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Née en Caroline du Sud, Mary-Louise Parker passe son enfance à voyager, son père étant juge dans l’armée américaine. Après des études d’art dramatique, elle fait des débuts remarqués sur les planches dans une pièce de Craig Lucas, "Prelude to a Kiss", pour laquelle elle est nommée aux Tony Awards en 1990. Le metteur en scène la dirige également dans son film Un compagnon de longue date. Mais c'est l'année suivante que la comédienne décroche son premier véritable rôle au cinéma, aux côtés de Kathy Bates et Jessica Tandy dans Beignets de tomates vertes.
Tout en continuant de jouer au théâtre, Mary-Louise Parker enchaîne les tournages. Elle passe sans difficulté du thriller (Le Client de Joel Schumacher) à la comédie dramatique (l’émouvant Avec ou sans hommes, avec Whoopi Goldberg et Drew Barrymore). En 2001, elle rejoint le casting d’A la Maison blanche. La comédienne marque les esprits en lobbyiste féministe, un rôle qu’elle endosse pour une vingtaine d’épisodes jusqu’à la fin de la série en 2006. Parallèlement, elle est l'épouse d’Edward Norton, confrontée à un terrifiant tueur en série dans Dragon Rouge et participe en 2003 à Angels in America, mini-série d’HBO au casting cinq étoiles (Al Pacino, Meryl Streep, Emma Thompson), dans laquelle elle impressionne en femme mormone accro aux calmants.
2005 est une année importante pour Mary-Louise Parker. Elle est choisie pour incarner Nancy Botwin dans Weeds. La série est encensée par la critique, et la comédienne remporte un Golden Globe pour son interprétation de mère célibataire vendant de la marijuana pour subvenir aux besoins de sa famille. Son succès à la télévision ne l’empêche pas de poursuivre sa carrière au cinéma, bien au contraire. Elle tourne L’Assassinat de Jesse James par le lâche Robert Ford avec Brad Pitt et Casey Affleck et Les Chroniques de Spiderwick sous la direction de Mark Waters. Elle s’associe par la suite à Bruce Willis pour Red et Red 2. En 2013, elle fait à nouveau équipe avec Robert Schwentke, le metteur en scène du premier "Red", pour les besoins de R.I.P.D. Brigade Fantôme, un "buddy movie extraterrestre".