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Das präzise Zerschneiden von DNA ist für viele Anwendungen in der Gentechnik essenziell. Egal ob es darum geht Gene zu inaktivieren oder neue Gene einzufügen, in beiden Fällen muss die DNA-zerschnitten werden. Das molekulare Werkzeug das hierfür angewandt wird heisst CRISPR/Cas9. Was das ist und wie es funktioniert, erklärt dir dieses Tafelbild.
In vivo - in lebenden Organismen
Das CRISPR-Cas9 System stammt aus dem ältesten Konflikt der Erde. Jenem zwischen Viren und Bakterien. Dabei versuchen die Bakteriophagen (Bakterien infizierende Viren) Bakterien zu infizieren und diese dabei zur Virusproduktion umzuprogrammieren. Die Bakterien wiederum versuchen, diese genetische Umprogrammierung zu umgehen indem fremde virale DNA abschnitte zerschnitten und abgebaut werden. Dafür braucht die Bakterie ein Enzym namens Cas9 sowie eine Bibliothek an viralen DNA-Motiven die CRISPR:
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CRISPR
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) sind Abschnitte die in repetitiver Art und weise immer wieder im Erbgut von Bakterien vorkommen. Darin sind zum einen Gene für die Ausbildung von Caspasen wie etwas der Caspase 9 enthalten, sowie Abschnitte viraler Genome (Spacer) die von Bakterien mit Hilfe der Cas9 zur Erkennung und Abwehr von Viren eingesetzt werden und somit eine Art bakterielles Immunsystem bilden. Nach der Infektion mit einer Bakteriophage können dem CRISPR sogar neue Sequenzen hinzugefügt werden, um eine Immunität gegenüber diesen Bakteriophagen zu generieren.
- Cas9
Die Caspase 9 (Cas9) ist ein Protein welches eine wichtige Rolle in der Abwehr viraler Genome in Bakterien spielt. Dafür werden die in den CRISPR gespeicherten DNA Abschnitte mit jenen der Viren verglichen und im Falle eines Matches von der Caspase zerschnitten. Neben der Cas9 werden in den CRISPR weitere Caspasen codiert, die für die Funktion der bakteriellen Virusabwehr von Bedeutung sind, für die Verwendung in vitro aber aktuell keine wichtige Rolle spielen.
Dank der Erforschung der Bakteriellen Virusabwehr ist Forscherinnen bewusst geworden, dass mit Hilfe künstlicher DNA Sequenzen nahezu jede X-beliebige DNA-Sequenz zerschnitten werden kann.
Aufbau des Systems
Aus den CRISPR wird zum einen das Protein Cas9 gebildet und andererseits zwei RNA Stücke (crRNA und tracrRNA). Zusammen bilden diese den CRISPR/Cas9 Komplex der in vivo virale DNA zerschneidet und in vitro jede andere DNA an beliebigen Stellen schneiden kann.
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Cas9
Die Caspase 9 ist das Enzym, welches von der Zelle anhand des Genes aus dem CRISPR gebildet wird und mit Hilfe der crRNA und tracrRNA DNA-Doppelstränge zerschneiden kann.
- crRNA
Die crRNA setzt sich im Wesentlichen aus den Protospacer und einem Repeat zusammen. Der Protospacer ist das Auge der Cas9 und fungiert als primäre Erkennungssequenz der an der zu schneidenden DNA bindet. Je nach dem welche DNA geschnitten wird variiert er, während der Repeat konstant ist und die crRNA mit der tracrRNA verbindet. Er heftet die beiden RNA-Moleküle zusammen.
- tracrRNA
Die tracrRNA bindet am Repeat der crRNA und bildet aufgrund einer palindromischen Basenabfolge eine harnadelförmige Struktur mit sich selber. Sie fungiert als Schlüssel der es der crRNA erlaubt in die Cas9 eingebaut zu werden.
Die zur crRNA passende Erkennungssequenz alleine reicht jedoch nicht, damit Cas9 an die DNA binden kann. Zusätzlich wird auf der zu schneidenden DNA ein kurzer Abschnitt namens PAM (proto-spacer adjacent motif) benötigt.
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PAM
Ein PAM signalisiert der Cas9, dass eine DNA zu bearbeiten ist. Nur wenn ein solcher drei Buchstaben langer Abschnitt (5’-NGG-3’ / eine beliebige Base und 2 Guanin) neben der Erkennungssequenz liegt, kann Cas9 an die DNA binden und die zum Repeat passende Stelle erkennen. Bei diesem Prozess wird die DNA entspiralisiert und das crRNA-tracrRNA-Molekül kann sich an der passenden Stelle anlagern.
Damit Cas9 ein DNA Abschnitt schneiden kann muss dadrauf also sowohl die Erkennungssequenz liegen, die zum Protospacer auf der crRNA passt, als auch ein PAM um diese erst zu erkennen. Da das Erbgut des Bakteriums selbst wiederum besitzt keine PAMs, somit ist es vor der Zerstörung durch das eigene Abwehrsystem geschützt.
In Vitro - im Reagenzglas
Forscherinnen, die sich mit der Erforschung der bakteriellen Virusabwehr beschäftigten, haben herausgefunden, dass die Spacer Bereiche in den CRISPR welche für die Erkennungssequenz in der crRNA codieren künstlich verändert werden können. Damit wurde es möglich, ein System zu kreieren mit dem fast jede beliebige DNA Sequenz ganz präzise geschnitten werden kann. Wird der Protospacer einer crRNA durch einen künstlich erzeugten ersetzt, so wird die resultierende RNA gRNA (guideRNA) genannt, da sie der Cas9 zeigt, wo die DNA geschnitten werden soll. Das System das in Vitro Anwendung findet, besteht folglich aus einem modifizierten CRISPR (tracrRNA & gRNA) und der Cas9.
Je nach dem wie nach dem Schneiden einer DNA im Labor verfahren wird, kann mit dem CRISPR/Cas9 System eine Deletion verursacht werden, um so Gene gezielt auszuschalten. Daneben gibt es auc hdie Möglichkeit mittels anderer gentechnischer Werkzeuge ein neues Gen präzise an der Schnittstelle einzusetzen.
Im Vergleich zu früheren Verfahren wo die DNA zufällig ins Genom integriert wurde, ist CRISPR/Cas9 deutlich präziser und verringert das Risiko für off-target-Effekte wie etwa zufällige Mutationen massiv.
Quellen:
- https://www.mpg.de/11018867/crispr-cas9
- https://www.spektrum.de/thema/crispr-cas9/1408852