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Les cellules de notre organisme sont soumises à divers stress qui peuvent induire leur apoptose, un type de mort cellulaire programmée. L'apoptose est déclenchée par l'activation des protéases de la famille des caspases suite à la stimulation de récepteurs de mort ou au relâchement de cytochrome C de la mitochondrie. Les cellules ont cependant la possibilité de survivre dans des conditions de stress en utilisant une série de mécanismes permettant de bloquer ou de freiner l'activation des caspases. Comme la dérégulation de l'apoptose est impliquée dans le développement de plusieurs pathologies, telles que le cancer ou le diabète, une meilleure compréhension de l'apoptose et de ses mécanismes de contrôle est cruciale pour développer de nouveaux outils thérapeutiques pour traiter ces maladies.
Les cellules de l'organisme sondent continuellement leur milieu environnant afin de déterminer si celui-ci est propice à leur bon fonctionnement. Si ce n'est pas le cas, elles vont mettre en uvre des mécanismes de survie pour pallier à la dégradation du milieu extérieur, ou alors décider que la dégradation des conditions externes est telle qu'il est plus judicieux de se suicider. Cette mort programmée, appelée apoptose, n'est pas une réponse passive de la cellule mais la résultante de l'activation de voies intracellulaires spécifiques, entraînant une série de réactions cellulaires et moléculaires précises et coordonnées. Nous allons décrire au cours des pages suivantes, quelles sont les molécules et les voies intracellulaires impliquées dans l'apoptose et quels sont les outils à disposition de la cellule pour contrecarrer, si nécessaire, l'induction de cette mort cellulaire.
L'apoptose est induite suite à l'activation de certains membres des caspases, une famille particulière de protéases, qui découpent leurs substrats spécifiquement après des résidus aspartate.1-3 Ces clivages engendrent les événements biochimiques et cellulaires caractéristiques de l'apoptose : la cellule se ratatine,4 le noyau se condense et se fragmente,5 la cellule se scinde en corps apoptotiques et des marqueurs indiquant aux macrophages qu'il faut phagocyter la cellule mourante sont exprimés à la surface membranaire.6 Pour comprendre comment le phénomène de l'apoptose se déroule au niveau moléculaire, il est donc nécessaire d'identifier les protéines qui sont clivées par les caspases et d'en caractériser les fonctions exactes dans le processus de l'apoptose. A ce jour, plus de 280 substrats de caspases ont été décrits 7 mais certains chercheurs pensent qu'il y en aurait plus de 500, voire plus de 1000. Devant une telle pléthore de cibles des caspases, il devient difficile de différencier les substrats qui jouent un rôle primordial dans l'apoptose de ceux qui sont seulement d'innocentes victimes de l'attaque protéolytique des caspases mais ne participant pas au processus de l'apoptose. Le seul moyen à disposition des chercheurs pour déterminer l'importance dans l'apoptose d'un événement de clivage particulier est de remplacer dans une cellule la forme sauvage d'un substrat de caspases par un mutant ne pouvant être clivé et déterminer si cela affecte l'apoptose induite par une série de stimuli différents. Ce type d'approche implique des techniques telles que la recombinaison homologue, qui nécessitent un investissement en temps important. Ceci explique en partie pourquoi cette approche n'a été utilisée que pour trois substrats de caspases seulement, PARP [poly(ADP-ribose) polymerase],8 la protéines du rétinoblastome (Rb)9 et RasGAP (Ras GTPase-activating protein).10 Nous sommes loin de comprendre dans le détail comment l'apoptose est déclenchée après activation des caspases ! Par contre, les signaux en amont commencent à être mieux compris et sont décrits ci-dessous.
Deux voies d'activation des caspases ont été bien décrites : la voie extrinsèque et la voie intrinsèque (figure 1). La voie extrinsèque est initiée par l'activation des récepteurs de mort présents à la surface de la cellule. Ces récepteurs appartiennent à la famille des récepteurs au TNF (tumor necrosis factor) et comprennent notamment TNFR1, Fas et DR4/5. Ces récepteurs sont activés lorsqu'ils se lient à leur ligand. La figure 1 montre, en prenant Fas comme exemple, que la stimulation des récepteurs de mort conduit à l'activation d'une caspase initiatrice appelée caspase 8. Une fois activée, la caspase 8 clive et active à son tour la caspase 3, une caspase exécutrice, responsable du clivage de la majorité des substrats des caspases dans la cellule.11,12 La voie intrinsèque implique la mitochondrie. Sans rentrer dans les détails, les stimuli induisant la voie intrinsèque conduisent la mitochondrie à relâcher du cytochrome C dans le cytoplasme. Ceci stimule la formation de l'apoptosome, un complexe comprenant sept copies d'Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) liées au cytochrome C et assemblées à autant de molécules de caspase 9, une autre caspase initiatrice. L'incorporation de la caspase 9 dans l'apoptosome stimule son activité et lui permet de cliver et d'activer la caspase 3. La voie extrinsèque et la voie intrinsèque se rejoignent donc au niveau de l'activation de la caspase 3.
A la fin des années 1990, il était généralement admis que l'activation des caspases 8, 9 et 3 constituait un point de non-retour pour la cellule qui était alors inexorablement entraînée vers une mort certaine.13-15 Depuis, il est apparu que l'activation de ces caspases n'induit pas toujours l'apoptose mais peut participer à d'autres réponses cellulaires indispensables pour le bon fonctionnement de la cellule.16 Par exemple, il a été observé que l'activation de la caspase 3 est nécessaire à la différenciation des cellules musculaires striées,17 et que l'activation et la prolifération des cellules T requièrent l'activation de caspases.16,18-20 Ceci montre que les caspases impliquées dans l'apoptose peuvent dans certains types cellulaires, en réponse à des stimuli particuliers, et vraisemblablement en fonction de leurs niveaux d'activation, engendrer d'autres réponses que la mort cellulaire. Dans ces cas, les cellules activent des mécanismes dits de survie pour contrecarrer le potentiel létal des caspases.
L'inhibition des voies conduisant à l'apoptose peut opérer à différents niveaux : les récepteurs de mort, le relâchement de cytochrome C par la mitochondrie, la prévention de l'activation des caspases et l'inhibition directe de l'activité protéolytique des caspases.
Nous avons vu précédemment que l'activation de la voie extrinsèque de l'apoptose s'effectue par l'intermédiaire de récepteurs de mort (figure 1). Il existe des mécanismes qui empêchent que ces récepteurs soient activés. Ils mettent en jeu des leurres qui font également partie de la famille des récepteurs au TNF. Ces protéines, tels DcR1, DcR2 et DcR3 (DcR pour Decoy Receptor) et l'ostéoprotégérine, sont capables de lier les ligands de mort mais ne possèdent pas les domaines intracellulaires leur permettant de se connecter à la voie menant à l'activation des caspases.21-23 Ces récepteurs leurres «tamponnent» donc les ligands de mort en les empêchant d'interagir avec les récepteurs capables d'activer les caspases.
Les protéines de la famille de Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) régulent la voie intrinsèque de l'apoptose.6,24 Bcl-2 a été initialement identifié comme l'oncogène responsable du développement des lymphomes B résultant de la translocation chromosomique t(14, 18).24 La famille de Bcl-2 peut être divisée en plusieurs catégories en fonction de domaines spécifiques appelés BH1 à BH4 (BH domains signifiant Bcl-2 homology domains) (figure 2). La catégorie des protéines anti-apoptotiques comprend Bcl-2 lui-même, Bcl-XL, Mcl-1, A1 et Bcl-W. Ces protéines sont caractérisées par la présence des quatre différents domaines BH. Les protéines pro-apoptotiques sont subdivisées en deux catégories distinctes, celle des protéines à un seul domaine BH3, comprenant Bad, Bid, Bik, Noxa et Puma, et celle des protéines contenant les domaines BH1, BH2 et BH3, constituée de Bax et Bak. Ces dernières sont des protéines pouvant, suite à leur activation, induire le relâchement de cytochrome C de la mitochondrie (figure 2). L'activation de Bax et Bak est régulée par la balance entre les protéines anti-apoptotiques portant les domaines BH1-BH4 et les protéines pro-apoptotiques à un seul domaine BH3 (figure 2). Si les premières sont plus nombreuses, Bax et Bak restent inactifs. Si c'est le contraire, Bax et Bak induisent le relâchement de cytochrome C (figure 2).
Les protéines de la famille Heat Shock (HSP) s'accumulent dans les cellules exposées à la chaleur, d'où leur nom, mais également à d'autres conditions de stress. Ces molécules fonctionnent en tant que protéines chaperonnes et stabilisent ainsi leurs protéines cibles. Elles permettent à la cellule de s'adapter à la dégradation des conditions environnementales.25 Certaines protéines heat shock sont exprimées constitutivement dans les cellules alors que l'expression d'autres est induite par un stress cellulaire. Les protéines HSP induites par les stress, telles que HSP27 ou HSP70, ont apparemment des fonctions anti-apoptotiques. HSP27 semble être capable de lier le cytochrome C relâché par la mitochondrie et empêcher de cette manière l'apoptosome de se former (figure 1).25 HSP70, quant à elle, est capable d'interagir avec Apaf-1, bloquant également la formation de l'apoptosome. HSP70 peut aussi interagir avec AIF (Apoptosis Inducing Factor), une protéine capable d'induire la mort cellulaire indépendamment, semble-t-il, de l'activation des caspases.26 Cette interaction pourrait ainsi empêcher la capacité d'AIF d'induire la mort de la cellule.25 Les protéines HSP ont ainsi la possibilité de bloquer la mort cellulaire à différents niveaux.
Les protéines inhibitrices de l'apoptose (Inhibitor of Apoptosis Proteins ou IAPs) ont été identifiées pour la première fois dans des baculovirus. Elles sont caractérisées par la présence d'un ou plusieurs domaines appelés BIR (pour Baculovirus IAP Repeat) qui leurs confèrent la capacité d'inhiber les caspases. XIAP, c-IAP1, c-IAP2 et Survivin se lient directement aux caspases 3, 7 et 9 et inhibent leur activité protéolytique.27-29 XIAP est l'IAP humaine qui a été la plus étudiée. Elle possède plusieurs domaines BIR qui ne sont pas fonctionnellement équivalents. En effet, la région qui comprend les domaines BIR1 et BIR2 est responsable de l'inhibition des caspases 3 et 7, alors que la région comprenant le domaine BIR3 inhibe la caspase 9.29 Les IAPs sont donc des protéines qui peuvent agir très en aval des voies conduisant à l'apoptose puisqu'elles touchent directement les caspases.
La grande majorité des substrats de caspases, une fois clivés, promeuvent l'apoptose. Il existe cependant des substrats qui au contraire inhibent l'apoptose lorsqu'ils sont protéolysés par les caspases. Par exemple, le clivage de la protéine kinase C-e par la caspase 3 induit son activation et ceci semble engendrer un signal anti-apoptotique.30 La stimulation du récepteur des lymphocytes B induit le clivage, par des caspases, des kinases Lyn et Fyn en des fragments qui protègent les cellules.31,32 La manière dont ces différentes protéines, une fois clivées par les caspases, induisent une réponse anti-apoptotique, ainsi que leur contribution dans la survie des cellules restent pour l'instant largement incomprises. Par contre, on connaît mieux le rôle de RasGAP, un autre substrat des caspases inhibant l'apoptose après clivage par celles-ci.
RasGAP est une protéine ubiquitaire de 120 kDa composée de plusieurs domaines (figure 3). Comme son nom l'indique RasGAP active, grâce à son domaine GAP (GTPase-activating protein), la fonction GTPasique de Ras et ainsi convertit la forme active de Ras lié au GTP en la forme inactive liée au GDP. Les domaines N-terminaux de RasGAP, à l'opposé, favorisent, d'une manière qui reste pour l'instant mystérieuse, les fonctions effectrices de Ras.33 RasGAP est donc une protéine qui peut soit favoriser, soit inhiber, l'activité de Ras.34 RasGAP possède deux sites de coupures par les caspases.35-37 Le premier site (indiqué par 1 dans la figure 3) est situé entre le deuxième domaine SH2 et le domaine PH et le deuxième site (indiqué par 2 dans la figure 3) entre le domaine riche en proline et le premier domaine SH2. Ces sites ne sont pas utilisés dans les mêmes conditions. Le premier site est reconnu à de très basses activités de caspase 3 ce qui engendre alors deux fragments appelés N et C. Le deuxième site quant à lui, situé dans le fragment N, ne peut pas être clivé par les caspases si le premier site n'a pas été utilisé et d'autre part est reconnu à de plus hautes activités de caspase 3.10,37 Le clivage de RasGAP au niveau du deuxième site engendre deux nouveaux fragments appelés N1 et N2.
Une étude récente a démontré que le premier clivage de RasGAP est crucial pour la survie des cellules dans des conditions de stress légers.10 Les cellules portant une mutation dans RasGAP l'empêchant d'être clivée au niveau du premier site sont en effet extrêmement sensibles à des stimulus apoptotiques qui n'affectent toutefois pas la viabilité ou la croissance de cellules normales.10 Les cellules normales activent faiblement la caspase 3 dans ces conditions mais survivent, alors que les cellules ne pouvant pas cliver RasGAP activent massivement leur caspase 3 et meurent. La survie des cellules normales dépend donc paradoxalement d'une faible activation de caspases nécessaire au clivage partiel de RasGAP.38 Ceci pourrait expliquer pourquoi les souris knock-out pour RasGAP, et donc de ses fragments, présentent une apoptose très augmentée dans le cerveau.39
Il a été montré que des deux fragments engendrés par le clivage partiel de RasGAP, c'est le fragment N qui induit un signal qui maintient l'activation de la caspase 3 à des niveaux compatibles avec la survie de la cellule10,40 (figure 4). Le fragment N active Ras (figure 4, panneau 1) qui stimule alors la phosphatidyl-inositol-3 kinase (PI3K) à produire des phosphatidyl-inositols 3,4,5-triphosphate (PIP3) (figure 4, panneau 2). Grâce à leur domaine PH (Plekstrin Homology domain) qui a une forte affinité pour les PIP3, deux kinases, Akt et PDK, sont alors recrutées au niveau de la membrane (figure 4, panneau 3) où PDK phosphoryle et active Akt (figure 4, panneau 4). Une fois activée, Akt permet la survie des cellules en maintenant l'activation de la caspase 3 à de bas niveaux 10 (figure 4, panneau 5). Les mécanismes moléculaires mis en jeux par l'activation de Akt suite à la formation du fragment N n'ont pas encore été totalement élucidés. Il semble important toutefois que le fragment N inhibe la capacité de Akt à activer le facteur de transcription NFkB (figure 4, panneau 5).40 En effet, bien que NFkB facilite la survie dans de nombreuses cellules, il existe des types cellulaires, comme les cellules bêta du pancréas par exemple, où l'activation de NFkB induit l'apoptose.41 Il apparaît donc logique que le fragment N, pour promouvoir la survie dans le plus grand nombre possible de types cellulaires inhibe la capacité de Akt à activer le facteur de transcription NFkB.
Les propriétés du fragment N en font un candidat idéal pour le développement d'outils thérapeutiques permettant de freiner l'élimination pathologique de cellules dans des maladies telles que le diabète ou la maladie d'Alzheimer. Nous avons actuellement des travaux en cours portant sur les effets du fragment N dans les cellules bêta des îlots de Langerhans. L'expression du fragment N devrait augmenter la survie de ces cellules et donc freiner le développement du diabète.
Comme les cellules de notre organisme sont constamment soumises à des stress de toute nature provenant notamment de notre interaction avec le milieu extérieur, l'évolution nous a doté de mécanismes divers pour assurer notre survie. Ces mécanismes mettent en uvre différentes stratégies pour bloquer, à différents niveaux, les voies conduisant à l'apoptose (figure 5). La dérégulation de ces mécanismes peut cependant avoir de néfastes répercussions. Ainsi, une activation constitutive des mécanismes de survie est observée dans de nombreux cancers.25,28,29 A l'opposé, une activation défectueuse des mécanismes de survie peut conduire au développement de maladies caractérisées par une perte pathologique de certains types cellulaires, comme observé dans les maladies neurodégénératives (Alzheimer, Parkinson, etc.) ou le diabète. L'étude des voies cellulaires conduisant à l'apoptose et la manière dont elles sont régulées est donc critique pour la compréhension de ces maladies et l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques.