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Testosteron ist das wichtigste männliche Geschlechtshormon (Androgen). Die Bildung erfolgt hauptsächlich in den Leydig-Zellen der Hoden, geringfügig auch in der Nebennierenrinde und der Leber, sowie bei Frauen im Eierstock. Über das Blut gelangt es in die verschiedenen Organe, die einen Androgenrezeptor aufweisen, z.B. Gehirn, Hoden, Prostata, Haarwurzeln, Muskeln und Knochen. Seine Hauptfunktion liegt in der Entwicklung der primären und sekundären Geschlechtsmerkmale wie Penis, Prostata und Hoden, Bartwuchs und Stimmbruch, nicht zuletzt aber auch der männlichen Libido und Sexualität.
Die starke anabole (muskelaufbauende) Wirkung des Testosterons führt in der quergestreiften Muskulatur zu einer Zunahme der Muskelmasse, die Zahl der Muskelfibrillen bleibt aber gleich. Auch am Herzmuskel hat Testosteron einen nachgewiesenen starken anabolen Effekt. Vor allem die anabole Wirkung geht ab dem 40. Lebensjahr schrittweise verloren.
Androgene, wie auch Östrogene, führen zu einer erhöhten Knochendichte und zu einer verstärkten Knochenmineralisation. In der Haut lässt sich ein Wachstum der Talgdrüsen beobachten, die zu Akne führen kann. Durch die Wirkung auf die Haarfollikel kommt es zur klassischen männlichen Geschlechtsbehaarung und – am Kopf – bei genetischer Veranlagung zum Rückgang des Haarwuchses an Schläfen und Stirn (Glatzenbildung).
Testosteron hat auch einen deutlichen Einflüsse auf die Stimmungslage, das Selbstwertgefühl, den Sexualtrieb, das Sexualverhalten und allgemeine Aktivitäten. Zusammenhänge zwischen räumlichem Vorstellungsvermögen, mathematischer Begabung und gar dem Kompositionstalent werden vermutet und in wissenschaftlichen Studien untersucht.
Es gibt tageszeitliche Schwankungen des Testosteronwertes im Blut. Durch psychische (Stress) oder körperliche Anstrengung (Sport) kann eine vorübergehende Erniedrigung des Testosteronwertes auftreten.