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Vaskuläre Endothelzellen (EC) spielen mehrere wichtige physiologische Rollen, darunter die Kontrolle der Hämostase, die Regulierung des Leukozytentransports während Entzündungsreaktionen1 und die Modulation des Gefäßtonus und der Gefäßdurchlässigkeit. Es wurden neue Expressionskassetten entwickelt, um die Transgenexpression von Apolipoprotein AI in EC zu erhöhen. Methoden der Gentherapie, die darauf abzielen, sowohl lokale als auch systemische Erkrankungen2,3,4 zu behandeln, haben auf EC abzielen, weil ihnen Gentransfervektoren schnell intravenös oder intraarteriell injiziert werden. E-Zigaretten sind besonders attraktiv für eine qualitativ hochwertige Behandlung, die Atherosklerose vorbeugt oder behandelt, da sie Abschnitte von feurigen Zellen und Cholesterin (wesentliche Teile von atherosklerotischen Wunden) in die Venenwand leiten.
Statistiken
Unabhängig davon, ob sie durch EC oder andere Zellen übertragen werden, erfordert eine erfolgreiche atheroprotektive Qualitätsbehandlung Artikulationsbänder, die eine Transgenexpression auf unbestreitbarem Niveau erreichen7. Unter Verwendung einer Expressionskassette, die den unmittelbaren frühen Promotor des Cytomegalovirus (CMV) enthält, haben wir zuvor gezeigt, dass die EC-Überexpression von Apolipoprotein AI (APOAI) Atherosklerose bei hyperlipidämischen Kaninchen verlangsamen oder umkehren kann8,9,10. Die Expression des APOAI-Transgens nahm im Laufe der Zeit ab9,10 und diese Schutzwirkung war partiell. Wir dachten, dass die Verwendung von Expressionskassetten, die höhere und stabilere APOAI-Spiegel exprimieren, die ideal mit EC-Spezifität sind, um eine ektopische Transgenexpression zu verhindern, die EC-gerichtete atheroprotektive Gentherapie mit APOAI verbessern könnte. Die Verwendung einer stärkeren Expressionskassette kann es auch ermöglichen, niedrigere Vektordosen zu verwenden, um die Toxizität des Vektors zu verringern.
Ergebnisse
Ergebnisse Die APOAI-Expression wird durch Hinzufügen eines Scherspannungs-Response-Elements (SSRE) nicht erhöht. Wir testeten die Aktivität eines exogenen SSRE stromaufwärts unserer derzeit am stärksten exprimierenden APOAI-Kassette (4XETE-gApoAI-oPRE14,15; ergänzende Abbildung S1); zuerst mutierten wir eine 5′-GAGACC-3′-endogene SSRE-Sequenz, die wir im „nichtkodierenden“ Teil des murinen Edn1-Promotors entdeckten (die 4XETE-Sequenz enthält den Edn1-Promotor). Die Änderung dieser Anordnung zu 5′-ATGTCA-3′ (im 4XETE-gApoAI-oPRE-mSSRE-Vektor; ergänzende Abbildung unter statischen Bedingungen, S1) verursachte einen nahezu vollständigen Verlust der APOAI-Expression in Endothelzellen der Rinderaorta (BAEC) ( > 99 %, P = 0,002, Abb. 2B). Wir ließen diese Sequenz in Vektoren intakt, um zu sehen, ob das Hinzufügen einer auf Scherung ansprechenden Expression aus der 4XETE-gApoAI-oPRE-Kassette mit einem exogenen SSRE erhöht werden könnte, da es selbst unter statischen Bedingungen für die Aktivität des 4XETE-Promotors/Enhancers notwendig zu sein schien.
Testing in BAEC, HAEC, and HUVEC for CRM that is specific to the EC
Eine auf Bioinformatik basierende Methode, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie dabei hilft, hochexprimierende zelltypspezifische Expressionskassetten für Hepatozyten, Kardiomyozyten und Skelettmyozyten zu erzeugen16,17,18, wurde dann in BAEC, HAEC und HUVEC getestet. Bei diesem Verfahren werden kurze DNA-Sequenzen (cis-regulatorische Module) verwendet. Basierend auf ihrer Fähigkeit, Transkriptionsfaktoren in der Nähe der Promotoren von Genen zu binden, die in bestimmten Zelltypen stark exprimiert werden, wurden CRM als transkriptionell aktiv bestimmt (Abb. 3). Um EC-explizites CRM zu erkennen, haben wir ursprünglich 8 Record Factor Restricting Destinations (TFBS) unterschieden, die: (i) vorzugsweise mit vier relativ EC-spezifischen Genen assoziiert sind, die in den transkriptionell aktiven, evolutionär konservierten Regionen von HUVEC nahe beieinander stark exprimiert werden ( basierend auf den Histonen und offenem Chromatin bedeuten aktive Transkription.). Die Transkription hat Konsensus-Bindungsstellen in diesem TFBS. Wir fanden 11 DNA-Segmente, die Cluster dieses TFBS enthalten und daher EC-spezifisches CRM darstellen könnten, indem wir innerhalb von 2 kb von den Startstellen der Transkription von vier stark exprimierten, relativ EC-spezifischen Genen scannen. Die Promotoren oder Introns der vier relativ EC-spezifischen Gene enthalten diese 11 CRM (55–352 bp): Statistiken für THBS1 (CRM 8–10), CDH5 (CRM 1–4), EFEMP1 (CRM 5–7) und VWF (CRM 11) Wir verwendeten den Student’s t-Test, um zwei Gruppen zu vergleichen, wenn die Bedingungen Normalität und gleiche Varianz erfüllt waren. Wenn nicht, haben wir einen Mann-Whitney-Rangsummentest verwendet. Für Post-hoc-Korrekturen für Mehrfachvergleiche verwendeten wir die Dunn-Methode in Verbindung mit der Kruskal-Wallis-Einweg-ANOVA an Rängen. In Experimenten, die mehrere Gruppen verglichen (z. B. die Anzahl der Mef2c-Enhancer-Kopien, verschiedene CRM oder die vier genomischen Knock-in-Konstrukte). Für die statistischen Analysen wurde SigmaStat verwendet.
Fazit
Schlussfolgerung Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien und Verfahren von ARRIVE durchgeführt und vom Tierschutzamt der Universität von Washington genehmigt.