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Oozytengewinnung
Oozyten können in verschiedenen Reifungsstadien aus den Ovarien gewonnen werden. Die Grösse der Eizelle, das Vorhandensein eines Polkörperchens und die Ausbildung der Corona radiata tragen zur Beurteilung der Eizellreife bei. Je nach Reifestadium und Gewinnungszeitpunkt müssen die Eizellen nach der Entnahme weiter ausreifen. Dies geschieht während der in vitro Maturation (siehe unten).
Es stehen verschiedene Techniken zur Gewinnung der Eizellen zur Verfügung. Es wird unterschieden, ob die Oozyten aus toten (Gewinnung nach der Schlachtung) oder aus lebenden Tieren (mittels Laparaskopie, oder sogenanntem Ovum Pick-Up, OPU) gewonnen werden.
Technik bei geschlachteten Tieren
Zu Forschungszwecken oder bei genetisch wertvollen Tieren werden nach der Schlachtung die Ovarien entnommen. Bei der Aspiration werden mittels einer Hohlnadel die Eizellen aus den Follikeln abgesaugt. Beim Slicing, einer Alternative zur Aspiration, wird die Ovaroberfläche mit einem Mehrklingenmesser angeritzt, mit einem flüssigen Medium abgespült und der Inhalt in einem Gefäss aufgefangen.
Die Oozyten werden in eine Spüllösung (u.a. Glukose, Natriumpyruvat, Penicillin, Spreptomycin, Heparin) verbracht und mehrmals gewaschen.
Die in der Literatur gemachten Angaben zur Ausbeute streuen stark und hängen zudem ab von der eingesetzten Technik. Für die Slicing-Methode werden 5-75 gewonnene Oozyten pro Ovar angegeben, wovon 30-50% als IVF-tauglich gelten.
Technik am lebenden Tier
Am lebenden Tier haben sich zwei Oozytengewinnungsmethoden durchgesetzt. Die Laparoskopie und die sogenannte Ovum Pick-Up Methode (OPU). Bei der Laparaskopie wird ein Kaltlichtendoskop durch das Scheidendach geschoben und der Follikel mit einer im Endoskop integrierten Kanüle punktiert.
Die Ovum pick up Methode hingegen basiert auf der Ultrasonographie. Bei der auch als „transvaginale ultraschallgeleitete Follikelpunktion“ bezeichneten Methode wird der Schallkopf in die Vagina geschoben und das Ovar durch die rektal eingeführte Hand gegen die Sonde gepresst. Mit einer Kanüle, deren Kanal im Sondenträger integriert ist, wird der Follikel (am besten durch eine Hilfsperson) punktiert und die Eizelle entnommen.
Die Erfahrung hat gezeigt, dass 2 Sessionen pro Woche die besten Eizellgewinnungsraten ergeben. Eine hormonelle Stimulation vor dem Eingriff hingegen bringt keine Verbesserung der Eizellgewinnungsraten.
Die Angaben über die Ergebnisse der OPU schwanken stark. Bei 50% der Follikel führt eine Puktion zur Gewinnung von Oozyten. Pro Tier und Eingriff können 4-10 Oozyten gewonnen werden, 50% davon können in der Regel als IVF-tauglich bewertet werden.
Auch mehrmalig wiederholte Punktionen führen laut Literatur nicht zu ernsthaften Schäden des Spendertieres. Eine Verdickung der Ovarkapsel wurde beschrieben, jedoch ohne Nachteile mit sich zu bringen.
Unter dem Mikroskop werden die Oozyten morphologisch klassifiziert. Es existieren verschiedene Einteilungsschemata. Eine geläufige Klassifizierung ist diejenige von Blondin und Sirard (1995). Sie teilt die Oozyten in fünf Stadien ein, von denen die Klassen eins bis drei als IVF-tauglich gewertet werden.
Oozytenreifung
Die Eizellen werden in verschiedenen Reifestadien entnommen. Ihre Ausreifung bis zur Metaphase II der Meiose muss in vitro abgeschlossen werden. Dieser Vorgang wird als in vitro Maturation bezeichnet.
Gegenüber der Maturation in vivo kommt es bei der in vitro Maturation zu einer Verzögerung der Reifungsvorgänge. Es kann zu einer Asynchronizität zwischen der Kern- und der Zytoplasmareifung kommen, wodurch die Befruchtungseignung in Frage gestellt wird. Die in vitro Maturation findet in Zellkulturmedium statt. Dieses wird mit Proteinen (fetales Kälberserum oder Estrous Cow Serum) supplementiert. Wird zusätzlich FSH zugegeben, verbessern sich die Reifungs- und Befruchtungsraten.
Empirisch wurde festgestellt, dass eine Maturationsdauer von 18-24 Stunden am besten geeignet ist, Oozyten in die Metaphase II zu überführen.
Eine deutliche und gemeinsame Expansion aller Zellschichten ist die Grundlage einer erfolgreichen Maturation.
Spermienaufbereitung
Meistens wird für die IVF tiefgefrorenes Sperma verwendet, seltener frische Ejakulate oder epididymale Spermien. Tote oder schwache Spermien müssen aussortiert werden. Bei der Zentrifugation werden Spermien aufgrund ihrer Dichte getrennt. Beim „Swim-up“ Verfahren wird die in vivo Selektion bei der Cervixpassage nachgeahmt. Die vitalen Spermien schwimmen oben auf und können separiert werden.
Die Spermien erlangen ihre Fähigkeit, Eizellen zu befruchten, im weiblichen Geschlechtsapparat. Sie machen eine sogenannte Kapazitation durch. Dieser Prozess muss für eine erfolgreiche Befruchtung auch in vitro ablaufen und wird mit Hilfe von Heparin (teilweise zusätzlich mit Epinephrin und Hypotaurin) ausgelöst.
Befruchtung in vitro
Die eigentliche in vitro Fertilisation läuft in einem Nährmedium aus Tyrode-Laktat ab. Sehr wichtig dabei ist die Zugabe von Proteinen. Diese erlauben den Spermien die Anheftung an die Zona pellucida und unterstützen zudem die Akrosomreaktion.
In einer Schale werden 20 bis 25 Oozyten mit ungefähr 100‘000 auf Motilität und Morphologie geprüften Spermien zusammen gebracht. Während der 21 Stunden dauernden Inkubation bei 39°C und Zugabe von 5% CO2 befruchten die Spermien die Oozyten.
In vitro Kultivierung
Das Ziel der in vitro Kultivierung ist das Heranreifen lassen von übertragungsfähigen Embryonen. Dieses Ziel wurde nach einigen Rückschlägen nun mit Hilfe der Kokultivierung auf einschichtigen Zellkulturen erreicht. Die Zellkulturen können aus Granulosazellen oder Eileiterepithelzellen bestehen.
Eine erste Beurteilung wird am Tag drei nach Befruchtung vorgenommen. Wenn die Zygoten intakte und gleichmässig geformte Blastomeren aufweisen, werden sie als befruchtet eingestuft.
Am 8. Tag werden transferwürdige Embryonen auf Empfängertiere übertragen oder bei -196°C eingefroren.