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Die Untersuchung von DNA gehört mitlerweile zum Standard in der Forschung, der Medizin, der Forensik oder auch zur Stammbaumanalyse. Doch wie kann ein Stück DNA vervielfältigt werden, damit es untersucht und analysiert werden kann? Der Prozess dahinter wird dir in diesem Tafelbild erklärt.
PCR heisst Polymerase Chain Reaction also Polymerase Kettenreaktion. Dabei handelt es sich um eine repetitive Abfolge von Kopierschritten die einzig über die Temperatur des Raktionsgefässes gesteuert werden. Was eine Polymerase ist und welche Aufgabe sie hat, wird im Tafelbild zur Replikation gezeigt.
Die PCR beinhaltet folgende Bestandteile:
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2 Primer
Als Primer werden kurze DNA Stücke mit einer vorgegebenen Sequenz bezeichnet. Diese haben zwei Funktionen, einerseits ermöglichen sie es der Polymerase am DNA-Strang zu binden, um die DNA zu verdoppeln, andererseits sind sie dank ihrer Sequenz spezifisch und binden nur dort in der DNA, wo diese komplementär zur Primersequenz ist. Es wird also lediglich ein Bereich der DNA verdoppelt. Es braucht 2 Primer weil beide Stränge der DNA verdoppelt werden sollen und die Polymerase nur von 3’ zu 5’ lesen kann.
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DNA
Die DNA eines Organismus dient als Grundlage der PCR. Es muss also nicht zwingend ein kurzes Stück der DNA sein sondern kann eine ganze Menge sein.
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Taq Polymerase
Polymerasen kommen in allen Organismen zur Verdoppelung der DNA vor, da bei der PCR jedoch mitunter hohe Temperaturen vorkommen wird die Polymerase eines hitzetoleranten Bakteriums Termophilus aquaticus verwendet, welche kurz als Taq Polymerase bezeichnet wird. Sie ist für das kopieren der DNA-Seqeunz zuständig
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Nukleotiden (dNTPs - deoxynukleotidtriphosphate)
Damit die Polymerase die DNA verdoppeln kann müssen sämtlichen Nukleotiden in einer gewissen Konzentration im Reaktionsgefäss vorliegen. Aus ihnen werden die Kopien der DNA gebildet.
Die PCR läuft in, sich als Kettenreaktion wiederholenden, Zyklen ab. Ein Zyklus der Polymerase-Kettenreaktion läuft jeweils in 3 Schritten ab:
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Denaturierung ~96°C
Als Erstes werden die beiden DNA-Stränge voneinander getrennt. Die Wasserstoffbrücken, welche die Nukleotiden der beiden Stränge miteinander verbinden, brechen bei ~96°C auf, wonach die DNA als Einzelstrang vorliegt.
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Primerhybridisierung ~55°C
Wird nun die Temperatur auf ~55°C gesenkt, können kurze DNA-Abschnitte wie die Primer bereits wieder einen Doppelstrang binden, während die Bildung einer kompletten Doppelhelix noch nicht möglich ist. Je nach Länge und GC-Gehalt der Primer muss die Temperatur der Hybridisierung unterschiedlich gewählt werden, da die Anzahl der zu bildenden Wasserstoffbrücken variiert.
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Elongation ~72°C
Soblad die Primer an die DNA gebunden haben beginnt die Taq-Polymerase mit der Replikation der DNA, diese läuft bei 72°C am effizientesten ab, weshalb das Reaktionsgefäss entsprechend temperiert wird. Nach der Elongation sind aus dem Ursprungsstrang der DNA zwei Doppelstränge entstanden.
Während jedes Zykluses wird die Anzahl der DNA Kopien verdoppelt. Damit genügend Genmaterial für weitere Untersuchungen vorhanden ist, wird diese Reaktion rund dreissig mal repetiert, wobei theoretisch etwa eine Milliarde Kopien des Genfragments zwischen den Primern entstehen, sowie 31 längere Fragmente. In der Praxis liegt die Anzahl der DNA-Kopien in Abhängigkeit der Länge des DNA Stücks jedoch tiefer, da der Prozess nicht perfekt abläuft.
Quellen:
- Unterlagen zur PCR aus dem Fraefe Lab der Universität Zürich