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Einfriergeschwindigkeit
Aufgrund der erzielten Abkühlraten während des Gefriervorganges wird zwischen langsamem und schnellem Einfrieren unterschieden.
Durch die Anwendung automatisierter Kühlgeräte lassen sich die Zellen in definierten Raten abkühlen. Dies wird kontrolliertes Gefrierverfahren genannt.
Langsames Einfrieren
Beim langsamen Einfrieren werden geringere Abkühlraten (z.B. -0.3°C/Min) und niedrige molare Konzentrationen von Kryoprotektiva verwendet. Während der Abkühlung entstehen im Extrazellulärraum Eiskristalle, und die Zellen werden dehydriert siehe biochemische Prinzipien.
Durch Anpassen der Kryoprotektiva und Überführung der Pailletten in Flüssigstickstoff nach Erreichen empirisch ermittelter höherer Temperaturen (-25°C und -35°C) entwickelte sich das konventionelle Tiefgefrierverfahren, das heute zur Kryokonservierung von Embryonen und Eizellen angewandt wird. Ein programmierbares Kühlgerät steurt die Abkühlrate.
Schnelles Einfrieren
Wird die Zelle so schnell abgekühlt, dass für das osmotische Ausströmen von intrazellulärer Flüssigkeit keine Zeit bleibt, bilden sich intrazelluläre Eiskristalle. Das osmotische Gleichgewicht bleibt zwar erhalten, aber durch das Kristallwachstum im Zellinnern können die Zellorganellen und die Zellmembran erheblich geschädigt werden. Beim schnellen Einfrieren werden die Proben, abhängig von der Spezies, nach dem Abkühlen auf ungefähr -25°C in flüssigen Stickstoff umgesetzt.
Bei der ultraschnellen Tiefkühltechnik wird auf ein Kühlgerät verzichtet. Die Pailletten werden direkt in Flüssigstickstoff (N2) getaucht. Dabei kann eine Abkühlrate um die 2000°C/min erreicht werden. Durch das beigegebene nicht-penetrierende Kryoprotektivum, das extrazellulär verbleibt und somit die Osmolarität erhöht, dehydriert die Zelle teilweise und die innere Kristallbildung wird reduziert. Diese Technik findet bis jetzt noch keine routinemässige Verwendung.