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Chemie | Biochemie | Medizin
Nina Kunz, 2004 | Aarau, AG
Adeno-assoziierte Viren (AAV) sind kleine Viren mit einem einzelsträngigen DNS-Genom von 4,7kb Länge. AAV werden als Vektoren in der Gentherapie eingesetzt, da sie nicht pathogen sind. AAV können zwar Wirtszellen infizieren, sich jedoch nicht selbstständig replizieren. Dazu ist normalerweise eine Ko-Infektion mit einem Helfervirus, z.B. mit einem Adeno- oder einem Herpesvirus, notwendig. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Replikation auch stattfinden kann, wenn die mit AAV2 infizierten Zellen mit UV-Strahlung oder Hydroxyurea (zellulärer Stress) behandelt werden. Zudem wurde untersucht, welcher Replikationsmechanismus (Rolling Hairpin Replication oder Rolling Circle Replication) dabei mehrheitlich auftritt.
Fragestellung
(I) Kann eine Replikation des Adeno-assoziierten Virus Typ 2 (AAV2) in Verozellen mit Hilfe von Hydroxyurea oder UV-Strahlung hervorgerufen werden und wenn ja, mit welcher Effizienz? (II) Welcher Replikationsmechanismus (Rolling Hairpin Replication oder Rolling Circle Replication) findet statt, wenn die Replikation durch zellulären Stress induziert wird
Methodik
Ob UV-Strahlung oder Hydroxyurea eine Replikation des AAV2 in Verozellen induzieren kann, wurde mit Hilfe von indirekter Immunfluoreszenz untersucht. Dazu wurde der Antikörper Anti-Rep verwendet, welcher an das Rep-Protein von AAV2 bindet. Rep-Proteine werden für die Replikation der DNS des AAV2 gebraucht, weshalb angenommen werden kann, dass sich die AAV2 DNS beim Vorhandensein von Rep-Protein repliziert bzw. das Rep-Protein exprimiert wird. Zur Analyse der Replikationsformen von AAV2 bei einer Replikation induziert mittels UV-Strahlung oder Hydroxyurea wurde die virale DNS mittels Hirt DNS-Extraktion aus den Verozellen extrahiert. Anschliessend wurde jede Probe halbiert und eine Hälfte mit dem Restriktionsenzym HindIII geschnitten. Mittels Southern Analyse wurden die entstandenen DNS-Fragmente visualisiert. Als Sonde wurde eine rep-Sonde verwendet, welche spezifisch in der rep-Kodierungssequenz bindet.
Ergebnisse
Sowohl die Behandlung mit UV-Strahlung, wie auch mit Hydroxyurea, führten zur Expression des Rep-Proteins und lieferte somit ein Hinweis auf effiziente Replikation. Dabei zeigte jedoch die UV-Behandlung mit 200µJ für 1s die stärkste Synthese des Rep-Proteins. Alle AAV2 infizierten Proben zeigten in der Southern Analyse eine Bande bei 3kb. Bei allen mit HindIII geschnittenen Proben war zudem noch eine Bande bei 4,7kb sichtbar. Im Gegensatz dazu waren bei der Kontrolle, bei welcher eine Ko-Infektion mit HSV-1 durchgeführt wurde und welche zusätzlich mit HindIII geschnitten wurde, noch weitere Banden bei 1,9kb und 3,8kb sichtbar.
Diskussion
Es war sowohl durch die Zugabe von Hydroxyurea, sowie auch durch die Behandlung mit UV-Strahlung möglich, AAV2 Rep-Proteine ohne eine Ko-Infektion mit einem Helfervirus zu generieren. Dabei hatte die Behandlung der Zellen mit UV-Strahlung von 200µJ für 1 Sekunde am besten funktioniert. Damit eine Aussage über die optimale UV-Strahlendosis getroffen werden kann, müsste die Menge der erhaltenen Rep-Proteine mit der Anzahl der lebenden respektive toten Zellen in Verbindung gebracht werden. Aus den in der Southern Analyse nachgewiesenen Banden kann vermutet werden, dass sich AAV2 bei einer Behandlung mit UV-Strahlung oder der Zugabe von Hydroxyurea mittels der Rolling Circle Replikation vermehrt.
Schlussfolgerungen
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich AAV2 ohne die Zugabe eines Helfervirus replizieren kann und dass eine solche Replikation vermutlich mittels der Rolling Circle Replikation stattfindet.
Würdigung durch die Expertin
Sereina Sutter
Für diese Arbeit hat die Jungforscherin grossen Einsatz gezeigt. Die Fragestellung fokussierte sich darauf, ob induzierter zellulärer Stress zur Replikation des ansonsten Helfervirus-abhängigen Adeno-assoziierten Virus Typ 2 führt und welcher Replikationsmechanismus dabei verwendet wird. Nina Kunz konnte einerseits zeigen, dass Replikation induziert wird und andererseits, dass es sich vermutlich um eine sogenannten Rolling Circle Replikation handelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit ergeben weitere wichtige Informationen zur Biologie dieses für die Gentherapie relevanten Virus.
Prädikat:
sehr gut
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Alte Kantonsschule Aarau
Lehrerin: Monika Eggenschwiler