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Die Mehrfarben-Fluoreszenzmikroskopie ist ein wichtiges Werkzeug für die Biowissenschaften, um die relative Anordnung zellulärer Strukturen oder die Wechselwirkungen verschiedener Proteine zu untersuchen. Herkömmliche Mikroskope, die Arbeitspferde für viele biologische Studien, können jedoch nur Details in der Grössenordnung der Wellenlänge des Lichts auflösen. In den vergangenen zwei Jahrzehnten haben mehrere Konzepte der Superauflösungsmikroskopie den Forschern geholfen, diese Beugungsgrenze zu überwinden und neue Entdeckungen zu machen. Diese neuen Methoden finden nur langsam ihren Weg in die biologische Routineanwendung. Bei einigen der neuen Techniken ist dies auf die komplexe Mikroskop-Hardware zurückzuführen, aber auch die gestiegenen Anforderungen an die Probenpräparation und die Fluoreszenzmarkierungen stellen erhebliche Hürden dar. Bei Multicolor-Anwendungen sind die Anforderungen an eine erfolgreiche Super-Resolution-Imaging-Methode noch schwieriger zu erfüllen.
Das Labor für biomedizinische Optik der EPFL unter Leitung von Theo Lasser hat sich intensiv mit dem Super-Resolution Optical Fluctuation Imaging (SOFI) beschäftigt, um die räumliche Auflösung und die Abtastung in 2D und 3D zu erhöhen. SOFI ist eine Alternative zu Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopietechniken wie STORM und PALM. Sie analysiert räumlich-zeitliche Statistiken höherer Ordnung einer Zeitreihe blinkender Fluorophore und erfordert nicht die Isolierung von Emissionen einzelner Fluorophoren. SOFI ist mit einem breiteren Spektrum von Markierungs- und Bildgebungsbedingungen kompatibel, was die Auswahl und die Experimente mit Fluorophoren vereinfacht. In ihrer neuen Studie erweiterten die Forscher an der School of Engineering unter Leitung von Theo Lasser und Aleksandra Radenovic (Leiterin des Labors für Biologie im Nanobereich) die statistische Analyse auf den Spektralbereich, um den Weg zu einem neuen Ansatz für mehrfarbige Superauflösungs-Bildgebung zu ebnen.
Die Anzahl der Farben ist nicht durch die Spektralkanäle des Mikroskops oder die Ausnutzung des spektralen Übersprechens begrenzt.
Die Idee hinter dem mehrfarbigen SOFI-Ansatz ist Folgende: Im klassischen Multicolor-Imaging sollte ein Übersprechen zwischen verschiedenen Spektralkanälen des Mikroskops vermieden werden. Hier nutzen die Forschenden das Crosstalk zur Erzeugung zusätzlicher Farbkanäle. Sie wenden die Crosstalk-Analyse zwischen mehreren gleichzeitig erfassten Spektralkanälen an. Die statistische Analyse erlaubt es ihnen, die vom Mikroskop bereitgestellten physikalischen Detektionskanäle durch zusätzliche virtuelle Spektralkanäle zu ergänzen. «Nur die Signale, die in den verschiedenen Spektralkanälen räumlich und zeitlich korreliert sind, erscheinen in den virtuellen Kanälen. Wir nehmen genau das Übersprechen auf, das alle anderen loswerden wollen», erklärt Kristin Grußmayer, eine der Hauptautorinnen der Studie. Die zusätzlichen rechnerisch erzeugten Spektralkanäle zusammen mit der linearen Entmischung ermöglichen die Abbildung von deutlicheren Fluorophorfarben als die aufgezeichneten physikalischen Detektionskanäle.
Die Publikation liefert die Theorie hinter dem spektralen Cross-Cumulant Multicolor SOFI und enthält einen Rahmen zur Optimierung der Spektralkanäle des Mikroskops für eine gegebene Kombination von Fluorophoren, die abgebildet werden sollen. Anhand simulierter Datensätze konnte das Team verifizieren, dass ihr neuer Multicolor-Ansatz für eine breite Palette von Etiketten mit unterschiedlichen photophysikalischen Eigenschaften funktionieren sollte, selbst für solche mit stark überlappenden Emissionsspektren. «Wir konnten zeigen, dass unser Ansatz für die Dreifarbenabbildung in fixierten und in lebenden Zellen für eine Vielzahl von Farbstoffen und fluoreszierenden Proteinen funktioniert. Die Bildgebung kann mit kommerziellen Weitfeldaufbauten mit zweikanaligen Bildteilereinheiten durchgeführt werden, die weithin verfügbar sind. Im Prinzip sind wir nicht auf 3 Farben beschränkt», sagt Kristin Grußmayer.
Anleitungen zur Durchführung der mehrfarbigen spektralen Cross-Cumulant SOFI-Analyse sind auf der Webseite des Labors für Biologie im Nanomassstab unter https://www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/ verfügbar, und das Softwarepaket kann unter https://www.epfl.ch/labs/lben/wp-content/uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip heruntergeladen werden.