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Établir le profil génétique d’une tumeur revient à regarder l’ADN des cellules qui la composent à la loupe afin de répertorier et d’interpréter les anomalies moléculaires (mutations).
une définition
Établir le profil génétique d’une tumeur revient à regarder l’ADN des cellules qui la composent à la loupe afin de répertorier et d’interpréter les anomalies moléculaires (mutations).
Connaître les mutations présentes dans l’ADN des cellules cancéreuses permet d’identifier les protéines altérées et peut aider à:
poser un diagnostic, en repérant les protéines altérées responsables de la progression de la tumeur;
choisir le meilleur traitement, en repérant les protéines altérées qui pourraient être la cible d’un médicament et/ou en repérant les protéines altérées qui pourraient induire une résistance à un médicament.
SÉQUENCER l’ADN
Pour établir le profil génétique d’une tumeur, il faut séquencer l’ADN des cellules qui la composent.
L’ADN est constitué de 2 brins complémentaires: chaque brin est une succession de quatre molécules (nucléotides), symbolisées par les lettres a, c, g et t. Le nucléotide a et toujours en face du nucléotide t et le nucléotide c en face du nucléotide g.
Séquencer l’ADN revient à déterminer l’ordre dans lequel se succèdent ces 4 nucléotides dans un des 2 brins de l’ADN.
LES TECHNIQUES DE SÉQUENÇAGE NOUVELLE GÉNÉRATION (NGS)
Une technique de séquençage de l’ADN a littéralement révolutionné les sciences de la vie: le séquençage nouvelle génération à haut débit, ou NGS (Next Generation Sequencing).
Le NGS est une technique qui permet de séquencer de très grandes quantités d’ADN en un temps record.
Plus de 10 milliards de fragments d’ADN d’une longueur de 150 à 300 nucléotides peuvent être séquencés en quelques heures!
Les différentes étapes du séquençage NGS
La synthèse du brin complémentaire se fait en présence des 4 nucléotides a, c, g, t, associé chacun avec un fluorophore qui émet de la lumière de couleur différente. Un seul nucléotide est inséré à la fois grâce à la protéine ADN polymérase. Un nucléotide a est toujours inséré en face d’un nucléotide t et un nucléotide c est toujours inséré en face d’un nucléotide g.
L’analyse de l’enchaînement de ces images permet de décrypter les séquences d’ADN de plusieurs milliards de fragments d’ADN d’une longueur de 150 à 300 nucléotides en quelques heures!
RÉPERTORIER LES MUTATIONS
Afin de répertorier les mutations présentes dans l’ADN des cellules de la tumeur, les séquences d’ADN obtenues lors du séquençage sont alignées et comparées avec la séquence ADN du génome humain de référence.
Un tel travail est titanesque.
Il ne peut être accompli sans l’aide d’outils d’analyse bioinformatique!
Aligner, comparer, valider
De telles comparaisons permettent de «voir» quels nucléotides dans l’ADN des cellules cancéreuses diffèrent de ceux du génome de référence.
Pour qu’une différence soit validée comme «mutation», il faut qu’elle soit présente dans un nombre minimum de fragments.
Au final plusieurs centaines de mutations peuvent être validées.
Dans l’exemple montré, une mutation t -> a est présente (*).
Le nucléotide a est retrouvé dans plusieurs fragments et remplace le nucléotide t présent dans la séquence ADN du génome humain de référence (en gris).
A PROPOS DU GÉNOME HUMAIN DE RÉFÉRENCE
On parle du génome humain comme s’il n’y en avait qu’un seul. Mais ce n’est pas le cas : nous possédons chacun un génome absolument unique.
Il y aurait environ 3 millions de différences entre notre génome et celui de notre voisin !
«LE» génome humain est en fait le résultat d’une mosaïque de bouts de génomes appartenant à une dizaine d’individus différents.
Ce génome humain « mosaïque » sert de référence pour les chercheurs. Une mutation est identifiée si un nucléotide dans l’ADN étudié diffère de celui qui est présent dans l’ADN du génome humain de référence à la même position.
Chaque mutation est définie par le changement observé (par exemple a -> t) et sa position (chr7:140’753’336) sur la version actuelle du génome humain de référence (GRCh38.p12).
CHERCHER UNE AIGUILLE DANS UNE BOTTE DE FOIN...
Analyser l’ensemble de l’ADN des cellules cancéreuses est un processus très long et complexe.
Trouver quelques dizaines de «fautes d’orthographe» dans un texte de 6 milliards de lettres est un véritable défi, surtout si ce texte est présent en millions d’exemplaires, puisqu’il existe des millions de cellules au sein d’une biopsie d’une tumeur.
...ALTERNATIVE: SÉQUENÇAGE CIBLÉ
Il existe aujourd’hui des techniques qui permettent de sélectionner l’ADN que l’on veut analyser.
Les chercheurs peuvent alors séquencer spécifiquement :
→ un ensemble de 50 à 500 gènes (panel de gènes) que l’on sait être fréquemment modifiés dans les tumeurs, ce qui représente moins de 0.025 % du génome humain (entre 500’000 et quelques millions de nucléotides).
→ les parties de l’ADN contenant l’information qui code pour des protéines, soit l’ensemble de la partie codante des gènes, appelées exons (exome), ce qui représente moins de 2 % du génome.
INTERPRÉTER LES MUTATIONS
Le séquençage et l’analyse bioinformatique d’un panel de 50 gènes génère, en moyenne, une liste de quelques dizaines voire centaines de mutations intéressantes.
Certaines mutations ne jouent aucun rôle dans le développement d’un cancer ou sur le choix du traitement. Certaines, par exemple, ne modifient pas la séquence d’une protéine, et donc sa fonction. D’autres mutations modifient la séquence de la protéine mais n’ont pas d’impact sur sa structure 3D et sa fonction.
Comment, alors, décider qu’une mutation est biologiquement plus importante qu’une autre ?
C’est le début d’une grande enquête!
L’IMPORTANCE DES BANQUES DE DONNÉES
Si elles sont connues, les informations relatives à une mutation et à son éventuel effet sur la fonction d’une protéine ou sur la réponse à un médicament sont répertoriées dans différentes banques de données spécialisées. Chaque information est susceptible d’être complétée ou corrigée au cours du temps, en fonction des avancées scientifiques et techniques .
LORSQUE RIEN N’EST CONNU…
Dans environ 25 % des cas, l’effet d’une mutation sur la fonction d’une protéine n’est pas connu. On fait alors appel à des outils de prédiction bioinformatiques et en particulier à la modélisation moléculaire.
Il arrive cependant qu’aucune information ne puisse être retrouvée sur l’effet de certaines mutations. Ces mutations sont appelées « variants of unknown clinical significance » (VUS; variants sans signification clinique connue).
Une analyse complexe – bioinformatique et statistique – des données retrouvées permet au final d’identifier et d’interpréter une dizaine de mutations qui seront rapportées à l’équipe médicale : c’est une étape clé !
Exemple de rapport adressé à l’oncologue
« La mutation BRAF V600E a été retrouvée dans les cellules de la tumeur du patient.
Cette mutation est référencée comme « pathogène » (ou « driver ») dans plusieurs banques de données internationales et par de nombreuses publications scientifiques. La répercussion fonctionnelle de cette mutation est bien établie : elle est responsable de la progression de la tumeur.
Cette mutation est somatique et ne peut pas être utilisée dans le cadre d’un dépistage informatif pour les autres membres de la famille.
Il existe un médicament qui cible spécifiquement BRAF V600E – le vemurafenib. »