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Milchkefir entsteht, indem man Kefirknollen (siehe Bild) ein bis zwei Tage mit Kuh-, Ziegen- oder Schafsmilch versetzt. Auch die Verwendung von Stutenmilch ist möglich, das Produkt heißt dann Kumys. Die Milch sollte vorher gekocht und dann abgekühlt werden. Die Verwendung von H-Milch und pasteurisierter Milch ist ebenfalls gut möglich. Auch von der erfolgreichen Verwendung von Sojamilch wurde schon berichtet.
Der Ansatz wird daraufhin stehen gelassen. Optimale Temperaturen liegen im Bereich von 10 °C bis 25 °C. Dabei wird die Milch fermentiert. Der Alkoholgehalt des fertigen Produkts kann je nach Gärdauer von 0,2 Prozent bis maximal etwa 2 Prozent betragen. Bei niedrigeren Temperaturen überwiegt die Hefegärung und das Produkt enthält mehr Kohlendioxid und Ethanol, sowie weniger Milchsäure. Bei höheren Temperaturen ist die Milchsäuregärung bevorzugt und der Ethanol-Gehalt ist geringer, der Milchsäure-Gehalt höher.
Fett- und Eiweißgehalt entsprechen etwa dem der verwendeten Milch. Das cremige Getränk hat einen leicht säuerlichen Geschmack.
Der Kefir wird mit einem Kunststoffsieb unter leichtem Schütteln von den blumenkohlartigen Kefirknollen getrennt, die anschließend mit kaltem Wasser gespült und in einem Einmachglas mit einer Wasser-Milch-Mischung bedeckt und an einem kühlen, dunklen Ort bis zur nächsten Zubereitung aufbewahrt werden.
Die Kefirknollen (Kefirkörner, Kefirpilz, tibetanischer Pilz) können bis etwa zur Größe von Walnüssen wachsen, aber auch faustgroße Kefirknollen sind nicht ungewöhnlich. Kefirknollen besitzen eine gummiartige Konsistenz und bestehen aus Bakterien, Hefen, Eiweißen, Fetten und aus Polysacchariden, die durch verschiedene der in den Knollen enthaltenen Bakterien produziert werden. Diese Knollen vergrößern sich im Laufe der Zeit und zerfallen teilweise in kleinere Knollen. Sie verdoppeln ihre Masse je nach den Umgebungsbedingungen bei Raumtemperatur in etwa 14 Tagen. Kefirknollen können zur Aufbewahrung getrocknet oder eingefroren werden. Industriell hergestellter und im Handel angebotener Kefir entspricht üblicherweise nicht dem traditionell mit Kefirknollen hergestellten Getränk und hat die Bezeichnung „Kefir, mild“. Damit das entstehende Getränk immer den gleichen Geschmack besitzt, wird industriell mit einer definierten Mischung verschiedener Bakterien und Hefen gearbeitet, welche die komplexe Zusammensetzung des Mikroorganismen-Konsortiums von Kefirkörnern nicht vollständig nachahmen können. Traditioneller Kefir besitzt eine an seine Umgebung angepasste Zusammensetzung des Konsortiums, die sich zum Beispiel jahreszeitlich bedingt verändern kann. „Kefir, mild“ enthält in der Regel keinen Alkohol, dafür aber pro 100 g noch ca. 2,73,9 g Laktose und ist somit bei Laktoseunverträglichkeit nicht geeignet. Dagegen enthält der echte Kefir Alkohol, ist aber laktosefrei.