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Woher kommt das Verfahren CRISPR/Cas9
Die CRISPR/Cas9 Technik basiert auf einem natürlichen Abwehrmechanismus, der bei Bakterien vorkommt. Bakterien speichern in ihrem Genom kurze DNA-Sequenzen der Viren, die sie infizieren. Diese sich wiederholtenden DNA-Abschitte werden als CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) bezeichnet. Kommt es zu einer erneuten Infektion mit demselben Virus, erkennt dies das Bakterium und kann sich dagegen wehren.
Wie funktioniert CRISPR/Cas9
Bakterien transkribieren CRISPR, diese kurzen Sequenzen der viralen DNA, regelmäßig in RNA-Mikrosequenzen. So entstehen Kopien von Fragmenten des Genoms der Viren. Treffen solche RNA-Kopien auf das Originalvirus in der Zelle, wird das Virus erkannt und die RNA bindet an die identische, homologe virale Sequenz. Dies ermöglicht es dem Protein Cas9, das virale Genom zu zerschneiden und so unschädlich zu machen. Kurz gesagt, ist Cas9 ein molekularer Meissel oder eine Schere, welche die DNA am Punkt schneidet, an dem eine RNA-Kopie von CRISPR bindet. Der genaue Mechanismus wurde erst 2012 verstanden und für die Biotechnologie nutzbar gemacht.
Die Wissenschaftler interessierten sich vor allem für die Fähigkeit der molekularen Schere Cas9, die DNA an einem ganz bestimmten Ort, der durch die Übereinstimmung mit der RNA ermittelt wird, zu schneiden. In der biotechnologischen Anwendung wird eine Guide-RNA (gRNA), die mit der Sequenz eines gesuchten Gens identisch ist, synthetisch hergestellt und zusammen mit dem Protein Cas9 in eine Zelle eingebracht. Diese gRNA erkennt die DNA-Sequenz im Genom der Pflanzenzelle durch Homologie und bindet diese Sequenz. Das Protein Cas9 erkennt diese RNA-DNA-Verbindung und schneidet die DNA. Diese Schnittstelle in der DNA wird daraufhin genutzt, um Mutationen zu erzeugen, genetische Sequenzen unterschiedlicher Länge einzufügen oder zu entfernen. Dies geschieht zum Teil durch natürliche Reparaturmechanismen der Zellen.
Der genaue Mechanismus wurde erst 2012 entdeckt und für die Biotechnologie nutzbar gemacht. Dazu wird die ursprüngliche Funktionsweise dieses bakteriellen Abwehrsystems imitiert, um die DNA an einer bestimmten Stelle zu zerschneiden. Dazu wird eine sogenannte Guide-RNA (gRNA), welche identisch mit der gewünschten Gen-Sequenz ist, synthetisiert und zusammen mit dem Cas-Protein in eine Zelle eingebracht. Dazu kommen meist die konventionellen gentechnischen Methoden zum Einsatz, das heisst das Genkonstrukt wird mit einer Genkanone oder mittels eines Vektors in die Zelle eingeschleust.
Danach dockt die Guide-RNA die gesuchte DNA-Sequenz an und das Cas9 Protein schneidet beide DNA-Stränge durch (Doppelstrangbruch). Diese Schnittstelle wird daraufhin mit den zellulären Reparaturmechanismen repariert.
Diese Möglichkeit, mit CRISPR/Cas9 effizient DNA-Sequenzen anzusteuern und zu schneiden, ist für die Biotechnologie entscheidend. Diese Schnitte werden verwendet, um Mutationen zu erzeugen, mehr oder weniger lange genetische Sequenzen einzufügen oder aber zu entfernen. Das CRISPR/Cas-System hat die Biotechnologie revolutioniert, weil es viel einfacher und schneller zu entwickeln ist als verwandte Techniken. Und dies zudem noch sehr viel billiger.
Unterschiede zwischen konventionellen Methoden der Gentechnik und CRISPR/Cas9
Die Unterschiede zwischen Genom-Veränderungen mit CRISPR/Cas9 und der konventionellen Gentechnik sind nicht für alle Organismen gleich. Allgemein kann gesagt werden:
- Bei konventionellen gentechnischen Methoden ist die Stelle, an der das Genom verändert wird, in der Regel zufällig. Mit CRISPR/Cas9 erfolgt die Modifikation an einer vordefinierten Sequenz des Genoms.
- Die CRISPR/Cas-Technik erlaubt es nicht nur, dem Genom neue Gene hinzuzufügen, sondern es können auch bestehende Gene gezielt deaktiviert, modifiziert oder eliminiert werden.
- Mit CRISPR/Cas9 ist es möglich, mehrere spezifische Stellen des Genoms gleichzeitig zu modifizieren (Multiplexing).
- Bei Organismen (Tiere, Insekten, Menschen, Pilze), deren Genom mit konventionellen gentechnischen Methoden kaum verändert werden kann, wird CRISPR/Cas9 künftig Eingriffe ins Genom vereinfachen.
Risiken und Genauigkeit von CRISPR/Cas9
Es wird immer wieder hervorgehoben, das CRISPR-System sei präziser als andere Techniken. Trotzdem kann es mit CRISPR/Cas9 zu ungewollten fehlerhaften Effekten (off-target) kommen. Diese treten auf, wenn das Protein Cas9 von der gRNA an eine falsche Stelle, ausserhalb der vorgesehenen Zielregionen des Genoms geleitet wird und dort den DNA-Strang durchtrennt. Zudem schneidet CRISPR/Cas9 auch bei einer ungefähren Übereinstimmung zwischen der gRNA und der zu schneidenden DNA-Sequenz.
Es muss daher durch ein angemessenes Risikobewertungsverfahren im Rahmen der Regulierung dieser Techniken sichergestellt werden, dass solche ungewollten Effekte nicht stattfinden. Denn kleinste Mutationen können - auch bei wenigen Off-Target-Effekten - gravierende Auswirkungen haben. So beruht beispielsweise die Hämophilie A (Bluterkrankheit) auf einer einzigen Mutation in einem Gen, das für einen Gerinnungsfaktor kodiert.
Hinzu kommt, dass die sogenannte Genom-Editierung immer verbunden ist mit der Einführung der Bausteine Cas9 und einer gRNA in eine Zelle. Die transformierten Zellen werden anschließend in-vitro kultiviert. Jeder dieser zwei Prozesse kann zu unbeabsichtigten Veränderungen des Genoms führen.
Die Genauigkeit des CRISPR/Cas9-Systems hängt immer auch von der Sorgfalt der Durchführenden ab. Durch die Versuchsanordnung kann das Ausmass der ungewollten Modifikationen beeinflusst werden.
Daher ist es notwendig, Kontrollverfahren einzuführen, um sicherzustellen, dass solche Nebenwirkungen nicht auftreten, und eine angemessene Risikobewertung im Rahmen der Regulierung dieser Techniken vorzusehen.
Unsicherheiten bei CRISPR/Cas9
Unsicherheit bezeichnet das, von dem wir wissen, dass wir es nicht wissen, aber auch alles, von dem wir nicht wissen, dass wir es nicht wissen. Unser Wissen über das Genom und seine Funktionsweise ist noch immer sehr dürftig. Zur Erinnerung: Gene machen nur 2% des Genoms aus. Die genaue Rolle der restlichen 98% der DNA ist nicht genau bekannt! Das Genom ist keine statische Einheit, die nur aus einem Code besteht, der modifiziert werden kann, ohne dass dieser Modifikationsprozess andere Reaktionen auslöst. Vielmehr ist das Genom eine Einheit, welche mit Selbstorganisation, Selbstregulierung und Selbstanpassung ausgestattet ist - in ständiger Beziehung zur entsprechenden Umwelt. Von Präzision zu sprechen, ist unverantwortlich, solange wir nicht verstanden haben, wie Genome funktionieren, sich selbst organisieren und entwickeln. Auch zu den genauen Funktionsweisen von CRISPR/cas9 und den DNA-Reparatursystemen bestehen Wissenlücken. Man kann sie zwar anwenden, doch was genau vor sich geht, versteht die Wissenschaft im Detail noch nicht. Darum ist es unabdingbar, dass CRISPR/Cas9 als Gentechnik eingestuft wird und damit dem Gentechnik-Gesetz unterstellt wird.