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Die spätgotische Pfeilerbasilika wurde 1471 bis 1490 unter Niklaus Birenvogt erbaut, der Werkmeister am Berner Münster war, und ersetzte die zähringische Liebfrauenkirche aus dem letzten Viertel des 12. Jahrhunderts.
Der Turm ist 72 m hoch. Der spätgotische Lettner, der 1512 von Heinrich Kummer vollendet wurde, gilt als der kostbarste Lettner der Schweiz. Er wurde 1867 als Orgelempore hinten ins Schiff versetzt und dabei um 180 Grad gedreht.
1725 bis 1761 wirkte als Pfarrer an der Stadtkirche Burgdorf Johann Rudolf Gruner. Er begründete die Solennität, ein heute noch gefeiertes Schulfest, zu dem traditionell ein Gottesdienst in der Stadtkirche gehört. Ein weiterer bekannter Pfarrer an der Stadtkirche war der Liederdichter Gottlieb Jakob Kuhn, der hier von 1824 bis 1849 tätig war.