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Le diagnostic de laboratoire des maladies infectieuses se base sur deux approches : a) détecter le microbe lui-même (directement par microscopie ou après culture) ou l’une de ses structures moléculaires (protéines ou acides nucléiques) ou b) mesurer la réponse immunitaire humorale (anticorps spécifiques) ou cellulaire (stimulation lymphocytaire). Le choix de l’approche analytique dépend du questionnement clinique, du type de pathogène et de l’existence de tests de laboratoire pour le pathogène en question.
Si les anticorps et les antigènes sont bien des structures moléculaires, le terme «diagnostic moléculaire» se réfère à des méthodes de détection et d’analyse du génome d’un organisme. Les premières méthodes d’analyse de l’ADN, comme le Southern blot, existaient déjà dans les années 1970,1 mais c’est le développement de la PCR au milieu des années 1980 qui démocratisa leur utilisation.2,3 Très rapidement, la possibilité d’amplifier l’ADN et l’ARN (acide ribonucléique) fut utilisée pour la détection de pathogènes. Trente ans plus tard, la PCR est une méthode centrale du laboratoire de microbiologie.
Encore récemment limitée, la palette des tests de diagnostic moléculaire s’est fortement étoffée et il est important de connaître quelques règles pour leur bon usage. Cet article vise à donner une vue d’ensemble des tests moléculaires, les réponses qu’ils peuvent apporter au clinicien et leurs limitations.
L’analyse d’échantillons par les méthodes moléculaires se divise en trois étapes :
extraction de l’ADN et/ou de l’ARN à partir de l’échantillon primaire ;
amplification d’une séquence ADN/ARN cible du pathogène par PCR ;
détection de l’amplificat.
Les méthodes couvrant ces trois étapes se sont perfectionnées au cours des années. Une des principales innovations fut le développement de la PCR en temps réel, permettant de combiner les étapes 2 et 3, réduisant considérablement la durée de l’analyse. Ainsi, un résultat est actuellement disponible en 24 heures, alors qu’il fallait plusieurs jours à l’origine.
Hormis leur grande rapidité par rapport à la culture, les méthodes basées sur la PCR sont très spécifiques et sensibles, souvent plus que les méthodes traditionnelles. De plus, le développement de tests moléculaires pour un pathogène particulier peut être relativement aisé, pour autant que des séquences génétiques de référence soient disponibles. Ceci permet la mise sur pied des tests moléculaires en quelques semaines et une réaction rapide à l’émergence de nouveaux pathogènes, comme ce fut le cas lors de la pandémie de grippe A/H1N1 en 2009, ou plus récemment avec la grippe A/H7N9 ou le coronavirus MERS (Middle East respiratory syndrome coronavirus).4
La détection par PCR est souvent opposée à la détection d’anticorps. Les méthodes moléculaires, tout comme la détection d’antigènes, permettent un diagnostic dans la phase aiguë d’une maladie, avant l’apparition d’anticorps (tableau 1). La présence d’anticorps dans le sérum n’est en effet mesurable au plus tôt qu’après quelques jours (rubéole, varicelle), voire quelques semaines (virus respiratoires, maladie de Lyme).5 Dans la phase aiguë, une PCR positive démontre le plus souvent une infection, alors qu’une sérologie négative doit être répétée dans un délai adéquat pour mettre en évidence une séroconversion.5,6 Il faut néanmoins rappeler que pour certaines maladies, par exemple la mononucléose infectieuse, les anticorps spécifiques sont présents au moment des symptômes. La détection d’anticorps suffit alors pour confirmer un diagnostic.7
Les méthodes moléculaires peuvent servir au diagnostic de pratiquement toutes les infections aiguës rencontrées au cabinet médical (tableau 1). Elles ne sont toutefois pas toujours nécessaires au diagnostic. Ainsi, un état fébrile avec des symptômes respiratoires en période de grippe ne justifie pas nécessairement une PCR. De même, un tableau de varicelle chez un enfant ne requiert pas systématiquement une analyse de laboratoire. Par ailleurs, la PCR n’est pas utile au diagnostic de certaines infections, mais peut être utile dans leur suivi ou dans certaines situations (tableau 2).
En permettant la détection de pathogènes pas ou difficilement cultivables, les méthodes moléculaires ont révolutionné la microbiologie médicale, principalement pour le diagnostic des maladies virales. En effet, la culture de virus nécessite des lignées de cellules humaines ou animales immortalisées et peut prendre plusieurs semaines. Elle est de moins en moins utilisée et a été largement supplantée par la PCR, qui a également remplacé la sérologie pour de nombreuses indications, telles que l’infection aiguë à Herpès ou à Varicella zoster ou le zona.6,8
Contrairement aux virus, les techniques moléculaires n’ont pas remplacé les cultures pour les bactéries ou les champignons. Elles ont toutefois pris une place importante pour la détection de pathogènes spécifiques tels que Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (MRSA) ou Clostridium difficile. De plus, la détection de certaines bactéries à croissance lente ou requérant des conditions de cultures très particulières (mycobactéries, Chlamydia) a également été améliorée et simplifiée par le développement de PCR spécifiques.
La détection par PCR est disponible pour de nombreuses infections parasitaires comme la toxoplasmose, la leishmaniose, l’amibiase (distinction entre Entamoeba histolytica et dispar) ou la malaria.9 Pour ces maladies, les méthodes traditionnelles (microscopie ou sérologie) restent encore très utilisées, mais il est vraisemblable que les méthodes moléculaires gagnent en importance dans les prochaines années.
Outre une simple détection, les méthodes moléculaires modernes permettent également de donner des indications quantitatives, par exemple pour suivre l’évolution de la charge virale des virus VIH ou de l’hépatite C sous thérapie, et de détecter ainsi l’émergence de souches résistantes. Cette quantification est également utile pour le diagnostic de réactivations de virus latents comme le polyomavirus BK ou le CMV (cytomégalovirus) chez les patients immunosupprimés.10
Bien que le séquençage de l’ADN ait été développé avant la PCR, toutes les méthodes modernes se basent désormais sur celle-ci. Son application la plus commune en microbiologie est la détection et l’identification de bactéries par le séquençage de l’ADN ribosomal. La séquence de ce gène étant spécifique à une espèce ou une famille, une identification est rendue possible, aussi lorsque la bactérie n’est pas ou plus cultivable. Cette méthode de PCR eubactérienne n’est cependant utile que pour des prélèvements normalement stériles, comme les implants ou le liquide céphalorachidien. La détection de mutations causant des résistances aux thérapies est une autre application du séquençage, utilisée par exemple pour la caractérisation des virus VIH ou CMV.
Contrairement à la culture, qui permet en principe la mise en évidence de tous les microbes présents dans un prélèvement, les méthodes moléculaires, ainsi que sérologiques, doivent être appliquées de façon ciblée. Il n’y a pas de «PCR pour tout». Le médecin doit décider à l’avance ce qu’il veut rechercher (par exemple, le virus de la grippe ou un virus respiratoire syncitial). Il existe cependant pour certains syndromes, tels que les affections respiratoires, de plus en plus de panels moléculaires, permettant de tester des dizaines de pathogènes en une fois. Si l’efficacité analytique de ces analyses en multiplex n’est plus à démontrer, leur coût reste important et leur utilisation devrait se faire de façon différenciée et réfléchie.
Un prélèvement adéquat est indispensable pour garantir la qualité d’une analyse. Typiquement, un frottis nasopharyngé pour la détection du virus de la grippe n’est optimal que s’il est fait de manière correcte (frottis profond). Pour les échantillons sanguins, il est préférable d’éviter les tubes héparinés, qui peuvent causer des inhibitions de la PCR. Dans le doute, il ne faut pas hésiter à contacter le laboratoire.
La haute spécificité des méthodes moléculaires est aussi leur point faible. Ainsi, une nouvelle variante d’un virus ou d’une bactérie peut être moins bien détectée, voire même échapper complètement à l’amplification. Ceci fut par exemple le cas lors de la pandémie de grippe de 2009, où certains tests ne détectaient pas le nouveau virus. Il incombe au laboratoire de régulièrement passer en revue les caractéristiques de ses tests, de les comparer aux données génétiques disponibles et de les adapter aux nouvelles variantes. Ce talon d’Achille des méthodes moléculaires a poussé les fabricants de tests de suivi de charge virale VIH à cibler deux gènes du virus, réduisant ainsi le risque d’une quantification inexacte.
Les méthodes sérologiques, ainsi que la détection d’antigènes, sont moins sensibles à ces variations génétiques et restent donc recommandées pour le dépistage de certains pathogènes, tel le VIH (tableau 2). Enfin, chaque méthode a un seuil de détection au-dessous duquel elle reste négative, signifiant que le pathogène en question n’est pas détectable dans le prélèvement testé, mais n’excluant pas formellement une infection où il n’est présent qu’en faible quantité, comme par exemple Borrelia dans le liquide céphalorachidien lors de neuroborréliose.
Les résultats de PCR quantitatives d’un laboratoire ne sont pas toujours comparables avec ceux d’un autre laboratoire. S’il existe depuis quelques années des standards internationaux pour certains paramètres infectieux comme le VIH ou l’hépatite B, ils ne sont pas disponibles pour tous les pathogènes. Le praticien doit en être conscient lorsqu’il compare des résultats de deux laboratoires. Le type d’échantillon est également un facteur critique pour la comparaison de résultats. Par exemple, la charge virale CMV mesurée dans le sang total n’est pas équivalente à celle mesurée dans le plasma, typiquement plus faible.11
Si les méthodes moléculaires sont rapides par rapport à la culture des micro-organismes, il faut avoir à l’esprit que la durée d’une analyse (turn-around-time) dépend non seulement de la méthode (résultat dans la journée pour une PCR à cible unique ; plusieurs jours pour une analyse par séquençage), mais également de facteurs organisationnels au laboratoire. Les échantillons ne sont généralement pas traités un par un, mais groupés pour permettre une utilisation rationnelle des automates d’extraction et d’amplification. En cas d’urgence, il vaut la peine de contacter le laboratoire.
Les méthodes moléculaires jouent désormais un rôle important dans le diagnostic des infections, également pour la pratique ambulatoire. Dans certains cas, par exemple le diagnostic des infections respiratoires virales, elles ont supplanté les méthodes sérologiques, en permettant une détection directe des pathogènes impliqués. Dans d’autres cas, elles peuvent être utilisées en complément des méthodes traditionnelles, comme les cultures ou la sérologie. Enfin, elles sont inutiles pour certaines infections. Il convient donc d’utiliser ces méthodes de façon différenciée, en connaissant leurs forces et leurs limitations. A l’avenir, de plus en plus de tests moléculaires seront disponibles pour le praticien, permettant notamment de rechercher des groupes de pathogènes en utilisant des panels par syndrome (infection respiratoire, gastro-entérite, méningite…). Il est probable que leur coût baisse dans les prochaines années, rendant leur utilisation plus rationnelle dans le contexte ambulatoire.
> Les méthodes moléculaires peuvent être utiles dans le contexte ambulatoire et sont même devenues les méthodes de référence pour certaines infections
> La qualité des résultats des méthodes moléculaires dépend beaucoup de la qualité du prélèvement
> Comme toutes les méthodes d’analyse, les méthodes moléculaires ont leurs faiblesses qu’il faut connaître pour interpréter au mieux leurs résultats
> Le contact direct avec le laboratoire est indispensable en cas de doute sur la méthode à utiliser, sur le type de matériel à prélever ou sur l’interprétation d’un résultat