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En transplantation rénale, les anticorps anti-HLA préformés sont bien connus pour être responsables des rejets hyperaigus. Mais ils sont également impliqués dans les rejets aigus à médiation humorale et dans la physiopathologie du rejet chronique (dysfonction chronique du greffon). La technique standard pour détecter les anticorps anti-HLA basée sur la fixation et la cytotoxicité du complément n'est ni spécifique ni très sensible. De nouvelles approches de type Elisa (Enzyme linked immuno sorbent assay) ou de cytométrie de flux avec des microbilles fluorescentes ont révolutionné la détection et la détermination de la spécificité des anticorps anti-HLA. Dans cet article, nous faisons le point sur le rejet médié par les anticorps anti-HLA et la relevance clinique de ces anticorps détectés par ces nouvelles techniques.
Il existe différentes barrières génétiques et immunologiques à la transplantation : la barrière de l'espèce, des groupes sanguins, des complexes majeurs d'histocompatibilité (MHC ou HLA) et la barrière des antigènes mineurs. C'est dans les années 1930 que Peter Gorer met en évidence le rôle du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) chez la souris en transplantation. Ces travaux suggèrent également l'importance des anticorps contre les antigènes MHC du donneur lors du rejet d'allogreffe. Plus tard, ce dernier et O'Gorman démontrèrent que ces allo-anticorps étaient détectables par lyse médiée par le complément (Complement dependent cytotoxicity), une technique encore utilisée de nos jours dans ce même but.1 Ainsi, parallèlement au rejet cellulaire médié par les lymphocytes T, le lien entre anticorps (notamment ceux dirigés contre les antigènes HLA) et un rejet humoral pouvant être hyperaigu, aigu ou chronique est désormais reconnu.2 Le développement d'anticorps dirigés contres les molécules HLA allogéniques (d'un individu différent) peut se produire chez les femmes après une (des) grossesse(s), suite à des transfusions sanguines ou après une transplantation avec un individu non HLA identique. La détection des anticorps anti-HLA s'est profondément modifiée par l'apport de nouvelles techniques de laboratoire qui permettent une analyse très précise de spécificités grâce au technique d'Elisa (Enzyme linked immuno sorbent assay) ou de cytométrie de flux avec des microbilles fluorescentes. En transplantation rénale, la relevance clinique de ces nouvelles méthodes, plus spécifiques et plus sensibles de détection des anticorps anti-HLA est discutée dans le cadre de la surveillance et la prévention des rejets médiés par les anticorps (AMR : Antibody mediated rejection).
La cellule endothéliale est la cible principale des anticorps : ceux-ci ont une toxicité directe et une toxicité médiée par le complément, qui peut former le complexe d'attaque membranaire, attirer des cellules inflammatoires et activer la phagocytose (figure 1). Les cellules endothéliales endommagées sécrètent du facteur von Willebrand (FvW), causant l'agrégation et l'adhésion des plaquettes. L'exposition de la membrane basale active les plaquettes, le tout contribuant à la thrombose et à l'occlusion vasculaire. Dans le rejet hyperaigu, causé par des anticorps des groupes sanguins ou anti-HLA préexistants en forte concentration, c'est ce mécanisme qui aboutit, en quelques minutes à quelques heures, à des dommages ischémiques irréversibles de l'organe transplanté. Le rôle des anticorps anti-HLA dans les rejets aigu et chronique serait, quant à lui, plutôt dû à un processus de «dommage/réparation/dommage» se répétant dans le temps, avec inflammation et prolifération des cellules endothéliales et musculaires lisses, provoquant une athérosclérose de l'organe transplanté. Trois facteurs influencent la vitesse de ce processus : la concentration d'anticorps, la capacité de réparation du tissu et l'intensité de la thérapie immunosuppressive.
Le diagnostic actuel du rejet d'allogreffe rénal médié par les anticorps (Antibody mediated rejection ou AMR) repose, en plus de la dysfonction d'organe (augmentation de la créatinine et de l'urée), sur trois points cardinaux, établis initialement lors de la conférence de Banff, en 1997, et revus en 2001 :3
1. A la biopsie, évidence morphologique de lésions tissulaires aiguës, comme :
* lésion tubulaire aiguë ;
* neutrophiles et/ou cellules mononuclées dans les capillaires péritubulaires et/ou les glomérules et/ou thrombose capillaire ;
* ou artérite intimale/nécrose fibrinoïde/inflammation des artères intramurales ou transmurales.
2. Evidence immunopathologique (immunohistochimie) de l'action des anticorps comme :
* C4d et/ou (rarement) immunoglobulines dans les membranes basales des capillaires péritubulaires (pas dans le glomérule, qui capte même dans le rein normal) ;
* ou immunoglobulines et complément dans la nécrose artérielle fibrinoïde.
3. Evidence sérologique d'anticorps circulants contre le donneur ou contre d'autres antigènes endothéliaux du donneur.
Ces trois critères doivent être tous présents pour un diagnostic définitif, lorsque deux critères seulement sont présents, on parle de suspicion d'AMR. Le diagnostic d'AMR et sa reconnaissance comme entité à part entière sont importants, car il est aujourd'hui possible de traiter et prévenir ces rejets. Les médicaments immunosuppresseurs peuvent influencer, par différents mécanismes, la production d'anticorps de façon non spécifique et agir ainsi sur les anticorps anti-HLA, le rejet humoral avec plus ou moins d'efficacité (tableau 1) :
Les inhibiteurs de la calcineurine : cyclosporine A, FK506 ou rapamycine ; les antimétabolites : aziathioprine, MMF ou cyclophosphamide ; les anticorps antilymphocytaires en cas de rejet sévère ou résistant aux stéroïdes.4 Les bénéfices de la splénectomie pour la survie de la greffe et du patient restent controversés.
Par immunoadsorption (élimination sélective des immunoglobulines par un passage du sang sur des colonnes recouvertes d'antigènes de groupe sanguin A ou B, de protéines A ou d'Ig antihumaines : des colonnes spécifiques aux anticorps anti-HLA ne sont pas disponibles) ; plasmaphérèse/ échange de plasma (déplétion non spécifique de facteurs humoraux : anticorps, complément, cytokines, etc.) et les immunoglobulines intraveineuses polyclonales (IVIG) qui agissent par différents mécanismes encore incomplètement élucidés : fixation du complément, blocage des sites spécifiques des anticorps du receveur, liaison au fragment Fc, etc.
Les tests de détermination des anticorps anti-HLA ont eux évolué vers beaucoup plus de sensibilité et spécificité ces quatre-cinq dernières années. Historiquement, la première méthode utilisée est celle de la cytotoxicité dépendante du complément (Complement dependent cytotoxicity : CDC) si des anticorps spécifiques contre les lymphocytes sont présents, la voie classique du complément est activée et il en résulte une lyse des cellules par le complexe d'attaque membranaire. Il est possible d'augmenter la sensibilité de la procédure en ajoutant des globulines anti-humaines, qui en faisant des cross-link entre les anticorps présents, augmentent la probabilité de détecter la cytotoxicité. De plus, la réaction est répétée à différentes dilutions pour titrer la quantité d'anticorps (Ac) réactifs. Le pourcentage de puits de la plaque d'échantillonnage où ont eu lieu des réactions détermine le pourcentage de Panel reactive antibody ou PRA. Un pourcentage au-delà de 50% de réactivité détermine un patient sensibilisé et à plus de 80%, le patient est hautement sensibilisé. Par cette méthode, une spécificité des allo-anticorps HLA, présents dans le sérum du patient, peut également être déterminée. Cette méthode, qui est la plus ancienne, a l'avantage de mesurer la cytotoxicité des anticorps présents mais n'est pas totalement spécifique pour les anticorps anti-HLA du donneur (DSA : Donor specific antigens), puisque d'autres anticorps, par exemple contre les antigènes lymphocytaires autres ou des auto-anticorps, peuvent entraîner une réaction qui ne sera pas due à des antigènes HLA portés par le greffon.
Le PRA peut également être déterminé par des méthodes spécifiques et plus sensibles pour les anticorps anti-HLA et appelées Solid phase assays (SPA) :
* Elisa : des antigènes HLA spécifiques sont immobilisés sur une surface et on y ajoute le sérum du patient. La fixation des anticorps est mise en évidence après lavage par l'ajout d'immunoglobulines contre le fragment Fc des anticorps, couplées à une enzyme. L'enzyme convertit un substrat incolore en produit coloré et la quantité d'anticorps peut être déterminée par spectrophotométrie.
* Cytométrie de flux avec des microbilles fluorescentes (flowPRA ou Luminex) : mise en contact du sérum du patient avec des microsphères sur lesquelles sont fixés des antigènes HLA déterminés. On ajoute ensuite à la solution des anticorps anti-IgG humains marqués par une molécule fluorescente, le tout étant analysé par un appareil à détection laser. Il existe différents types de microsphères, possédant soit plusieurs soit un seul antigène HLA à leur surface.
Chez tous les transplantés (surtout greffe de rein), on effectue un dépistage des anticorps anti-HLA (PRA) par CDC et Elisa avant la mise en liste. Après la transplantation, une analyse est effectuée chaque année. Pour les patients sensibilisés, on complète les examens par une détermination des spécificités par Elisa, FlowPRA, ou Luminex. Il est important de noter que la valeur du PRA peut augmenter ou diminuer dans le temps et que des pourcentages élevés sont corrélés à une augmentation des rejets hyperaigus, de non fonction primaire du greffon, de fonction retardée du greffon et de rejet prouvé par biopsie.5
De plus, avant chaque greffe de rein, afin de déterminer une possible réactivité entre le receveur et le donneur pouvant mener à un rejet hyperaigu ou aigu, on effectue un cross match juste avant la transplantation avec du sérum frais du receveur (cross match final). Il est obligatoire et généralement réalisé par la technique CDC. Il est aussi possible de faire le cross match par cytométrie de flux (notamment pour le donneur vivant). Cette méthode utilise le FACS (Fluorescence actived cell sorter) et met en évidence la réactivité du sérum du patient contre les cellules du donneur avec un marquage des anticorps anti-HLA. Ce test peut définir l'isotype d'immunoglobuline réactive (IgM ou IgG) et le type de cellule (anticorps anti-CD3 et anti-CD20 marqués pour mettre en évidence respectivement les cellules T et les cellules B). La cytométrie de flux est plus sensible que la technique CDC mais plus lourde à mettre en place sur le plan pratique. Le cross match, par la technique CDC, reste ainsi la référence avant chaque greffe.
Deux études publiées en 2006 traitent de ce sujet. L'étude de Vasilescu 6 tente de déterminer l'intérêt de rechercher des anticorps anti-HLA et anti-DSA par des méthodes sensibles comme le cross match par FACS et le Luminex. Parmi les 80 patients étudiés, 27 patients (33%) avaient des PRA détectés par CDC et SPA, mais tous avaient un cross match négatif par CDC avant la greffe. La survie des greffons à un an était de 98% : deux patients sur 80 ayant perdu leur greffon (diagnostic d'AMR ayant été retenu pour un de ces deux patients). Un cross match par FACS rétrospectif sur des sérums, obtenus le jour de la transplantation, révèle que 21% des patients (17/80) avaient en fait un cross match par FACS positif (FC+) dont 6/17 patients (35%) ont nécessité un traitement pour AMR (FC+/AMR+). Par contre, parmi les patients avec un cross match par FACS négatif (FC-), seuls 3/63 (0,04%) durent recevoir un traitement pour AMR (FC-/ AMR+). Ainsi, malgré le fait que les auteurs relèvent que la corrélation entre un cross match par FACS positif et le risque de développer un rejet humoral (FC+/AMR+) est statistiquement significative (p = 0,002), la détection d'anticorps anti-DSA par cross match FACS présente une spécificité de 95% (60/63 FC-/AMR-) mais une sensibilité de seulement 35% (6/17 FC+/AMR+) pour prédire le risque d'AMR. Les auteurs soulignent également une corrélation significative entre un taux de PRA élevé et le risque de rejet humoral. En conclusion de cette première étude, l'analyse des spécificités des anticorps anti-HLA permet de prédire le risque d'AMR lorsqu'elle est associée à d'autres paramètres tels que déposition de C4d et cross match par FACS. De plus, un cross match rétrospectif par cytométrie de flux peut être utile dans le suivi d'un patient, mais il faut rester prudent quant à son utilité en prospectif en raison de faux positifs fréquents.
Gibney et coll.7 rapportent également l'intérêt de mesurer le PRA et de rechercher des anticorps anti-HLA par des méthodes sensibles (Luminex) afin de permettre une meilleure prise en charge des patients transplantés. Dans cette étude, 55 (40%) patients avec un PRA L 15% ont été identifiés, dont 20 (14%) avec DSA (PRA+/DSA+) et, à six mois, les patients PRA+/DSA+ présentaient 60% de dysfonctions rénales et complications immunologiques contre 26% chez les patients PRA+/DSA-(p = 0,01). Cette étude démontre une association claire entre un PRA par Luminex positif avec DSA positifs et le risque de complications, malgré un cross match par CDC négatif. Ceci permet de stratifier les patients en sous-groupe à haut risque (PRA+/DSA+) et en un sous-groupe à bas risque (PRA+/DSA-) qui est associé à un taux de rejet aigu de seulement 3% et à une très bonne survie du greffon et du patient à six mois. A partir de ces données, les auteurs proposent un screening du PRA par cytométrie de flux (Luminex) chez tous les patients : si le test est négatif, un cross match par CDC serait suffisant ; s'il est positif, un cross match plus sensible par FACS et une recherche des DSA par Luminex seraient utiles pour déterminer le risque immunologique prétransplantation. Cette approche éviterait ainsi de faux positifs, mis en évidence par un cross match par FACS, chez des patients à faible risque, problème également évoqué dans les conclusions de Vasilescu 6 permettant ainsi une meilleure évaluation des transplantations à risque.
Après transplantation, il est reconnu qu'il existe des différences interpatients dans la production d'anticorps anti-HLA spécifiques. Il s'agit d'évaluer un lien potentiel entre la détection de ces anticorps par des méthodes spécifiques et le risque de défaillance du greffon.
Terasaki et Ozawa 8 ont déterminé la survie des greffons rénaux de donneurs vivants et cadavériques sur une période de deux ans, en tenant compte de la présence ou non d'anticorps anti-HLA. De façon intéressante, selon des travaux précédents,9 l'incidence d'anticorps anti-HLA chez des patients transplantés de plus de six mois est approximativement la même que chez ceux transplantés, il y a plus de dix ans. La recherche d'anticorps anti-HLA (PRA) a été faite en prétransplantation, à six mois, douze mois et vingt-quatre mois post-transplantation par CDC, FACS ou Elisa, avec un traitement binaire des résultats (AC+ vs AC-). Ainsi, sur les 2231 patients, 478 (21,4%) présentaient des anticorps anti-HLA un an post-transplantation, 6,2% d'entre eux ont eu une défaillance du greffon, vs 2,8% sur les 1753 patients anticorps anti-HLA négatifs (p = 0,0001). Deux ans après greffe, 15,1% des patients anticorps anti-HLA positifs ont eu une défaillance du greffon contre 6,8% chez les patients anticorps anti-HLA négatifs (p = 0,00000002). Si l'on considère seulement les patients ayant produit des anticorps anti-HLA de novo après la transplantation (233) vs ceux n'ayant jamais produit d'anticorps anti-HLA (1331), on obtient un taux hautement significatif de 16,7% vs 6,5% de défaillance (p = 0,0000001). Selon ces derniers résultats, il semblerait que la formation d'anticorps anti-HLA de novo aurait plus d'impact sur la survenue de défaillance de greffe. Mais étant donné l'inhomogénéité des analyses en prétransplantation, il est difficile de tirer des conclusions, puisque si tous les patients avaient été testés avec des méthodes sensibles, la fréquence d'anticorps formés de novo aurait pu être plus basse.
Si on analyse maintenant les résultats à deux ans, selon le type de méthode de détection des anticorps, il semble que la cytotoxicité donne la meilleure différence entre les groupes d'anticorps anti-HLA positifs et négatifs. Ceci pourrait être expliqué par le fait que la cytotoxicité détecte les IgG et les IgM, ainsi que les antigènes non HLA qui seraient la cause de certains rejets.
Finalement une corrélation a également été faite entre la concentration sérique de créatinine à six mois, la présence d'anticorps anti-HLA et la survie du greffon.
La créatinine sérique a une forte valeur prédictive sur la survie du greffon, et l'influence des anticorps anti-HLA est la plus forte dans les valeurs de créatinine sérique intermédiaires : le mécanisme postulé de cette différence serait l'état plus ou moins sclérosé de l'endothélium. Ainsi des anticorps venant se déposer sur un endothélium déjà endommagé (reflété par la concentration de créatinine sérique) auront beaucoup plus d'impact que sur un endothélium sain, et il en résulte une augmentation du risque de défaillance dans les deux ans. Ces résultats, pourraient donc être utiles en clinique, permettant de classifier les patients à plus ou moins haut risque selon leur concentration sérique de créatinine et leur statut d'anticorps anti-HLA et d'adapter, en fonction, le traitement immunosuppresseur.
Une autre étude10 porte plus spécifiquement sur la détection d'anticorps anti-HLA par FlowPRA : 72 patients ayant reçu leur première greffe rénale de donneur cadavérique, tous avec un PRA négatif par CDC et cytométrie de flux (l 5% réactivité) et un cross match prétransplantation négatif par CDC et FACS, ont été suivis en post-transplantation pendant quatre ans et l'apparition d'anticorps anti-HLA spécifiques a été recherchée. Tous les patients étaient traités par triple immunosupression (cyclosporine A, prednisone, azathioprine/MMF). Seize des 72 patients (22,2%) démontrèrent une réactivité anti-HLA, dont 12/16 avaient des DSA. La majorité des anticorps anti-HLA est apparue dans les quatorze jours post-transplantation (un patient à trois mois et un autre à quatre ans). Trente-sept patients sur 72 ont eu une fonction retardée du greffon. Une corrélation significative a pu être établie entre l'apparition d'anticorps anti-HLA et :
* le retard de fonction du greffon ;
* le rejet aigu (37,5% vs 3,6%, p = 0,001) ;
* le rejet chronique (43,75% vs 7,1%, p l 0,001) ;
* la perte du greffon pour causes immunologiques (56,25% vs 7,1%, p l 0,001).
Par contre, la survie du greffon n'était pas statistiquement significative (p L 0,05).
Les résultats de cette étude plaident en faveur d'un rôle délétère des anticorps anti-HLA apparus dans le mois suivant la greffe. De plus, les patients ayant une titration élevée anticorps anti-HLA présentent plus de rejets aigus sévères et de perte précoce du greffon, alors que ceux avec une titration plus basse ont tendance à faire des rejets chroniques, suggérant que la titration et le monitoring des allo-anticorps pourraient être utiles pour présumer du risque de rejet.
Grâce au cross match par CDC et par FACS, le rejet hyperaigu médié par les anticorps est une situation heureusement exceptionnelle sauf chez les patients à très haut risque (hautement sensibilisé). Toutefois, le rejet humoral reste un problème important en transplantation rénale puisque environ 40% des rejets chroniques seraient dus à des problèmes immunologiques avec présence d'anticorps.8 Les anticorps spécifiques au HLA participent clairement à ces rejets et reste un sujet d'investigation intense (importance relative des anticorps contre HLA classe I ou classe II, rôle de l'isotype IgG ou IgM, recherche des épitopes immunogéniques des HLA, antigènes HLA solubles, etc.). Cependant d'autres types d'anticorps non HLA sont aussi à investiguer. Les nouvelles techniques ont permis de faire un bond en avant dans la détection des spécificités anti-HLA et dans notre compréhension du rôle de ces anticorps dirigés spécifiquement contre le greffon (DSA).
Toutefois, on se rend compte que, dans certaines situations, la présence d'anticorps anti-HLA détectés par des techniques sensibles n'est pas significative, en particulier pour les anticorps préformés. Des études sont en cours afin de mieux cerner l'utilisation de ces nouvelles techniques dans l'analyse immunologique des patients en attente de transplantation rénale ou dans le suivi postgreffe. L'utilisation de ces techniques reste l'apanage de laboratoires spécialisés (laboratoire d'immunogénétique) qui sont reliés au centre de transplantation. L'analyse des résultats ne peut se faire qu'en étroite interaction entre les néphrologues, les chirurgiens de transplantation, qui prennent en charge les patients, et les immunologues de transplantation qui interprètent ces tests en fonction du contexte clinique.