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Lüthi J., , Wegmüller B.
Institut für Biochemie, Universität Bern, Bern
Duration: 2 years End of the Project: 1994
Background and Aim
Es sollen zwei neuartige Methoden entwickelt werden, welche das Potential haben, punkt-mutierte DNA in einem hohen Background unveränderter Moleküle zu erfassen. Die Methoden sind so beschaffen, dass sie für den Nachweis beliebiger Mutationen anwendbar sind. Das Endziel besteht darin, mindestens eine Methode so zu verfeinern, dass sie für ein schnelles und zuverlässiges Screening von Hot-spots in carcinogenese-relevanten Genen benutzt werden kann, d.h. 1 - 10 punktmutierte DNA-Moleküle in 106 Wildtypmolekülen erkennt und amplifiziert.
Die Methoden sollen erlauben, die Wirkung genotoxischer Substanzen auf Zellen in einem sehr frühen Stadium zu charakterisieren und somit Tierversuche massiv zu verkürzen oder sogar duch Zellkulturen zu ersetzen. Als Modell dient murine Leber-Tumor-DNA mit Punktmutationen im 61, Codon des Ha-ras-Gens.
Method and Results
Die thermostabile DNA-Polymerase von Thermus litoralis besitzt eine Exonucleasefunktion, durch welche bei der Strangverlängerung fehleingesetzte Nucleotide wieder entfernt werden. Dies wurde ausgenutzt, um eine neuartige Mutations-Detektionsmethode zu entwickeln. Durch Verwendung markierter Primer-Oligonucleotide können PCR-Produkte produziert werden, die nur dann markiert sind, wenn mutierte DNA vorliegt.
Dieses Verfahren wurde getestet mit DNA, bei der eine Mutation in Codon 61 des Ha-ras-Gens vorliegt. Nach PCR-Amplifikation konnten so 10 bis 100 mutierte Gen-Kopien pro Ansatz nachgewiesen werden.
References
Nucleic Acids Research, 23, 2, 311-312, 1995