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Remarques:
1) Cette expérience a été mise en place afin de remplacer le protocole intitulé "PCR (locus D1S80)". L’amplification est en effet meilleure et les résultats plus simples à interpréter. Toutefois un nouveau propotocle PCR a été développé, intitulé "PCR sensibilité au PTC", qui permet de faire le lien entre un génotype donné et le phénotype associé. L'expérience d'amplification par PCR du locus PV92 peut encore être empruntée sur demande.
La technique de polymérisation en chaîne (en anglais « polymerase chain reaction ») ou PCR, permet d’amplifier des millions de fois un unique fragment d’ADN. Cette méthode est devenue un outil précieux non seulement pour la recherche en biologie moléculaire mais également pour le diagnostique médical, la détermination de microorganismes ou encore la criminologie. L’invention de la PCR revient à Kary Mullis dans les années 80. Il obtint pour cette découverte le Prix Nobel de Chimie en 1993. La découverte d’ADN polymérases thermorésistantes (la Taq polymérase par exemple) isolées de bactéries (Thermus aquaticus) vivant dans des sources d’eau chaude a facilité l’utilisation de la PCR et a permis son automatisation.
Thèmes : la PCR, la structure du génome humain, le génotypage, la criminologie, l’ADN, l’électrophorèse.
La PCR : Une réaction de PCR nécessite :
Ces 5 ingrédients sont mélangés dans un tube à essai et soumis à différents cycles de températures.

1ère étape : la dénaturation (94°C).
2ème étape : l’hybridation (40-65°C).
3ème étape : l’élongation (72°C).
Ces trois étapes correspondent à 1 cycle de PCR, à la suite duquel on a doublé le nombre de fragment d’ADN cible initial. Environ une trentaine de cycle sont en principe effectués dans une expérience de PCR classique. Ainsi, après 30 cycles on aura amplifié 2n fois notre ADN cible.
Un schéma de l'amplification par PCR est visible ici:
Les séquences alu :
L’ADN humain est constitué de nombreuses séquences répétées représentant plus de 50% du génome. Les séquences Alu font partie des éléments répétés les plus abondants. Il s’agit de courtes séquences d’environ 300 pb qui ont été mobilisées chez les primates il y a environ 65 millions d’années. Le nom de ces séquences vient du fait qu’elles possèdent un site de restriction pour l’enzyme AluI. La dispersion des séquences Alu dans le génome s’effectue en utilisant un intermédiaire ARN par un processus dénommé rétroposition. Ces éléments Alu contribuent à l’évolution du génome, à son architecture mais peuvent également être la cause de certaines maladies génétiques. Les séquences Alu continuent de se disperser à raison d’une insertion toute les 200 naissances.
Certaines séquences Alu se sont insérées récemment (il y a environ 1 million d’année) et ne se retrouvent pas chez tous les individus. Ce polymorphisme peut être utilisé pour l’étude des populations. Par exemple, le locus PV92 situé sur le chromosome 16 peut, suivant les personnes, contenir ou non une séquence Alu. Certains individus possèdent ainsi un élément Alu sur leurs 2 chromosomes 16 (+/+), ou sur l’un des 2 (+/-), on pas d’insertion à ce locus (-/-).
L'EXPERIENCE:
Protocole :
1) Extraction d'ADN à partir de cellules épithéliales de la bouche
2) Amplification par PCR
|1 réaction||24 réactions|
|2xTaq ReadyMix||12.50 µl||300 µl|
|Primers mix PV92||5.00 µl||120 µl|
|DMSO||1.25 µl||30 µl|
|H2O||1.25 µl||30 µl|
|94° 5 minutes|
|94° 30 secondes||}|
|54° 30 secondes||40 cycles|
|72° 30 secondes|
|72° 5 minutes|
3) Préparation du gel d’agarose
Le TBE 10x concentré doit être manipulé uniquement par les enseignants ou les préparateurs, en prenant soit de porter une blouse, des lunettes et des gants en nitrile. Le TBE 1x concentré peut sans problème être manipulé par les élèves, à conditions qu’ils respectent les mêmes conditions de sécurité.
Le TBE est toxique pour l’environnement, il ne faut donc pas le jeter à l’évier. Celui-ci doit être récupéré et éliminé par le biais de votre propre filière de traitement des produits chimiques.
Le gel d'agarose est une matrice pour séparer les molécules d'ADN selon leur taille dans un champ électrique. Les petits fragments migrent plus vite que les grands, la concentration d'agarose est choisie en fonction de la taille des fragments à séparer. Ici nous allons utiliser un gel à 1.5% d’agarose.
Les cuves d'électrophorèse possèdent des petits blocs en plexi pour protéger les électrodes. Souvent les cuves sont déformées et les blocs ne rentrent plus. Il suffit donc de couper, après solidification du gel, une petite lamelle d’agarose en haut et en bas du gel pour libérer les électrodes.
4) Analyse des génotypes sur gel
1er puits: 5 µl de marqueur.
2ème puits et suivants: 20 µl de vos échantillons.
Avant dernier puits: le contrôle négatif.
Dernier puits: le contrôle positif.
5) Résultats et discussions
Un autre exemple d'analyse de résultats est accessible ici
Matériel fourni:
Matériel non fourni:
L’Université de Genève décline toutes responsabilités en cas de dommages survenus durant les expériences.