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Um die Auswirkungen aller Belastungen auf die Lebensgemeinschaften in einem Gewässer beurteilen zu können, wird der Gewässerzustand auch biologisch untersucht. Anhand der Zusammensetzung der Fauna und Flora können Rückschlüsse auf die Qualität des Gewässers gezogen werden, die allein mit chemischen Messungen nicht möglich sind. Neben der Wasserqualität kann mit biologischen Methoden auch der Einfluss der Gewässerstruktur, der Wassertemperatur oder etwa des Abflusses erfasst werden.
Der biologische Zustand der Sitter und ihrer Zuflüsse hat sich kontinuierlich verbessert. Heute kann er weitgehend als gut bezeichnet werden. Dies ist zum überwiegenden Teil den Sanierungen bei der Abwasserreinigung zu verdanken. Vereinzelt sind lokal oder auch saisonal noch Defizite feststellbar. Auffällig sind vielerorts auch Abfälle im Uferbereich und Stellen mit übermässig verfestigter (kolmatierter) Flusssohle.
Fische sind aufgrund ihrer Langlebigkeit am stärksten von den Beeinträchtigungen betroffen. Im Unterlauf war der fischökologische Zustand durchgehend unbefriedigend bis schlecht. Die Ursachen dafür liegen in erster Linie in den Beeinträchtigungen der Sitter durch die Wasserkraftnutzung (Restwasserstrecken, Schwall-Sunk, Geschiebemangel). Die erforderlichen Sanierungsmassnahmen für die einzelnen Kraftwerke sind bekannt und werden bis spätestens 2030 umgesetzt.
Verschmutzungen durch Einleitungen von gereinigtem Abwasser haben sich deutlich reduziert. Vereinzelt Probleme bereiten aber nach wie vor Abschwemmungen von Gülle sowie Belastungen aus Mischwassersystemen.