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ERSTER AKT
Silla, Schüler des in Rom ansässigen Meisters Palestrina, probt während dessen Abwesenheit eine eigene Komposition im neuesten Stil der jüngst in Florenz entstandenen Kunstrichtung. Er singt sie Ighino vor, der an den ungewohnten Klängen keinen Gefallen findet und dem Freund eröffnet, dass sein Vater seit der Heirat mit Lukrezia in Ungnade gefallen ist und nach ihrem frühen Tod keine Note mehr geschrieben hat. Unbemerkt von beiden treten Kardinal Borromeo und Palestrina in das Zimmer. Der Kardinal ist ungehalten, solche fremdartige Musik zu hören und verlangt von dem Meister eine Messe, die den Anforderungen des Papstes entspricht. Es sind Bestrebungen im Gange, nur noch den Gregorlanischen Choral, jedoch nicht die neuartige Figuralmusik zuzulassen. Palestrina weigert sich, weil er glaubt, nichts mehr komponieren zu können. Der Kardinal geht besorgt davon. Dem allein gebliebenen Meister erscheinen seine Vorgänger; die tote Lukrezia mahnt ihn, Borromeos Aufgabe zu lösen. Engelsstimmen werden laut. Palestrina schreibt in fliegender Eile die neue Messe, bis er erschöpft einschläft. Ighino und Silla nehmen das Manuskript zum Abschreiben mit.
ZWEITER AKT
Das Tridentiner Konzil tagt im Palast des Fürstbischofs Madruscht. Kardinal Borromeo und der Kardinallegat Novagerio besprechen die Lage. Man erwartet den Kardinallegaten Morone zurück, der bei Kaiser Ferdinand Zugeständnisse auf die Kirchenmusik gemacht hat. Nebenbei teilt Borromeo mit, dass er Palestrina, der sich geweigert hat, seine neue Messe aufführen zu lassen, inhaftiert hat. Morone ist inzwischen eingetroffen, trotzdem können sich die Legaten nicht einigen. Es entsteht ein grosser Tumult; die Sitzung wird vertagt. Nachdem der Saal leer ist, fallen die Diener der Würdenträger übereinander her, bis sie mit Gewalt getrennt werden.
DRITTER AKT
Ighino hat die Messe seines Vaters, nachdem er von der Verhaftung gehört hat, Kardinal Borromeo ausgehändigt, worauf der Meister aus dem Gefängnis entlassen worden ist. Müde und durch die Haft geschwächt, erwartet Palestrina mit seinem Sohn und einigen Sängern, wie die neue Messe, die gerade vor Papst und Kardinälen erklingt, gefallen wird. Der Jubel des Volks dringt in die Wohnung des Künstlers; päpstliche Kapellsänger stürzen ins Haus und bringen die Nachricht von dem grossen Erfolg des neuen Werks, der Missa Papae Marcelli. Der Papst erscheint selbst und segnet Palestrina. Borromeo bittet den Freund um Vergebung. Ighino ist überglücklich und eilt zu seinem Freund Silla, der seit einiger Zeit in Florenz arbeitet. Palestrina bleibt allein zurück und improvisiert auf der Orgel, das Bild seiner toten Frau steht vor ihm.