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Les enzymes de restriction sont des protéines synthétisées par des bactéries pour se protéger des infections de virus (bactériophages). Ces enzymes coupent l’ADN viral à des endroits spécifiques. Ce mécanisme de résistance aux bactériophages, dénommé restriction, fut étudié par W. Arber à l’Université de Genève dans les années 60. Il obtint avec D. Nathans et H. Smith le prix Nobel de Médecine en 1978 pour la découverte et les applications des enzymes de restriction.
Thèmes: Enzymes de restriction, coupure de l'ADN, séparation par électrophorèse sur gel d'agarose, complexité des génomes, cartes de restriction.
Introduction: Lorsqu’un bactériophage infecte une bactérie, il lui « injecte » son ADN. Sans système de défense adapté, de nombreux bactériophages seront alors produits dans la bactérie qui sera finalement lysée. De manière à résister à cette infection la bactérie synthétise des enzymes de restriction qui vont fragmenter l'ADN viral étranger. Parallèlement, la bactérie possède des méthylases capables de modifier (méthyler) son propre ADN afin qu’il ne soit pas reconnu par les enzymes de restriction.
Aujourd’hui plusieurs centaines d’enzymes de restriction différentes sont disponibles commercialement. Elles font parties des outils (ciseaux moléculaires) indispensables aux biologistes moléculaires. Ces outils permettent de couper l’ADN afin d’isoler certains fragments, de construire des cartes génétiques (cartes de restriction), de créer de nouvelles combinaisons d’ADN, etc. Les enzymes de restrictions ont permis l’avènement de la biologie moléculaire.
Le nom d’une enzyme de restriction indique son origine: Sau3A provient de Staphylococcus aureus 3A, BamHI provient de Bacillus amyloliquefaciens H, EcoRI provient de Escherichia coli, MspI provient de Moraxellaspecies, KpnI provient de Klebsiella pneumoniae. Ces enzymes reconnaissent et coupent des séquences de nucléotides très spécifiques appelées sites de restriction. Ces sites sont pour la plupart palindromiques, c'est-à-dire qu’ils sont composés de séquences nucléotidiques identiques sur les deux brins mais en orientations antiparallèles.
Un schéma représentant la coupure par l’enzyme EcoRI est visible ici
Suivant le nombre de nucléotides reconnus, l'enzyme de restriction coupe l'ADN plus ou moins fréquemment. Par exemple, pour cette expérience nous utilisons deux enzymes différentes qui reconnaissent respectivement quatre et six nucléotides: MspI (CCGG) et BamHI (GGATCC). En moyenne ces deux enzymes coupent l'ADN toutes les 256 (44) et 4096 (46) paires de bases. Suivant l’enzyme de restriction, les extrémités des fragments obtenus peuvent être formées de deux brins d’égales longueurs, appelés "bouts francs" (blunt ends) ou présenter un brin plus long que l’autre. Dans ce cas l’extrémité est dénommée "bouts collants" (sticky ends). Des exemples de coupures engendrées par différentes enzymes sont représentés dans la figure ci-jointe.
L'EXPERIENCE: (cliquer pour voir le schéma de l'expérience)
L'ADN utilisé dans cette expérience est celui de plasmides que nous utilisons dans notre laboratoire. Les plasmides sont des ADN circulaires, relativement petits. Le plasmide pUC19 compte environ 2600 nucléotides. Il sert de "vecteur" pour cloner des gènes. Le plasmide pUC19-TIF1 contient en plus un fragment d'ADN de levure d'environ 5800 paires de bases. En comparaison, l'ADN du bactériophage l (lambda) est plus grand (environ 50'000 paires de bases, 50kpb), le chromosome d'une bactérie (Escherichia coli) contient 3'500'000 paires de bases (3’500 kpb), le génome d'une levure (2 x 16 chromosomes) contient 2x 14'000'000 paires de bases (14'000 kbp) et les 2 x 23 chromosomes d'un être humain contiennent 2 x 3'000'000'000 bp (6'000'000 kbp). En longueur cela correspond à 1.4 mm pour le chromosome bactérien, 4.3 mm pour les chromosomes de la levure et 2 m pour les chromosomes d'un être humain.
Protocole :
Pour des raisons de difficulté de pipettage et de temps, nous conseillons que 4 groupes digèrent le plasmide pUC19 (tubes 1, 2, 3) et les 4 autres groupes digèrent le plasmide pUC19-TIF1 (tubes 4, 5, 6).
1) Digestion :
|H2O||pUC19||pUC19-tif1||

Tampon de
digestion 10x
|BamHi||MspI|
|tube 1||12.5 µl||1 µl||-||1.5 µl||-||-|
|tube 2||11.5 µl||1 µl||-||1.5 µl||1 µl||-|
|tube 3||8.5 µl||4 µl||-||1.5 µl||-||1 µl|
|tube 4||12.5 µl||-||1 µl||1.5 µl||-||-|
|tube 5||11.5 µl||-||1 µl||1.5 µl||1 µl||-|
|tube 6||8.5 µl||-||4 µl||1.5 µl||-||1 µl|
Attention : Garder les enzymes de restriction sur glace - Utiliser une pointe neuve pour chaque pipetage
A cette étape il est possible de congeler les réactions et de poursuivre l'expérience lors d'une prochaine séance.
2) Préparation du gel d’agarose
Le TBE 10x concentré doit être manipulé uniquement par les enseignants ou les préparateurs, en prenant soit de porter une blouse, des lunettes et des gants en nitrile. Le TBE 1x concentré peut sans problème être manipulé par les élèves, à conditions qu’ils respectent les mêmes conditions de sécurité.
Le TBE est toxique pour l’environnement, il ne faut donc pas le jeter à l’évier. Celui-ci doit être récupéré et éliminé par le biais de votre propre filière de traitement des produits chimiques.
Pendant la digestion préparer le gel d’agarose. Ce gel est une matrice permettant de séparer les molécules d'ADN selon leurs tailles dans un champ électrique. Les petits fragments migrent plus vite que les grands, la concentration d'agarose est choisie en fonction de la taille des fragments à séparer. Ici nous allons utiliser un gel à 1.5% d’agarose.
3) Migration des échantillons sur gel d’agarose (voir le schéma)
4) Analyse des résultats
Un exemple de résultat obtenu est visible ci-dessous:
Matériel fourni:
Matériel non fourni:
L’Université de Genève décline toutes responsabilités en cas de dommages survenus durant les expériences.