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Coloration de coupes paraffine à l'hématoxyline
Le protocole ci dessous est appliqué à des coupes paraffine (8 μm d'épaisseur). L'exemple présenté concerne des coupes longitudinales réalisées dans l'extrémité d'une racine primaire de Zea mays fixée au Navashine. Il s'agit d'un fixateur composé de trioxyde de chrome 1%, formaldéhyde 37% et d'acide acétique glacial 100% dans les proportions suivantes: 70:28:7 ml.
Etapes du protocole de coloration : les coupes sont successivement
- Déparaffinées par passage dans 3 bains de xylol de 2 – 3 minutes chacun.
- Réhydratées par passages successifs de 3 min dans des bains d’alcool (2 bains d'alcool 100, 1 bain d'alcool 90, un bain
d'alcool 70) et ensuite dans 2 bains d'eau distillée.
Il convient de bien agiter les lames dans chaque bain et de les égoutter entre deux passages, particulièrement entre le
3èmebain de xylol et le 1er bain d’alcool, sans laisser sécher les coupes.
- Immergées dans le colorant, préalablement filtré si un dépôt bleuté s’observe à la surface de la solution, pendant 12 à 15 minutes. Ce temps est à déterminer en fonction du type de tissu et de l’âge du colorant.
- Lavées à l'eau de distribution, puis à l’eau distillée.
- Montées entre lame et lamelle dans l'Eukitt.
- Observées et photographiées
Résultat de la coloration
Cette coloration est un exemple de coloration indirecte. L’hématoxyline ne dispose en effet pas de pouvoir colorant par elle-même. Elle doit être associée à une base avec laquelle elle forme un sel au sens chimique, qu’on appelle laque. Cette coloration nucléaire permet de discerner nettement les nucléoles et la chromatine dense ainsi que les chromosomes. Ces structures nucléaires sont bien contrastés par rapport au reste de la cellule. La coloration à l'hématoxyline permet ainsi de relever aisément les noyaux en mitose dans une coupe (microphotographies ci dessus).
Avant le montage on peut passer les lames pendant 30 secondes environ dans une solution fraîche de rouge de ruthénium (1: 5000) pour colorer les substances pectiques des parois cellulaires. Dans ce cas, le passage dans les alcools de la chaîne de montage doit être très bref.
Les trois microphotographies ci dessous illustrent le résultat de la coloration. Les deux premières montrent deux portions de la coupe avec des mitoses à différents stades dans la zone méristématique de l'extrémité de la racine. Celle du bas montre une portion de coupe longitudinale dans l'extrémité de la racine primaire.