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Issu d'une famille de huit enfants, Willem Dafoe débute au théâtre à l'âge de vingt ans, dans une troupe expérimentale du Milwaukee. C'est au cours d'un voyage à New York qu'il rencontre sa femme, Elizabeth LeCompte, avec qui il crée la compagnie théatrâle Wooster Group, dans laquelle il continue de jouer, parallèlement à ses rôles au cinéma.
Le cinéma, il y entre en 1980, via La Porte du paradis de Michael Cimino, qui permet aux spectateurs de découvrir son physique émacié et troublant, souvent mis au service, par la suite, de rôles de méchants : on le voit ainsi en vampire dans Les Prédateurs de Tony Scott, ou en trafiquant de fausse monnaie dans Police féderale Los Angeles de William Friedkin.
En 1986, Dafoe change de registre en incarnant le sergent Elias dans Platoon d'Oliver Stone. Même s'il ne gagne pas l'Oscar du meilleur second rôle, pour lequel il est nommé, il acquiert une certaine notoriété vis-à-vis du public et d'Hollywood. Cela lui permet d'obtenir des rôles plus variés et plus conséquents tels qu'un agent du FBI dans Mississippi burning ou un vétéran du Vietnam dans Né un 4 juillet, film dans lequel il retrouve Oliver Stone. Martin Scorsese lui confie ensuite un rôle aussi difficile que marquant : celui de Jésus dans la controversée Dernière tentation du Christ.
Dans les années 1990, l'acteur continue à faire parler de lui, en jouant notamment aux côtés de Madonna dans le sulfureux Body d'Uli Edel, puis en apparaissant au générique de films prestigieux et aussi variés que peuvent l'être Sailor et Lula de David Lynch, eXistenZ de David Cronenberg ou encore Le Patient anglais d'Anthony Minghella.
Interprète de Max Schreck, célèbre pour son rôle de Nosferatu, dans L'Ombre du vampire d'E. Elias Merhige, Willem Dafoe décroche une seconde nomination à l'Oscar du Meilleur Second Rôle en 2000. Il continue ensuite de prêter ses traits à des personnages machiavéliques comme dans Spider-Man 1 et 2, où il incarne Norman Osborne, alias le Bouffon Vert, et dans XXX 2 en 2004.
Variant les genres, l'acteur joue ensuite dans la comédie de Wes Anderson, La Vie aquatique puis dans la suite de Dogville de Lars von Trier, Manderlay, avant de s'essayer au scénario pour les besoins de The Widow's lover, réalisé par Giada Colagrande en 2005. Il apparaît ensuite chez Martin Scorsese dans Aviator puis chez Spike Lee dans Inside man - l'homme de l'intérieur, dans lequel il campe un capitaine de la brigade d'intervention new-yorkaise; avant de retourner au registre comique en jouant le vice-Président d'American dreamz.
De plus en plus éclectique dans ses choix, Willem Dafoe passe ensuite de la comédie (Les Vacances de Mr. Bean) au fantastique (Le Cirque de l'étrange), tout en faisant un détour par l'univers de Lars von Trier grâce à Antichrist, où il donne la réplique à Charlotte Gainsbourg. Cette grande diversité dans ses choix artistiques se confirme en 2010, l'acteur étant à l'affiche d'un film de science fiction vampirique (Daybreakers), d'un film d'animation (Fantastic Mr. Fox) et d'un drame racontant l'histoire d'une jeune palestinienne placée dans un orphelinat après le suicide de sa mère (Miral, réalisé par Julian Schnabel, à qui l'on doit Le Scaphandre et le papillon).
Prolifique, le comédien touche autant aux films intimistes (4h44 Dernier jour sur terre, The Grand Budapest Hotel, Pasolini) qu'aux productions destinées à un public plus large (John Carter, Bad Country, John Wick). En 2014, il est choisi pour faire partie du jury du Festival de Cannes.