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Hauptbestandteil der Galle sind die Gallensäuren. Sie werden in den Leberzellen aus Cholesterin hergestellt. Die Gallensäuren haben einen speziellen Aufbau: Das eine Ende ist wasserliebend (hydrophil), das andere Ende ist fettliebend (lipophil). Mit dem lipophilen Ende binden sie sich an das Nahrungsfett, ihre hydrophilen Enden zeigen nach aussen. Dadurch bilden sich viele, kleine, wasserlösliche Fetttröpfchen, die eine Hülle aus Gallensäuren besitzen. Sie werden Mizellen genannt. Die Mizellen können sich feiner im Darm verteilen als grosse Fetttropfen.
Auch Bilirubin ist in der Galle enthalten (Abbaustoff von Erythrozyten). es verleigt dem Gallensaft seine grünliche Farbe, dem Stuhl seine braune Farbe (Sterkobilin) und dem Urin die gelbe Farbe (Urobilin).