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L'immunité est évaluée par des tests de laboratoire qui, la plupart du temps, donneront une réponse peu spécifique. Par ailleurs, les tests qui permettent de quantifier la réponse immunitaire sont pratiquement absents de la majorité des laboratoires de routine. Issues de la recherche, de nouvelles approches et de nouvelles technologies sont en train de révolutionner les méthodes de mesure de l'immunité. Certaines sont déjà utilisées en routine, d'autres sont encore en développement mais devraient rejoindre la batterie de tests à disposition en routine, afin d'affiner la mesure de l'immunité sur le plan spécifique et fonctionnel. Cette revue fait le point sur ces nouvelles approches.
Les déficits immunitaires sont généralement suspectés puis détectés suite à une augmentation de la fréquence des épisodes infectieux au-delà de ce qui est considéré comme normal. Chez les nouveau-nés et les petits enfants, des infections à répétition orientent le médecin avant tout vers un déficit immunitaire congénital. Chez l'adulte, l'immunodéficience acquise est généralement associée à l'infection VIH mais de très nombreux patients souffrent d'immunodéficience acquise «iatrogène» liée à un traitement immunosuppresseur (transplantation, maladie auto-immune) ou anticancéreux, à une maladie chronique (dialyse) ou tout simplement due au grand âge. Les tests de laboratoire «classiques» permettent d'évaluer la fonction du système immunitaire de manière globale mais aussi de différencier l'immunité cellulaire et humorale. Cette évaluation de routine est suffisante dans de nombreux cas mais montre aussi certaines limites en particulier au niveau fonctionnel. Depuis quelques années, de nouvelles approches technologiques ont modifié, voire révolutionné l'analyse de la fonction du système immunitaire. Issus de la recherche notamment dans le domaine de la transplantation, ces tests deviennent ou pourraient devenir un appui très intéressant dans certaines situations cliniques et devraient progressivement devenir des examens clés dans l'évaluation précise et fonctionnelle du système immunitaire.
L'immunité est classiquement séparée en immunité innée et immunité acquise, elle-même divisée en immunité humorale et cellulaire. Sur le plan biologique, les nombreux progrès effectués par l'immunologie fondamentale ont bien souligné que la distinction entre immunité innée et acquise pouvait être arbitraire et qu'une meilleure compréhension de certaines populations comme les cellules dendritiques ou les cellules natural killer (NK) démontrait les connexions et l'interdépendance de ces différents partenaires. De même, les lymphocytes T, qui sont les médiateurs de l'immunité cellulaire acquise, jouent un rôle très important pour la production des anticorps spécifiques synthétisés par les lymphocytes B.
La formule sanguine complète avec répartition, l'analyse du frottis sanguin, de même que la détermination des sous-populations lymphocytaires avec des marqueurs spécifiques par cytométrie de flux restent des tests de choix pour débuter l'évaluation du système immunitaire. L'analyse des immunoglobulines sériques est également indispensable dans le bilan initial d'une immunodéficience. Ce bilan initial pourra être complété par la stimulation in vitro des lymphocytes T avec des antigènes plus ou moins spécifiques, tests proposés dans certains laboratoires plus spécialisés. La fonction des neutrophiles est également évaluée si l'histoire clinique du patient laisse suspecter un tel déficit. Des tests spécifiques comme la «charge respiratoire» des neutrophiles (test au NBT) ou le chimiotactisme seront alors proposés par les laboratoires spécialisés.
Dans cette revue, nous allons revenir sur certains tests qui ne sont effectués de routine que par quelques laboratoires mais qui peuvent donner des informations très utiles sur la mesure de la fonction du système immunitaire dans des situations bien précises. Nous discuterons plus particulièrement des nouvelles approches en cours, notamment avec la cytométrie de flux (FACS) pour l'analyse du phénotype des cellules du système immun, la méthode luminex (Luminex ®), pour la détection d'anticorps et la PCR «en temps réel» ou le microarray pour la détection de gènes d'intérêts pour la fonction immunitaire (tableau 1).
La cytométrie de flux est une des analyses clés à effectuer lors de l'évaluation initiale de tout patient présentant une immunodéficience innée ou acquise. Les analyses standards en cytométrie de flux étant dans la majorité des cas anormales chez les patients souffrant d'une immunodéficience congénitale ou acquise comme le VIH, elle s'avère également très utile pour le suivi de patients traités par certains anticorps monoclonaux utilisés en oncologie, immunologie clinique ou en transplantation comme les anti-CD20 (rituximab) ou les antithymoglobulines (ATG). La cytométrie de flux permet l'analyse des sous-types de lymphocytes : lymphocytes T, CD4 et CD8, lymphocytes B et cellules NK. Des anticorps monoclonaux marqués avec différents fluorochromes vont se lier à la surface des cellules du sang périphérique exprimant un marqueur spécifique des sous-populations lymphocytaires. Le cytomètre de flux détecte la fluorescence émise par ces anticorps et détermine le nombre de cellules ayant lié un anticorps. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules analysées mais également en nombre absolu de cellules positives. En plus des sous-types lymphocytaires décrits ci-dessus, la cytométrie de flux permet également de préciser le phénotype de ces cellules lymphocytaires, c'est-à-dire, si ces lymphocytes sont des cellules naïves ou mémoires/activées. Par exemple, lors d'une immunodéficience sévère combinée (CIVD), l'analyse des populations de lymphocytes B naïfs (CD27 -, IgM +, IgD +), mémoires (CD27 +, IgM +, IgD -) et immatures (CD27 +, IgM +, IgD +) permet de mieux déterminer dans quel groupe de CIVD se trouvent les patients selon les nouvelles classifications.1 De même, la communauté médicale et scientifique porte de plus en plus d'intérêt à l'analyse et la détermination de lymphocytes T régulateurs, cellules qui ont une fonction inhibitrice sur l'activité des autres lymphocytes, et dont la présence ou l'absence pourrait jouer un rôle dans plusieurs pathologies auto-immunes et dans les mécanismes de tolérance en transplantation. Ces lymphocytes T régulateurs ont un phénotype CD4 + CD25 + ce qui peut être aisément déterminé par cytométrie de flux. La multiplication des fluorochromes permet ainsi l'analyse de multiples paramètres par échantillon.
Les analyses immunologiques comportent aussi l'évaluation et la quantification d'agents pro- et/ou anti-inflammatoires, tels que les cytokines qui jouent un rôle prépondérant dans les maladies auto-immunes, les processus inflammatoires et le rejet aigu ou chronique en transplantation. La mesure ex vivo d'une réponse anti-inflammatoire ou pro-inflammatoire permet de comprendre la réponse immune in vivo attestée par de nombreuses publications sur ce sujet. De ce fait, la mesure par ELISA du taux de cytokines circulantes dans le sang ou autres liquides biologiques est pratiquée de routine. Néanmoins, grâce aux progrès de la recherche, d'autres techniques de mesure des cytokines sont en cours de développement pour la routine.
L'ELISpot est une méthode basée sur la détection d'une cytokine produite par des cellules mononucléées du sang périphérique et cultivées durant 48 h avec un antigène ou un mitogène. La cytokine sécrétée est alors révélée par des anticorps monoclonaux anticytokines qui vont créer des spots autour des cellules sécrétant une cytokine donnée. Dans des laboratoires spécialisés, cette technique est utilisée pour déterminer une réponse antigénique spécifique dans le cadre du développement de vaccins, ou dans l'auto-immunité.2 En transplantation,3 cette technique a été utilisée pour déterminer la présence de lymphocytes T spécifiques aux donneurs.
La détection des cytokines au niveau intracellulaire est largement utilisée en recherche pour déterminer une réponse immune. Des cellules immunes au repos ou stimulées sont perméabilisées puis fixées et mises en suspension avec des anticorps anticytokines. Ceux-ci pénètrent la cellule et permettent la détection et la quantification de cytokines produites dans la cellule. L'avantage de cette technique est que l'on peut faire des analyses multiparamétriques permettant soit de déterminer la coexpression de plusieurs cytokines dans une même cellule, production de l'IFN-g et/ou de l'IL-4 par exemple, soit de coupler la détection de cytokines intracellulaires à un marquage de surface, afin de déterminer si la cellule produisant de l'IFN-g est un lymphocyte T ou une cellule NK par exemple.4
Le capture assay utilise aussi la détection de cytokines par cytométrie de flux associant des anticorps anticytokines et antimarqueurs de surface cellulaire couplés à des fluorochromes permettant l'analyse de cellules sécrétant des cytokines. Cette technique est très sensible et permet également l'analyse du phénotype des cellules produisant l'une ou l'autre cytokine. De ce fait, la détection d'un lymphocyte CD8 + spécifique activée par antigène et produisant une cytokine comme l'IFN-g devient accessible (figure 1).5
Cette technologie a révolutionné la visualisation et la quantification de la réponse des cellules T antigènes spécifiques. Quatre molécules HLA de classe I (ou de classe II) purifiées sont biotinylées et peuvent ainsi se fixer à une molécule de streptavidine qui est couplée à un fluorochrome. Cette construction forme un tétramère-HLA. Les molécules HLA fixent un peptide (viral par exemple) qui sont reconnues en fonction de leur polymorphisme (figure 2A).
Les tétramères-HLA avec le peptide sont reconnus par des lymphocytes T CD8 + ou CD4 + par l'intermédiaire de leur récepteur T spécifique (figure 2B).6 La figure 2C montre un exemple de détection de lymphocytes T CD8 + dirigés spécifiquement contre un peptide (un peptide du virus CMV en l'occurrence) chez un patient qui a présenté une infection à cytomégalovirus par cytométrie de flux. Cette approche est utilisée pour détecter la présence de lymphocytes CD8 + pour des nombreux virus comme le VIH 7 ou le virus des hépatites B et C.8 Les tétramères peuvent aussi être utilisés pour reconnaître des peptides non viraux comme les antigènes mineurs en transplantation.9 Actuellement, on trouve essentiellement des tétramères-HLA de classe I, reconnus par les lymphocytes CD8 + mais la technologie se développe également avec les tétramères HLA de classe II permettant de détecter des lymphocytes T CD4 + spécifiques.10
On ne saurait clore ce chapitre sur l'immunité cellulaire sans mentionner les tests cellulaires utilisés plus spécifiquement en transplantation de cellules souches hématopoïétiques et en transplantation d'organes. Dans ce domaine, le monitoring de la réponse immunitaire anti-donneur par les cellules T a débouché sur la mise au point de tests in vitro qui dérivent de concepts clés que sont le complexe majeur d'histocompatibilité (HLA) et les différentes voies de reconnaissances des antigènes allogéniques par le système immunitaire. La description de ces concepts sort du cadre de cette revue, toutefois il est important de se rappeler que la mise en présence de cellules sanguines mononucléées (lymphocytes/monocytes) provenant de deux individus de la même espèce mais génétiquement différents induit une activation de ces cellules qui peut être mesurée par différents read out comme la cytotoxicité,11 la prolifération cellulaire ou la production de cytokines.12 Ces différents tests connus sous la dénomination de réaction lymphocytaire mixte (MLC) ou test des précurseurs lymphocytaires T cytotoxiques (CTLp) ont joué un rôle clé dans la sélection de donneur compatible après greffe de cellules souches hématopoïétiques, voire dans le monitoring immunologique des patients après transplantation.11,12 Le développement de la méthode dite de la «dilution limite» a permis d'estimer de manière précise la fréquence de cellules T antigène-spécifique participant à la réponse immunitaire. Ces approches sont toutefois laborieuses, peu automatisables, très chronophages et ne peuvent pas être introduites dans tous les laboratoires. Elles restent l'apanage de laboratoires spécialisés où l'expertise dans l'interprétation est indispensable mais elles donnent toujours des informations très intéressantes, pouvant être utiles dans la décision d'une réduction de l'immunosuppression après transplantation d'organe par exemple.13
La mesure des différents isotypes d'immunoglobulines IgG, IgA et IgM, voire IgE, est toujours très utile en cas de suspicion de déficit immunitaire. Le taux des sous-classes d'IgG bien que controversé doit également être considéré. La mesure du taux d'anticorps spécifiques reste le standard pour déterminer la réponse humorale suite à une infection, à une vaccination ou pour déterminer les auto-anticorps dans les maladies auto-immunes. Les différentes méthodes utilisées pour mesurer le taux d'IgG incluent la néphélométrie, la turbidimétrie, l'immunodiffusion radiale, l'immunofluorescence, le radio-immunoassay (encore utilisé dans quelques situations) et surtout l'ELISA qui est la technique la plus utilisée pour la détermination des anticorps spécifiques.
Dans le domaine plus spécifique de la transplantation d'organe (en particulier de rein), la présence d'allo-anticorps dirigés contre les antigènes HLA est un problème clinique majeur. L'immunisation contre des antigènes anti-HLA se produit dans trois situations :
La présence d'anticorps anti-HLA peut conduire à un rejet immédiat du greffon (rejet hyperaigu) ou à un rejet humoral qui se caractérise par les dépôts d'anticorps dans les parois vasculaires du greffon.10 Il convient donc d'éviter à tout prix une transplantation avec un greffon qui exprime des antigènes HLA contre lesquels sont dirigés des anticorps anti-HLA présents dans le sérum du receveur.17,18 En raison de la grande diversité du système HLA (polymorphisme), l'optimisation d'une technologie permettant de mesurer ces spécificités est très complexe. La technologie Luminex ® (cf. ci-dessous) a révolutionné ce domaine, en permettant de fixer un grand nombre d'antigènes HLA sur des microsphères et d'analyser ainsi la spécificité des anticorps anti-HLA avec une grande précision et une grande sensibilité.
Parmi les nouvelles technologies, nous mentionnerons :
1. La méthode Luminex permet la détection d'auto-anticorps, d'allo-anticorps (anticorps anti-HLA par exemple), de cytokines dans le sérum, ou de séquences d'ADN.
2. La PCR en temps réel permet la détermination et la quantification de l'expression de gènes. Ceci peut se faire à partir des cellules du sang périphérique, de liquides biologiques ou de tissus.
3. Le microarray permet de déterminer l'expression de gènes. Ceci peut se faire à partir des cellules du sang périphérique, de liquides biologiques ou de tissus. A noter que la validation des résultats obtenus par microarray se fait par PCR en temps réel.
Cette technologie récente va très rapidement étendre son application à un grand nombre d'applications cliniques. Le concept de la technologie Luminex ® est basé sur une analyse multiple et simultanée, dans un même puit, de plusieurs paramètres (xMAP ® ou Multi-Analyte Profiling), et rendue possible par l'utilisation de microsphères en suspension, de fluorescences différentes. Cette technologie Luminex ® xMAP ® est basée sur un principe de dosage type ELISA, comportant des microbilles (5,6 microns) identifiées par un code de couleur spécifique à chaque paramètre. Le système optique étant constitué de deux lasers, le premier excite le mélange de colorants à l'intérieur des microbilles xMAP ® et le second excite le fluorochrome rapporteur adhérant à la surface des microbilles.
Sur ces microbilles, on peut aussi bien fixer des antigènes, des récepteurs, des peptides ou bien encore des oligonucléotides. Dans quelques laboratoires en Suisse romande, cette technologie Luminex ® est déjà utilisée de routine pour l'identification des génotypes HLA19 et vient d'être accréditée pour l'identification d'anticorps anti-HLA chez des patients immunisés, soit greffés, soit en liste d'attente pour un don d'organe.20 Son application pour déterminer la présence d'auto-anticorps ainsi que de cytokines est en cours d'évaluation.
Cette technique est très sensible et permet de détecter de faibles quantités d'ARN messager dans des cellules ou des tissus. C'est une approche également très utile pour évaluer l'expression d'un gène au cours du temps ou de comparer des collectifs de patients. En utilisant des molécules fluorogéniques, l'appareil de PCR détecte l'accumulation du produit de dégradation en cours de PCR. Plus l'ARN messager est exprimé en grande quantité, plus l'accumulation de produits fluorés est précoce et c'est finalement la mesure du produit accumulé qui permet une détermination quantitative du messager exprimé. Cette application est utilisée pour analyser l'expression d'un grand nombre d'ARN messagers de cytokines et protéines impliquées dans l'inflammation. Par exemple, l'expression augmentée de granzyme B et perforine, deux protéines produites par les lymphocytes T cytotoxiques, signe un rejet de greffe rénale.21 De même, une expression augmentée de l'ARN messager de FOXP3, facteur de transcription spécifiquement exprimé par les cellules T régulatrices CD4 + CD25 +, permet de prédire l'évolution favorable d'une greffe rénale ou d'un épisode de rejet.22
L'utilisation, en clinique, de gene chips pour analyser l'expression de gènes (jusqu'à des dizaines de milliers) est en plein développement. Cette technologie très sophistiquée est encore peu utilisée en routine en raison de l'interprétation laborieuse et difficile des résultats et du soin particulier qu'il faut appliquer à la préparation des échantillons d'ARN. L'espoir est de pouvoir caractériser, pour une maladie donnée, un ensemble de gènes qui seront sur- ou sous-exprimés et d'établir ainsi une cartographie permettant de classifier ces ensembles de gènes dans un but diagnostique et pronostique, voire éventuellement de déterminer leur sensibilité de réponse à un traitement.23 C'est en oncologie que cette technologie du microarray a été la plus étudiée et de nombreuses publications décrivent des profils de gènes impliqués dans tel ou tel processus cancérigène.24-26 De même en transplantation, cette technologie est en développement pour tenter de déterminer quels sont les gènes candidats exprimés plus spécifiquement lors d'un rejet de greffe rénale 27 comprenant entre autres la molécule CD20, exprimée à la surface des lymphocytes B, qui est fortement associée à un rejet humoral et qui semble aussi augmentée lors d'une résistance au traitement de corticoïdes.28,29 Cette nouvelle technologie est donc en plein développement dans divers domaines, et il ne serait pas surprenant de voir son application devenir un examen de routine diagnostique dans un proche avenir.
Les progrès gigantesques effectués par l'immunologie fondamentale ces dernières années n'ont pu se réaliser que grâce à l'optimisation de nouvelles technologies. Utilisées dans les laboratoires cliniques ces nouvelle approches s'avèrent être très informatives et peuvent être transférées dans les laboratoires effectuant des analyses de routine. Il s'agit d'un excellent exemple de transfert de technologie from bench to bedside. La demande pour une meilleure compréhension et estimation de l'état d'immunocompétence d'un patient est très grande. Elle peut même s'avérer indispensable pour permettre l'amélioration de la prise en charge de certaines pathologies. La transplantation d'organe est un très bon exemple de la nécessité de renforcer les tests de laboratoire pour la mesure de l'immunité. Sans traitement immunosuppresseur, l'organe est invariablement rejeté. Les traitements immunosuppresseurs conduisent inévitablement à une immunodéficience iatrogène amenant trop souvent à des complications infectieuses plus ou moins sévères. Une meilleure estimation de l'équilibre entre immunosuppression et immunodéficience est indispensable pour pouvoir faire des progrès significatifs dans le domaine, ces prochaines années. De nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur l'induction de la tolérance rendent nécessaires le développement et la validation de tests qui permettent de mieux évaluer le degré d'immunité.
Par ailleurs, compte tenu de la prévalence de pathologies comme les cancers, les maladies auto-immunes, les maladies chroniques ou tout simplement dues au grand âge, l'immunodéficience acquise, iatrogène ou non, pourrait bien devenir un des grands défis de la médecine de demain.
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