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VON PETER J. MEIER-ABT UND KARIN MÖLLING
Somatische Gentherapie hat zum Ziel, vererbte und erworbene Genkrankheiten durch Einschleusung von normalen Genen in bestimmte Zielzellen des Körpers definitiv zu heilen. Das Konzept der somatischen Gentherapie hat sich bisher vor allem in Tiermodellen durchgesetzt. Für durchschlagende klinische Erfolge sind weitere Fortschritte in der molekularen Genetik und in den Methoden des gezielten in vivo Gentransfers notwendig.
Modalitäten der somatischen Gentherapie
Gentherapie bedeutet allgemein die Einschleusung eines oder mehrer Fremdgene in den Organismus mit therapeutischem Nutzen für das Individuum. In diesem Sinne kann auch jede Organtransplantation als eine spezielle Form von Gentherapie betrachtet werden, da durch den Organtransfer die Gene unzähliger somatischer Fremdzellen vom Spender auf den Empfängerübertragen werden. Somatische Zellen sind alle Körperzellen, die nicht an der Reproduktion eines Individuums beteiligt sind (zum Beispiel Muskelzellen, Blutzellen, Hirnzellen, Leber- und Nierenzellen). Entsprechend beschränken sich die Auswirkungen aller Modalitäten der somatischen Gentherapie auf das behandelte Individuum und werden nicht auf die Nachkommenübertragen. Eine definitive Eliminierung einer Erbkrankheit für alle Generationen würde gentherapeutische Eingriffe in die Keimbahn voraussetzen. Die Anwendung der Keimbahntherapie beim Menschen steht zur Zeit aber nicht zur Diskussion. Sie ist technisch noch nicht möglich, ethisch (noch) problematisch und gesetzlich in manchen Ländern, so auch in der Schweiz (Artikel 24novies der Bundesverfassung), verboten. Die gegenwärtigen Diskussionen um die Möglichkeiten und Methoden der Gentherapie betreffen daher ausschliesslich die verschiedenen Spielformen der somatischen Gentherapie.
Gene sind die Träger vererbbarer Information in allen lebenden Zellen. In pflanzlichen und tierischen Zellen sind die Gene in den Zellkernen lokalisiert und dort strukturell in den Chromosomen organisiert. Das menschliche Genom enthält 46 Chromosomen, die aus Desoxyribonukleinsäuren (DNA) bestehen. Die DNA besteht aus zwei komplementären Polynukleotidketten mit den vier Bausteinen Desoxyadenosin (A), Desoxyguanosin (G), Thymidin (T) und Desoxycytosin (C). Durch komplementäre Basenpaarung zwischen Adenin und Thymin (A=T) bzw. Guanin und Cytosin (G=C) entsteht die bekannte Doppelhelixstruktur der DNA. Gene sind strukturell-funktionelle Einheiten auf den Chromosomen, die als definierte DNA-Sequenzen die Information für bestimmte Proteine enthalten. Die Expression der Gene geschieht prinzipiell in zwei Schritten. Im ersten Schritt, der Transkription, wird die DNA nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung (A=U [Uracil]; G=C) in eine komplementäre Boten-RNA oder Messenger-RNA (mRNA)überschrieben. Im zweiten Schritt, der Translation, wird die mRNA-Sequenz in eine Aminosäuresequenzübersetzt. Dabei kodieren immer drei aufeinanderfolgende Nukleotide (Basentriplet=Kodon) der mRNA für eine Aminosäure. Die Gesamtheit aller Kodons und der entsprechenden Aminosäuren wird als genetischer Code bezeichnet. Damit bestimmt die DNA-Sequenzüber die komplementäre mRNA-Sequenz die Aminosäuresequenz und damit Struktur und Funktion der synthetisierten Proteine. Da viele Krankheitszustände durch die Synthese abnormer Proteine bedingt sind, stellt die Korrektur der abnormen Genexpression durch Gentherapie letztlich ihre einzige definitive Therapieform dar. Die erfolgreiche Anwendung der Gentherapie setzt die genaue Kenntnis von Genen und Gendefekten und deren Einfluss auf normale und pathologische Zellfunktionen voraus. Durch die Fortschritte der molekularen Genetik und die Entwicklung der rekombinanten Gentechnologie während der letzten 20 Jahre ist es heute möglich geworden, die bestimmten Krankheiten zugrundeliegenden Gendefekte rasch zu identifizieren (zum Beispiel mittels «positional cloning»). Gene können durch molekulare Scheren (Restriktionsenzyme) isoliert, mittels Ligasen in virale Vektoren (zum Beispiel Plasmide) eingebaut und in geeigneten Zellen (zum Beispiel Bakterien, Hefezellen) amplifiziert und exprimiert werden. Wir besitzen hochempfindliche Nachweismethoden für spezifische Gene (zum Beispiel Polymerase-Kettenreaktion [PCR]) und automatische Sequenziermaschinen zum Lesen der Nukleotidsequenzen. Im Rahmen des menschlichen Genomprojektes sollen alle menschlichen Gene genau analysiert und ihre kodierenden Nukleotidsequenzen identifiziert werden. Das menschliche Genom (Erbmasse pro Zelle) enthält etwa 200000 Gene, wobei jedes Gen durchschnittlich etwa 15000 Nukleotidbausteine aufweist. Unser gesamtes genetisches Material umfasst demnach etwa drei Milliarden Nukleotide. In fünf Jahren sollten sämtliche menschliche Genbereiche, deren genetische Information in Proteineübersetzt werden kann (Exone), durchsequenziert sein.
Eine weitere wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche Gentherapie ist die effiziente und reproduzierbare Einschleusung und Expression eines gewünschten Gens in geeigneten Zellen. Bis heute wurde der Gentransfer in den meisten Fällen ex vivo durchgeführt (siehe Abbildung). Hierbei werden die Zielzellen (zum Beispiel Lymphozyten, hämatopoetische Stammzellen, Leberzellen) aus dem Organismus isoliert, in Zellkultur mit dem gewünschten Gen transfiziert und schliesslich wieder in den Organismus reimplantiert. Durch ex vivo Gentransfer kann ein möglicher Gentransfer in Keimbahnzellen sicher ausgeschlossen werden. Ebenso sind in vitro Gentransfermethoden generell effizienter als die bis heute zur Verfügung stehenden in vivo Gentransfermethoden. Die Anwendbarkeit der ex vivo Gentherapie ist aber beschränkt auf jene Zellen, die relativ leicht aus dem Körper isoliert und in genügenden Mengen gezüchtet werden können. Zudem gelingt die Reimplantation der in vitro transfizierten Zellen in den Körper oft nur unvollständig und/oder die Expression des Transgens geht in vivo relativ rasch wieder verloren. Zur Aufrechterhaltung einer Langzeitsekretion eines Genproduktes in vivo wird auch versucht, genetisch modifizierte (transfizierte) Zellen in selektiv permeable Kapseln zu verpacken, die die Zellen vor einer Destruktion durch das Immunsystem schützen. In naher Zukunft ist der weitere Fortschritt der somatischen Gentherapie vor allem abhängig von der Entwicklung von sicheren und leicht anwendbaren in vivo Gentransfermethoden, welche eine effiziente und stabile Genexpression in bestimmten Zielorganen erlauben. Grundsätzlich gibt es virale und nicht-virale Gentransferverfahren. Virale Transfermethoden benutzen spezielle genetisch modifizierte Viren («virale Vektoren») als Transportvehikel für genetisches Material. Obwohl eine Vielzahl von Viren auf ihren potentiellen Nutzen in der Gentherapie hin untersucht worden sind, werden am häufigsten replikationsdefiziente Retro- und Adenoviren verwendet. Retrovirale Vektoren haben den Vorteil, dass sie das gewünschte Gen in das Genom von sich teilenden Zielzellen integrieren (wenn auch nur «random») und damit zu einer stabilen Genexpression in Mutter und Tochterzellen führen können. Im Gegensatz dazu können mit adenoviralen Vektoren auch nicht proliferierende Zielzellen effizient transfiziert werden. Das gewünschte Gen wird aber nicht in das Genom integriert, und die Genexpression ist lediglich transient und wird durch eine antivirale Immunantwort zusätzlich limitiert. Transiente Genexpression kann auch mit einer Reihe von nicht-viralen Transfermethoden erreicht werden wie zum Beispiel durch direkte Injektion von DNA in das Gewebe (zum Beispiel Muskulatur, Schilddrüse), mit Liposomen oder mittels rezeptor-vermitteltem Gentransfer. Die letztere Methode ermöglicht einen zielgerichteten in vivo Gentransfer in spezielle Zellen und Organe. So kann zum Beispiel DNA durch Komplexierung mit Asialoglykoprotein (ASGP) via den leberzellspezifischen ASGP-Rezeptor spezifisch in Leberzellen eingeschleust werden. Eine andere Möglichkeit zur gewebsspezifischen Genexpression ist die Verwendung von gewebsspezifischen Promotoren (= Genabschnitte, die die Transkription kontrollieren). So wird beispielsweise Alpha-Foetoprotein (AlphaFP) beinahe ausschliesslich durch Leberzellkarzinome gebildet. Durch Kopplung mit dem AlphaFP-Promotor kann erreicht werden, dass ein gewünschtes Gen ausschliesslich in hepatozellulären Karzinomzellen exprimiert wird.
Anwendungsmöglichkeiten der Gentherapie ergeben sich vor allem auf drei Gebieten, nämlich den klassischen Erbkrankheiten mit isoliertem Einzelgendefekt, den erworbenen genetischen Erkrankungen (zum Beispiel chronische Infektionskrankheiten) und den multifaktoriellen genetischen Erkrankungen (zum Beispiel Tumoren, Herz- und Kreislaufkrankheiten).
Erbkrankheiten: Über 4000 vererbte Gendefekte sind heute bekannt, und über einige sind eindrucksvolle neue wissenschaftliche Erkenntnisse erzielt worden. So wurde der Gendefekt der Cystischen Fibrose, auch Mukoviszidose genannt, einem der häufigsten vererbten Gendefekte, der bei einem von 2500 Kindern auftritt, charakterisiert. Ebenso ist das Gen, das bei der Muskeldystrophie einen Defekt aufweist, bei etwa einem von rund 3500 Neugeborenen identifiziert worden. Die Liste neuentdeckter Gendefekte wächst rasch und bietet breite Möglichkeiten für die Gentherapie. Das eigentliche Therapieziel ist dabei der Genersatz für das defekte oder fehlende Gen, das heisst, das Defektgen müsste selektiv aus dem Genom herausgeschnitten und das normale Gen an exakt der gleichen Stelle eingesetzt werden können. Nur ein solchermassen durch homologe Rekombination rekonstruiertes Gen würde der normalen Genregulation unterliegen. Leider ist effizienter Genersatz durch homologe Rekombination bis heute nicht möglich. Die gegenwärtig verfügbaren Gentransfermethoden erlauben lediglich eine Genaddition mit transienter oder im Falle der retroviralen Vektoren «randomly integrated» Genexpression. Die erste kausale Therapie durch Substitution eines fehlenden oder defekten Gens wurde bei der Adenosindeaminasemangelkrankheit durchgeführt. Bei dieser Krankheit liegt ein genetischer Defekt der Adenosindeaminase (ADA) vor. Der ADA-Mangel führt zu einer Akkumulation von Deoxyadenosin, das unter anderem eine direkte toxische Schädigung von T-Lymphozyten verursacht. In der Folge kommt es zu einer lebensbedrohlichen Immunschwäche. Bei vier Patienten konnte durch wiederholte retrovirale ex vivo Gentransfers in körpereigenen T-Lymphozyten ein deutlicher und über länger als ein Jahr persistierender Anstieg der ADA, eine markante Verbesserung der Immunreaktionen und ein Rückgang von klinisch manifesten Infektionen erzielt werden (Science 270, 470 und 475, 1995). Weniger eindrücklich waren die Resultate bei der familiären Hypercholesterinämie. Diese Krankheit führt infolge eines vererbten Rezeptordefektes (LDL-Rezeptor) in der Leber zu stark erhöhten Cholesterinwerten im Blut und zu frühzeitiger Arteriosklerose bereits im Kindesalter. Durch adenoviralen ex vivo Gentransfer in isolierten Leberzellen und Reimplantation der mit dem normalen LDL-Rezeptorgen transfizierten Hepatozyten in die Patientenlebern konnte lediglich in drei von fünf Patienten eine partielle Reduktion der Serumcholesterinwerte über mindestens vier Monate erreicht werden (Nature Med. 1, 1148, 1995). Diese Resultate zeigen deutlich die Grenzen der ex vivo Lebergentherapie und unterstreichen die Notwendigkeit von effizienteren in vivo Gentransfermethoden.
Erworbene genetische Erkrankungen. Gentherapie gegen HIV: Ein besonders dringendes Problem ist es, wirksame Therapien gegen HIV zu entwickeln. Dafür kommen alle viralen Gene als Ziel in Frage. Inhibitoren der HIV-Vermehrung sind gegen das Vermehrungsenzym von HIV, gegen die Reverse Transkriptase entwickelt worden. Jedoch kommt es beim Infizierten innerhalb kürzester Zeit zur Resistenz. Gentherapeutische Ansätze betreffen die Hemmung der Virus-Replikation zum Beispiel durch intrazelluläre Immunisierung. Diese beinhaltet, dass man ein nicht funktionsfähiges virales Protein künstlich herstellt und in die Zelle einschleust. Es soll dann die Wirkung des echten viralen Proteins blockieren oder dieses verdrängen. Ein solches Protein ist zum Beispiel das virale Strukturprotein Gag. Beim Zusammenbau des Virus entsteht eine hochsymmetrische Icosaeder-Struktur. Ein falscher Baustein bringt den gesamten Aufbau zum Einsturz. Das Virus ist nicht mehr infektös. Ähnlich wird die Wirkung des Regulationsproteins Rev verhindert. Es lagert sich wie Perlen einer Kette auf die virale RNA. Ein falsches Rev-Protein blockiert diese geordnete Struktur. Damit wird die Funktion von Rev zerstört, es transportiert die virale RNA nicht mehr aus dem Kern, und die virale Proteinsynthese unterbleibt. Um wirklich alle HIV-infizierten Zellen zu treffen, muss man die Stammzellen eines Patienten therapieren. Die HIV-infizierten Lymphozyten stammen von sogenannten CD34-positiven Vorläuferzellen ab. Diese müssen aus dem Blut oder Knochenmark isoliert werden, ex vivo therapiert und dem Patienten reinfundiert werden. Die so geschützten Lymphozyten könnten dann nach ihrer Ausreifung zwar noch von HIV infiziert werden, jedoch sollte kein neues Virus entstehen.
Ein weiterer Ansatz, der sich bereits in der klinischen Erprobung befindet, ist ein Ribozym gegen die virale RNA. Es handelt sich dabei um katalytisch aktive RNA, welche so hergestellt werden kann, dass sie eine vorgegebene RNA, zum Beispiel die HIV-RNA, an einer ganz bestimmten Stelle schneidet. Auch für die Ribozym-Therapie wird wieder ein Retrovirus verwendet. Dieses infiziert die infizierten Zellen oder Stammzellen, seine genetische Information wird ins Zellgenom integriert und produziert Ribozym RNA. Befindet sich in derselben Zelle auch HIV-RNA, so wird diese wie von einer Schere zerschnitten und die Virusproduktion gehemmt.
Ein völlig neuartiger Ansatz zur Therapie der HIV-Infektion beruht auf einer Impfung. Dieser Ansatz beruht darauf, dass man Gene von HIV, zum Beispiel diejenigen, die für das Hüllprotein env kodieren, als DNA direkt in den Muskel von Patienten spritzt. Dort wird etwas env-Protein synthetisiert. Das Protein wird von der Zelle dann weiterverarbeitet wie in einer echten Infektion. Darauf beruht die Wirksamkeit dieses Ansatzes. Das prozessierte env-Protein wird als Antigen an die Oberfläche der Zelle transportiert und stimuliert dort vor allem die zelluläre Immunabwehr. So erhofft man sich eine effizientere Impfung mit nackter DNA als mit vorfabriziertem rekombinantem env-Protein.
Multifaktorielle genetische Erkrankungen. Gentherapie gegen Krebs: Krebs ist heute allgemein als genetische Krankheit, die mit einer abnormen Proliferation von Zellklonen einhergeht, anerkannt. Der hohe Proliferationsindex macht Krebszellen zu einem idealen Ziel von retroviralen Gentransfervektoren. Zudem offeriert die komplexe Biologie von Krebszellen ein breites Spektrum von gentherapeutischen Ansatzpunkten, die hier nur summarisch zusammengefasst werden können. Erstens wird versucht, die Immunabwehr von Tumorzellen durch Einschleusung von immunstimulatorischen Zytokingenen (zum Beispiel IL-1Beta, IL-2, IL-4) zu erhöhen. Dazu werden Tumorzellen aus dem Patienten isoliert, in Kultur mit immunstimulierenden Genen transfiziert (retrovirale Vektoren) und dann dem Patienten subkutan reinjiziert («Tumor-Vakzination»). Tumorvakzinationsstudien werden vor allem bei Melanom, Kolonkarzinom und Nierenzellkarzinom durchgeführt. Zweitens können tumorinfiltrierende T-Lymphozyten in vitro genetisch so verändert werden, dass sie tumorzerstörende Faktoren (zum Beispiel tumor necrosis factor-Alpha (TNF)) sezernieren. Drittens wird versucht, die Expression von Onkogenen zu blockieren (zum Beispiel mit Antisense-Oligonukleotiden) und/oder die Expression von Tumorsuppressorgenen zu stimulieren. Viertens können normale Knochenmarkzellen durch Transfektion mit dem MDR1-Gen (MDR=Multiple Drug Resistance) vor der Toxizität einer hochdosierten Chemotherapie geschützt werden. Und fünftens können Toxingene in Krebszellen eingeführt werden, die die Sensitivität der Krebszellen gegenüber gewissen Medikamenten stark erhöhten. Bei der Toxingenmethode soll nicht nur der Tumor zerstört werden, sondern auch die Zelle, die das Therapie-Gen trägt. Der Ansatz beinhaltet drei Anleihen aus der Virologie: ein Mäuse-Retrovirus wird als Träger für ein Gen des Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1), dem Thymidin Kinase (TK) Gen, verwendet. Letzteres ist eines der wenigen Gene, gegen die heute ein antivirales Medikament existiert: das Cyclovir, genauer das Gancyclovir (GAC). GAC interagiert mit der TK und wird zu toxischen Triphosphaten umgesetzt. Diese wiederum hemmen die DNA Synthese in sich teilenden Zellen. Um möglichst viel TK-Genprodukt zu produzieren, wird das TK-Gen vor einen besonders effizienten Promoter geschaltet, den des Cytomegalo-Virus (CMV). Der Retrovirusvektor besteht also letztlich aus drei viralen Komponenten, den zwei LTRs (Long Terminal Repeats), die aus dem zuerst zugelassenen, bereits hoffähig gewordenen Retrovirus LTR-neo-LTR, LNL, stammen und das neo-Resistenzgen tragen. Weiterhin beinhaltet der Vektor den CMV Promotor, der das TK Gen des Herpes Simplex Virus (HS-TK), reguliert. Dieser Retrovirus wird in Retrovirusproteine verpackt. Dazu ist vor einigen Jahren eine Mäuse-Zell-Linie entwickelt worden, die als Verpackungszell-Linie für viele retrovirale Experimente verwendet wird, sie heisst PA317. Das von dieser Verpackungszell-Linie produzierte Retrovirus ist ein Pseudovirus, denn es ist defekt. Es kann nur ein einziges Mal eine neue Zelle infizieren, diese aber nicht mehr verlassen. Mittels solcher defekten Viren werden die gewünschten Therapiegene in eine Zielzelle eingebracht, ohne dass diese neue Viruspartikel produzieren kann. So gelangt das TK-Gen in eine neue Zelle. Bringt man die Verpackungszell-Linie in die Nähe einer Tumorzelle, so ist zu erwarten, dass das Virus diese Tumorzelle infiziert. Gibt man jetzt dem Patienten das GAC, so entsteht sowohl in der Verpackungszelle wie auch in den neu infizierten Tumorzellen das giftige Abbauprodukt. Beide Zellen gehen auf diese Weise durch die GAC-Behandlung zugrunde. Man hat, wenn alles richtig verlaufen ist, sowohl die Tumorzelle wie auch die zur Therapie verwendete Verpackungszell-Linie vernichtet und die Therapie beendet.
Das Konzept der somatischen Gentherapie ist zweifellos revolutionär und wird zu einem völlig neuen Verständnis der Therapie von Krankheiten führen. Während mit den traditionellen Arzneimitteln abnorme Zellfunktionen lediglich vorübergehend modifiziert werden können, hat die somatische Gentherapie das Potential, viele Krankheiten definitiv zu heilen. Bis es soweit ist, muss aber noch viel grundlegende Entwicklungsarbeit geleistet werden. Insbesondere brauchen wir effizientere Gentransfermethoden und die Möglichkeit des definitiven Genersatzes durch homologe Rekombination. Mechanismen der Regulation der Genexpression sollten vermehrt in die Planung gentherapeutischer Verfahren einbezogen werden. Tatsächlich ist die initiale Euphorie betreffend die klinische Wirksamkeit der somatischen Gentherapie einer gewissen Ernüchterung und Enttäuschungüber die Resultate der initialen klinischen Studien gewichen. Die Erwartungen waren allzu hoch und die kürzlich publizierten ersten negativen klinischen Resultate daher um so enttäuschender. Andererseits zeigen die initialen Studien, dass das Prinzip der somatischen Gentherapie richtig ist. Mit neuen Erkenntnissen und neuen Methoden sollte es möglich sein, das Prinzip der Gentherapie in den nächsten 10 bis 15 Jahren in die Realität umzusetzen. «Gene therapy is not a failure it is simply still too immature to deliver yet on its promises» (T. Friedmann, Nature Med. 2, 144, 1996).
Zum Thema: Fernsehsendung «Format NZZ» vom 1./2. April 1996 zum Thema «Gentherapie: Kein Grund zur Euphorie?». Unter anderen wurde das Aids-Projekt von Karin Mölling vorgestellt.
Dr. Peter J. Meier-Abt ist ordentlicher Professor für Klinische Pharmakologie und Toxikologie am Departement für Innere Medizin des Universitätsspitals Zürich, und Dr. Karin Mölling ist ordentliche Professorin und Direktorin des Institutes für Medizinische Virologie der Universität Zürich.
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Felix Mäder (<email-pii>)
http://www.unizh.ch/upd/magazin/1-96/gentherapie.html
Last update: 1-APR-96