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Faculté des sciences de base SB, Section de chimie et génie chimique, Institut des sciences et ingénierie chimiques ISIC (Laboratoire de chimie physique des polymères et membranes LCPPM)
Investigation of the neurokinin-1 receptor by fluorescence techniques
Thèse sciences Ecole polytechnique fédérale de Lausanne EPFL : 2005 ; no 3272.Add to personal list
- Summary
- G protein-coupled receptors (GPCR) constitute by far the largest family of transmembrane cell-surface proteins involved in signal transduction and are the most important targets for the development of novel therapeutic compounds. Many processes mediated by GPCR signal transduction are still not well understood at the molecular level and novel methods for their investigation are of general interest. The thesis presented here describes investigations on the neurokinin-1 receptor (NK1R), a member of the GPCR family, using fluorescence techniques. Fluorescence resonance energy transfer (FRET), the technique of preference in this work, is used to measure ligand-protein and protein-protein interactions in living cells. In order to reach this goal, the NK1R has been labelled with either fluorescent proteins or by using the novel post-translational ACP labelling technique. A FRET-based method for monitoring specific ligand binding to NK1R is described. In this context, a fluorescent agonist for NK1R was synthesized and characterized. The ACP labelling technique was shown to be superior for this kind of experiments compared to labelling with fluorescent proteins. The same ACP labelling approach was shown to be ideally suited to study oligomerization of membrane proteins by FRET. It was shown, that the NK1R does not form homo-dimers, as many other GPCRs do. From these experiments we furthermore conclude, that the NK1R is present in small microdomains in the membrane. Interactions between the NK1R and the different subunits of the heterotrimeric Gαqβ1γ2-complex were investigated by FRET using different instrumentation. Proximity of the NK1R and the G protein could be detected, but no change in FRET was observed after activation of the receptor. Total internal reflection fluorescence (TIRF), was used to develop an assay for studying ligand binding in vitro. Here, the NK1R was immobilized directly on a surface using a cell membrane preparation. This method was shown to be highly sensitive.
- Résumé
- Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) forment une famille particulièrement riche de protéines transmembranaires essentielles pour la signalisation cellulaire et constituent une des cibles principales pour le développement de nouveaux composés thérapeutiques. Les diverses étapes de la transmission d'un signal de l'extérieur vers l'intérieur de la cellule par activation de la protéine G ne sont généralement pas connues avec précision à l'échelle moléculaire. Le développement de nouvelles méthodes d'investigation est donc nécessaire pour acquérir une meilleure compréhension du fonctionnement intime des RCPG. Cette thèse applique un large éventail de techniques basées sur la fluorescence à l'étude d'un membre important de cette famille de protéines, le récepteur neuroquinine-1 (NK1R). La technique de transfert d'énergie par fluorescence résonnante (FRET) a été utilisée de manière prépondérante dans ce travail car elle permet la mesure des interactions entre protéines ou entre une protéine et son ligand au sein même d'une cellule vivante. Ce type d'étude requiert un marquage préalable du récepteur soit avec des protéines fluorescentes soit en utilisant une nouvelle technique post-translationnelle basée sur une protéine transporteuse d'acyles (PTA). Cette thèse établit une méthode basée sur le FRET qui permet de mesurer la liaison spécifique d'un ligand au récepteur NK1R. Un agoniste fluorescent du récepteur NK1R a d'abord été synthétisé et caractérisé. La technique de marquage par PTA s'est imposée dans le cadre de ces expériences. La technique de marquage par PTA est particulièrement bien adaptée à l'étude de l'oligomérisation des protéines membranaires par FRET. Il a ainsi été démontré que le récepteur NK1R ne forme pas des homodimères contrairement à la plupart des RCPG étudiés précédemment. Cette série d'expériences indique aussi que le récepteur NK1R se trouve dans des domaines microscopiques de la membrane cellulaire. Les interactions entre le récepteur NK1R et les différentes sous-unités du complexe heterotrimérique Gαqβ1γ2 ont été étudiées par FRET dans plusieurs configurations instrumentales. La proximité du NK1R et de la protéine G a pu être détectée mais aucun changement n'a été observé par FRET lors de l'activation du récepteur. La fluorescence induite par réflexion interne totale (TIRF) est au coeur d'un essai qui quantifie la liaison d'un ligand à son récepteur in vitro. De manière innovante, le récepteur NK1R a été immobilisé sur une surface directement à partir d'une préparation cellulaire. Cette méthode se distingue par sa très haute sensibilité.