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Die Strecke nach Lauterbrunnen erhielt gegenüber der alten Planung zwei Zahnstangenrampen, so daß durch günstigere Linienführung kein rutschgefährdeter Steilhang angeschnitten werden mußte. Die planmäßie Inbetriebnahme der BOB erfolgte pünktlich zum vorgesehenen Termin am 1. Juli 1890.
Mit der Verbesserung der Verbindung von Bern her und der Eröffnung der weiterführenden Bahnen von Lauterbrunnen nach Mürren (1891), von Wilderwil zur Schynigen Platte (1893) und der Wengernalpbahn (1893) stiegen die Beförderungszahlen der BOB rasch an.Gleisanlagen und Stationsgebäude wurden bereits 1893 erweitert.
Ab 1906 wurden Überlegungen angestellt, die Strecke zu elektrifizieren. Nach Errichtung der Kraftwerke Lauterbrunnen und Burglauenen der Jungfraubahn ergab sich die Möglichkeit, überschüssige Energie preiswert zu beziehen.Die BOB elektrifizierte daher ihre beiden Strecken mit dem auch schon bei der Wengernalpbahn eingeführten Gleichstromsystem von 1500 V und fuhr ab dem 17.3.1914 elektrisch. Die Dampflokomotiven wurden ausgemustert und größtenteils verkauft. Nach dem zweiten Weltkrieg erhielt die BOB neue moderne Triebwagen in mehreren Serien (1949, 1965, 1979 und 1986). Oberbau und Fahrstromversorgung wurden verstärkt, die einfache Fahrleitung durch eine niedrige Kettenfahrleitung ersetzt. Durchgehender Streckenblock und die 1970 erstellte ferngesteuerte Ausweiche Sandweid erhöhten die Streckenkapazität; eine neue zentrale Hauptwerkstätte in Zweilütschinen vergrößerte die Werkstattkapazität der BOB. Neben den Hauptuntersuchungen an BOB-Fahrzeugen können im Bedarfsfall auch die der anderen Bahnen der Jungfrauregion in Zweilütschinen durchgeführt werden.
Die Strecke nach Lauterbrunnen folgt dem Lauf der Weißen Lütschine aufwärts. Sie steigt mit zwei Zahnstangenrampen von 6,0 % und 12,0 % auf die Höhe von Lauterbrunnen (797 m). Am Ende besteht Anschluß an die Wengernalpbahn sowie an die Bergbahn Lauterbrunnen-Mürren. Die Strecke nach Grindelwald wendet sich hinter Zweilütschinen nach Osten und folgt dem Lauf der Schwarzen Lütschine. Die Höhe von Grindelwald auf 1034 m wird mit Hilfe von ebenfalls zwei Zahnstangenrampen von 12,0 % und 10,7 % Maximalsteigung erreicht. Auch in Grindelwald besteht Übergang zur Wengernalpbahn, deren beide Strecken sich auf der Kleinen Scheidegg treffen.
Der Betrieb auf dem Y-förmigen BOB-Netz wurde bereits ab 1890 im Prinzip so wie heute durchgeführt: die nach Grindelwald und Lauterbrunnen bestimmten Züge werden von Interlaken Ost bis Zweilütschinen vereint geführt und dort getrennt. Der vordere Zugteil ist der nach Lauterbrunnen und verläßt Zweilütschinen als erster. Der hintere Zugteil fährt nach Grindelwald. In Gegenrichtung werden die beiden Züge zu einem einzigen gekuppelt. Die ohnehin einfachen Rangiervorgänge werden durch automatische +GF+-Kupplungen vereinfacht. Die Bahnen der Jungfrauregion (BOB, WAB und JB) sind in einem gemeinsamen Fahrplanfeld zusammengefaßt, das einander anschließende Zugverbindungen Interlaken Ost-Lauterbrunnen-Wengen-Kleine Scheidegg-Jungfraujoch und Interlaken Ost-Grindelwald-Kleine Scheidegg-Jungfraujoch (sowie in Gegenrichtung) aufweist.