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Le développement des anticorps monoclonaux et l'évolution rapide des lasers et des programmes d'analyses informatiques ont permis à la cytométrie de flux (CF) de devenir un outil performant d'analyse multiparamétrique cellulaire. Depuis son introduction, son champ d'application a été élargi et touche non seulement les domaines de l'hémato-oncologie mais également de l'immunologie (tableau 1) et de la recherche en biologie cellulaire. Au cours de ces dix dernières années, le diagnostic des hémopathies malignes a considérablement évolué. La nouvelle classification OMS 2001 intègre les résultats de l'immunophénotypisation, des examens cytogénétiques et des analyses moléculaires, aux examens morphologiques.1 L'immunophénotypisation est devenue depuis lors nécessaire au diagnostic des lymphomes et des leucémies. Elle apporte des renseignements sur leur pronostic et leur évolution après traitement (suivi de la maladie résiduelle). Elle peut jouer un rôle dans les choix thérapeutiques en guidant l'utilisation de certains anticorps monoclonaux comme le rituximab (anticorps anti-CD20), l'alemtuzumab (anticorps anti-CD52), le gemtuzumab (anticorps anti-CD33 couplé à la calicheamicine) et en détectant les phénomènes de résistance médicamenteuse.2 La CF est devenue aussi un outil indispensable à la quantification des cellules CD34+ lors de récolte de cellules souches hématopoïétiques périphériques ou médullaires.3
Le cytomètre
Le cytomètre de flux analyse les caractéristiques morphologiques et la fluorescence d'une suspension cellulaire. Il est équipé d'un ou deux lasers dont la lumière monochromatique permet d'exciter les cellules préalablement marquées avec des anticorps monoclonaux porteurs d'un fluorochrome.4 Les échantillons analysés, prélevés sur un anticoagulant (généralement l'héparine), proviennent le plus fréquemment du sang périphérique, d'une aspiration médullaire ou d'une suspension de cellules ganglionnaires ou spléniques. Il est également possible d'analyser des liquides céphalorachidiens ainsi que des liquides d'épanchements pleuraux ou d'ascite. Dans le cytomètre, les cellules en suspension sont entraînées dans un courant qui crée un flux laminaire. Suite à leur excitation par le laser, les fluorochromes émettent de la lumière en retournant à leur état de repos. Cette lumière émise à des longueurs d'onde spécifiques est recueillie sur différents photomultiplicateurs grâce à un jeu d'optiques, de miroirs et de filtres (fig. 1) et analysée par ordinateur.4
Le marquage cellulaire
Les anticorps monoclonaux, le plus souvent d'origine murine, sont regroupés en fonction d'une classification qui assigne une appartenance de la molécule qu'ils reconnaissent à un
cluster de différenciation (CD) (tableau 2).5 Les anticorps monoclonaux peuvent reconnaître des molécules localisées à la surface ou à l'intérieur des cellules analysées après perméabilisation membranaire. Le marquage de la surface cellulaire est effectué, soit avec des anticorps monoclonaux couplés directement à un fluorochrome, soit plus rarement en marquage indirect.4 L'intensité de la fluorescence donne des informations sur la densité antigénique à la surface des cellules. L'emploi de plusieurs fluorochromes, chacun pouvant être excité avec la même longueur d'onde mais émettant à des longueurs d'onde différentes, permet de mesurer plusieurs propriétés cellulaires simultanément.
Les diagrammes
Les informations obtenues sont présentées à la fois sous forme d'histogrammes et de diagrammes bidimensionnels de type dot-plot. L'analyse de l'angle de dispersion lumineuse du faisceau laser sépare les cellules selon leur taille (déviation dans le sens du rayon laser : forward-angle light scatter ou FSC) et selon leur granularité (déviation à angle droit du rayon laser : side-angle light scatter ou SSC).4 Ces caractéristiques optiques permettent de distinguer, par exemple, dans une suspension de cellules mononucléées du sang périphérique, les lymphocytes des monocytes et des neutrophiles (fig. 2). En hémato-oncologie, lors de la recherche de cellules blastiques ou lymphomateuses, l'analyse est limitée aux cellules dont la taille et la granularité correspondent à celles des cellules malignes. Cette sélection est définie au moyen d'une «fenêtre d'analyse» (gating) délimitée sur le diagramme FSC/SSC. L'immunomarquage permet ensuite de préciser le pourcentage de cellules malignes parmi les cellules comprises dans la fenêtre d'analyse.
Généralités
La CF détermine l'appartenance à une lignée cellulaire et le degré de différenciation cellulaire ; elle révèle la présence d'expressions antigéniques parfois aberrantes et permet de préciser la clonalité des proliférations lymphocytaires B anormales.
I Appartenance à une lignée cellulaire : la plupart des marqueurs (CD) sont associés à une ou plusieurs lignées cellulaires. Certains anticorps monoclonaux sont plus spécifiques, comme la myéloperoxydase cytoplasmique de la lignée myéloïde, le CD22 et le CD79a cytoplasmiques de la lignée lymphocytaire B et le CD3 cytoplasmique de la lignée lymphocytaire T.
I Degré de différenciation : au cours de l'hématopoïèse normale, les précurseurs acquièrent ou perdent l'expression d'une combinaison d'antigènes (CD) en relation avec les différents stades de maturation et leur différenciation le long des diverses lignées hématopoïétiques. Les cellules les plus immatures coexpriment les marqueurs CD34, HLA-DR ou la désoxyribonucléotidyl-transférase terminale (TdT), alors que les cellules différenciées perdent l'expression de ces marqueurs.5
Lymphomes
Lymphomes B
Les lymphomes malins résultent d'une expansion monoclonale de lymphocytes tumoraux. Le sang périphérique contient normalement environ deux fois plus de lymphocytes B kappa positifs que de lymphocytes B lambda positifs.6 L'expression prédominante de l'une des chaînes légères à la surface des lymphocytes (très forte augmentation ou diminution du rapport kappa/lambda) est le témoin de l'expansion d'une population lymphocytaire B monoclonale (fig. 3).7 Lorsque le nombre de lymphocytes B est suffisant pour effectuer une CF (généralement >10% des cellules analysées), cet examen permet de déterminer la clonalité lymphocytaire dans la plupart des cas examinés.8 Les cellules lymphomateuses B expriment fréquemment à leur surface des antigènes (CD) n'appartenant pas à leur lignée cellulaire ou des marqueurs n'appartenant pas à leur stade de différenciation. C'est, par exemple, le cas de la coexpression du marqueur lymphocytaire T CD5 dans la leucémie lymphoïde chronique (LLC) (fig. 4). Cette combinaison particulière d'antigènes et l'intensité d'expression de certains marqueurs permettent d'établir un diagnostic précis, expliquant le rôle central que tient la CF dans la classification des lymphomes B (tableau 3).6
Chez les patients qui présentent une lymphocytose périphérique, la CF permet de distinguer un phénomène réactionnel d'un processus tumoral B ou T. Par exemple, si l'on observe une clonalité B avec une coexpression des marqueurs C19, CD5 et CD23, il s'agit le plus fréquemment d'une leucémie lymphoïde chronique (LLC) (fig. 4). Cette maladie doit être différenciée des autres lymphomes en phase leucémique (tableau 4) dont le pronostic est souvent nettement moins bon.1,6 Dans certaines situations où la LLC n'exprime que faiblement le marqueur CD23, sa distinction avec le lymphome du manteau est difficile. L'expression de forte intensité du CD20 et de l'immunoglobuline de surface ainsi que l'absence d'expression du CD23 nous orientent vers le diagnostic de lymphome du manteau. Ce sont la présence de la translocation t(11 ; 14) en biologie moléculaire et en cytogénétique conventionnelle ainsi que l'expression de la cycline D1 intranucléaire, en cytométrie de flux ou en immunohistochimie, qui confirment ce diagnostic.1,6,9 Cette distinction est fondamentale en raison des implications pronostiques et thérapeutiques différentes de ces deux pathologies.
Les progrès récents en biologie moléculaire ont permis de définir deux sous-types de LLC en fonction de la présence ou l'absence d'hypermutations somatiques des gènes codant pour la partie variable de la chaîne lourde des immunoglobulines (IgVH). Les patients dont le status IgVH est muté ont une survie plus longue que les patients dont le status IgVH est non muté.10 La détermination de ce status en biologie moléculaire n'est effectuée que dans certains laboratoires spécialisés et reste très coûteuse. La détection de l'expression de la tyrosine kinase ZAP-70 en CF pourrait permettre de la remplacer. L'expression de ZAP-70 dans >20% des cellules lymphomateuses a en effet été corrélée à un status IgVH non muté.11 De même, l'augmentation de l'expression de CD38 est également associée à un status IgVH non muté.12 Ces deux marqueurs représentent donc deux facteurs de mauvais pronostic, rapidement identifiables par la CF.
Lymphomes T
Le diagnostic des lymphomes T par CF est plus difficile en raison de l'absence de marqueur de clonalité T. La présence d'une expansion monoclonale T est suspectée en cas d'anomalie marquée du rapport CD4/CD8, d'aspect de double population lymphocytaire lors de l'analyse des coexpressions des marqueurs lymphocytaires T ou encore en cas de coexpressions aberrantes (tableau 5).6 L'absence de certains marqueurs habituellement retrouvés sur les lymphocytes T normaux est la caractéristique la plus utile pour rechercher une néoplasie T (observée dans 75% des cas).8 La clonalité d'une prolifération lymphocytaire T doit être par contre confirmée par l'analyse des réarrangements des gènes codant pour la chaîne gamma du récepteur T (T-cell receptor : TcR). Les lymphomes T peuvent également exprimer de façon anormale les chaînes légères ab et gd du TcR. La majorité des lymphocytes T normaux du sang périphérique expriment les chaînes ab tandis que les lymphocytes gd+ représentent moins de 5% des lymphocytes circulants.13 Les lymphomes T sont moins fréquents que les lymphomes B. Environ la moitié est classée comme «lymphome T périphérique» car ces lymphomes n'entrent pas dans une catégorie mieux définie.6 Les autres sont répartis dans les divers sous-groupes indiqués dans le tableau 5.
La leucémie à LGL est caractérisée par une prolifération de lymphocytes granulaires monoclonale T persistante. Elle est divisée en deux catégories : la leucémie à T-LGL CD3 positive et la leucémie à NK-LGL CD3 négative.14 La leucémie à T-LGL (fig. 5) possède généralement un phénotype de lymphocyte T cytotoxique avec expression du marqueur CD8 et du marqueur LGL CD57. La plupart ont une évolution clinique indolente qui peut cependant être compliquée de la survenue d'une neutropénie, d'une anémie, voire d'une aplasie médullaire. Une hépatosplénomégalie est parfois observée. La leucémie à NK-LGL, CD3 négative, est CD2 positive et exprime les marqueurs NK CD16 et CD56. Habituellement, elle est doublement négative pour le CD4 et le CD8 et n'exprime pas les chaînes ab ou gd du TcR. Dans la classification de l'OMS, certains cas, dont l'évolution clinique est défavorable, entrent dans le groupe «leucémie à cellules NK agressive».1 D'autres cas, dont l'évolution est bénigne, peuvent présenter des cytopénies.
Leucémies aiguës
La classification de l'OMS 2001 a intégré la CF afin de définir plus précisément l'appartenance des cellules leucémiques à une lignée hématopoïétique et leur degré de différenciation.1 Les cellules leucémiques ont été considérées comme étant équivalentes à des cellules hématopoïétiques normales, bloquées à un stade de leur différenciation. Toutefois, les analyses de CF ont montré que ces cellules expriment non seulement des marqueurs d'immaturité mais aussi des marqueurs aberrants qui les distinguent des progéniteurs hématopoïétiques normaux. On peut observer par exemple l'expression de marqueurs d'une ou plusieurs autres lignées cellulaires qui ne sont pas exprimés lors de la différenciation cellulaire normale.1,9,14 Ce profil d'expression permet le diagnostic des leucémies aiguës et le suivi de la maladie résiduelle après chimiothérapie intensive.
Leucémies myéloïdes aiguës
La classification OMS 2001 sépare les leucémies myéloïdes aiguës (LMA) en fonction de leurs anomalies cytogénétiques récurrentes. Certains de ces sous-groupes sont associés à un phénotype distinct. La leucémie promyélocytaire aiguë, caractérisée par la translocation t(15 ; 17), est HLA-DR et CD15 négative. Elle peut exprimer les marqueurs CD2 et CD9. La LMA présentant la translocation t(8 ; 21) coexprime souvent les marqueurs CD19 et CD56. La LMA M4 à éosinophiles avec inv(16) exprime le CD2 en plus des marqueurs monocytaires.1,9,14 On peut supposer que le phénotype aberrant détaillé dans ces exemples soit relié aux altérations génétiques sous-jacentes. Cependant, dans la plupart des cas, la sensibilité et la spécificité de ces combinaisons antigéniques sont relativement faibles. L'analyse moléculaire garde un rôle prépondérant dans le pronostic des LMA.
Au cours de ces deux dernières décennies, des études ont éclairci les mécanismes de résistance à la chimiothérapie (multiple drug resistance). Plusieurs observations ont montré qu'une protéine membranaire, la glycoprotéine-P (gp-P), permet de transporter certains médicaments, notamment les anthracyclines, hors de la cellule tumorale. L'expression de la gp-P est associée à une diminution du taux de rémission complète après chimiothérapie. L'expression de la gp-P à la surface des cellules malignes peut être détectée avec des anticorps monoclonaux (MRK16, UIC2, 4E3).2 Des tests fonctionnels ont également été développés en CF.
Leucémies lymphoblastiques aiguës
La classification des leucémies lymphoblastiques aiguës (LLA) est basée sur le stade de maturation du lymphoblaste.1,9,15 Les LLA-B sont classées en fonction de la présence ou de l'absence d'expression d'immunoglobulines cytoplasmiques, d'immunoglobulines de surface et du CD10. Le stade de différenciation est corrélé à l'évolution clinique. Chez environ un tiers des LLA-B, on peut observer des anomalies chromosomiques récurrentes qui sont parfois associées à un phénotype spécifique. Par exemple, la LLA-B CD10 négative porte des marqueurs myéloïdes aberrants (CD15 et CD65). Elle est associée à la présence de la t(4 ; 11) avec réarrangements des gènes MLL-AF4 de mauvais pronostic.1,14
Les LLA-T sont classées parallèlement aux stades de développement du thymocyte normal, selon l'expression du CD1 et du CD3 de surface.15 Les anomalies génétiques récurrentes sont moins fréquentes que dans les LLA-B et il n'existe pas de corrélation claire entre ces anomalies moléculaires et le phénotype. L'impact pronostique de la CF dans les LLA-T est moins bien étudié. Il semble que le profil correspondant au «thymocyte commun ou cortical» caractérisé par la coexpression des marqueurs CD1, CD4 et CD8, confère une meilleure survie.16
Maladie résiduelle
Un patient est considéré en rémission complète (RC) morphologique lorsqu'il persiste moins de 5% d'éléments blastiques dans sa moelle. Toutefois, même dans ces circonstances, on retrouve encore jusqu'à 1010 cellules tumorales non détectées par l'examen morphologique.17 La sensibilité de la cytométrie, couplée à la possibilité d'analyser rapidement de multiples paramètres sur un grand nombre de cellules, permet de détecter un nombre très faible de cellules blastiques résiduelles (détection d'une cellule maligne parmi 103-105 cellules normales).18 La persistance d'une maladie résiduelle (minimal residual disease) étant la source de récidive après chimiothérapie, son suivi en CF peut être utile lorsqu'il n'existe pas d'anomalies moléculaires identifiables (fig. 6).
Cellules souches hématopoïétiques
Les cellules souches hématopoïétiques pluripotentes sont capables à la fois de se diviser pour maintenir un pool stable de cellules souches au cours de l'existence et de reconstituer la moelle hématopoïétique. Elles sont identifiées par des marqueurs de surface, notamment le CD34. La mobilisation des cellules souches médullaires dans le sang périphérique après chimiothérapie ou administration de facteurs de croissance hématopoïétique permet de les récolter en vue d'effectuer une greffe après chimiothérapie intensive dont les doses auraient été létales en l'absence de sauvetage médullaire (autogreffe, allogreffe). La quantification des cellules CD34+ par CF dans le sang périphérique permet de déterminer le moment propice de la récolte et de vérifier que le nombre de cellules CD34+ du greffon soit suffisant (minimum de 2x106 CD34/kg) pour reconstituer l'hématopoïèse après greffe.3
L'immunophénotypisation est devenue indispensable au diagnostic des lymphomes et des leucémies. Avec l'évolution des anticorps monoclonaux, la CF va continuer d'apporter des informations fiables et rapidement disponibles. Son développement, parallèle à celui de l'expression génique, devrait permettre de refléter de façon plus précise la biologie des cellules tumorales afin d'améliorer les stratégies thérapeutiques. Les études cliniques en cours vont contribuer également à mieux définir la place de la CF dans le pronostic et le suivi de la maladie résiduelle après chimiothérapie intensive. W