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Was sind Zinkfinger-Nukleasen:
- Erkennungsdomäne mit Zinkfinger-Protein künstlich gebaut
- Nicht sehr zielgenau
- Herstellung dauert lange und ist sehr aufwändig
- Kleinste aller bisher bekannten „Genscheren“
Wie bei anderen Genome Editing-Verfahren soll auch mittels ZFN die DNA (bzw. die DNA-Sequenz) an bestimmten Stellen gezielt verändert werden; durch Einfügen, Entfernen oder Austausch bestimmter DNA-Abschnitte.
Zunächst muss das DNA-Molekül an einer bestimmten Stelle „durchgeschnitten“ werden. ZFN sind Proteine, die genau zu diesem Zweck hergestellt und verwendet werden. Der „Zink-Finger“ (ZF) als Bestandteil der ZFN kann einen bestimmten kurzen Abschnitt der DNA (9-12 Basen) erkennen und der andere Bestandteil, die Nuklease (N) schneidet die DNA an dieser Stelle durch. Es bedarf zweier ZFN – sie docken schräg gegenüber voneinander am DNA-Doppelstrang an – um beide Stränge durchzuschneiden. Der Schnitt in der DNA löst einen von zwei möglichen DNA-Reparaturmechanismen der Zelle aus, um die offenen Enden wieder zu verknüpfen und dies hat eine Reihe von möglichen Ergebnissen zur Folge.
3 ZFN-Typen:
- ZFN-1: kleinere, ortsspezifische und zufällige DNA-Veränderungen, diese können kleinere Deletionen (Löschungen), Substitutionen (Ersetzungen) oder Insertionen (Einfügungen) von Nukleotiden sein. In diesem Fall „repariert“ die Zelle den „Schnitt“ mehr oder weniger zufällig, wobei sie einen Reparaturmechanismus anwendet, der als „NHEJ“ (Nicht-homologe Endverknüpfung) bezeichnet wird.
- ZFN-2: kleinere ortsspezifische gezielte DNA-Veränderung, wie etwa „Punktmutationen“ (Veränderung eines einzelnen Nukleotids). Hier erfolgt die Reparatur auf Anweisung eines DNA-Matrizenstrangs, der hinzugefügt wurde (ein DNA-Strang mit derselben Sequenz wie der Zielbereich, jedoch mit ein oder zwei kleineren Veränderungen oder einer kurzen Einfügung). Der hier angewendete Reparaturmechanismus heißt „HR“ (Homologe Rekombination).
- ZFN-3: grössere ortsspezifische Insertionen von Genen oder regulierenden Sequenzen. Bei diesem Verfahrenstyp wird wie bei ZFN-2 ein DNA-Matrizenstrang hinzugefügt, dieser enthält jedoch eine zusätzliche lange DNA-Sequenz (z. B. ein oder mehrere Gene) zur Integration.
Das Gen für die speziell zugeschnittene ZFN wird für gewöhnlich durch Gentechnik-Verfahren mit einer standardmässigen GV-Transformation in die Pflanze eingebracht, und macht diese damit zunächst zu einem GVO. Wenn die ZFN-Proteine produziert wurden und ihre Aufgabe erfüllt haben, werden in einem nächsten Schritt Pflanzenlinien ausgewählt, die das Transgen für die ZFN-Proteine nicht tragen.
Kommerzielle Anwendungen ZFN-1, 2: Der Verlust, die Veränderung oder die Insertion eines einzelnen Nukleotids (Punktmutation) kann ausreichen, um bestimmte Merkmale einer Pflanze zu verändern, bspw.: Herbizidtoleranz, männliche oder weibliche Sterilität, Blütenfarbe, verzögerte Fruchtreife.
Ungewollte Veränderungen und Risiken:
- Ziel-Ungenauigkeit: Die ZFN-Technologie ist für ihre unspezifische Anlagerung an Nicht-Ziel-DNA bekannt, was zu einer signifikanten Menge nicht gewollter Mutationen im Genom führt. Diese Mutationen können a), wenn sie in der kodierenden Sequenz vorkommen, die Funktion von Proteinen; oder b), wenn sie in regulierenden Sequenzen vorkommen, die Genexpression beeinflussen, so dass etwa mehr Pflanzengifte produziert oder Proteine nicht mehr erzeugt werden, die wichtig sind für die Nährstoffversorgung, Abwehrkräfte oder Resistenz gegen Krankheiten der Pflanze.
- Möglicherweise werden die zugefügten DNA-Matrizenstränge (ZFN-2 und 3) willkürlich – entweder ganz oder teilweise – in das Genom integriert, wie es auch bei transgenen Insertionen (Einfügungen) geschieht, wodurch Gene und regulierende Sequenzen zerstört oder Proteine potentiell verändert werden. Das kann wiederum zu einer Leistungsminderung, höherer Krankheitsanfälligkeit, Anreicherung von Giften und Rückständen und einem Anstieg von Allergenen führen.
- Transformations- und Transfektionsprozesse, einschließlich Gewebekultur, werden zur Herstellung von mit ZFN gentechnisch veränderten Pflanzen eingesetzt. Solche Prozesse führen bekanntlich zu weiteren Mutationen (mit den oben aufgeführten Risiken).
Schlussfolgerung: Alle drei ZFN-Varianten sind Gentechnik-Verfahren, deren Zweck es ist, absichtliche Veränderungen am Erbgut und an den Eigenschaften eines Organismus hervorzurufen. Alle drei sind anfällig für ungewollte Effekte, sowohl bedingt durch die ZFN-Aktivität als auch durch die Auswirkungen der Gentechnik-Verfahren, was in der Regel zu hunderten von Mutationen und ungewollten Effekten führt. Abgesehen davon sind die Reparaturmechanismen der Pflanzen nicht abschliessend erforscht, was Anlass zu zusätzlichen Unsicherheiten gibt. Aufgrund des Prozesses, der Veränderungen und Risiken sind ZFN als GVO einzustufen und erfordern umfassende Risikobewertungen.
Quelle: „Neuen Züchtungstechniken“ (NZT). Inhärente Risiken und Regulierungsbedarf. Dr. Ricarda A. Steinbrecher. EcoNexus, Briefing, Dezember 2015, S. 2-3