d'utiliser, en pratique clinique, des tests de résistance génotypiques, car ils sont plus rapides et moins coûteux que les tests phénotypiques. Au moins trois d'entre eux ont une large diffusion ; Stanford, ANRS et Virco. Les deux premiers sont mis à disposition gratuitement, en ce qui concerne le système d'interprétation, alors que le troisième est commercialisé. Il existe de nombreux autres tests en développement ou disponibles, et les données de la littérature indiquent un haut degré de convergence entre les interprétations données par ces différents systèmes d'interprétation. Les différences sont essentiellement dues au fait que les auteurs qui mettent en avant leur «meilleur» système, utilisent un programme d'interprétation immédiatement actualisé et le comparent avec des versions non actualisées des concurrents. C'est la vie ! Une autre différence réside dans la représentation graphique des résultats, la couleur, etc. L'essentiel, en fait, c'est d'utiliser un système d'interprétation régulièrement mis à jour et intégrant une interprétation pour les nouveaux antirétroviraux. Dans ce contexte, les algorithmes actuels ne tiennent que partiellement compte des antiprotéases boostées par des minidoses de ritonavir, à l'exception du lopinavir.
Tous les résultats transmis aux cliniciens en Suisse comprennent une interprétation. Quelques compléments pratiques : beaucoup de mutations associées à la résistance «réversent» en l'absence d'une pression sélective induite par le(s) médicament(s) en cause (pas toujours vrai car, par exemple, les mutations induites par les PI sont en général maintenues après changement de PI). La mutation qui réverse le plus rapidement en l'absence de pression sélective est la mutation associée à la résistance à la lamivudine M184V : on assiste à la réapparition de la forme sauvage déjà après un mois d'arrêt de la lamivudine. Après une interruption thérapeutique de plusieurs mois, on assiste, chez la grande majorité des malades, au remplacement du (des) virus muté(s) par le virus sauvage7 provenant du réservoir des cellules CD4 infectées d'une façon latente (exemple figure 1A, figure 1B autre exemple de résistance se développant sous traitement). Pour les malades avec interruption thérapeutique de plus de quinze jours, il faudra donc demander un test de résistance sur un plasma prélevé avant l'interruption thérapeutique, si disponible. En conclusion, il faut tenir compte de l'historique du traitement, demander si possible un test de résistance sous traitement pour les malades traités et indiquer au laboratoire les médicaments actuellement prescrits (actuellement indispensable pour obtenir le remboursement du test par les caisses-maladie).
Finalement, aussi bien les tests phénotypiques que génotypiques ne peuvent être pratiqués que sur des échantillons avec une virémie plasmatique de 1000 copies/ml de plasma : le prélèvement consiste en un tube de sang EDTA ou citralé de 5 à 10 ml envoyé le jour du prélèvement au laboratoire. On peut cependant, dans des cas exceptionnels, pratiquer des séquences sur le provirus, c'est-à-dire sur de l'ADN viral purifié à partir des lymphomonocytes.
Oui, partiellement. Le problème est, en fait, complexe et même les études contrôlées sont influencées par des facteurs inattendus. Ainsi, si l'on considère une randomisation de malades avec ou sans génotype communiqué au médecin traitant, celui-ci, en l'absence de données de résistance, tendra naturellement à donner, en cas d'échec virologique, des médicaments auxquels son patient n'a pas été préalablement exposé et de plus, dans le doute, donnera les médicaments les plus efficaces. C'est seulement à long terme, dans ce dernier cas, que l'on observera un épuisement des possibilités thérapeutiques, alors que l'évaluation des études comparatives se fait généralement à douze et éventuellement vingt-quatre semaines.
Plusieurs études contrôlées ont montré qu'il y avait un avantage en ce qui concerne la diminution de la virémie suite à un changement de traitement guidé par les résultats de tests génotypiques de résistance en comparaison avec une adaptation du traitement selon les bonnes pratiques cliniques. Des études conduites d'une façon similaire pour les tests phénotypiques ont donné des résultats moins conclusifs. Dans la plupart des études, le recul est cependant de moins d'un an.8,9,10
Ces indications ont récemment été actualisées par un panel d'experts américains et européens et sont similaires à celles rédigées, il y a plus de deux ans, par un panel d'experts européens.11,12 Elles sont valables pour les pays comme la Suisse où la majorité des antirétroviraux ont été largement disponibles depuis de nombreuses années.
En bref, l'utilisation des tests de résistance génotypiques ou phénotypiques est recommandée :
1. Pour les malades avec infection aiguë. La transmission de virus résistants en Suisse est d'environ 10% et est restée stable ces cinq dernières années.13 Si l'on opte pour ne pas traiter le malade, on peut se contenter de stocker du plasma et de procéder plus tard à un test de résistance. Si l'on opte pour un traitement immédiat, il est recommandé de commencer le traitement sans attendre le résultat des tests de résistance et d'adapter le traitement par la suite si nécessaire.
2. Avant l'initiation d'un premier traitement, car le premier traitement c'est la meilleure chance de succès. On peut cependant procéder à une évaluation coût/bénéfice. Par exemple, une infection acquise en Afrique a beaucoup moins de chance d'être due à un virus résistant. De même, une infection très ancienne (plus de dix ans) acquise en Suisse a également une faible chance d'être due à un virus résistant. Au contraire, une infection acquise vraisemblablement il y a une ou quelques années, d'un partenaire depuis plusieurs années sous antirétroviraux, est probablement due à un virus résistant.
3. Lors d'une réponse suboptimale au traitement antirétroviral et lors du premier ou de multiples échecs virologiques.
4. Pour les femmes enceintes virémiques et leurs bébés, par la suite, s'ils sont infectés.