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En 1988, nous avons développé les premières greffes de cellules souches in utero pour traiter des ftus humains avec divers dé-sordres génétiques graves. Six malades ftaux (âgés de douze à vingt-huit semaines après fécondation) ont été greffés avec des cellules souches du foie foetal (donneurs de sept à quatorze semaines). La greffe in utero chez le premier malade, atteint d'un syndrome des lymphocytes dénudés, conduisait à une reconstitution des lymphocytes T et à la présence d'antigènes HLA du donneur. D'autres foetus avec déficit immunitaire ont été traités dans le monde récemment, avec une reconstitution comparable. Par contre, l'effet de la greffe in utero dans des hémoglobinopathies et dans d'autres erreurs innées du métabolisme est actuellement plus limité et insuffisant pour corriger durablement les maladies initiales. Cette variété de greffe peut également conduire au développement futur de la thérapie génique in utero.
La greffe de cellules souches représente un traitement efficace de certaines maladies congénitales sévères et de diverses hémopathies acquises. Les cellules souches peuvent être obtenues à partir du foie ftal, du sang du cordon, de la moelle osseuse, de la rate ou du sang périphérique. Elles n'ont pas les mêmes propriétés selon leur tissu d'origine.
En dehors du foie ftal de moins de quinze semaines (c'est-à-dire moins de treize semaines après la fécondation), les autres sources de cellules souches contiennent de façon naturelle des lymphocytes T, en nombre et degré de maturité divers. Ces lymphocytes T peuvent induire une réaction du greffon contre l'hôte chez le receveur et celle-ci est d'autant plus importante et grave qu'il existe une incompatibilité entre donneur et receveur. La déplétion en lymphocytes T réduit l'incidence de la réaction du greffon contre l'hôte mais elle accroît les risques d'échec de la greffe, de reconstitution incomplète, de lymphomes induits par le virus d'Epstein-Barr et de rechute de la leucémie.1
La greffe de cellules du foie ftal, provenant d'un donneur âgé de huit à treize semaines après la fécondation, n'apporte pas de lymphocyte T et peut être pratiquée à travers d'importantes barrières d'histocompatibilité, sans risque notable de réaction du greffon contre l'hôte.2 En vingt-cinq ans, nous avons traité soixante-trois malades par greffe de tissus ftaux pour des déficits immunitaires graves, des désordres hématologiques ou des erreurs innées du métabolisme. Les deux tiers des malades sont vivants, grâce à la greffe. Les deux causes principales d'échec ont été représentées par une prise insuffisante de la greffe chez certains malades et la présence d'une infection grave avant la greffe. C'est la raison pour laquelle, nous avons développé la greffe de cellules souches à un stade encore plus précoce, chez le ftus humain in utero, afin de bénéficier de la tolérance immunologique (liée à l'immaturité immunitaire du receveur) et de la protection contre les infections (dans l'utérus maternel).
La première greffe de cellules souches in utero a été effectuée en 1988 chez un enfant avec syndrome des lymphocytes dénudés.3 Depuis cette période, cinq autres malades ont été greffés également dans notre centre hospitalier universitaire et environ vingt et un autres malades ftaux ont reçu des cellules souches in utero, que celles-ci proviennent du foie ftal ou de moelle osseuse déplétée en lymphocytes T.
La poursuite des efforts de recherche est nécessaire à l'application de cette technique nouvelle dans des pathologies héréditaires variées, de même qu'elle l'est pour la mise en place ultérieure d'un programme de thérapie génique in utero.
Les cellules du donneur ftal peuvent être préparées de différentes façons. Nous les utilisons fraîches pour préserver toutes les chances de succès clinique, bien que la cryopréservation ne semble pas provoquer d'altération importante des cellules hématopoïéti-ques.4 Les organes ftaux (foie ftal, éventuellement complété du thymus ftal) sont prélevés en suivant scrupuleusement les recommandations du Comité consultatif national d'éthique pour les sciences de la vie et de la santé.5 En particulier, l'équipe responsable du prélèvement d'organes sur le ftus décédé est totalement distincte et indépendante de celle impliquée dans l'interruption de grossesse. Dans les heures suivant la mort ftale, le foie et le thymus sont prélevés stérilement.
Une suspension mono-cellulaire est préparée soit en utilisant un homogénéiseur de Potter soit en appliquant les organes sur une grille métallique. La suspension cellulaire est aspirée à plusieurs reprises dans une seringue puis les cellules sont comptées et leur viabilité est testée par la méthode d'exclusion du bleu Trypan. Seules sont utilisées les suspensions cellulaires avec une viabilité supérieure à 70%. Le nombre de cellules nucléées vivantes greffées à partir d'un seul foie ftal varie largement avec l'âge du donneur ; il est en général de quelques centaines de millions.
Le sérum maternel est l'objet de tests pour toute une série d'antigènes ou d'anticorps viraux et des prélèvements bactériologiques sont effectués sur la suspension cellulaire. Le groupe sanguin ABO et le phénotype HLA sont déterminés.
La suspension cellulaire est ensuite administrée au patient, dans la dilution appropriée, par voie intraveineuse ou intra-péritonéale. L'injection chez le ftus est effectuée sous contrôle échographique.
La justification de l'utilisation des cellules du foie ftal, entre les âges de huit et treize semaines après la fécondation, tient au fait que cet organe contient alors toutes des cellules souches hématopoïétiques de l'organisme mais pas encore de lymphocytes T susceptibles de déclencher une réaction du greffon contre l'hôte. De plus, ces cellules ont un important potentiel prolifératif et régénératif. Même lorsque la greffe est effectuée à travers d'importantes barrières d'histocompatibilité, les lymphocytes qui en dérivent et qui se différencient chez le receveur ont pu montrer de bonnes fonctions immunologiques.2,6
L'application de cette greffe à un ftus, in utero, présente plusieurs avantages :7
I induction de tolérance car le ftus est immature sur le plan immunologique ;
I absence habituelle de conséquences pathologiques du déficit génétique en cause à ce stade très précoce ;
I présence des facteurs environnementaux favorables à la prolifération et la différenciation des cellules souches ftales ;
I absence d'infection.
De plus, il est psychologiquement moins difficile pour une famille de choisir un traitement in utero plutôt que d'attendre plusieurs mois avant d'entreprendre un traitement retardé après la naissance quand la décision de poursuite de la grossesse a été prise par cette famille. Même dans les cas regrettables où survient une mort foetale dans les suites du traitement, le traumatisme psychologique chez les parents est moins important que dans les cas de mort suivant une greffe post-natale.
Enfin, chez les receveurs avec un déficit immunitaire qui doivent être isolés et protégés d'éventuelles infections aussi longtemps que leur immunité n'est pas suffisamment reconstituée, la durée de séjour en bulle stérile peut être raccourcie puisqu'une grande partie de la période nécessaire au développement des cellules greffées s'effectue pendant la vie ftale, sous la protection de l'utérus maternel. Dans les premiers mois de la vie du nourrisson, les examens sanguins permettent de suivre la progression de l'immunité et de choisir le moment opportun pour sortir l'enfant de la bulle dans laquelle il a été placé à la naissance.
Les trois malades que nous avons traités par greffe de cellules du foie ftal in utero pour des déficits immunitaires étaient des ftus avec déficit immunitaire combiné ou maladie granulomateuse chronique.
Le premier malade ftal chez lequel le traitement a été appliqué (D.T., tableau 1) était atteint d'un syndrome des lymphocytes dénudés. Cette affection est particulièrement difficile à traiter car lorsque des greffes de cellules souches sont appliquées au stade post-natal, elles conduisent souvent à un échec de greffe, car il persiste chez le receveur une immunité de transplantation, et elles sont souvent compliquées d'infections, car l'immunité anti-infectieuse est très défaillante. Il s'agit d'un déficit immunitaire combiné provoqué par l'absence d'expression d'antigènes HLA, à transmission génétique.8,9 Dans le cas de ce malade, le défaut génétique identifié provoquait une absence de fixation de la protéine RFX sur la boîte X, d'où absence de transcription correcte des gènes HLA.
Le premier malade dans cette famille était préalablement mort du même syndrome des lymphocytes dénudés avant l'âge d'un an, malgré un essai de transplantation de cellules sou-ches qui n'avait permis ni prise stable de la greffe ni reconstitution immunologique. Le diagnostic prénatal effectué en milieu de 2e grossesse permettait d'établir à nouveau la présence du syndrome des lymphocytes dénudés de type III (c'est-à-dire avec absence presque complète aussi bien des antigènes de classe I que des antigènes de classe II du système HLA), chez le ftus. Les choix offerts à la famille étaient les suivants :
I avortement thérapeutique ;
I attente de la naissance pour tenter une greffe post-natale ;
I ou enfin greffe in utero de cellules souches, complétée de greffes post-natales.
Les parents étaient informés que la dernière proposition correspondait à un traitement qui n'avait pas été préalablement réalisé chez d'au-tres malades et que son efficacité ne pouvait donc pas être garantie. Ils choisissaient cependant cette possibilité et, à vingt-huit semaines après la fécondation, la greffe était effectuée par l'injection de 7 ml de milieu de culture contenant la suspension de cellules de foie et de thymus d'origine ftale dans la veine ombilicale.3,10 Deux donneurs ftaux de 7 et 7,5 semaines étaient utilisés pour cette greffe.
Peu après la naissance, 10 à 12% des lymphocytes du patient se distinguaient des autres cellules par leur expression normale d'antigènes HLA de classe I.3,7 Il était établi que ces cellules provenaient du donneur puisque leurs spécificités HLA étaient du type du donneur et différaient des spécificités retrouvées chez les parents de D.T. En particulier, l'expression de l'antigène HLA A9, spécifique du donneur, permettait de mesurer répétitivement le pourcentage des lymphocytes T du sang périphérique du malade qui dérivaient des cellules du donneur. Les valeurs retrouvées dans tous les examens effectués de la naissance jusqu'à 10,5 ans étaient comprises en-tre 10% et 28% (fig. 1). Par contre, l'expression des antigènes HLA de classe II, à la surface des lymphocytes au repos, restait relativement basse, suggérant un développement des cellules B plus faible que celui des cellules T, à partir des cellules souches du donneur.
Comme cela était prévu d'emblée, le nouveau-né était placé dans une bulle stérile et, pour accélérer la reconstitution, il recevait sept perfusions supplémentaires de cellules ftales à partir de neuf donneurs. Ces administrations de cellules ftales ne permettaient pas de prise supplémentaire de greffe puisque seuls les antigènes du premier donneur dont les cellules avaient été injectées in utero étaient retrouvés dans tous les examens successifs.
La reconstitution immunologique progressait au cours des premiers mois, permettant la sortie de la bulle et conduisant à l'apparition d'une réponse d'hypersensibilité retardée à divers antigènes (antigènes de candida et antigènes tétaniques). Une réponse proliférative in vitro des lymphocytes T à ces antigènes ainsi qu'aux antigènes de CMV était également trouvée. Les taux d'immunoglobulines restaient relativement bas, de même que le nombre de lymphocytes B provenant du donneur. L'enfant devait donc recevoir des perfusions d'immunoglobulines. De plus, un traitement était instauré du fait d'épisodes fréquents de diarrhée. Au total, il était considéré que l'enfant avait une reconstitution satisfaisante de l'immunité cellulaire mais qu'il persistait un déficit de présentation de l'antigène car les autres cellules de l'organisme demeuraient déficientes en expression d'antigènes HLA de classe II notamment, et un déficit de production d'anticorps du fait de l'insuffisance des lymphocytes B.
A l'âge de 11 ans, les parents souhaitaient compléter le résultat par une greffe de cellules de moelle osseuse HLA identique, d'un donneur non apparenté. Celle-ci, réalisée dans un autre centre, permettait, après quelques mois et en dépit d'un épisode de réaction du greffon contre l'hôte, le retour à une immunité satisfaisante. Il demeurait cependant un déficit de présentation de l'antigène par l'ensemble des cellules de l'organisme, hors de celles apportées par les greffes, puisque le déficit génétique des autres cellules n'était pas corrigé.
Un deuxième ftus (M.H.), présentant un déficit immunitaire combiné sévère, était l'objet d'un diagnostic prénatal puis d'une greffe de cellules du foie ftal in utero. L'immunité à médiation cellulaire ainsi que la production d'anticorps se développaient progressivement, apportant une défense anti-infectieuse.
Les cellules du donneur étaient identifiées par la présence du chromosome Y dans certaines cellules, chez cette petite fille, et par des antigènes HLA distincts de ceux du receveur. A l'âge de 6 et de 8 ans, les nombres de lymphocytes T appartenant aux diverses sous-populations étaient voisins de la normale et les taux d'immunoglobulines étaient également normaux, même s'il existait de façon transitoire une restriction d'hétérogénéité. La réponse proliférative des lymphocytes T à des phytomitogènes et à des antigènes était normale.
Pendant neuf ans, M.H. paraissait en relativement bonne santé mais une cholangite sclérosante se développait. A l'âge de 9,5 ans, l'enfant reçut une greffe de foie d'origine cadavérique, afin de traiter la cholangite sclérosante progressive. Des complications chirurgicales et infectieuses ont malheureusement provoqué le décès de l'enfant.
Le ftus A.V. recevait deux greffes de foie ftal pour traiter une maladie granulomateuse chronique. Ces greffes étaient, là encore, effectuées par voie intraveineuse dans la veine ombilicale aux âges de 17 et 21 semaines. Malencontreusement, une bradycardie ftale était provoquée, peut-être en raison de la perfusion rapide d'un nombre assez élevé de cellules, conduisant à la mort ftale en une heure.
Au moins sept autres malades ftaux ont été traités dans le monde par greffe in utero de foie ftal ou de moelle osseuse déplétée en lymphocytes T, pour déficit immunitaire.7 Deux de ces sept patients, souffrant d'un déficit immunitaire combiné sévère lié au chromosome X, ont obtenu une prise de la greffe et une reconstitution immunologique.11, 12
Les résultats obtenus chez les deux premiers malades avec déficit immunitaire nous ont incités à tenter de traiter par greffe in utero les ftus ayant des maladies hématologiques non immunes. Dans de telles conditions, la prise de la greffe peut être rendue plus difficile du fait du système immunitaire intact et il nous est donc apparu souhaitable de réaliser la greffe de cellules souches à une phase encore plus précoce, pendant le premier trimestre ou au début du second trimestre de la gestation, à un moment où les ftus normaux n'ont pas encore développé une immunité à médiation cellulaire significative.13
Chez le ftus M.R. le diagnostic de thalassémie b-0 majeure était effectué par biologie moléculaire sur un prélèvement de villosités choriales. La mère refusait l'interruption de grossesse et sollicitait une greffe de cellules souches in utero. Celle-ci était effectuée par voie intrapéritonéale, sous contrôle échographique, à l'âge de douze semaines après la fécondation.
Les examens effectués après la naissance montraient la présence de cellules thalassémi-ques dans le sang périphérique mais également de cellules du donneur. Le chromosome Y était décelé, par biologie moléculaire. L'hémoglobine A représentait 0,9% de toute l'hémoglobine à neuf mois et 30% de cette hémoglobine totale à l'âge d'un an, trois mois après une seule transfusion sanguine. Le nombre de globules rouges avec hémoglobine normale n'était pas suffisant pour corriger très significativement la maladie initiale et, à partir de l'âge de 5 ans, les transfusions sanguines devaient être très régulières chaque mois puis toutes les trois semaines, en association avec de la déféroxamine. Même au niveau de la moelle osseuse, le nombre de cellules du donneur décroissait et, à l'âge de 6 ans, seul 0,5 à 1 % des cellules médullaires exprimait simultanément le marqueur CD34 et le phénotype HLA A32 provenant du donneur.
Chez un deuxième malade avec thalassémie b-0 majeure, la greffe de cellules souches a été effectuée par administration intraveineuse, dix-sept semaines après la fécondation. Malheureusement, une bradycardie ftale est survenue, provoquant la mort foetale.
Quatre malades ftaux supplémentaires avec thalassémie b-0 et trois malades avec thalassémie a ont reçu une greffe de cellules sou-ches in utero dans divers centres. Aucun malade n'a obtenu une reconstitution hématopoïétique suffisante chez l'ensemble de ces patients, de même que chez un malade avec drépanocytose.7
L'évolution différente de la reconstitution chez les malades avec déficit immunitaire et chez ceux avec hémoglobinopathie est illustrée dans la figure 2. Dans le premier cas, un avantage sélectif pour les cellules du donneur semble permettre un bon développement de ces cellules tandis que chez les malades avec thalassémie, les cellules de l'hôte l'emportent très largement, freinant le développement secondaire des cellules du donneur qui se multiplient insuffisamment pour apporter une amélioration très significative.
De la même façon, chez sept malades ftaux avec diverses erreurs innées du métabolisme, les résultats ont été variables, incomplets et suggérant soit une prise insuffisante de la greffe, soit un effet trop partiel sur la maladie initiale du fait d'un nombre insuffisant de cellules du donneur. Nous avons traité l'un de ces sept malades par deux greffes in utero permettant la prise de cellules de l'un des deux donneurs, identifiées par le marqueur HLA A2. Les manifestations neurologiques de la maladie de Niemann-Pick n'ont cependant été que retardées dans leur apparition et le décès est survenu en dépit de cette tentative thérapeutique. Est-ce que la barrière hémo-méningée empêchait le passage d'un nombre suffisant de cellules du donneur au niveau cérébral ou est-ce que la greffe n'apportait pas un nombre suffisant de cellules du donneur avec équipement enzymatique normal ?
En dépit d'une incompatibilité majeure entre donneur et receveur, la greffe des cellules du foie ftal permet chez certains malades, une reconstitution immunitaire très importante et les lymphocytes T développés à partir des cellules du donneur ont un fonctionnement qui ne paraît pas être entravé par la différence des molécules HLA portées par les cellules du donneur et celles du receveur.
Il existe en particulier un développement de tolérance immunologique s'exprimant vis-à-vis des antigènes du donneur comme de ceux du receveur. La tolérance vis-à-vis du donneur dépend d'une délétion clonale provoquée par un contact entre les lymphocytes T du donneur et les cellules dendritiques ou macrophagiques également issues du donneur. La tolérance vis-à-vis des antigènes du receveur est obtenue par un processus d'anergie clonale et elle provient du contact entre les lymphocytes T du donneur (dans leur phase de différenciation à l'intérieur du thymus) et les cellules épithéliales thymiques du receveur.7
De plus, les lymphocytes T qui se développent chez ces malades chimériques acquièrent progressivement des fonctions normales, malgré la disparité totale des molécules HLA exprimées par les cellules du donneur (notamment les cellules T, qu'elles soient CD4+ ou CD8+) et celles du receveur (notamment les cellules présentatrices de l'antigène, au niveau des molécules HLA de classe II ou de classe I). L'analyse du fonctionnement de l'immunité chez ces patients a permis de démontrer la sélection dans leur thymus d'un mécanisme de reconnaissance de l'antigène présenté par des déterminants HLA allogéniques (reconnaissance «allo + X»).2,14,15
La thérapie génique des maladies héréditaires, génétiquement déterminées, offre des espoirs formidables. Pour l'instant, le nombre de maladies ayant pu bénéficier d'essais de thérapie génique est très limité et les résultats sont, dans leur majorité, encore jugés relativement décevants. Dans le cas des maladies immunologiques et hématologiques, en particulier, il importe que le transfert du gène normal s'applique aux cellules souches hématopoïétiques qui peuvent se renouveler spontanément tout au long de la vie. Jusqu'à maintenant, le rendement et l'efficacité de ce transfert génique sur les cellules souches médullaires humaines sont encore très modestes et insuffisants pour corriger la plupart des maladies concernées. Des résultats plus importants ont été obtenus sur des lymphocytes T en cours de multiplication mais alors le bénéfice obtenu ne dure pas plus de quelques mois ou quelques années.
Nous avons pu observer, expérimentalement, une efficacité très largement supérieure du transfert génique sur les cellules souches du foie ftal, dont les propriétés sont à cet égard plus favorables que celles des cellules souches médullaires. Les cellules souches du sang du cordon offrent un niveau de rendement intermédiaire entre les cellules du foie ftal et celles de la moelle osseuse.
Les perspectives de thérapie génique in utero ou néonatale sont donc les suivantes :
I transfert ex vivo du gène de correction avec un vecteur approprié dans des cellules ftales puis administration in vivo (in utero) ;
I administration in vivo directe du gène de correction et du vecteur approprié (in utero) ;
I Transfert ex vivo du gène de correction et du vecteur dans les cellules du sang du cordon, à la naissance, puis administration au patient in vivo.
Il s'agit là de perspectives nécessitant au préalable de nombreuses expériences chez l'animal, une profonde réflexion éthique et une mise au point des dispositions réglementaires. Dans tous les cas, une attention particulière doit être apportée aux cellules germinales du receveur afin qu'aucun transfert de gènes ne se développe à ce niveau et que le traitement reste réservé aux cellules somatiques.
La greffe de cellules souches in utero présente de nombreux avantages, notamment l'induction d'une tolérance immunologique et la prévention de diverses complications liées à la maladie initiale. L'isolement du jeune malade dans l'utérus maternel est un atout supplémentaire et les facteurs de croissance ou de différenciation fournis par le receveur foetal favorisent le développement des cellules greffées. Les résultats actuels sont satisfaisants dans certains déficits immunitaires mais encore très insuffisants dans les hémoglobinopathies et les erreurs innées du métabolisme. Des travaux expérimentaux complémentaires sont nécessaires pour amplifier le bénéfice du traitement appliqué chez des ftus n'ayant pas de déficit immunitaire. A l'avenir, la thérapie génique in utero apportera une solution thérapeutique nouvelle et importante chez certains malades.