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Nachdem er nach dem Ende seines Prozesses 1511 nach Mailand zurückkehrte, hätte sich Leonardo auf ein Alter freuen können, von zufriedener Arbeit erfüllt, mit der wahrscheinlichen Hauptaufgabe – wäre es nach seinem Willen gegangen – die gewaltige Masse an Beobachtungen und Vermutungen, die er in seinen Notizbüchern angesammelt hatte, zu ordnen und einige von ihnen für die Veröffentlichung vorzubereiten. Aber so wie sein eigener Stern aufstieg, sank der seines königlichen Protektors. Der Einfluss der Franzosen in der Lombardei wurde von feindlichen politischen Mächten erschüttert und dann wieder für eine Weile durch die Siege von Gaston de Foix bestätigt, dann schließlich in der Schlacht zerstört, in der dieser Held vor den Mauern Ravennas fiel. Im Juni 1512 brachte ein Bündnis zwischen Spanien, Venedig und dem Papst wieder die Sforza-Dynastie in Mailand an die Macht, in der Person von Ludovicos Sohn Massimiliano.
Dieser Fürst muss als Kind mit Leonardo bekannt gewesen sein, ärgerte sich aber vielleicht über den bereitwilligen Wechsel seiner Loyalität zu den Franzosen; auf jeden Fall gab er ihm keine Anstellung. Binnen weniger Monate verabschiedete sich der alternde Meister aus Mailand und zog mit Hab und Gut sowie einem Gefolge an Schülern nach Rom, in den Dienst des Hauses, mit dem er zuerst befreundet war, der Medici. Die enormen Unternehmungen von Papst Julius II. hatten Rom bereits zum Hauptsitz und Zentrum der italienischen Kunst gemacht. Die Nachfolge 1513 durch Giulio de Medici unter dem Titel Leo X. löste auf allen Seiten Hoffnung auf noch üppigere und wohlwollende Patronage aus. Leonardos spezieller Freund am päpstlichen Hof war der jüngste Bruder des Papst, Giuliano de Medici, der in sich verschwenderische Gewohnheiten mit einem echten Interesse an Kunst und Wissenschaften vereinigte. Durch seinen Einfluss wurden Leonardo und seine Leute im Belvedere des Vatikans untergebracht. Er bekam ein eigenes Atelier mit einem deutschen Mitarbeiter gestellt, der jedoch den Auftrag hatte, den Papst, der selbst keine hohe Meinung von Leonardo hatte, über dessen Aktivitäten stets zu unterrichten.
Aber die Bedingungen der Zeit und des Orts stellten sich als ungünstig heraus. Die junge Generation behauptete das Feld. Michelangelo und Raffael, die, wie wir gesehen haben, teilweise auf Leonardos Schultern zu großer Berühmtheit aufgestiegen waren, hatten gerade durch ihre großen Errungenschaften in der Sixtinischen Kapelle und in den Stanze frischen Ruhm geerntet. Ihre rivalisierenden Anhänger hassten sich gegenseitig, aber beide Gruppen, insbesondere die Michelangelos, wendeten sich bitter gegen den altgedienten Neuling. Von Leonardos kleinen Experimenten und Findigkeiten in der Wissenschaft, insbesondere von einer Art zoologischer Spielzeuge, die er als Zeitvertreib erfunden hatte, und von mechanischen Tricks, die mit lebenden Tieren durchgeführt wurden soll der Papst eher angetan gewesen sein. Um die ernsthafteren Forschungen und Projekte des Meisters aber kümmerte er sich wenig, war er doch weit mehr an den Fantastereien der Astrologen und Alchemisten interessiert.
Als man Leonardo nach dem Auftrag für ein Bild dabei fand, wie er für sich ein neues Medium aus Ölen und Kräutern zusammenmischte, noch bevor er den Entwurf begonnen hatte, war der Papst – vielleicht nicht ohne Grund – der Meinung, dass nichts ernsthaftes dabei herauskommen würde. Die einzigen Gemälde, die er nach der Quellenlage sicher in Rom anfertigte, waren zwei kleine Tafelbilder für einen Beamten des päpstlichen Hofs, eines von einem Kind, das andere von einer Madonna, beide verloren oder nicht auffindbar. In diese Zeit könnte auch eine verlorene Leda gehören, die aufrecht mit einem Schwan an ihrer Seite und den vier Kindern an den Füßen steht. Dieses Bild war im 16. Jahrhundert in Fontainebleau und ist aus mehreren Kopien bekannt, die schönste in der Galleria Borghese Rom, sowie aus einem oder zwei vorläufigen Skizzen vom Meister selbst und einer kleinen kopierten Skizze von Raffael.
Ein Porträt einer Florentiner Dame, das er für Giuliano de Medici gemalt haben sollte und das später in Frankreich gesehen wurde, könnte ebenfalls in Rom angefertigt worden sein, allerdings könnte es sich auch um eine verwirrte Beschreibung der Mona Lisa handeln. Traditionell wird Leonardo ein reizvolles Fresko einer Madonna im Konvent von St. Onofrio zugeschrieben, aber dies scheint klar ein Werk Boltraffios zu sein. Die einzigen Ingenieurswerke, die aus dieser Zeit bekannt sind, waren am Hafen und den Verteidigungsanlagen von Civita Vecchia. Durch weitere umfangreiche anatomische Studien entdeckte Leonardo auch die Arterienverstopfung (Arteriosklerose) bei alten Menschen. Doch seine ebenfalls umfangreichen Aufzeichnungen darüber wurden nie publiziert, sie blieben sogar Jahrhunderte lang verschollen. Im Ganzen fand sich der Meister in diesen römischen Tagen für das erste und einzige Mal in seinem Leben gekränkt. Darüber hinaus wurde er von der Aufsässigkeit und Bösartigkeit des deutschen Hilfshandwerkers geplagt, der in seiner Wohnung beherbergt war und für den Papst spionierte. Beschuldigungen der Pietätlosigkeit und der Leichenfledderei durch diesen Mann in Zusammenhang mit seinen anatomischen Studien waren die Ursache dafür, dass der Papst ihm seine Gunst zeitweise völlig entzog.
Nach einem Aufenthalt von weniger als zwei Jahren verließ Leonardo Rom unter den folgenden Umständen. Ludwig XII. von Frankreich war in den letzten Tagen des Jahres 1514 gestorben. Sein junger und brillanter Nachfolger Franz I. überraschte Europa, indem er an der Spitze einer Armee über die Alpen vorstieß, um seine Rechte in Italien zur Geltung zu bringen. Nach einigem Zögern befahl Leo X. im Sommer 1515 Giuliano de Medici als Gonfaloniere der Kirche, die päpstlichen Truppen in die Emilia zu führen und die Bewegungen der Invasoren zu beobachten. Leonardo begleitete seinen Protektor auf dem Marsch und blieb mit dem Hauptquartier der päpstlichen Armee in Piacenza, als Giuliano erkrankte und sich nach Florenz zurückzog. Nach der Schlacht bei Marignano wurde abgemacht, dass Franz und der Papst sich im Dezember in Bologna treffen sollten. Der Papst, der über Florenz reiste und dort einen großen neuen Plan für die laurentinische Bibliothek diskutierte, hegte die Idee, den Auftrag Leonardo zu geben; aber Michelangelo kam eilends aus Rom und sicherte sich selber den Auftrag. Leonardo begab sich von Piacenza dorthin und wurde zur rechten Zeit dem König vorgestellt. Zwischen dem brillanten jungen Souverän und dem weisen Alten entsprang sofort eine starke Sympathie; Leonardo begleitete Franz auf seinem Marsch nach Hause bis nach Mailand und beschloss dort, die königliche Einladung nach Frankreich anzunehmen, wo ihm ein neues Heim mit jeglicher Zusicherung von Ehre und Achtung zugesichert wurde.