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Das musst du wissen
- Forschenden gelang es, nackte DNA oder RNA in Muskeln von Mäusen zu spritzen, um ausgewählte Proteine zu produzieren.
- Daraufhin begann die Forschung an der Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs auf Basis von DNA.
- DNA wurde bevorzugt, da man diese damals, anders als RNA, im grossen Massstab herstellen konnte.
«Instabil!» Wie oft werden mRNA-Pioniere diesen Spruch schon gehört haben, der zum Verzicht auf vielversprechende Forschungen führte, den Geldbeutel von Geldgebern oder Pharmaunternehmen verschloss und mitunter ihre Karrieren entgleisen liess?
Es stimmt, dass mRNA «instabil» ist, wie Biologen sagen. Was für dich und mich fragil bedeutet. Und unnütz in der Sprache der Pharmakonzerne. Wie wir sehen werden, widerspiegelt es einfach ihre anhaltende Geringschätzung der mRNA.
Sobald RNA in Lebendes gelangt, wird sie von bestimmten Molekülen zerstört, die sich durch die Evolution darauf spezialisiert haben, und zwar sowohl innerhalb als auch ausserhalb der Zelle. In Gegenwart dieser Biester, die sie verschlingen sollen, beträgt die Lebensdauer der mRNA im Organismus nur wenige Minuten.
Sibirische Mammuts
Im Gegensatz dazu scheint die DNA ein Monument der Stabilität zu sein. Und zwar so stabil, dass intakte Fragmente davon in Mammutfossilien gefunden wurden, die seit Hunderttausenden von Jahren im sibirischen Permafrost vergraben waren. Wir beginnen jetzt auch, DNA als Medium zu nutzen, um digitale Informationen unbegrenzt zu speichern.
Dieser Unterschied erklärt grösstenteils, warum die ersten RNA-Transfektionen vorübergehend in eine wissenschaftliche Sackgasse geraten sind. Die RNA-Transfektion ist der Prozess, bei dem eine synthetische mRNA in eine Zelle geschickt wird, um die für die Produktion von Proteinen benötigte Information zu liefern.
Besser steht es um die Cousine DNA: Ihr Ruf der Stabilität, aber auch die Entscheidungen von Wissenschaftlern und Managern von Pharmaunternehmen wie Merck, die diese Technologien zu den ersten Patienten bringen werden, machen sie zum Liebling der Molekularbiologen. Die Geschichte, die du gleich lesen wirst, ist der Anfang der Erklärung für die erstaunliche Abwesenheit von Big Pharma im Rennen um Impfstoffe gegen Covid im Jahr 2020.
Der Gentherapie-Boom
Lass uns zurückblicken, und zwar auf das Jahr 1987, als Syntex seine Arbeit an Liposomen einstellte (siehe Folge 1). Damals gründete Phil Felgner zusammen mit anderen Professoren der Universität von San Diego ein Unternehmen, das zunächst antivirale Medikamente gegen AIDS entwickeln sollte: Vical.
Damals wollten alle Unternehmer rund um das Salk Institut die aufkommende Chance der Gentherapie nutzen. So auch der Molekularbiologe Inder Verma, der Viagene gründete, um virale Vektoren zu entwickeln. Bei Vical, das sich in den ehemaligen Räumlichkeiten eines Zyklotrons in San Diego niedergelassen hat, hat Phil Felgner noch nicht aufgegeben. Er glaubt, dass seine Liposomen medizinische Anwendungen haben können. Er lud Robert Malone ein, sich ihm anzuschliessen.
«Nur sehr wenige Menschen können in die Zukunft sehen, und Malone konnte es. Wir hatten damals die gleiche Vision», erklärt Phil Felgner. Er hatte es geschafft hatte, mRNAs in Zellkulturen zu exprimieren. Nun, mussten wir beweisen, dass es auch in vivo möglich ist.» Robert Malone hatte die Anfänge dieses Nachweises mit Frosch-Embryonen erbracht. Aber in der Molekularbiologie ist die Labormaus das Tier der Wahl für die in vivo Verifizierung.
Verblüffung in vivo
Als er an die Universität von San Diego kam, um Theodore Friedman, den Pionier der Gentherapie, zu konsultieren, stiess Phil Felgner auf einen seiner Postdocs, Jon Wolff. «Jon erklärte mir, dass er eine Stelle an der Universität von Wisconsin in Madison annehmen würde. Und, dass es dort Laborratten gibt.» Malone, Wolff und Felgner entwarfen dann ein Experiment, um zu sehen, ob nicht nur DNA, sondern auch mRNA, das von Liposomen transportiert wird, Proteine in den Muskelzellen dieser Ratten exprimieren kann.
Jon Wolffs Ergebnisse aus Madison brachten zunächst grosse Zufriedenheit. Dann setzt das Staunen ein. Die Daten zeigten, dass das Niveau der Proteinexpression in den Muskeln der Mäuse mit den besten Ergebnissen vergleichbar waren, die durch Transfektion von Zellen in vitro erzielt wurden. «Es hat auf Anhieb funktioniert, genauso gut mit RNA wie mit DNA», sagt Felgner. «Es war also die erste erfolgreiche Transfektion von genetischem Material in lebenden Säugetieren mit Lipid-Nanopartikeln. Aber da war noch was.»
Wissenschaftlich rigoros hatten die Chemiker von Vical auf Kontrollexperimente bestanden: Injektionen von Liposomen kombiniert mit RNAs und DNAs, um Luziferase und andere Marker zu exprimieren, aber auch von Liposomen allein und DNAs und mRNAs allein. Experimente mit den «nackten» DNAs oder RNAs ergaben ähnliche oder höhere Werte der Proteinexpression als die in Fett umhüllten.
«Zuerst dachte Jon Wolff, seine Assistenten hätten die Mäuse oder die Daten verwechselt. Aber wenn man sie wiederholte, waren die Ergebnisse immer die gleichen: Nackte RNA, die in den Muskel eines Tieres gespritzt wurde, wurde als Protein exprimiert», betont Robert Malone.
Ausserdem war lokal, also in der Nähe der Injektionsstelle, die Konzentration dieser Proteine recht hoch. Trotz der elektrischen Abstossung zwischen der Zelloberfläche und der RNA und DNA waren einige Zellen in der Lage, das Molekül aufzunehmen. Das war damals unverständlich. «Später erkannten wir, dass temporäre Risse in den Muskelzellmembranen während der Injektion das Eindringen von DNA oder RNA in die Zellen ermöglichen», sagt Phil Felgner.
Die Folgen dieser Entdeckung waren entscheidend. Vical meldete sofort ein Patent an, noch vor der Veröffentlichung dieser Arbeit im Fachmagazin Science im März 1990. Die Möglichkeit, nackte DNA oder RNA in die Muskeln von Patienten zu spritzen, um ausgewählte Proteine zu produzieren, eröffnete ein neues therapeutisches Feld. Warum nicht die Zellen eines Diabetikers das Insulin produzieren lassen, das er braucht? Das Gleiche bei Gerinnungsfaktoren für Bluter? Oder Erythropoietin zur Erhöhung des Volumens der roten Blutkörperchen im Blut von Patienten, die sich einer Chemotherapie unterziehen?
Mit Ausnahme vielleicht der roten Blutkörperchen war dieser Ansatz angesichts des Ausmasses dieser Krankheiten nicht realistisch. Denn obwohl viele Muskelzellen Proteine exprimierten, war die Ausbeute immer noch nicht ausreichend, um in den drei Litern Plasma im Blutkreislauf wirksam zu sein. «Ausserdem», ergänzt Phil Felgner, «war es ärgerlich, dass sich bei diesen Experimenten manchmal eine Immunreaktion gegen das exprimierte Protein entwickelte.»
Auf den Spuren der Impfstoffe
In diesem Zusammenhang schienen Impfstoffe für nackte DNA oder RNA am vielversprechendsten. Denn es reichen schon geringe Mengen an Proteinen, sogenannten Antigenen, die für ein Virus oder ein Bakterium charakteristisch sind, um eine signifikante Immunantwort zu stimulieren. Ein Impfstoff strebt eine Immunantwort an. Und zwar entweder humoral, das heisst durch die Produktion von Antikörpern durch B-Lymphozyten, oder zellulär, durch die Rekrutierung von T-Lymphozyten. Diese zerstören die vom Virus oder den Bakterien infizierte Zellen.
Vical setzte mit dieser Entdeckung neue Prioritäten. Das Unternehmen wird sich auf Gentherapien konzentrieren und bei seinem Börsengang sofort 130 Millionen Dollar für deren Entwicklung einnehmen. Da der AIDS-Impfstoff in aller Munde ist, wird Phil Felgner zunächst gemeinsam mit Forschern der Universität San Diego eine nackte DNA entwickeln, die ein für das HIV-Virus spezifisches Protein kodiert, das GP120-Protein. Bei AIDS entspricht es dem berühmten Spike-Protein des Coronavirus: der Schlüssel, der ihm das Eindringen in Zellen ermöglicht. So wurden Antikörper in Mäusen produziert und die National Institutes of Health (NIH) finanzierten später eine klinische Studie.
Doch der Entscheid zugunsten der DNA versetzte den Träumen von Robert Malone einen herben Schlag. In den Hintergrund geschoben, ging er an die Northwestern University, um sein Medizinstudium zu beenden. Er legte seine mRNA-Forschung auf Eis und erzählte mir, dass dies bei ihm auch heute noch Übelkeit auslöst.
Unterdessen geht die Forschung bei Vical jedoch weiter. Da HIV ein besonders schwieriges Ziel für eine Impfung war, begannen zwei von Phil Felgners Assistenten, Suzanne Parker und Gary Rhodes, ähnliche Experimente mit der Grippe. Und diese erste Arbeit wurde den Forschern in den Labors von Merck in West Point, Pennsylvania, vorgestellt.
Merck setzt auf DNA
Maurice Hilleman, der Mikrobiologe, der damals die Impfstoffforschung von Merck leitete, war begeistert. Mit seiner Entwicklung von etwa vierzig Impfstoffen wie Masern, Mumps, Hepatitis A, Hepatitis B, Windpocken, Meningitis und Lungenentzündung war seine Unterstützung viel wert. Es wurde ein Vertrag aufgesetzt, laut dem Vical jährlich eine Million Dollar von Merck erhält, um die Entwicklung eines universellen Grippeimpfstoffs fortzusetzen.
«Die Herausforderung bestand darin, nicht nur Antikörper, sondern auch zytotoxische T-Zellen zu produzieren, also Zellen, die in der Lage sind, infizierte Zellen zu eliminieren», erklärt Margaret Liu, die damals eine Impfstoff-Forschungsgruppe bei Merck leitete, per Videokonferenz. Diese Frau, geboren als Kind chinesischer Eltern und aufgewachsen in Colorado, sollte später die «Mutter der DNA-Impfstoffe» genannt werden. DNA und nicht RNA – wir werden herausfinden, warum. «Da das Virus mutiert, hatten wir gehofft, dass diese Form der Gedächtnisimmunität das Problem umgehen würde und man nicht jedes Jahr einen neuen Impfstoff für jeden neuen Stamm entwickeln muss», sagt sie.
«Damals standen mehrere Richtungen offen», sagt Liu, die heute von San Francisco aus die WHO zu DNA- und mRNA-Impfstoffen berät. «Wir wollten Proteine ins Visier nehmen, die im Influenzavirus konserviert werden, um mit T-Zellen eine anhaltende Immunität zu erreichen, auch gegen neue Stämme.»
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Sie macht keinen Hehl daraus, dass es auch innerhalb von Merck Zweifel an den Chancen des Unterfangens gab. «Es schien ungefähr so bizarr wie die kalte Fusion», lächelt sie vor einem schwarz lackierten Paravent, der einen gewissen Hang zur Inszenierung zeigt. «Forschungen von Robert Malone, Phil Felgner und Jon Wolff hatten die Expression von Proteinen in Muskeln gezeigt, aber noch nicht in Zellen mit den antigenen Proteinen, die die zelluläre Immunantwort steuern.»
In diesem Zusammenhang traf Merck eine Entscheidung, die weitreichende Folgen hatte. Sie gibt der Entwicklung dieses Impfstoffs mit nackter DNA den Vorzug und vernachlässigt die mRNA. Eine Entscheidung, die mit dem Siegeszug der RNA-Impfstoffe heute dazu führt, dass sich manche rechtfertigen müssen. Wie John Donnely, der 25 Jahre lang als wissenschaftlicher Mitarbeiter bei Merck tätig war. Margaret Liu hat ihn in einer der E-Mails kopiert, die sie mir geschickt hat. Er greift spontan in den Austausch ein. «Zuerst versuchten wir es mit mRNA und die Ergebnisse waren gut, sogar besser als mit der DNA», schreibt er. «Aber wir mussten viel niedrigere Dosen verwenden als bei der DNA, weil wir mit der damaligen Standardmethode nur winzige Mengen herstellen konnten. Es war eindeutig kein marktfähiger Prozess. Ausserdem waren dafür teure Reagenzien erforderlich.»
Ein Rendite-Problem
Es ist so, dass selbst wenn die DNA einfacher zu verwenden ist als die RNA, es ein Problem mit der Rendite gibt. Einige Viren sind beim Einschleusen ihres Genoms in Zellen teuflisch effizient, und zwar so effizient, dass tausend Viren tausend Zellen infizieren können. Aber um tausend Zellen mit nackter oder in Liposomen verkapselter DNA zu transfizieren, muss man zehn Millionen Kopien einsetzen. Der Ansatz ist also zehntausendmal weniger effizient. Damals war es noch sehr schwierig, äquivalente Mengen an mRNA herzustellen und die Biotechnologien produzierten DNA in pharmazeutischer Qualität bereits in grossem Massstab.
«Die stabilere DNA schien uns eine bessere Chance zu haben», sagt Liu. Und Phil Felgner fügt hinzu: «Mercks Priorität war es, herauszufinden, ob es sich industrialisieren lässt. Aber bereits die Herstellung von nackter DNA, ohne virale Vektoren, war riskant.
Merck wird es jedoch nie gelingen, seinen nackten DNA-Grippeimpfstoff zu entwickeln. «Die DNA-Transfektion funktionierte bei kleinen, aber nicht bei grossen Tieren. Sie haben es mit immer grösseren Dosen von DNA versucht, aber es hat nicht funktioniert», sagt Malone.
Phil Felgner ist nuancierter: «Merck hatte es geschafft, alle Hürden der Industrialisierung zu überwinden und nachzuweisen, dass diese DNAs kein Risiko bergen, wenn sie mit der DNA der injizierten Probanden interagieren. Die Sicherheit war ausreichend. So konnten wir zu klinischen Studien am Menschen übergehen, um die Wirksamkeit dieses nackten DNA-Impfstoffs nachzuweisen.»
Flugzeugabstürze
Das Ergebnis ist enttäuschend. Obwohl es ihrer Gruppe gelang, in vivo zu demonstrieren, dass man Mäuse gegen verschiedene Influenzastämme schützen kann, verlor Margaret Liu die wissenschaftliche Leitung des Projekts. Und die klinischen Studien konzentrierten sich auf die Produktion von Antikörpern, statt auf T-Zellen, was ebenfalls eine Enttäuschung brachte.
Natürlich legte diese Forschung den Grundstein für die Entwicklung zukünftiger DNA-Impfstoffe. Sie werden aber in erster Linie für veterinärmedizinische Zwecke eingesetzt, um zum Beispiel das Aussterben des vom West-Nil-Virus bedrohten kalifornischen Kondors zu verhindern.
Die Forschung an einem universellen Grippeimpfstoff für Menschen wird von Merck in der Folge aufgegeben. Die Ergebnisse wurden nie veröffentlicht. Andere Ereignisse trugen zu seinem Scheitern bei. Margaret Liu, die vom Projekt angezogen wurde, ging mit einem Teil ihres Teams zu Chiron. Und Mary Lou Clements-Mann, die Immunologin an der Johns Hopkins University, die die klinische Studie leitete, starb 1998 beim Absturz des Swissair-Flugs 111 von New York nach Genf.
Wird die RNA vom Pech verfolgt? Zwei Jahre zuvor hatte eine andere Flugzeugkatastrophe über dem Atlantik, die des TWA-Flugs 800, das Leben von Rodolphe Mérieux, dem Erben des grossen französischen Pharmabosses Alain Mérieux, gefordert. Genau zu dieser Zeit gab seine Gruppe, BioMérieux, ein anderes Forschungsprojekt auf, das ebenfalls die Entwicklung von mRNA-Impfstoffen hätte vorantreiben können. Diese hätte Frankreich in die Pole-Position bei dieser revolutionären Technologie bringen können.
Nächste Folge: Die erste Demonstration eines mRNA-Impfstoffs an Tieren
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