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Was ist eine Genbank?
Im Allgemeinen versteht man unter einer Genbank größere, in Vektoren gespeicherte Abschnitte von DNA, also eine systematische Sammlung von DNA-Molekülen.
Eine genomische DNA Bank besteht aus rekombinanten Mikroorganismen, die jeweils einzelne Fragmente vom gesamten Genom eines Organismus enthalten. Insgesamt ist durch die aufgenommenen Fragmente das ganze Genom abgedeckt.
Eine spezielle Form der genomischen DNA-Banken sind subgenomische DNA-Banken. Diese enthalten nicht das gesamte Genom, sondern ein kleineres, recht gut charakterisiertes Fragment.
Wie stellt man eine Genbank her?
- DNA aus Gewebe isoliert
- geeigneter Vektor ausgewählt
- DNA in kürzere Fragmente zerschnitten (RE) (dürfen Aufnahmekapazität des Vektors nicht überschreiten, sonst nicht aufgenommen und später in der Bank nicht vorhanden
- DNA mit dem Vektor ligiert
- in λ-Phagenköpfe verpackt oder durch direkte Transformation Vektor mit der DNA in den Wirt eingebracht.
Danach kann die Bank zur Identifikation eines gewünschten Klons gescreent oder für die Langzeitlagerung amplifiziert werden.
Welche Vektoren werden verwendet?
- Lambda oder Cosmid Vektoren (Phagen 10-20 kb inserts, Cosmide 30-40
kb)
- hohe Klonierungseffizienz
- relativ große Fragmente aufnehmen
- Yeast artificial chromosome Vektoren (in Hefezellen)
- 0.3 bis 1.2 Mb genomischer DNA
Wie groß muss eine Genbank sein?
Die Schwierigkeit bei der Herstellung von DNA Banken besteht darin, sicherzustellen, dass zumindest eine Version jeder Sequenz von Interesse enthalten ist.
Wenn das Zielfragment zuvor gereinigt werden konnte, kann die Gesamt-Klonanzahl reduziert werden (z.B. bei subgenomischen DNA-Banken).
Was ist eine cDNA Bank?
Sie beinhaltet lediglich jene DNA, die komplementär zur vorhandenen mRNA im untersuchten Zell- oder Gewebetyp ist. Dies sind also nur jene mRNAs, die gerade in der Zelle aktiv sind. Je häufiger die jeweiligen Gene abgelesen und transkribiert werden, desto häufiger ist dann auch die cDNA in der Bank vertreten.
Weil nur rund 5% der gesamten RNA einer Zelle mRNAs sind, werden diese angereichert, damit sie im Verhältnis zu anderen RNAs (ribosomale RNAs, etc.) häufiger in der cDNA Bank vorkommen.
Außerdem enthalten cDNA Banken nur solche mRNAs, die ein Poly(A)-Tail besitzen. Kurzlebige mRNAs (z.B. Histon mRNAs) haben kein Poly(A)-Tail und sind deshalb in cDNA Banken nicht vorhanden.
Wie wird eine cDNA Bank hergestellt?
- gesamte isolierte RNA auf einem speziellen Medium inkubiert.
- An diesem Trägermix (z.B. Agarose) sind Oligo(dT)-Primer gekoppelt.
- An diese Oligo(dT)-Polynukleotide lagern sich all jene RNAs an, die ein Poly(A)-Tail besitzen
- Die anderen RNAs können eluiert werden.
- aus der gereinigten mRNA DNA gemacht werden.
- Dazu wird das Enzym Reverse Transkriptase eingesetzt. Diese braucht, wie jede Polymerase, einen Primer
- zwei verschiedene Primer eingesetzt
- Oligo(dT) Primer (zu jeder mRNA eine einzige vollständige cDNA synthetisiert werden
- zufälligen Hexamer-Primern (jede mögliche Kombination ist vorhanden), binden irgendwo an die mRNA, weshalb die cDNA meist in mehrere Stücke zerteilt synthetisiert wird. Ein weiterer Nachteil dieser Primer ist, dass sie nicht auf mRNA spezifisch sind.
- cDNA muss jetzt noch mit einer DNA-Polymerase doppelsträngig gemacht werden.
- Die 5‘ Enden der mRNAs sind allerdings alle unterschiedlich, was das Finden eines passenden Primers erschwert.
- mRNAs mit einer RNAse teilweise abbauen, damit die Polymerase an den so entstehenden freien 3‘ OH Enden die Synthese beginnen kann. Diese cDNA enthält aber nicht mehr die vollständige Sequenz
- vor der cDNA-Synthese ein Oligonukleotid bekannter Sequenz an das 5‘ Ende der gereinigten mRNAs zu ligieren. Ein zu diesem Oligonukleotid komplementärer Primer kann dann für die Doppelstrangsynthese mittels PCR eingesetzt werden. Mit dieser Methode ist die entstehende Sequenz vollständig.
- Vor der Ligation der cDNA mit dem ausgewählten Vektor müssen schließlich noch Linker an die Enden der cDNA ligiert werden, die der jeweiligen Restriktionsschnittstelle entsprechen.
Vorteile von cDNA Banken?
Vortiele durch Analyse von mRNA
- Es kann unmittelbar auf die AS Sequenz des Proteins geschlossen werden
- hnRNA (unprozessierte präRNA) kann udrch alternatives splicen zur Entstehung unterschiedlicher Varianten eines Proteins führen. Für Identifizierung dieser Varianten muss mRNA analysiert werden
- cDNA kann zur in-vitro und in-vivo Herstellung des Proteins verwendet werden (bei genomischea auf Grund von Exons/Introns nicht möglich, Prokaryoten können nicht splicen)
Was sind die Nachteile der cDNA Bank?
- RNA ist im Vergleich zur DNA instabil, im basischen ins OH am C2 der Ribose eine Schwachstelle
- Alle Organismen Enzyme zum effektiven Abbau von RNA (Regulation der Genaktivität, Schutz gegen RNA-Viren). (mRNA möglichst gleich nach der Isolierung weiterverarbeitet oder schockgefroren werden.)
- Die Analyse von RNA ist recht kompliziert, da viele molekularbiologische Methoden nur für DNA geeignet sind
- Der Anteil einer bestimmten mRNA an der gesamt-mRNA ist variabel und hängt von Gen, Gewebe, Stadium und Differenzierung des Organismus ab, Für cDNA Banken ist die Bestimmung der zu screenenden Klonanzahl daher schwieriger, weil nicht genau bekannt ist, wie viel von der Zielsequenz von Anfang an vorhanden war. Die Menge des entsprechenden Proteins im untersuchten Gewebe ist oft ein guter Indikator für die Menge an mRNA.