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Chemie | Biochemie | Medizin
Philipp Ellinger, 2000 | Unterentfelden, AG
Bei nicht-alkoholischen Fettleber-Patienten wurden ein Mangel an L-Serin und erhöhte 1-Deoxy-Sphingolipidwerte im Blutplasma festgestellt. Da (1-Deoxy-)SL pathologischen Charakter haben, stehen sie im Verdacht, eine bedeutendere Rolle bei der Entwicklung einer nicht-alkoholischen Fettleber zu spielen. Ziel dieser Arbeit war es, durch ein Huh7-Zellkultur-Modell sowohl die Entstehung von Lipidtröpfchen (LD) bei der nicht-alkoholischen Fettleber möglichst lebensgetreu zu simulieren wie auch mittels HPLC/MS-Messungen genauere Daten zum (1-Deoxy-)Sphingoid-Basenprofil der untersuchten Huh7-Zellen zu erhalten. Konkret untersucht wurden der Einfluss eines Serin-verminderten Nährmediums sowie HET0016 (CYP450-Inhibitor), DGAT1- und DGAT2-Inhibitoren wie auch der Fettsäurezufuhr. Unter anderem konnte gezeigt werden, dass der L-Serin-Gehalt im Nährmedium (bei zusätzlicher Fettsäure-Zugabe) eine bedeutende Rolle in der LD-Bildung spielt.
Fragestellung
Ziel war es, folgende Hypothesen bzgl. des Serin-verminderten Nährmediums zu überprüfen: (I) Bilden sich mehr LD und mehr 1-Deoxy-SL de-novo, verglichen mit einem Nährmedium mit normaler Serin-Konzentration? (II) Führt die Inhibition von CYP450 durch den HET0016-Inhibitor zur Akkumulation von LD (korrelierend mit Inhibitor-Konzentration) und mehr (1-Deoxy-)SL? (III) Führt die Inhibition von DGAT1 oder DGAT2 zu weniger LD (korrelierend mit Inhibitor-Konzentration)? (IV) Ist mit zusätzlich beigegebenen Fettsäuren (Ölsäure) eine höhere LD-Bildung zu beobachten?
Methodik
In einem ersten Zellkultur-Ansatz (für die Fluoreszenzmikroskopie) wurden Huh7-Leberkrebszellen in Serin-vermindertem Nährmedium wachsen gelassen. Ebenso wurden der Hälfte der Nährmedien zusätzlich Oleat beigegeben. Des Weiteren wurden jeweils in weiteren Petrischalen die einzelnen Inhibitoren separat beigegeben. Nach einem Tag Inkubationszeit wurden die Huh7-Zellen mittels der Fluoreszenz-Farbstoffe BODIPY493/503 (färbt LD grün) und DAPI (färbt Zellkerne blau) auf die Menge an gebildeten LD untersucht. Sie wurden mit Zellen in einem Vergleichsnährmedium mit gewöhnlicher Serin-Konzentration verglichen. Die Fluoreszenzbilder konnten mittels des Computerprogramms ImageJ anhand der Fluoreszenz-Intensität und der Anzahl Zellkerne ausgewertet werden. Ferner wurden in einem zweiten, ähnlichen Zellkultur-Ansatz (für Lipidanalyse) isotopenmarkierte L-Serin und L-Alanin verwendet. Mittels einer HPLC-MS sollte die Menge an isotopenmarkierten und damit de-novo gebildeten (1-Deoxy-)SL gemessen werden (Auswertung mittels Computersoftware MultiQuantTM, Sciex). Dabei wurden die (1-Deoxy-)Sphingoid-Basen untersucht, um Aussagen über den (1-Deoxy-)SL-Stoffwechsel machen zu können.
Ergebnisse
Es konnte gezeigt werden, dass im Serin-verminderten Nährmedium (ohne Inhibitoren) eine höhere LD-Bildung, verglichen mit dem Vergleichsmedium, resultierte, wenn zusätzlich Fettsäuren beigegeben wurden. Mit HET0016 war die LD-Menge deutlich erhöht und stieg mit ansteigender Inhibitor-Konzentration an. Beim DGAT2-Inhibitor war ein hemmender Effekt auf die LD-Bildung zu beobachten und beim DGAT1-Inhibitor sogar eine Erhöhung an LD.
Diskussion
Auffallend ist, dass sich nur im Serin-verminderten Nährmedium mit den zusätzlich beigegebenen Fettsäuren mehr LD bildeten, ohne zusätzliche Fettsäuren aber nicht. Dies könnte mit der zusätzlichen Anregung des Fettstoffwechsels zusammenhängen. Grund für den starken LD-Anstieg bei der Inhibition von CYP450 durch HET0016 könnte eine gehemmte Fettsäure-Oxidation sein. Des Weiteren kann eine hemmende Wirkung des DGAT1-Inhibitors, im Gegensatz zu DGAT2, widerlegt werden. Die erhaltenen (1-Deoxy-)SL-Resultate nach der HPLC/MS zeigten, dass sich im Allgemeinen im Serin-verminderten Nährmedium (mit/ohne HET0016 bzw. Fettsäuren) nur geringe Mengen an 1-Deoxy-SL nachweisen liessen. Die MS-Daten unterlagen jedoch hohen Standardabweichungen und sind deshalb weder repräsentativ noch eindeutig genug. Des Weiteren könnte es sein, dass jüngere Huh7-Zellen 1-Deoxy-SL besser metabolisieren können und die Inkubationszeit im Serin-verminderten Nährmedium zu kurz war.
Schlussfolgerungen
Die verringerte L-Serin-Konzentration im Nährmedium hat stimulierenden Einfluss auf die LD-Mengen in Huh7-Zellen, wenn zusätzlich Fettsäuren beigegeben werden. Ob dies im Zusammenhang mit einer möglichen erhöhten 1-Deoxy-SL-Biosynthese steht, müsste man in einer Lipidanalyse erneut untersuchen. Der Aspekt, weshalb nur mit zusätzlicher Fettsäure-Zufuhr ein signifikanter Unterschied in der LD-Menge resultiert, sollte weiterverfolgt werden. Ferner könnte man versuchen, den Versuch auf ein dreidimensionales und damit lebensgetreueres Zell-Modell zu übertragen.
Würdigung durch den Experten
Prof. Dr. Eric Kübler
Herr Ellingers Arbeit ist sehr ausführlich, sauber und vollständig. Sie beschreibt die Etablierung einer Säugetierzelllinie, um mit dieser eine Fettleber simulieren zu können. Als Ansatz wurden eine Reihe von Hypothesen aufgestellt, die sowohl die Validität der Zellkulturlinie zeigen, als auch erste Erkenntnisse über den Einfluss gewisser Enzyminhibitoren oder Mediumzusammensetzungen auf die Bildung von Fetttröpfchen liefern. Die Resultate bilden die Basis von wichtigen Einblicken beispielsweise in die Entstehung von Leberkrebs und deshalb auch möglicher Behandlungsoptionen dieser schweren Krankheit.
Prädikat:
sehr gut
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Alte Kantonsschule Aarau
Lehrerin: Eva Schön