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Ein Cholesteatom entsteht oft durch eine Entzündung des Mittelohres oder einer Fehlfunktion der Eustachischen Röhre. Meist kommt es zu einem Unterdruck im Mittelohr. Es kann eine sogenannte epitympanale Einziehung des Trommelfells entstehen.
Normalerweise leitet die Eustachische Röhre Luft vom hinteren Teil der Nase ins Mittelohr. Dadurch wird der normale Druck im Mittelohr reguliert. Bei einer allergischen Reaktion, einer Erkältung, einer Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, nach Bestrahlung oder bei einer Nasennebenhöhlenentzündung kann die normale Funktion der Eustachischen Röhre beeinträchtigt werden. Ein Vakuum kann im Mittelohr entstehen. Durch das entstandene Vakuum werden speziell durch Entzündungen geschwächte Teile des Trommelfelles angesaugt. Dies kann dann die Vorstufe eines Cholesteatoms sein. Sehr selten gibt es auch angeborene Cholesteatome. Häufigste Ursache für Cholesteatome sind jedoch Ohrentzündungen.