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Certaines pathologies, et la plupart des chimiothérapies, peuvent altérer la réserve ovarienne et mettre en péril la fertilité. Des techniques de cryoconservation de gamètes existent mais sont réservées à un nombre restreint de cas. Nous présentons ici notre technique de cryoconservation ovarienne et les principaux résultats obtenus par d’autres équipes. Cette méthode a l’avantage de pouvoir être proposée aux jeunes filles pré-pubères en cas de besoin. Le principal risque concerne une possible récidive de la pathologie initiale. Cette dernière peut être évitée par maturation ovocytaire in vitro. Compte tenu des importants progrès réalisés, il nous paraît légitime d’aborder la question de la préservation de la fertilité avec chaque patiente dont la réserve ovarienne pourrait être altérée du fait d’une pathologie ou de son traitement.
Les importants progrès réalisés dans la prise en charge thérapeutique des cancers chez l’enfant et les jeunes adultes ont pour conséquence une augmentation du nombre de survivants atteignant l’âge adulte. On estime ainsi qu’il y aura 180 000 adultes en âge de procréer ayant survécu à un cancer dans leur enfance au cours des quinze prochaines années en Europe. La question de la fertilité se posera alors avec insistance chez ces jeunes adultes, exposés à des doses importantes d’agents cytotoxiques à l’enfance ou à l’adolescence.
Parallèlement, un certain nombre de pathologies peuvent également conduire à une insuffisance ovarienne précoce (syndrome de Turner, X-fragile, infection VIH), mettant en péril la fertilité des jeunes femmes.
Chez l’homme adulte, la cryopréservation de sperme préalable à la réalisation d’une chimiothérapie ou d’une radiothérapie est une méthode simple, disponible depuis la fin des années 1950. Des techniques de préservation tissulaire chez le garçon prépubère ont récemment été décrites, mais restent à un stade expérimental.1 Des tentatives similaires de préservation tissulaire ont été conduites chez la femme et la jeune fille depuis la fin des années 1990 avec des succès divers.
La cryopréservation embryonnaire a été développée rapidement après l’avènement de la fécondation in vitro (FIV), permettant les premières naissances d’enfants issus d’embryons congelés au milieu des années 1980. Cette technique nécessite le plus souvent la réalisation d’une stimulation ovarienne contrôlée suivie d’une FIV et la cryopréservation des embryons obtenus. Elle est donc réservée aux patientes pubères ayant une situation familiale établie. En Suisse, les embryons obtenus restent la propriété du couple et ne peuvent être utilisés pour une future grossesse qu’avec l’accord des deux conjoints. Des questions éthiques peuvent donc se poser en cas de dissolution du couple, par exemple à l’occasion d’un divorce ou d’un décès prématuré de l’un des deux époux.
La cryopréservation ovocytaire a été développée dès 1991, dans certains pays interdisant la congélation embryonnaire. Cette technique permet de préserver la fertilité des jeunes femmes quel que soit leur statut marital. Les travaux qui ont suivi ont permis d’améliorer les chances de grossesse jusqu’à obtenir des taux similaires à ceux de la congélation embryonnaire.2 Des travaux récents ont montré la supériorité des techniques de vitrification ovocytaire3 sur les techniques de congélation lente.
Le principal problème rencontré lors des procédures de congélation tant embryonnaire qu’ovocytaire tient au relativement faible nombre d’ovocytes obtenus lors de chaque cycle de stimulation. Or, en cas de cancer, le délai avant instauration d’une chimiothérapie est souvent considéré comme primordial vis-à-vis du pronostic oncologique. De plus, en cas de cancer hormonosensible, il est préférable d’éviter l’importante exposition aux œstrogènes inhérente aux protocoles de stimulation ovarienne, même si celle-ci est de courte durée. Dans de telles situations, le recours à des protocoles de stimulation alternatifs a été envisagé (citrate de clomifène, tamoxifène, inhibiteurs de l’aromatase) avec des résultats variables.
Une alternative consiste en la réalisation de biopsies sur des fragments de cortex ovarien préalablement cryopréservés. Les ovocytes prélevés pouvant être maturés puis fécondés in vitro, en dehors de tout cycle de stimulation.
Les premières expériences de congélation de tissu ovarien datent du milieu du XXe siècle. Elles ont permis l’obtention de naissances chez les rongeurs et certains mammifères.4 Chez l’humain, la cryopréservation de tissu cortical ovarien a été initiée au milieu des années 1990.5,6 Deux techniques concurrentes ont été développées : la congélation lente programmée et la vitrification tissulaire.
La congélation lente programmée a été la principale méthode employée dans les années 1990.7 L’idée sousjacente est celle d’une préservation maximale des relations cellulaires au niveau du follicule et de la granulosa afin de permettre une maturation ovocytaire in situ lors de la décongélation. Différents protocoles ont été décrits, avec des résultats semblables.7 La formation de cristaux de glace lors des phases de congélation ou de décongélation étant dommageable pour les structures ovariennes, il est prudent de l’éviter en maintenant des rythmes de congélation/ décongélation adaptés et en utilisant des milieux cryoprotecteurs choisis. Afin de déterminer la sensibilité propre des différents composants tissulaires, chaque type cellulaire a été congelé puis décongelé séparément. Les agents les plus utilisés pour la congélation lente ont été le diméthyl sulfoxide (DMSO), le propanediol et l’éthylène glycol.5,6,8,9 La plupart des auteurs utilise des techniques de supplémentation en sucrose ou en protéines, parfois en utilisant le propre sérum de la patiente.
En pratique, un protocole de congélation lente commence par une étape d’imprégnation tissulaire dans une solution cryoprotectrice. Cette étape peut être conduite à température ambiante pendant quinze minutes avec du propanediol ou de l’éthylène glycol. Elle devra être effectuée sur glace si l’on choisit d’utiliser du DMSO. La phase de congélation initiale se fera de façon contrôlée ( 1 degré par minute) jusqu’à atteindre -6 à -8°C. La technique consiste alors à créer des cristaux de glace en périphérie du tissu afin d’éviter leur formation en son centre. Différentes techniques peuvent être utilisées en fonction du milieu de congélation. Le récipient contenant les fragments ovariens est ensuite refroidi lentement (0,3 degré par minute) jusqu’à -40°C à l’aide d’un appareillage spécifique de congélation programmée. L’ensemble est ensuite rapidement refroidi jusqu’à -150°C avant d’être plongé dans de l’azote liquide à -196°C.
Les protocoles de vitrification évitent la formation des cristaux de glace en utilisant des concentrations importantes de cryoprotectants. Afin de minimiser leur toxicité propre, il est nécessaire de minimiser le temps d’exposition des tissus et d’utiliser plusieurs agents au cours d’un même protocole. La technique de vitrification permet l’obtention d’une matière amorphe translucide, évoquant l’aspect du verre dépoli. Elle a été développée pour la cryopréservation des embryons, des ovocytes puis du tissu ovarien.
En pratique, un protocole de vitrification commence par une étape d’imprégnation tissulaire dans une solution cryoprotectrice. Cette étape doit être conduite rapidement, pendant cinq à dix minutes, puis l’ensemble est mis au contact d’une plaque métallique reposant sur de l’azote liquide afin d’assurer une congélation quasi instantanée. Le principal avantage de la méthode tient au fait qu’elle ne nécessite pas d’investir dans de coûteuses machines de congélation programmée. Notons ici que la réglementation impose l’usage de systèmes de conservation stériles à double chambre afin de limiter les risques de contamination microbienne.
Notre protocole de vitrification utilise une solution filtrée de propanediol, DMSO et éthylène glycol conservée en emballages stériles. Il permet l’obtention de tissus ovariens humains présentant d’excellentes caractéristiques en microscopie optique et électronique (Keros et coll. HR in press 2008). Nous avons conduit une comparaison des techniques de congélation lente et de vitrification sur du tissu ovarien prélevé chez des donneurs. La viabilité des tissus a été étudiée après 24 heures de mise en culture. Nous montrons une meilleure tolérance du stroma à la vitrification par rapport à la congélation lente (figure 1).
Enfin, il existe une dernière technique qui consiste à congeler l’ovaire dans son ensemble, avec le pédicule vasculaire afin de permettre une réanastomose après la décongélation.10 Les résultats cliniques sont décevants, un grand nombre de follicules étant perdus durant la phase initiale d’ischémie ou lors de la culture in vitro.
La viabilité des tissus humains cryopréservés a été étudiée par xénogreffe chez la souris immunodéficiente,5 permettant l’obtention de follicules antraux. Des travaux complémentaires ont été conduits in vitro, démontrant également une croissance folliculaire après mise en culture.11
Enfin, une preuve clinique de l’efficacité de la méthode a pu être obtenue après réimplantation de tissu décongelé chez plusieurs patientes.8,9,12,13 Au moins six enfants sont nés de cette technique de cryopréservation tissulaire à l’heure où nous écrivons cet article.
Lorsque les techniques de cryopréservation tissulaire sont utilisées avant l’instauration d’un traitement oncologique, l’un des principaux freins à leur généralisation tient au risque de résurgence de la pathologie oncologique initiale. Une dissémination cancéreuse a en effet été démontrée dans un modèle de leucémie chez le rongeur.14 Il est probable que le risque de récidive dépende du type de cancer incriminé. Le risque paraît ainsi limité en cas de lymphome de Hodgkin, l’un des cancers les plus fréquents chez la jeune fille, la pathologie ne métastasant généralement pas aux ovaires.15 Les sarcomes ainsi que la plupart des tumeurs solides présentent également un risque de métastase ovarienne considéré comme faible, mais nécessitant une approche au cas par cas. S’agissant des leucémies myéloïdes, il est possible d’envisager l’utilisation de marqueurs moléculaires pour dépister d’éventuelles cellules cancéreuses au sein du parenchyme ovarien. Chez la jeune femme, le risque de métastase ovarienne d’un cancer du sein est en revanche plus important. Une approche méticuleuse couplant analyse immunohistochimique et PCR pourrait permettre de détecter d’éventuelles cellules cancéreuses.
En revanche, il serait prudent d’exclure les cas de lymphome non hodgkinien ou de Burkitt puisque des cas de métastases ovariennes ont été clairement identifiés dans ces pathologies.
Lorsqu’une réimplantation de tissu ovarien n’est pas possible, comme par exemple en cas de cancer primaire ovarien, de leucémie, ou lorsque la preuve a été obtenue d’une contamination du tissu ovarien prélevé par des cellules cancéreuses, il est possible de recourir à une maturation des ovocytes in vitro, préalablement à leur fécondation. Des résultats prometteurs ont été obtenus, permettant l’obtention de follicules antraux après culture prolongée ou accélérée16 à partir de tissu congelé. Des résultats similaires ont également été obtenus à partir de tissu ovarien vitrifié, ce qui constitue un progrès remarquable.
La cryopréservation des ovocytes et des embryons constitue aujourd’hui une méthode éprouvée de préservation de la fertilité chez la femme jeune. Le principal inconvénient en est le faible nombre d’ovocytes récoltés par cycle ainsi que l’impossibilité de proposer cette méthode à la jeune fille prépubère. La cryopréservation de tissu ovarien est une alternative crédible ayant conduit à la naissance d’enfants après réimplantation. Cette technique est toujours conduite au stade expérimental. Ses principales limitations tiennent au fait qu’elle altère les chances de reprise spontanée de l’activité folliculaire après chimiothérapie et qu’elle présente un risque non négligeable de résurgence de la pathologie oncologique ayant conduit à sa réalisation, particulièrement en cas de cancers gynécologiques ou hématologiques. Cette dernière limitation peut être contournée en recourant à des techniques de maturation et fécondation in vitro. Compte tenu des importants progrès réalisés dans le domaine, il nous paraît légitime d’aborder la question de la préservation de la fertilité avec chaque jeune patiente dont la réserve ovarienne pourrait être altérée du fait d’une pathologie ou de son traitement.
> La question de la préservation de la fertilité devrait être abordée avec chaque jeune patiente dont la réserve ovarienne pourrait être altérée du fait d’une pathologie ou de son traitement
> Des techniques de cryopréservation tissulaire permettent, au cas par cas, de proposer une préservation de la fertilité chez la jeune fille prépubère
> Une approche multidisciplinaire est toujours nécessaire