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La transgénèse est l’addition d’un ou de plusieurs gènes étrangers dans une cellule. Le nouveau gène introduit est appelé transgène qui peut, s’il est exprimé, conférer de nouvelles caractéristiques à la cellule. La transformation de bactéries fut décrite la première fois par Griffith en 1928, puis plus tard par Avery qui démontra que l'ADN était le « principe transformant » capable de rendre des souches de Streptococcus pneumoniae virulentes.
Thèmes: Trangénèse, plasmides, bioluminescence, sélection de bactéries, résistances aux antibiotiques, ß-lactamase, formation de colonies sur boîtes de pétri.
Introduction: Dans l’expérience proposée, nous allons transformer Escherichia coli. Cette bactérie est rendue compétente (capacité à incorporer de l’ADN) par un traitement au CaCl2. Les bactéries compétentes sont d’abord gardées sur glace ce qui fige les membranes. L’ADN ajouté se fixe sur les bactéries. Un passage à 42°C restaure la fluidité des membranes permettant l’incorporation de l’ADN. Les bactéries sont ensuite cultivées une trentaine de minutes afin de permettre l’expression du gène de résistance nouvellement incorporé. Enfin ces bactéries sont étalées sur un milieu sélectif (permettant la croissance des cellules qui ont incorporé l’ADN). L’ADN utilisé est un plasmide. Il s’agit d’éléments extra-chromosomiques circulaires capables de se répliquer (de 1 à 100 copies) dans la bactérie et d’être transmis dans les cellules filles lors de divisions cellulaires. Dans la nature, les plasmides peuvent être échangés entre différentes espèces de bactéries. Ces plasmides peuvent disséminer ainsi de nouvelles caractéristiques tels que des résistances aux antibiotiques, à des métaux-lourds, ou encore de rendre les bactéries virulentes.
Le plasmide lux117: Pour cette expérience nous allons utiliser le plasmide lux117. Celui-ci contient une origine de réplication (ori), un gène de résistance à l’antibiotique ampicilline (ampR) ainsi que l’opéron lux, (un opéron est une unité de transcription) provenant de la bactérie Vibrio harveyi. Cet opéron contient 5 gènes, luxA à luxE. Ils codent pour les protéines impliquées dans la réaction de bioluminescence. Le gène ampR code pour une enzyme (la ß-lactamase) capable d’inactiver les antibiotiques de la famille des pénicillines en clivant une liaison du noyau ß-lactame. Seules les bactéries possédant le gène ampR sont capables de croître sur un milieu contenant de l’ampicilline (antibiotique de la famille des pénicillines).
La bioluminescence: La luciférase bactérienne est une enzyme contenant 2 sous-unités (α et ß) codées respectivement par les gènes luxA et luxB. Les gènes luxC, luxD et luxE codent pour des protéines impliquées dans la conversion d’acides gras en une longue chaîne d’aldéhyde nécessaire à la réaction de luminescence.
La bioluminescence est observée dans des milliers d’espèces d’organismes vivants tels que bactéries, protozoaires, champignons, annélides, cnidaires, mollusques, insectes et poissons. Le rôle de la bioluminescence varie suivant ces organismes. On note quatre fonctions principales : 1) l’éclairage, 2) l’appât, 3) la protection et 4) la communication. Historiquement, la bioluminescence est un phénomène connu depuis l’antiquité. Aristote (348-322 av JC) parlait déjà de lumière émise par des poissons morts et des moisissures. A partir de 1600 diverses recherches permirent d’établir que cette réaction mettait en jeu une enzyme (la luciférase), un substrat oxydable (la luciférine) ainsi que l’oxygène. Les enzymes et substrats utilisés pour les réactions de bioluminescence sont extrêmement variés d’un organisme à l’autre. Chez les bactéries, la luciférase catalyse l’oxydation de la riboflavine mononucléotide réduite (FMNH2) et une longue chaîne d’aldéhyde (R-CHO), générant une flavine oxydée (FMN), un acide gras (R-COOH), de l’eau (H2O) et de la lumière (490-500 nm). La réaction est la suivante :
L'EXPERIENCE: (cliquer pour voir le schéma)
1) préparation des cellules compétentes: Le protocole présenté ici est simplifié mais permet néanmoins d’obtenir une efficacité de transformation suffisante pour l’expérience proposée. Il est important que les élèves puissent se rendre compte de toutes les étapes nécessaires au déroulement de l’expérience. Si toutefois, pour des raisons techniques, il ne vous est pas possible de préparer des cellules compétentes nous pouvons vous en fournir.
2) la transformation:
3) Résultats:
Voici un exemple de ce que l'on peut observer:

Pour ceux qui désirent continuer
Comme décrit ci-dessus, les bactéries ayant intégré le plasmide non seulement resitantes à l'ampicilline mais elle sont également capable de produire de la bioluminescence. Ces deux caracteristiques nous permettent de vérifier que le plasmide a bien été intégré. Un autre moyen de le confirmer est de mettre en évidence, par PCR, un gène qui est présent uniquement sur le plasmide.
Nous allons donc amplifier ici le gène de résistance à l'ampicilline (environ 860 pb), en effectuant la PCR directement sur des colonies bactériennes.
|1 réaction||22 réactions|
|2xTaq Ready Mix||12.50 µl||275 µl|
|Primer mix||5.00 µl||110 µl|
|DMSO||1.25 µl||27.50 µl|
|H2O||6.25 µl||137.50 µl|

94°C, 5 minutes
94°C, 30 secondes
72°C, 5 minutes

30 cycles
1er puit: 5 µl de marqueur
2ème puit et suivants: 20 µl de vos échantillons
Avant dernier puit: le contôle négatif
Dernier puit: le contrôle positif
Cette expérience a été initialement mise en place par C. Béguin et M. Goldschmidt-Clermont. La partie concernant la PCR a été mise en place en collaboration avec Mme Starkenmann et M. Chakhparonian, enseignants au Collège Madame De Staël.
Matériel fourni:
Matériel non fourni:
L’Université de Genève décline toutes responsabilités en cas de dommages survenus durant les expériences.