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Dès la seconde moitié du XIe siècle, les frères de la communauté de Saint-Jean se rendirent compte qu’ils ne disposaient pas de la place suffisante pour accueillir les femmes dans l’hôpital de Jérusalem. Les Amalfitains leur fournirent d’abord un oratoire séparé et une maison particulière dans l’hôtellerie, avant d’ériger un second ensemble monastique. Construit sur le modèle de celui de Sainte-Marie Latine, le complexe réservé aux femmes fut placé sous le vocable de Sainte-Marie-Madeleine.
Cette présence féminine est attestée par Jacques de Vitry (1170-1240), évêque de Ptolémaïs (Acre), qui écrit dans son Histoire d’Orient:
Lorsque la fraternité d’hommes de l’Hôpital de Jérusalem devint un ordre et définit sa règle, une dame romaine du nom d’Agnès qui était abbesse de l’hôpital de Sainte-Madeleine fit, avec ses compagnes, profession de la même Règle. Elles prirent le même habit et s’engagèrent à l’observance des mêmes voeux.
Delaville Le Roux, qui s’est penché sur le sujet, écrit au sujet de leur origine à Jérusalem :
La création des Hospitalières fut parallèle à celle des Hospitaliers. […] on l’attribue à une dame romaine, appelée Alix ou Agnès, qui, venue en Terre sainte, établit à Jérusalem, sous le vocable de Sainte-Marie- Madeleine, un hôpital destiné aux pauvres femmes malades, et se consacra à les soigner.