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Die ersten Jahrzehnte der neugegründeten Universität verliefen bewegt, die Immatrikulationen schwankten von Jahr zu Jahr, es kam zu intensiven Auseinandersetzungen um den Charakter und die Ausrichtung der Hohen Schule und die Sicherung der Finanzen blieb eine ständige Aufgabe. Dennoch war die erste Generation auch im Vergleich zu anderen Neugründungen aus der gleichen Zeit durchaus erfolgreich. In den 80er und zu Beginn der 90er Jahre gingen die Immatrikulationen dann allerdings so deutlich zurück, dass sich der Rat in einer politisch schwierigen Zeit zu fragen begann, ob er die Universität schliessen solle.
Mitte der 1490er Jahre hat der Rat mehrmals über den Zustand der Universität und sogar über deren Aufhebung diskutiert. Zur gleichen Zeit erfolgte eine gewisse humanistische Neuausrichtung: Ein Lehrauftrag für Poesie wurde an Sebastian Brandt vergeben und der renommierte Jurist Ulrich Krafft, ehemaliger Student des kanonischen Rechts in Basel und Rektor der Universität Freiburg, wurde als Professor eingestellt. Damit verbunden war ein Anstieg der Immatrikulationen, aber auch eine deutliche Ausgabensteigerung.
So wurde 1501, im Jahr als sich Basel der Eidgenossenschaft anschloss, nach längeren Beratungen zwar explizit festgehalten, «dz man die Universitet nit verlossen soll». Gleichzeitig aber beschloss man, einen neuen Vorstoss in Sachen Pfründen zu unternehmen und die Privilegien der Universitätsangehörigen weiter einzuschränken. 1504 unternahm Basel dementsprechend auf der Tagsatzung einen neuen Vorstoss, seine in der Eidgenossenschaft liegenden Pfründen endlich zu inkorporieren und zugleich eine Landesuniversität für die Eidgenossenschaft zu werden. Beide Vorstösse scheiterten.
Eidgenössische Studenten besuchten auch zu Beginn des 16. Jahrhunderts weiterhin und in zunehmendem Masse deutsche Universitäten. Dagegen nahmen die Immatrikulationen von Studenten aus dem Reich in Basel als Folge des Schwabenkrieges von 1499, aber auch des Beitritts von Basel zur Eidgenossenschaft deutlich ab.
Die «Liebtat»: Eingliederung der Pfründen in den städtischen Haushalt
In dieser finanziell angespannten Situation zog der Rat 1507 die Konsequenzen aus der unbefriedigenden Situation und regelte die finanziellen Beziehungen zur Universität neu. In einer Phase schrumpfender städtischer Budgets beschloss er jährlich 200 Gulden als «Liebtat» für die Besoldung der Dozenten bereitzustellen. Im Gegenzug wurden die Erträge aus den Pfründen, die seit 1504 die bisherigen persönlichen Leistungen der Inhaber dieser Pfründen abgelöst hatten, in den Staatshaushalt integriert. Dadurch reduzierte sich die finanzielle Nettobelastung der Stadt für die Hohe Schule beträchtlich. So konnte Basel in den folgenden Jahren jeweils etwa ein Drittel seiner Auslagen für die Universität durch Pfründenerträge ausgleichen. Im Gegenzug zur finanziellen Sicherung der Universität auf bescheidenem Niveau mussten ihre Mitglieder auf die Befreiung vom Fleischumgeld verzichten. Bereits seit 1474 bezahlten sie zudem das Mehlumgeld, von dem sie der Freiheitsbrief zunächst ebenfalls freigestellt hatte. Diese Konsolidierung der universitären Finanzen und ihre enge Verschränkung mit dem städtischen Haushalt führte zu einer deutlichen Einschränkungen der Privilegien für die Universitätsangehörigen und ging zugleich mit einer zunehmenden Regionalisierung der Universität einher.
Die Entlassung von vier Gegnern der Reformation 1523
Schon die ersten Auseinandersetzungen im Zuge der reformatorischen Bewegung führten auch in der Universität zu Konflikten. So nahmen am demonstrativen Spanferkelessen in der Fastenzeit 1522, das im Klybeckschloss stattfand, auch Angehörige der Universität teil. Anschliessend versuchten sie, die Wahl eines neuen Rektors durchzusetzen. Die Institution aber war ein konservativer Hort der Gegner der Reformation: Dem Lektor Bonifaz Wolfhart wurde wegen des Fastenbruchs die Lehrerlaubnis entzogen und der Rektor des Wintersemesters 1522/23 schmückte seinen Eintrag in der Rektoratsmatrikel mit einer Klage über den Reformator Luther.
Schon im nächsten Jahr kam es zu einer ersten Eskalation. Vier Professoren, Johannes Gebweiler, Mauricius Finninger, Johannes Mörnach und Johannes Romanus Wonnecker, denunzierten anlässlich einer Visitation in der Fastenzeit 1523 zwei beliebte Reformprediger, Lüthart und Konrad Pellikan, beim Provinzial der Barfüsser. Als diese beiden daraufhin versetzt werden sollten, forderte der Rat die Rücknahme der Strafversetzung und entzog den vier Professoren ihre Besoldung. Im folgenden Juni setzte er statt dessen Pellikan und Johannes Oekolampad, den späteren Basler Reformator, als Theologieprofessoren ein. Die Universität wehrte sich gegen dieses Vorgehen und die Juristen wählten Mörnach ostentativ noch vier mal zum Dekan. Die Theologen nahmen Oekolampad und Pellikan nicht in die Fakultät auf und die Rektoren sprachen in den Einträgen der Rektoratsmatrikel unisono von der «pestis animarum», der Seelenpest und dem Unfrieden der Zeit.
Die Universität auf dem Höhepunkt der reformatorischen Unruhen
In den folgenden Jahren spaltete sich die Universität zusehends in zwei Lager auf. Als Anhänger der Reformation standen Oekolampad, der Mediziner Oswald Baer und der Artist Torinus, den Skeptikern und sogenannt Altgläubigen gegenüber - dem Theologen Ludwig Baer, den Juristen Cantiuncula und Amerbach, wie auch Sichart und Glarean, die ihre reformationsfreundlichen Positionen in der Folge des Bauernkriegs revidiert hatten. Die Konflikte eskalierten weiter; die Immatrikulationen nahmen drastisch ab, so dass sich im Dezember 1528 nur noch ein einziger Student an der Universität Basel immatrikulierte, Caspar Schüfelbiel aus Münster im Aargau.
Auf dem Höhepunkt der Unruhen verliessen 1529 mit dem Domkapitel auch verschiedene Professoren und Studenten die Stadt und zogen nach Freiburg. Allerdings scheint in den nächsten Jahren, entgegen der in der älteren Forschung verbreiteten Auffassung, der Universitätsbetrieb nie ganz eingestellt worden zu sein und so fand 1531, während des sogenannten Interregnums, die erste öffentliche anatomische Sektion an der medizinischen Fakultät unter Oswald Bär statt, dem letzten Rektor vor dem Durchbruch der Reformation 1529 und dem ersten nach der «Wiedereröffnung» der Universität 1532. Sie sollte am Anfang einer langen Erfolgsgeschichte der Basler Anatomie stehen.