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La technique de polymérisation en chaîne (en anglais « polymerase chain reaction ») ou PCR, permet d’amplifier des millions de fois un unique fragment d’ADN. Cette méthode est devenue un outil précieux non seulement pour la recherche en biologie moléculaire mais également pour le diagnostic médical, la détermination de microorganismes ou encore la criminologie. L’invention de la PCR revient à Kary Mullis dans les années 80. Il obtint pour cette découverte le Prix Nobel de Chimie en 1993. La découverte d’ADN polymérases thermorésistantes (la Taq polymérase par exemple) isolées de bactéries (Thermus aquaticus) vivant dans des sources d’eau chaude a facilité l’utilisation de la PCR et a permis son automatisation.
Thèmes : la PCR, la structure du génome humain, le génotypage, la criminologie, l’ADN, l’électrophorèse.
La PCR : Une réaction de PCR nécessite :
Ces 5 ingrédients sont mélangés dans un tube à essai et soumis à différents cycles de températures.

1ère étape : la dénaturation (94°C).
2ème étape : l’hybridation (40-65°C).
3ème étape : l’élongation (72°C).
Ces trois étapes correspondent à 1 cycle de PCR, à la suite duquel on a doublé le nombre de fragment d’ADN cible initial. Environ une trentaine de cycles sont en principe effectués dans une expérience de PCR classique. Ainsi, après 30 cycles on aura amplifié 2n fois notre ADN cible.
Un schéma de l'amplification par PCR est visible ici:
Les VNTR: L’ADN de très nombreux organismes vivant contient des séquences de nucléotides répétées en tandem les unes à la suite des autres. Ces séquences sont dénommées VNTR (variable numbers of tandem repeats). Le nombre de ces répétitions varie d’un individu à l’autre (de 0 à 300 répétitions) formant ainsi une empreinte génétique utilisée en criminologie, pour des recherches de paternité, ou encore pour étudier la génétique des populations.
Le locus D1S80 est situé sur le chromosome 1. Ce VNTR possède un motif de 16 pb répété de 14 à 41 fois suivant les individus (27 allèles différents). En regardant le nombre de répétitions sur les deux chromosomes 1 (le maternel et le paternel), on obtient ainsi 789 génotypes possibles (27x27=789).
L'EXPERIENCE:
Afin d’éviter toute contamination d’ADN, il est préférable d’utiliser des gants pendant toutes les manipulations.
Cette expérience peut être envisagée sous la forme d’une enquête policière : Un individu est venu dans le laboratoire de biologie saboter des expériences. Lors de ses méfaits il a laissé un indice : de la salive, ou un cheveu. Toute la classe est considérée comme « suspect potentiel » et le but de l’expérience sera de mettre la main sur le coupable. Le profile (génotype) de chaque élève pour ce locus sera observé sur gel d’agarose et comparé au profil du suspect. Le nombre de répétitions de chaque élève pourra également être déterminé.
Protocole :
La quantité d’ADN peut être critique pour obtenir des bons résultats. Bien qu’il soit possible d’effectuer cette expérience à partir d’un bulbe de cheveux il est préférable d’utiliser des cellules de la bouche, plus nombreuses, et obtenues facilement à partir de l'intérieur des joues.
1) Extraction d'ADN
1a) A partir de cellules épithéliales de la bouche:
1b) Alternative possible: à partir de follicules de cheveux
2) Amplification par PCR
|1 réaction||22 réactions|
|2xTaq ReadyMix||12.50 µl||275 µl|
|Primers mix D1S80||5.00 µl||110 µl|
|DMSO||1.25 µl||27.5 µl|
|H2O||1.25 µl||27.5 µl|
|94° 5 minutes|
|94° 30 secondes||}|
|65° 30 secondes||30 cycles|
|72° 30 secondes|
|72° 5 minutes|
3) Préparation du gel d’agarose
Le TBE 10x concentré doit être manipulé uniquement par les enseignants ou les préparateurs, en prenant soit de porter une blouse, des lunettes et des gants en nitrile. Le TBE 1x concentré peut sans problème être manipulé par les élèves, à conditions qu’ils respectent les mêmes conditions de sécurité.
Le TBE est toxique pour l’environnement, il ne faut donc pas le jeter à l’évier. Celui-ci doit être récupéré et éliminé par le biais de votre propre filière de traitement des produits chimiques.
Le gel d'agarose est une matrice pour séparer les molécules d'ADN selon leur taille dans un champ électrique. Les petits fragments migrent plus vite que les grands, la concentration d'agarose est choisie en fonction de la taille des fragments à séparer. Ici nous allons utiliser un gel à 1.5% d’agarose.
Les cuves d'électrophorèse possèdent des petits blocs en plexi pour protéger les électrodes. Souvent les cuves sont déformées et les blocs ne rentrent plus. Il suffit donc de couper, après solidification du gel, une petite lamelle d’agarose en haut et en bas du gel pour libérer les électrodes.
4) Analyse des génotypes sur gel
1er puit: 5 µl de marqueur de taille
2ème puits et suivants: 20 µl de vos échantillons.
Avant dernier puits: le contrôle négatif.
Dernier puits: le contrôle positif.
5) Résultats et discussions
Pour déterminer précisément la taille des fragments il faut tracer un graphique du log de la taille (en pb) du marqueur en fonction de la distance de migration (en mm) depuis le puits comme dans l’exemple ici.
Pour convertir la taille d’un allèle en nombre de répétition utiliser la formule suivante :
Voici un exemple de résultat :
Matériel fourni:
Matériel non fourni:
L’Université de Genève décline toutes responsabilités en cas de dommages survenus durant les expériences.