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Alors qu'il est très difficile d'étudier directement les composants moléculaires de l'oreille interne de l'homme, l'utilisation d'un modèle animal adéquat permet l'identification et l'analyse fonctionnelle de gènes associés aux surdités génétiques. Le zebrafish, poisson tropical de petite taille qui peut être élevé en grand nombre et à moindre coût, est doté d'une oreille interne présentant des similitudes avec l'oreille humaine. Des études précédentes ont détecté cinquante-deux mutants après mutagenèse chimique présentantdes anomalies du développement de l'oreille interne. Le clonage de leurs gènes défectueux et la caractérisation de leur phénotype sont en cours. L'un d'eux, mariner, un mutant du développement de la cellule ciliée, porte des mutations dans le gène de la myosine VIIA connue pour être défecteuse dans plusieurs formes de surdités héréditaires chezl'homme. D'autre part, dans le but de générer un modèle de surdité liée au vieillissement (presbyacousie), nous avons développé une méthode originale permettant d'identifier des mutants présentant une perte progressive de l'audition.
Dans les pays industrialisés, près d'un enfant sur mille est sourd profond. Dans environ 2/3 des cas, la surdité a une origine génétique : elle est parfois syndromique, mais le plus souvent la surdité est isolée.1 Une mutation (30delG) dans le gène de la connexine 26 (CX26) est la cause de la moitié des cas de surdité congénitale non syndromique à mode de transmission autosomique récessif (DFNB1).2 Dans la population caucasienne, on estime à 3% le taux de porteurs hétérozygotes de la mutation 30delG, une prévalence comparable à celle de la mutation responsable de la mucoviscidose.3 Compte tenu de la complexité de la structure de l'oreille interne, et sachant qu'un grand nombre de gènes est essentiel à la fonction auditive, il est remarquable que cette seule mutation contribue aussi largement au nombre total des cas de surdité congénitale.
Les pertes auditives liées à l'âge, ou presbyacousie, affectent une large proportion de la population. La presbyacousie découle du vieillissement des structures de l'oreille interne et des voies auditives centrales. Sa composante génétique et son héritabilité ont été démontrées récemment.4 De ce fait, les formes de surdités héréditaires progressives suscitent un regain d'intérêt car leur étude pourrait contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires des surdités liées à l'âge. L'identification et la caractérisation du gène codant pour un canal potassique (KCNQ4) exprimé dans la cochlée et les voies auditives centrales5 est, dans ce sens, tout à fait exemplaire. Des mutations dans ce gène sont détectées dans de larges familles atteintes de la surdité à mode de transmission autosomique dominante DFNA2.6,7. Les patients atteints présentent une perte auditive progressive associée à des troubles de l'équilibre débutant avant l'âge de 30 ans.
Parce que l'oreille interne humaine est un organe délicat et profondément enchâssé dans les rochers, il a été jusqu'à présent pratiquement impossible d'analyser les bases moléculaires de l'audition, de la fonction vestibulaire et des surdités en étudiant directement les cellules et les composants moléculaires. De ce fait, il est très utile d'identifier tous les gènes impliqués et de déduire la nature et la fonction des protéines pour lesquelles ils codent. Une approche consiste à cloner les gènes défectueux dans les diverses formes de surdités héréditaires. Au cours des six dernières années, cinquante-neuf gènes associés à des formes de surdité héréditaire ont été localisés sur les chromosomes humains, et déjà dix-neuf ont été identifiés par clonage positionnel et approche de gène candidat.8 A n'en pas douter, le rythme de ces progrès va aller en s'accélérant grâce aux données fournies par le séquençage du génome humain.
Une autre stratégie consiste à utiliser des modèles animaux (souris et zebrafish) pour l'identification des gènes responsables de surdités et troubles vestibulaires d'origine génétique. Cette approche alternative repose sur les similitudes entre leur système auditif et celui de l'homme, et les homologies génétiques inter-espèces.
Au cours des dix dernières années, le zebrafish (fig. 1) s'est progressivement imposé comme un modèle de choix pour l'étude du développement des vertébrés. D'une taille d'environ 3 cm, son élevage en laboratoire est aisé et relativement peu onéreux, son temps de génération est relativement court (deux à trois mois), et les accouplements produisent des couvées de 100 à 300 embryons optiquement transparents pendant les cinq à six premiers jours après fécondation (fig. 2). Ainsi, toutes les phases précoces du développement (des premières divisions cellulaires à l'organogenèse) sont aisément observables sous microscope, in vivo et en temps réel. De ce fait, les expérimentations ayant trait au développement tout comme l'observation d'anomalies morphologiques sont grandement facilitées. Les méthodes d'analyse moléculaire et génétique appliquées au zebrafish sont déjà très performantes et continuent d'être développées à grande vitesse.
Tout comme chez l'homme, le zebrafish est doté d'une oreille interne qui pourvoit à la fonction auditive et au maintien de l'équilibre. Elle est composée de trois canaux semi-circulaires, de trois organes otolithiques (la saccule, l'utricule, la lagena) (fig. 3) et de leurs épithélia neuro-sensoriels composés, tout comme chez l'homme, de cellules ciliées et de cellules de soutien. La cellule ciliée est le récepteur sensoriel qui détecte les ondes sonores et les mouvements de la tête. A sa surface, elle porte une touffe ciliaire composée de stéréocils, présentant une polarisation des plus courts aux plus longs stéréocils.
Les caractéristiques morphologiques, électrophysiologiques, biochimiques et moléculaires des cellules ciliées sont largement conservées dans le cours de l'évolution du poisson à l'homme. De ce fait, il est admis que la séquence des gènes, leur fonction et la structure des protéines pour lesquelles ils codent et qui constituent la cellule ciliée, présentent des homologies qui motivent et valident l'utilisation de ce modèle animal pour une meilleure compréhension des bases moléculaires du système auditif et vestibulaire de l'homme.
Pour étudier les gènes liés à une fonction donnée, une approche classique consiste à générer des mutants porteurs d'anomalies dans la séquence d'ADN des gènes impliqués dans cette fonction. Ces mutants sont produits par mutagenèse chimique, une méthode consistant à altérer de façon ponctuelle et aléatoire la séquence nucléotide d'un très grand nombre de gènes en exposant les cellules germinales au N-éthyl-N-nitroso-urée (ENU), un agent alkylant. Ce traitement peut induire des pertes de fonction qui sont transmises de façon mendélienne par croisements successifs. Les milliers de mutants ainsi générés, chacun porteur de mutations différentes, sont alors criblés afin de détecter des anomalies morphologiques observées à différents stades dans divers systèmes. Utilisant cette stratégie à grande échelle, deux projets parallèles menés à Bostona et à Tübingenb ont généré une collection de plus de 2000 zebrafish porteurs de mutations affectant le développement entre autres, de la rétine, du système cardiovasculaire, des arcs branchiaux, du système hématopoïétique et des organes du système digestif.9-12Cinquante-deux mutants présentent des anomalies de développement de l'oreille interne, et sont également en cours de caractérisation. Déjà, nombre des gènes responsables ont été clonés. Ces travaux vont grandement contribuer à la compréhension du développement des vertébrés, et à celui de leur oreille interne en particulier.
A Tübingen, huit mutants nageant continuellement en cercle et en vrille et donc atteints de trouble de l'équilibre, ont été identifiés.13,14 Leur caractérisation morphologique et électrophysiologique évoque une possible atteinte dans le processus de mécano-transduction des cellules ciliées. Ces cellules convertissent les stimulations mécaniques vibratoires en modulation de potentiels membranaires, initiant la transmission de l'information sonore vers le cerveau. Ernest et coll. ont cloné, par approche de gène candidat, le gène défectueux chez l'un de ces mutants, mariner. Mariner présente des mutations dans le gène de la myosine VIIA. Cette protéine est exprimée dans les cellules ciliées durant le développement de l'oreille interne du zebrafish.15Les cellules ciliées de ces mutants présentent à leur surface, une désorganisation dans l'arrangement des stéréocils (fig. 4). Ce phénotype est similaire à celui de la souris shaker-1 mutante dans le gène murin codant pour la myosine VIIA. Chez l'homme, des mutations dans ce gène sont responsables de trois formes de surdités héréditaires : 1) le syndrome de Usher (type 1B), associant surdité, trouble de l'équilibre et cécité ; 2) DFNA11, une forme de surdité progressive à mode de transmission dominante, et 3) DFNB2, une surdité congénitale récessive. Mariner constitue le premier modèle zebrafish de surdité génétique chez l'homme. Les sept autres mutants de l'oreille interne pourraient constituer également des modèles génétiques permettant d'identifier et d'étudier la fonction de nouveaux gènes spécifiques aux fonctions auditives et vestibulaires.
Dans le but d'identifier des gènes associés aux surdités et aux troubles vestibulaires résultant de processus dégénératifs liés à l'âge, nous avons mené au laboratoire Eaton-Peabody à Bostonc, un projet de crible basé sur une mutagenèse chimique à l'ENU.16 Nous avons généré une population de zebrafish adulte de près de 7000 mutants, puis avons développé une méthode de criblage permettant de tester leur audition de façon rapide, fiable et automatisée. Cette méthode consiste à analyser la réponse de fuite que présente le zebrafish exposé à une intense stimulation sonore de 400 Hz, la fréquence à laquelle les zebrafish sont les plus sensibles. Ce comportement de fuite stéréotypé, appelé réflexe de Mauthner, se manifeste par une contraction réflexe de la musculature d'un hémitronc, aisément distinguable du mouvement natatoire normal par analyse d'images vidéo acquises de façon synchrone à la stimulation sonore. Afin de détecter les mutants sourds parmi les poissons issus de la mutagenèse, nous avons testé la population mutante à l'âge de trois, puis neuf mois. Dix zebrafish présentant une réponse normale à trois mois, mais ne répondant plus à la stimulation sonore à neuf mois, ont été identifiés. S'agissant peut-être d'un phénotype à transmission autosomique dominant de perte progressive de l'audition, pour chacun des dix, une large progéniture hétérozygote a été générée afin de confirmer la nature génétique et mendélienne de cette perte de fonction. Les mutants sont destinés à être caractérisés morphologiquement et électrophysiologiquement, avant analyse génétique pour le clonage des gènes défectueux. S'il
s'avère que ces gènes ont des homologues humains, ces mutants pourraient constituer des modèles d'étude de certaines formes de presbyacousie.
Récemment, les progrès ont été spectaculaires en génétique moléculaire de l'audition. Au cours des six dernières années, dix-neuf gènes essentiels ont été identifiés par analyse génétique auprès de familles atteintes de surdités héréditaires non syndromiques. L'utilisation du zebrafish constitue une approche alternative et complémentaire pour l'identification et l'analyse fonctionnelle des gènes de l'audition. Ainsi, des mutants du développement de l'oreille interne ou présentant des pertes auditives progressives ont été générés permettant le clonage des gènes défectueux. La corrélation avec le phénotype permettra de contribuer à une meilleure compréhension des bases moléculaires du système auditif et de développer de nouveaux moyens diagnostiques, préventifs et thérapeutiques des surdités chez l'homme.