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Dr. Margot Olive's PhD defense - April 8th, 2022
Professor Tamar Kohn, thesis director, and the whole LCE'team, congratulate Dr. Margot Olive for her thesis on "Toward Biocontrol of Waterborne Pathogens : Contributions of Protists to Virus Removal and Associated Mechanisms".
Abstract
Human viruses are ubiquitous contaminants in surface waters, where they can persist over extended periods of time. Among the factors governing their environmental persistence, the control (removal or inactivation) by microorganisms remains poorly understood. Biological treatment of waterborne viruses, specifically grazing of viruses by protists, can enhance microbial water quality while avoiding the production of toxic by-products and high energy costs. However, tangible applications are limited by the lack of understanding of the underlying mechanisms. In the present thesis, we used protist assemblages from surface waters and a model protist species, Tetrahymena pyriformis, to better understand the interactions between protists and a wide range of waterborne viruses.
We first determined the contribution of indigenous bacteria and protists to the decay of human viruses in surface waters. Incubation of echovirus 11 (E11) in freshwater from Lake Geneva and seawater from the Mediterranean Sea led to a 2.5 log10 reduction in the infectious virus concentration within 48 h at 22°C, whereas E11 was stable in sterile controls. The observed virus reduction was attributed to the action of both bacteria and protists in the biologically active matrices. The effect of microorganisms on viruses was temperature dependent, with a complete inhibition of microbial virus control in lake water at temperatures ≤ 16°C. Among three protist isolates tested (Paraphysomonas sp., Uronema marinum, and Caecitellus paraparvulus), Caecitellus paraparvulus was particularly efficient at controlling E11 (2.1 log10 reduction over 4 days with an initial protist concentration of 103 cells × ml-1). In addition, other viruses (human adenovirus type 2 and bacteriophage H6) exhibited different grazing kinetics than E11, indicating that the efficacy of antiviral action also depended on the type of virus.
We then examined the feeding behavior of Tetrahymena pyriformis ciliates on thirteen viruses, including bacteriophages, enteric viruses and respiratory viruses. Significant differences in virus removal by T. pyriformis were observed, ranging from no removal (Qbeta, coxsackievirus B5) to ≥ 2.7 log10 (JC polyomavirus) over 48 hours of co-incubation of the protist with the virus. Virus removal by protists was thus differential. In addition, virus removal rates were conserved even when protists were co-incubated with multiple viruses simultaneously. Video analysis revealed that extent of virus removal was correlated with an increase in the protists’ swimming speed, a behavioral trait consistent with the protists’ response to the availability of food. Protistan feeding may be driven by a virus’ hydrophobicity, but was independent of virus size or the presence of a lipid envelope.
Human adenovirus was further used to examine the mechanisms underlying virus removal by protists. We demonstrated that the ciliate Tetrahymena pyriformis efficiently removed human adenovirus type 2 (HAdV2) from a freshwater matrix, with ≥ 4 log10 removal over 72 hours. Neither sorption onto the ciliate nor secreted metabolites contributed to the observed decay in infectious HAdV2. Instead, phagocytosis was shown to be the dominant removal mechanism, and HAdV2 viral particles were detected inside food vacuoles of T. pyriformis. The fate of HAdV2 once ingested was scrutinized and no evidence of virus digestion or inactivation was found over the course of 48 hours. This indicates that T. pyriformis can exert a dual role on microbial water quality: while they remove infectious adenovirus from the water column, they can also serve as hotspot for infectious viruses.
Finally, an exploratory study was conducted to investigate the use of protists as a biological disinfection step to enhance microbial water safety. Preliminary results suggest that the most promising approach is to use protists as biological filters after secondary treatment, where the nutrient and solids content is lower than in activated sludge. Research and challenges in this direction remain, for example to design a process able to retain protists without disrupting them and releasing infectious viruses.
Overall, this thesis elucidates how microorganisms modulate waterborne viruses in aquatic eco-systems and in engineered treatment applications. The results are of interest to surface water ecology, in that grazing rates and mechanisms, as well as favorable grazing conditions were determined. It also provides insights into future applications of protists as biological treatment systems to enhance water quality.
Keywords: Microbial water quality, enteric viruses, respiratory viruses, bacteriophages, surface water, wastewater, ciliates, protists, grazing, virus predation, biological filter, transmission electron microscopy, videography, biological control of contaminants.
Résumé
Les virus humains sont des contaminants omniprésents dans les eaux de surface, où ils peuvent persister pendant de longues périodes. Parmi les facteurs régissant leur persistance dans l'environnement, le contrôle (élimination ou inactivation) par les microorganismes reste mal compris. Le traitement biologique des virus présents dans l'eau, plus précisément la prédation des virus par les protistes, peut améliorer la qualité microbienne de l'eau tout en évitant la production de sous-produits toxiques et des coûts énergétiques élevés. Cependant, les applications tangibles sont limitées par le manque de compréhension des mécanismes sous-jacents. Dans la présente thèse, nous avons utilisé des assemblages de protistes provenant d'eaux de surface et une espèce modèle de protiste, Tetrahymena pyriformis, pour mieux comprendre les interactions entre les protistes et un large éventail de virus d'origine hydrique.
Nous avons d'abord déterminé la contribution des bactéries et des protistes indigènes à l’abattement des virus humains dans les eaux de surface. L'incubation de l'échovirus 11 (E11) dans de l'eau douce du lac Léman et de l'eau de mer de la Méditerranée a entraîné une réduction de 2,5 log10 de la concentration du virus infectieux en 48 heures à 22°C, alors que E11 était stable dans les contrôles stériles. La réduction observée du virus a été attribuée à l'action des bactéries et des protistes dans les matrices biologiquement actives. L'effet des microorganismes sur les virus dépendait de la température, avec une inhibition complète du contrôle microbien des virus dans l'eau du lac à des températures ≤ 16°C. Parmi les trois isolats de protistes testés (Paraphysomonas sp., Uronema marinum et Caecitellus paraparvulus), Caecitellus paraparvulus a été particulièrement efficace pour contrôler E11 (réduction de 2,1 log10 en 4 jours avec une concentration initiale de protistes de 103 cellules × ml-1). De plus, d'autres virus (adénovirus humain de type 2 et bactériophage H6) présentaient une cinétique d'ingestion différente de celle de E11, ce qui indique que l'efficacité de l'action antivirale dépend également du type de virus.
Nous avons ensuite examiné le comportement alimentaire des ciliés Tetrahymena pyriformis sur treize virus, y compris des bactériophages, des virus entériques et des virus respiratoires. Des différences significatives dans l'élimination des virus par T. pyriformis ont été observées, allant d'aucune élimination (Qbeta, coxsackievirus B5) à ≥ 2,7 log10 (JC polyomavirus) sur 48 heures de co-incubation du protiste avec le virus. L'ampleur de l'élimination des virus pourrait être liée à la capacité des protistes à détecter et à ingérer différents virus à des degrés différents. Nous avons donc montré que l’élimination de virus par les protistes était différentielle.
De plus, le taux d'élimination d’un virus donné était conservé même lorsque les protistes étaient co-incubés avec plusieurs virus simultanément. L'analyse vidéographique a révélé que l'ampleur de l'élimination des virus était corrélée à une augmentation de la vitesse de nage des protistes, un trait comportemental cohérent avec la réponse des protistes à la disponibilité en nourriture. L'élimination des virus par les protistes peut être déterminée par l'hydrophobie du virus, mais elle est indépendante de la taille du virus ou de la présence d'une enveloppe lipidique.
L'adénovirus humain a ensuite été utilisé pour examiner les mécanismes sous-jacents à l'élimination des virus par les protistes. Nous avons démontré que le cilié Tetrahymena pyriformis élimine efficacement l'adénovirus humain de type 2 (HAdV2) d'une matrice d'eau douce, avec une élimination ≥ 4 log10 sur 72 heures. Ni l’adsorption sur le cilié ni les métabolites sécrétés n'ont contribué à la décroissance observée de l'HAdV2 infectieux. Au contraire, la phagocytose s'est avérée être le mécanisme d'élimination dominant, et des particules virales HAdV2 ont été détectées à l'intérieur des vacuoles alimentaires de T. pyriformis. Le devenir du HAdV2 une fois ingéré a été examiné et aucun signe de digestion ou d'inactivation du virus n'a été trouvé au cours des 48 heures. Cela indique que T. pyriformis peut exercer un double rôle sur la qualité microbienne de l'eau : s'ils éliminent les adénovirus infectieux de la colonne d'eau, ils peuvent également servir de réservoirs de virus infectieux.
Enfin, une étude exploratoire a été menée pour étudier l'utilisation de protistes comme étape de désinfection biologique pour améliorer la sécurité microbienne de l'eau. Les résultats préliminaires suggèrent que l'approche la plus prometteuse consiste à utiliser les protistes comme filtres biologiques après le traitement secondaire, où la teneur en nutriments et en matières solides est plus faible que dans les boues activées. La recherche et les défis dans cette direction demeurent, par exemple pour concevoir un processus capable de retenir les protistes sans les perturber et libérer des virus infectieux.
Dans l'ensemble, cette thèse élucide la façon dont les microorganismes modulent les virus d'origine hydrique dans les écosystèmes aquatiques et dans les applications de traitement par ingénierie. Les résultats sont intéressants pour l'écologie des eaux de surface, dans la mesure où les taux et les mécanismes de prédation, ainsi que les conditions favorables à la prédation ont été déterminés. Ils donnent également un aperçu des futures applications des protistes comme systèmes de traitement biologique pour améliorer la qualité de l'eau.
Mots-clés : Qualité microbienne de l'eau, virus entériques, virus respiratoires, bactériophages, eaux de surface, eaux usées, ciliés, protistes, prédation des virus, filtre biologique, microscopie électronique à transmission, vidéographie, contrôle biologique des contaminants.