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Né au Brésil d'un père italien et d'une mère brésilienne, Rodrigo Santoro developpe très tôt son côté artistique, en organisant chez lui des spectacles de marionnettes durant les fêtes de famille. Plus tard, cette passion pour la création le conduire à adapter des téléfilms à l'Université Pontificale Catholique de Rio de Janeiro, dans laquelle il fait des études de marketing. Il décroche un peu plus tard son premier rôle dans une telenovela brésilienne Olho no Olho. Mais, sa carrière d'acteur décolle vraiment en 1994 lorsqu'il s'illustre dans la série Pátria Minha. Dès lors, il enchaine les productions télévisuelles brésiliennes, avec plus ou moins de succès.
En 2001, il se retrouve pour la première fois dans un long-métrage de fiction, intitulé Bicho de Sete Cabeças. Son interprétation touchante lui permet de glaner plusieurs récompenses, dont le prix du Meilleur Acteur lors du Brasilia Festival, et surtout de se faire connaitre puisque c'est grâce à cela qu'on le retrouve dans des films un peu plus importants par la suite : vengeur désoeuvré dans Avril Brisé, transsexuel dans le carcéral Carandiru et surfeur sexy dans Charlie's Angels : les Anges se déchainent. Hollywood lui ayant désormais ouvert ses portes, Rodrigo Santoro impose de plus en plus sa belle gueule sur les grands écrans américains. en effet, la même année, il fait craquer les spectatrices dans Love Actually. Parallèlement, il apparait aux côtés de Nicole Kidman dans le nouveau spot publicitaire pour Chanel N°5.
En 2005, on le retrouve dans la peau du tyrannique Xerxès Ier, dans le blockbuster 300 (son rôle le plus marquant à ce jour). Une année plus tard, Rodrigo devient un personnage régulier dans la 3ème saison de Lost. Après un passage dans deux films à petit budget (Redbelt, Leonera) il revient dans un projet d'envergure avec le biopic sur le révolutionnaire Che Guevara en 2 parties : Che 1ère partie : L'argentin et Che 2ème partie : Guerilla. En 2010, il joue aux côtés de Jim Carrey dans le touchant I Love You, Philip Morris.
2011 est une année un peu plus "brésilienne" pour lui puisqu'il se consacre aux productions de son pays natal. Ainsi, on peut le voir dans les films Heleno, Meu Pais et Reis e ratos. L'acteur se permet même un petit clin d'oeil en jouant les doubleurs pour le film d'animation... Rio. Après être repassé par la case comédie romantique pour les besoins de Ce qui vous attend si vous attendez un enfant, il joue les gros bras aux côtés d'Arnold Schwarzenneger dans Le Dernier Rempart. En 2014, il poursuit les rôles musclés puisqu'il interprète de nouveau Xerxes Ier dans 300, la naissance d'un Empire.