L_2009054SV.01000101.xml 26.2.2009 SV Europeiska unionens officiella tidning L 54/1 KOMMISSIONENS FÖRORDNING (EG) nr 152/2009 av den 27 januari 2009 om provtagnings- och analysmetoder för offentlig kontroll av foder (Text av betydelse för EES) EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR ANTAGIT DENNA FÖRORDNING med beaktande av fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen, med beaktande av Europaparlamentets och rådets förordning (EG) nr 882/2004 av den 29 april 2004 om offentlig kontroll för att säkerställa kontrollen av efterlevnaden av foder- och livsmedelslagstiftningen samt bestämmelserna om djurhälsa och djurskydd ( 1 ) , särskilt artikel 11.4 a, b och c, och av följande skäl: (1) Följande rättsakter antogs för att genomföra direktiv 70/373/EEG och gäller fortfarande i enlighet med artikel 61.2 i förordning (EG) nr 882/2004. — Kommissionens första direktiv 71/250/EEG av den 15 juni 1971 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 2 ) . — Kommissionens andra direktiv 71/393/EEG av den 18 november 1971 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 3 ) . — Kommissionens tredje direktiv 72/199/EEG av den 27 april 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 4 ) . — Kommissionens fjärde direktiv 73/46/EEG av den 5 december 1972 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 5 ) . — Kommissionens första direktiv 76/371/EEG av den 1 mars 1976 om gemenskapsmetoder för provtagning vid den officiella foderkontrollen ( 6 ) . — Kommissionens sjunde direktiv 76/372/EEG av den 1 mars 1976 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 7 ) . — Kommissionens åttonde direktiv 78/633/EEG av den 15 juni 1978 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 8 ) . — Kommissionens nionde direktiv 81/715/EEG av den 31 juli 1981 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 9 ) . — Kommissionens tionde direktiv 84/425/EEG av den 25 juli 1984 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 10 ) . — Kommissionens direktiv 86/174/EEG av den 9 april 1986 om fastställande av metoden för beräkning av energivärdet i foderblandningar till fjäderfä ( 11 ) . — Kommissionens elfte direktiv 93/70/EEG av den 28 juli 1993 om gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 12 ) . — Kommissionens tolfte direktiv 93/117/EEG av den 17 december 1993 om fastställande av gemenskapsmetoder för analys vid den officiella foderkontrollen ( 13 ) . — Kommissionens direktiv 98/64/EG av den 3 september 1998 om fastställandet av gemenskapsmetoder för analys av aminosyror, råoljor och råfetter och olakindox i djurfoder och om ändring av direktiv 71/393/EEG ( 14 ) . — Kommissionens direktiv 1999/27/EG av den 20 april 1999 om fastställande av gemenskapsmetoder för analys av amprolium, diclazuril och karbadox i djurfoder och om ändring av kommissionens direktiv 71/250/EEG, 73/46/EEG och om upphävande av direktiv 74/203/EEG ( 15 ) . — Kommissionens direktiv 1999/76/EG av den 23 juli 1999 om fastställande av gemenskapsmetoder för bestämning av natriumlasalocid i foder ( 16 ) . — Kommissionens direktiv 2000/45/EG av den 6 juli 2000 om fastställande av gemenskapsmetoder för bestämning av A-vitamin, E-vitamin och tryptofan i djurfoder ( 17 ) . — Kommissionens direktiv 2002/70/EG av den 26 juli 2002 om fastställande av krav för bestämning av gränsvärden för dioxiner och dioxinlika PCB i foder ( 18 ) . — Kommissionens direktiv 2003/126/EG av den 23 december 2003 om analysmetoder för identifiering av beståndsdelar av animaliskt ursprung i foder för den officiella foderkontrollen ( 19 ) . (2) Eftersom direktiv 70/373/EEG har ersatts med förordning (EG) nr 882/2004 bör genomföranderättsakterna till det direktivet ersättas med en enda förordning. Metoderna bör samtidigt anpassas för att ta hänsyn till nya vetenskapliga och tekniska rön. Metoder som inte längre fyller sitt syfte bör utgå. Bestämmelserna om provtagning kommer att uppdateras för att beakta den senaste utvecklingen när det gäller tillverkning, lagring, transport och saluföring av foder, men de gällande bestämmelserna om provtagning bör behållas tills vidare. (3) Direktiven 71/250/EEG, 71/393/EEG, 72/199/EEG, 73/46/EEG, 76/371/EEG, 76/372/EEG, 78/633/EEG, 81/715/EEG, 84/425/EEG, 86/174/EEG, 93/70/EEG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG och 2003/126/EG bör därför upphävas. (4) De åtgärder som föreskrivs i denna förordning är förenliga med yttrandet från ständiga kommittén för livsmedelskedjan och djurhälsa. HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE. Artikel 1 Provtagning för offentlig kontroll av foder när det gäller bestämning av sammansättning, tillsatser och främmande ämnen, med undantag av bekämpningsmedelsrester och mikroorganismer, ska utföras enligt metoderna i bilaga I. Artikel 2 Beredning av analysprov och resultatangivelse ska följa metoderna i bilaga II. Artikel 3 Analyser för offentlig kontroll av foder ska utföras enligt metoderna i bilaga III (Analysmetoder för kontroll av foderråvarors och foderblandningars sammansättning), bilaga IV (Analysmetoder för kontroll av halten godkända fodertillsatser), bilaga V (Analysmetoder för kontroll av främmande ämnen i foder) och bilaga VI (Analysmetoder för bestämning av beståndsdelar av animaliskt ursprung för offentlig kontroll av foder). Artikel 4 Energivärdet i foderblandningar till fjäderfä ska beräknas i enlighet med bilaga VII. Artikel 5 De analysmetoder för kontroll av förekomst av otillåtna fodertillsatser som anges i bilaga VIII ska användas som konfirmeringsmetoder. Artikel 6 Direktiven 71/250/EEG, 71/393/EEG, 72/199/EEG, 73/46/EEG, 76/371/EEG, 76/372/EEG, 78/633/EEG, 81/715/EEG, 84/425/EEG, 86/174/EEG, 93/70/EEG, 93/117/EG, 98/64/EG, 1999/27/EG, 1999/76/EG, 2000/45/EG, 2002/70/EG och 2003/126/EG ska upphöra att gälla. Hänvisningar till de upphävda direktiven ska anses som hänvisningar till denna förordning och ska läsas i enlighet med jämförelsetabellerna i bilaga IX. Artikel 7 Denna förordning träder i kraft den tjugonde dagen efter det att den har offentliggjorts i Europeiska unionens officiella tidning . Den ska tillämpas från och med den 26 augusti 2009. Denna förordning är till alla delar bindande och direkt tillämplig i alla medlemsstater. Utfärdad i Bryssel den 27 januari 2009. På kommissionens vägnar Androulla VASSILIOU Ledamot av kommissionen ( 1 ) EUT L 165, 30.4.2004, s. 1 . Rättad i EUT L 191, 28.5.2004, s. 1 . ( 2 ) EGT L 155, 12.7.1971, s. 13 . ( 3 ) EGT L 279, 20.12.1971, s. 7 . ( 4 ) EGT L 123, 29.5.1972, s. 6 . ( 5 ) EGT L 83, 30.3.1973, s. 21 . ( 6 ) EGT L 102, 15.4.1976, s. 1 . ( 7 ) EGT L 102, 15.4.1976, s. 8 . ( 8 ) EGT L 206, 29.7.1978, s. 43 . ( 9 ) EGT L 257, 10.9.1981, s. 38 . ( 10 ) EGT L 238, 6.9.1984, s. 34 . ( 11 ) EGT L 130, 16.5.1986, s. 53 . ( 12 ) EGT L 234, 17.9.1993, s. 17 . ( 13 ) EGT L 329, 30.12.1993, s. 54 . ( 14 ) EGT L 257, 19.9.1998, s. 14 . ( 15 ) EGT L 118, 6.5.1999, s. 36 . ( 16 ) EGT L 207, 6.8.1999, s. 13 . ( 17 ) EGT L 174, 13.7.2000, s. 32 . ( 18 ) EGT L 209, 6.8.2002, s. 15 . ( 19 ) EUT L 339, 24.12.2003, s. 78 . BILAGA I PROVTAGNINGSMETODER 1. SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE Prov som är avsedda för offentlig kontroll av foder ska tas med de metoder som beskrivs nedan. Prov som har tagits på detta sätt ska anses vara representativa för partierna. 2. PROVTAGNINGSPERSONAL Proven ska tas av personer som medlemsstaterna har bemyndigat för detta. 3. DEFINITIONER parti : en mängd av en produkt som utgör en enhet och vars egenskaper antas vara enhetliga. delprov : en viss mängd som tagits från ett ställe i partiet. samlingsprov : en blandning av delprov som tagits från samma parti. reducerat prov : en representativ del av samlingsprovet som erhållits ur detta genom reduktion. slutligt prov : en del av det reducerade provet eller av det homogeniserade samlingsprovet. 4. UTRUSTNING 4.1 Provtagningsutrustningen ska vara tillverkad av material som inte kan kontaminera de produkter som ska provtas. Medlemsstaterna kan officiellt godkänna sådan utrustning. 4.2 Utrustning som rekommenderas för provtagning av fast foder. 4.2.1 Manuell provtagning 4.2.1.1 Flatbottnad skyffel med vertikala sidor. 4.2.1.2 Provtagningsspjut med en lång skåra eller med olika fack. Provtagningsspjutets dimensioner måste lämpa sig för partiets egenskaper (behållarens djup, säckformat etc.) och fodrets partikelstorlek. 4.2.2 Mekanisk provtagning Godkänd mekanisk utrustning får användas för provtagning på foder i rörelse. 4.2.3 Provdelare Utrustning avsedd att dela upp provet i ungefär lika stora delar kan användas för tagning av delprov och beredning av reducerade och slutliga prov. 5. KVANTITATIVA KRAV 5.A Kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret. 5.A.1 Parti Partiet ska vara av sådan storlek att prov kan tas i var och en av dess beståndsdelar. 5.A.2 Delprov 5.A.2.1 Löst foder: Minsta antal delprov: 5.A.2.1.1 Partier på högst 2,5 ton sju 5.A.2.1.2 Partier på mer än 2,5 ton √ 20 gånger det antal ton som utgör partiet ( 1 ) , som mest 40 delprov 5.A.2.2 Förpackat foder: Minsta antal förpackningar som ska provtas ( 2 ) : 5.A.2.2.1 Förpackningar på mer än 1 kg: 5.A.2.2.1.1 Partier på en till fyra förpackningar samtliga förpackningar 5.A.2.2.1.2 Partier på fem till sexton förpackningar fyra 5.A.2.2.1.3 Partier på mer än sexton förpackningar √ det antal förpackningar som utgör partiet ( 1 ) , som mest 20 förpackningar 5.A.2.2.2 Förpackningar på högst 1 kg fyra 5.A.2.3 Flytande eller halvflytande foder: Minsta antal behållare som ska provtas ( 2 ) : 5.A.2.3.1 Behållare på mer än 1 liter: 5.A.2.3.1.1 Partier på en till fyra behållare samtliga behållare 5.A.2.3.1.2 Partier på fem till sexton behållare fyra 5.A.2.3.1.3 Partier på mer än sexton behållare √ det antal behållare som utgör partiet ( 1 ) , som mest 20 förpackningar 5.A.2.3.2 Behållare på högst 1 liter fyra 5.A.2.4 Foderblock och saltstenar Minsta antal block eller stenar som ska provtas ( 2 ) : ett block eller en sten per parti om 25 enheter, som mest fyra block eller stenar 5.A.3 Samlingsprov Det krävs ett samlingsprov per parti. Det sammanlagda antalet delprov i ett samlingsprov ska vara minst följande: 5.A.3.1 Löst foder: 4 kg 5.A.3.2 Förpackat foder: 5.A.3.2.1 Förpackningar på mer än 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2 Förpackningar på högst 1 kg vikten av innehållet i fyra originalförpackningar 5.A.3.3 Flytande eller halvflytande foder: 5.A.3.3.1 Behållare på mer än 1 liter 4 liter 5.A.3.3.2 Behållare på högst 1 liter volymen av innehållet i fyra originalbehållare 5.A.3.4 Foderblock eller saltstenar: 5.A.3.4.1 med en vikt på mer än 1 kg styck 4 kg 5.A.3.4.2 med en vikt på högst 1 kg styck vikten av fyra foderblock eller saltstenar i ursprunglig storlek 5.A.4 Slutliga prov Vid behov tas det slutliga provet från samlingsprovet genom reduktion. Minst ett slutligt prov ska analyseras. Det slutliga prov som analyseras ska vara av minst följande mängd: Fast foder 500 g Flytande eller halvflytande foder 500 ml 5.B Kontroll av främmande ämnen eller produkter som kan vara ojämnt fördelade i fodret, t.ex. aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria i foderråvaror ( 3 ) 5.B.1 Parti: se 5.A.1. 5.B.2 Delprov 5.B.2.1 Löst foder: se 5.A.2.1. 5.B.2.2 Förpackat foder: Minsta antal förpackningar som ska provtas: 5.B.2.2.1 Partier på en till fyra förpackningar samtliga förpackningar 5.B.2.2.2 Partier på fem till sexton förpackningar fyra 5.B.2.2.3 Partier på mer än sexton förpackningar √ det antal förpackningar som utgör partiet ( 1 ) , som mest 40 förpackningar 5.B.3 Samlingsprov Antalet samlingsprov kommer att variera med partiets storlek. Minsta antal samlingsprov per parti som krävs anges nedan. De delprov som utgör ett samlingsprov ska tillsammans väga minst 4 kg. 5.B.3.1 Löst foder Partiets vikt i ton: Minsta antal samlingsprov per parti: högst 1 1 mer än 1 och högst 10 2 mer än 10 och högst 40 3 mer än 40 4 5.B.3.2 Förpackat foder Partiets storlek i antal förpackningar: Minsta antal samlingsprov per parti: 1–16 1 17–200 2 201–800 3 fler än 800 4 5.B.4 Slutliga prov De slutliga proven tas från samlingsproven genom reduktion. Minst ett slutligt prov per samlingsprov måste analyseras. Vikten på det slutliga prov som analyseras ska vara minst 500 g. 6. ANVISNINGAR OM UTTAGNING, BEREDNING OCH FÖRPACKNING AV PROVEN 6.1 Allmänt Proven ska tas och beredas så snabbt som möjligt med beaktande av de försiktighetsåtgärder som krävs för att produkten varken ska förändras eller kontamineras. Instrument, ytor och behållare som kommer i kontakt med proven ska vara rena och torra. 6.2 Delprov 6.2.A Kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret Delprov ska tas slumpvis i hela partiet och ha ungefär samma storlek. 6.2.A.1 Löst foder Partiet indelas teoretiskt i ett antal ungefär lika stora delar. Ett antal delar som motsvarar antalet delprov enligt 5.A.2 väljs ut slumpvis, varefter minst ett prov tas från var och en av dessa delar. Provtagningen kan, om så är lämpligt, göras medan partiet är i rörelse (vid lastning eller lossning). 6.2.A.2 Förpackat foder När det antal förpackningar som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska en del av innehållet i varje förpackning tas ut med spjut eller skyffel. Vid behov tas proven efter det att förpackningarna har tömts separat. Eventuella klumpar bryts upp om så krävs; detta görs separat för varje samlingsprov där klumparna först tas ut från provet och sedan återförs till detta. 6.2.A.3 Flytande eller halvflytande foder som är homogent eller kan homogeniseras När det antal behållare som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska innehållet vid behov homogeniseras och en mängd tas från varje behållare. Delproven kan tas när innehållet lossas. 6.2.A.4 Flytande eller halvflytande foder som inte kan homogeniseras När det antal behållare som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska prov tas från olika nivåer. Proven kan också tas när innehållet lossas, men de första fraktionerna ska då kastas. I båda fallen ska den totala volymen vara minst tio liter. 6.2.A.5 Foderblock och saltstenar När det antal block eller stenar som krävs för provtagning enligt 5.A.2 har valts ut ska en del av varje block eller sten tas ut. 6.2.B Kontroll av främmande ämnen eller produkter som kan vara ojämnt fördelade i fodret, t.ex. aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria i foderråvaror Partiet indelas teoretiskt i ett antal ungefär lika stora delar, motsvarande det antal samlingsprov som anges i 5.B.3. Om detta antal är större än ett ska det totala antalet delprov enligt 5.B.2 fördelas ungefär jämnt på de olika delarna. Därefter tas prov av ungefär samma storlek ( 4 ) så att proven från varje del tillsammans väger minst 4 kg, dvs. minimivikten för varje samlingsprov. Delprov som tagits från olika delar får inte ingå i samma samlingsprov. 6.3 Beredning av samlingsprov 6.3.A Kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret Delproven ska blandas till ett enda samlingsprov. 6.3.B Kontroll av främmande ämnen eller produkter som kan vara ojämnt fördelade i fodret, t.ex. aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria i foderråvaror Delproven från varje del av partiet blandas och antalet samlingsprov enligt 5.B.3 bereds. Varje samlingsprovs ursprung ska noga registreras. 6.4 Beredning av slutliga prov Materialet i varje samlingsprov blandas noggrant till ett homogeniserat prov ( 5 ) . Vid behov ska samlingsprovet först reduceras till minst 2 kg eller 2 liter (reducerat prov), antingen med mekanisk eller automatisk delare eller med kvarteringsmetoden. Därefter bereds minst tre slutliga prov av ungefär samma storlek enligt de kvantitativa kraven i 5.A.4 or 5.B.4. Varje prov placeras i en lämplig behållare. Alla nödvändiga försiktighetsåtgärder ska vidtas för att undvika att provets sammansättning förändras eller att provet kontamineras eller förfalskas under transport och lagring. 6.5 Förpackning av slutliga prov Behållare och förpackningar ska förseglas och märkas (hela märkningen måste ingå i förseglingen) så att de inte kan öppnas utan att förseglingen skadas. 7. REGISTRERING AV PROV Alla provtagningar ska registreras så att varje parti entydigt kan identifieras. 8. VIDAREBEFORDRAN AV PROV För varje samlingsprov ska minst ett slutligt prov så snart som möjligt sändas till ett auktoriserat analyslaboratorium tillsammans med de upplysningar som den som utför analysen behöver. ( 1 ) Om det erhållna talet inte är ett heltal ska det avrundas till närmast högre heltal. ( 2 ) För förpackningar eller behållare med ett innehåll på högst 1 kg eller 1 liter och för foderblock eller saltstenar på högst 1 kg vardera ska samlingsprovet utgöras av innehållet i en originalförpackning eller originalbehållare, ett foderblock eller en saltsten. ( 3 ) Metoderna i 5.A ska användas för kontroll av aflatoxiner, mjöldryga, ricin och Crotalaria I helfoder och tilläggsfoder. ( 4 ) För förpackat foder ska en del av innehållet i de förpackningar som ska provtas tas ut med hjälp av ett spjut eller en skyffel efter det att förpackningarna om det behövs har tömts separat. ( 5 ) Eventuella klumpar ska brytas upp (om det behövs genom att de tas ut från provet och sedan återförs till detta), vilket görs separat för varje samlingsprov. BILAGA II ALLMÄNNA BESTÄMMELSER OM ANALYSMETODER FÖR FODER A. BEREDNING AV ANALYSPROV 1. Syfte De metoder som beskrivs nedan gäller beredning för analys av slutliga prov som skickats till kontrollaboratorierna efter provtagning i enlighet med bilaga I. Dessa prov ska beredas så att den uppvägda mängden enligt analysmetoden är homogen och representativ för de slutliga proven. 2. Försiktighetsåtgärder Vilken provberedningsmetod som ska användas beror på analysmetoden. Det är därför viktigt att man ser till att provberedningsmetoden lämpar sig för den analysmetod som används. Alla nödvändiga moment ska utföras på ett sådant sätt att man i görligaste mån undviker att provet kontamineras eller att dess sammansättning ändras. Malning, blandning och siktning bör göras så snabbt som möjligt så att provet i minsta möjliga utsträckning utsätts för luft och ljus. Kvarnar och rivare som avsevärt kan hetta upp provet bör inte användas. Malning för hand rekommenderas för foder som är särskilt känsliga för värme. Man bör också se till att apparaten inte i sig själv är en källa till kontaminering med spårelement. Om provet inte kan beredas utan betydande förändringar av dess vattenhalt ska vattenhalten före och efter beredningen bestämmas med den metod som anges i bilaga III del A. 3. Utförande Dela provet i lämpliga analys- och referensprov med lämpliga neddelningsmetoder, t.ex. genom växelvisa skyffeltag eller med hjälp av spaltneddelare eller rotationsneddelare. Koning och kvartering rekommenderas inte eftersom det kan ge större neddelningsfel. Förvara referensprovet i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning, och bered analysprov på minst 100 g enligt nedan. 3.1 Foder som kan malas i befintligt tillstånd Om inte annat anges i analysmetoderna siktas hela provet genom en sikt med kvadratiska maskor med sidan 1 mm (enligt ISO-rekommendation R565), efter malning om det behövs. Mal inte provet mer än nödvändigt. Blanda det siktade provet och placera det i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. Blanda provet igen i direkt samband med invägning för analys. 3.2 Foder som kan malas efter torkning Om inte annat anges i metodbeskrivningen torkas provet till en vattenhalt på 8–12 % genom den förberedande torkning som görs vid bestämning av vattenhalt enligt bilaga III del A punkt 4.3. Fortsätt sedan enligt anvisningarna i 3.1. 3.3 Flytande eller halvflytande foder Placera provet i en lämplig ren, torr behållare med lufttät förslutning. Blanda provet ordentligt i direkt samband med invägning för analys. 3.4 Öviga foder Prov som inte kan beredas enligt någon av de föregående metoderna bör behandlas med någon annan metod som garanterar att de provportioner som vägs in för analys är homogena och representativa för det slutliga provet. 4. Provförvaring Proven ska förvaras vid en temperatur som inte påverkar deras sammansättning. Prov avsedda för analys av vitaminer eller ämnen som är särskilt ljuskänsliga ska förvaras i behållare av brunt glas. B. BESTÄMMELSER OM REAGENS OCH UTRUSTNING FÖR ANALYS 1. Om inget annat anges för analysmetoden ska alla reagens vara analysrena (p.a.). Vid spåranalys ska reagensens renhet kontrolleras mot ett blankprov. Beroende på resultatet kan det krävas ytterligare rening av reagensen. 2. Om det i metodbeskrivningen inte anges vilken typ av lösnings- eller spädningsmedel som ska användas för beredning av lösningar, spädning, sköljning eller tvättning ska vatten användas. I allmänhet ska vattnet vara demineraliserat eller destillerat. I särskilda fall, som anges i metodbeskrivningarna, ska vattnet behandlas med särskilda reningsmetoder. 3. Eftersom viss utrustning normalt sett förekommer på kontrollaboratorier nämns i metodbeskrivningarna endast instrument och apparatur som är speciella eller som ska användas på ett speciellt sätt. Instrument och apparatur ska vara rena, särskilt när mycket små mängder ska bestämmas. C. VAL AV ANALYSMETOD OCH RESULTATANGIVELSE 1. Extraktion I många fall anges en specifik extraktionsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra extraktionsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda extraktionsmetoden har likvärdig extraktionseffektivitet för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden. 2. Rening I många fall anges en specifik reningsmetod för en viss analysmetod. I allmänhet kan andra reningsmetoder än den som finns i metodbeskrivningen användas om det kan visas att den använda reningsmetoden ger likvärdiga analysresultat för den analyserade matrisen som den metod som anges för analysmetoden. 3. Angivande av analysmetod som använts I allmänhet har det fastställts en analysmetod för bestämning av varje enskilt ämne i fodret. Om det finns flera metoder ska den metod som kontrollaboratoriet använt anges i analysrapporten. 4. Antal bestämningar Resultatet som anges i analysrapporten ska vara det medelvärde som erhållits vid minst två bestämningar som gjorts på separata delar av provet med tillfredsställande repeterbarhet. När det gäller analys av främmande ämnen gäller dock att om resultatet från den första bestämningen är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras så behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. När det gäller kontroll av det deklarerade innehållet av ett ämne eller en beståndsdel gäller att om resultatet från den första bestämningen bekräftar det deklarerade innehållet, dvs. analysresultatet hamnar inom ett intervall för acceptabel variation jämfört med det deklarerade innehållet, behövs ingen ytterligare bestämning, förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden används. I en del fall definieras detta acceptabla variationsintervall, t.ex. i rådets direktiv 79/373/EEG ( 1 ) . 5. Rapportering av analysresultat Analysresultatet ska uttryckas med lämpligt antal värdesiffror på det sätt som anges i metodbeskrivningen och ska vid behov korrigeras för vattenhalten i det slutliga provet före beredning. 6. Mätosäkerhet och utbyte vid analys av främmande ämnen. I fråga om främmande ämnen enligt direktiv 2002/32/EG, bl.a. dioxiner och dioxinlika PCB, gäller att om analysresultatet bedöms överstiga högsta tillåtna halt med hänsyn tagen till den utvidgade mätosäkerheten och korrigering för utbyte ska en produkt avsedd som foder inte anses uppfylla kraven på högsta tillåtna halt. För att bedöma om kraven uppfylls tar man den analyserade halten, korrigerad för utbyte, minus den utvidgade mätosäkerheten. Denna metod kan bara användas om det går att uppskatta mätosäkerheten och korrigering för utbyte med hjälp av analysmetoden (den kan exempelvis inte användas för mikroskopisk analys). Analysresultatet ska rapporteras enligt följande (om analysmetoden gör det möjligt att uppskatta mätosäkerhet och utbyte): a) Korrigerat för utbyte, med uppgift om hur stort utbytet är. Korrigering är inte nödvändig om utbytet är 90–110 %. b) Som x +/– U, där x är analysresultatet och U den utvidgade mätosäkerheten, beräknad med en täckningsfaktor på 2, vilket ger en konfidensgrad på ca 95 %. Om analysresultatet är betydligt (> 50 %) lägre än den specifikation som ska kontrolleras, och förutsatt att lämpliga kvalitetsförfaranden använts och att analysen endast syftar till att kontrollera om fodret uppfyller kraven i lagstiftningen, får analysresultatet rapporteras utan korrigering för utbyte. Utbyte och mätosäkerhet behöver inte anges i dessa fall. ( 1 ) EGT L 86, 6.4.1979, s. 30 . BILAGA III ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV FODERRÅVARORS OCH FODERBLANDNINGARS SAMMANSÄTTNING A. BESTÄMNING AV VATTENHALT 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan vattenhalten i foder bestämmas. Det bör framhållas att när det gäller foder som innehåller flyktiga ämnen, exempelvis organiska syror, bestäms också en betydande mängd flyktiga ämnen tillsammans med vatteninnehållet. Metoden omfattar inte analys av mjölkprodukter som används som foderråvaror, analys av mineralämnen och blandningar som främst består av mineralämnen, analys av animaliska och vegetabiliska fetter och oljor eller analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter. 2. Princip Provet torkas på angivet sätt, alltefter fodrets beskaffenhet. Viktförlusten bestäms genom vägning. När det gäller fast foder med hög vattenhalt är det nödvändigt att göra en förberedande torkning. 3. Utrustning 3.1 Kross av ej vattenabsorberande material som är lätt att rengöra, möjliggör snabb och jämn krossning utan nämnvärd värmeutveckling, så långt möjligt förhindrar kontakt med omgivande luft och som uppfyller kraven i 4.1.1 och 4.1.2 (t.ex. rivkvarnar med variabel malning, vattenkylda kvarnar eller liknande). 3.2 Analysvåg med en noggrannhet av 1 mg. 3.3 Torra behållare av korrosionsfri metall eller av glas och med lufttäta lock. Arbetsytan ska göra det möjligt att sprida ut provet till ca 0,3 g/cm 2 . 3.4 Elektrisk isotermisk ugn (± 2 o C) med god ventilation och möjlighet till snabb temperaturreglering ( 1 ) . 3.5 Reglerbar elektrisk vakuumugn med oljepump och antingen en anordning för tillförsel av varm, torr luft eller ett torkmedel (t.ex. kalciumoxid). 3.6 Exsickator med tjock perforerad metall- eller porslinsplatta och med ett effektivt torkmedel. 4. Utförande Observera: De moment som beskrivs i detta avsnitt måste utföras omedelbart efter det att provförpackningarna öppnats. Minst två parallella analyser ska utföras. 4.1 Beredning 4.1.1 Andra fodertyper än de som behandlas i 4.1.2 och 4.1.3 Ta minst 50 g av provet. Krossa eller sönderdela vid behov för att göra provet homogent med avseende på vattenhalt (se 6). 4.1.2 Spannmål och gröpe Ta minst 50 g av provet. Mal till partiklar som till minst 50 % passerar genom en sikt med en maskvidd av 0,5 mm och som lämnar högst 10 % återstod på en rundmaskig sikt med en maskvidd av 1 mm. 4.1.3 Foder i flytande form eller pastaform samt foder som till större delen består av oljor och fetter Ta ca 25 g av provet och väg med en noggrannhet av 10 mg. Tillsätt lämplig mängd vattenfri sand som vägts med en noggrannhet av 10 mg och blanda tills en homogen massa erhålls. 4.2 Torkning 4.2.1 Andra fodertyper än de som behandlas i 4.2.2 och 4.2.3 Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 1 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 103 o C. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i 4 timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 103 o C. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg. Foder som till större delen består av oljor och fetter torkas i ugnen i ytterligare 30 minuter vid 130 o C. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %. 4.2.2 Spannmål, mjöl och gröpe Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av det krossade provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i ugnen som förvärmts till 130 o C. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Låt torka i två timmar räknat från det att ugnstemperaturen åter stigit till 130 o C. Sätt på locket på behållaren, ta ut denna ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg. 4.2.3 Foderblandningar som innehåller mer än 4 % sackaros eller laktos; foderråvaror som t.ex. johannesbrödsfrön, hydrolyserade spannmålsprodukter, malt, torkad betsnitsel, lösliga biprodukter från fisk- eller sockerindustrin; foderblandningar som innehåller mer än 25 % mineralsalter inklusive kristallvatten Väg en behållare (3.3) med lock med en noggrannhet av 0,5 mg. Väg upp ca 5 g av provet med en noggrannhet av 1 mg i den vägda behållaren och fördela det jämnt. Sätt in behållaren utan lock i vakuumugnen (3.5) som förvärmts till 80–85 o C. Sätt in behållaren i ugnen så snabbt som möjligt så att ugnstemperaturen inte sjunker alltför mycket. Ställ in trycket på 100 torr och låt torka vid detta tryck i 4 timmar, antingen med en torr varmluftsström eller med användning av torkmedel (ca 300 g till 20 prov). Om det senare alternativet väljs ska vakuumpumpen frånkopplas när det angivna trycket har uppnåtts. Räkna torkningstiden från det att ugnstemperaturen åter har nått 80–85 o C. Låt försiktigt ugnen återgå till atmosfärstryck. Öppna ugnen, sätt omedelbart lock på behållaren, ta ut den ur ugnen, låt svalna i 30–45 minuter i exsickatorn (3.6) och väg med en noggrannhet av 1 mg. Låt torka i ytterligare 30 minuter i vakuumugnen vid 80–85 o C och väg på nytt. Skillnaden i vattenhalt mellan de båda vägningarna får inte överstiga 0,1 %. 4.3 Förberedande torkning 4.3.1 Andra foder än de som behandlas i 4.3.2 Fasta foder med hög vattenhalt som försvårar krossning måste genomgå en förberedande torkning enligt följande: Väg upp 50 g okrossat prov med en noggrannhet av 10 mg (pellets och briketter kan vid behov delas grovt) i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn vid 60–70 o C tills vattenhalten har reducerats till 8–12 %. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i 1 timme och väg med en noggrannhet av 10 mg. Krossa provet omedelbart enligt 4.1.1 och torka enligt 4.2.1 eller 4.2.3 beroende på fodrets beskaffenhet. 4.3.2 Spannmål Spannmål med en vattenhalt över 17 % måste genomgå en förberedande torkning enligt följande: Väg upp 50 g omalda spannmålskärnor med en noggrannhet av 10 mg i en lämplig behållare (t.ex. en 20 × 12 cm aluminiumplåt med 0,5 cm upphöjd kant). Låt torka i ugn i 5–7 minuter vid 130 o C. Ta ut provet ur ugnen, låt svalna utan lock i laboratoriet i två timmar och väg med en noggrannhet av 10 mg. Mal omedelbart enligt 4.1.2 och torka enligt 4.2.2. 5. Beräkning av resultat Vattenhalten (X) i procent av provet beräknas med nedanstående formler. 5.1 Torkning utan förberedande torkning där: m = provets ursprungliga vikt i gram m 0 = det torkade provets vikt i gram. 5.2 Torkning med förberedande torkning där: m = provets ursprungliga vikt i gram m 1 = provets vikt i gram efter förberedande torkning m 2 = provets vikt i gram efter krossning eller malning m 0 = det torkade provets vikt i gram. 5.3 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,2 % av den absoluta vattenhalten. 6. Anmärkning Om det är nödvändigt att krossa provet och detta medför en iakttagbar förändring av vattenhalten, måste resultaten av analyserna av fodrets beståndsdelar korrigeras på grundval av provets ursprungliga vattenhalt. B. BESTÄMNING AV VATTENHALT I ANIMALISKA OCH VEGETABILISKA OLJOR OCH FETTER 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod är det möjligt att bestämma halter av vatten och flyktiga ämnen i animaliska och vegetabiliska oljor och fetter. 2. Princip Provet torkas till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg) vid 103 o C. Viktförlusten bestäms genom vägning. 3. Utrustning 3.1 Flatbottnad skål av korrosionsresistent material, 8–9 cm i diameter och ca 3 cm hög. 3.2 Termometer med förstärkt kula och expansionsrör i överdelen, graderad från ca 80 o C till minst 110 o C och ca 10 cm lång. 3.3 Sandbad eller elektrisk värmeplatta. 3.4 Exsickator med ett effektivt torkmedel. 3.5 Analysvåg. 4. Utförande Väg med 1 mg noggrannhet upp ca 20 g av det homogeniserade provet på den torra, vägda skålen (3.1) där termometern (3.2) placerats. Upphetta på sandbadet eller värmeplattan (3.3) under ständig omrörning med termometern så att temperaturen stiger till 90 o C på ca 7 minuter. Sänk värmen och ge akt på mängden bubblor som stiger från skålens botten. Temperaturen får inte överstiga 105 o C. Fortsätt att röra om och skrapa skålens botten tills det inte längre bildas några bubblor. För att försäkra sig om att vattnet helt har avlägsnats upphettar man upprepade gånger till 103 ± 2 o C och kyler till 93 o C mellan upphettningarna. Därefter får provet svalna till rumstemperatur i exsickatorn (3.4) varefter det vägs. Detta upprepas tills viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar inte längre överstiger 2 mg. Observera: Om provets vikt ökar efter flera upphettningar, tyder detta på att fettet har oxiderats. Resultatet beräknas då utifrån den vägning som gjordes omedelbart innan vikten började öka. 5. Beräkning av resultat Provets vattenhalt X i procent beräknas med formeln där: m = provets vikt i gram m 1 = skålens vikt (i gram) inklusive innehåll före upphettning m 2 = skålens vikt (i gram) inklusive innehåll efter upphettning. Resultat under 0,05 % ska redovisas som ”under 0,05 %”. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,05 % av den absoluta vattenhalten. C. BESTÄMNING AV RÅPROTEINHALT 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan råproteinhalten i foder bestämmas på grundval av kvävehalten, bestämd med Kjeldahlmetoden. 2. Princip Provet uppsluts med svavelsyra i närvaro av en katalysator. Syralösningen görs basisk med natriumhydroxidlösning. Ammoniaken destilleras av och samlas upp i en uppmätt kvantitet svavelsyra varefter syraöverskottet titreras med en standardlösning av natriumhydroxid. Alternativt destilleras den frigjorda ammoniaken till ett överskott av borsyralösning, som sedan titreras med saltsyra eller svavelsyra. 3. Reagens 3.1 Kaliumsulfat. 3.2 Katalysator: koppar(II)oxid, CuO, eller koppar(II)sulfatpentahydrat, CuSO 4 5H 2 O. 3.3 Zinkgranulat. 3.4 Svavelsyra, ρ 20 = 1,84 g/ml. 3.5 Svavelsyra, standardlösning, c(H 2 SO 4 ) = 0,25 mol/l. 3.6 Svavelsyra, standardlösning, c(H 2 SO 4 ) = 0,10 mol/l. 3.7 Svavelsyra, standardlösning, c(H 2 SO 4 ) = 0,05 mol/l. 3.8 Metylrött (indikator): lös 300 mg metylrött i 100 ml etanol, σ = 95–96 % (v/v). 3.9 Natriumhydroxidlösning (teknisk kvalitet kan användas) β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10 Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11 Natriumhydroxid, standardlösning, c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12 Pimpstensgranulat som saltsyresköljts och glödgats. 3.13 Acetanilid (smältpunkt = 114 o C, N-halt = 10,36 %). 3.14 Sackaros (kvävefri). 3.15 Borsyra (H 3 BO 3 ). 3.16 Indikatorlösning av metylrött: lös 100 mg metylrött i 100 ml etanol eller metanol. 3.17 Lösning av bromkresolgrönt: lös 100 mg bromkresolgrönt i 100 ml etanol eller metanol. 3.18 Borsyralösning (10–40 g/l beroende på vilken utrustning som används). Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten ska indikatorerna metylrött och bromkresolgrönt tillsättas borsyralösningarna. För beredning av 1 liter borsyralösning tillsätts 7 ml lösning av metylrött (3.16) och 10 ml lösning av bromkresolgrönt (3.17) innan volymen justeras. Beroende på det vatten som används kan borsyralösningens pH variera mellan olika satser. Det är ofta nödvändigt med en liten tillsats av bas för att få ett positivt blankprov. Anmärkning: En tillsats av ca 3–4 ml NaOH (3.11) till 1 liter borsyra (10 g/l) ger vanligen en god justering. Lösningen förvaras i rumstemperatur skyddad från ljus och ammoniakångor. 3.19 Saltsyra, standardlösning, c(HCl) = 0,10 mol/l. Anmärkning: Andra koncentrationer av lösningarna (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 och 3.19) kan användas om beräkningarna korrigeras för detta. Koncentrationerna bör alltid anges med fyra decimaler. 4. Utrustning Lämplig utrustning för uppslutning, destillation och titrering enligt Kjeldahlmetoden. 5. Utförande 5.1 Uppslutning Väg upp 1 g av provet med 0,001 g noggrannhet och överför detta till uppslutningsapparatens kolv. Tillsätt 15 g kaliumsulfat (3.1), en lämplig mängd katalysator (3.2) (0,3–0,4 g koppar(II)oxid eller 0,9–1,2 g koppar(II)sulfatpentahydrat), 25 ml svavelsyra (3.4) och vid behov några korn pimpsten (3.12). Blanda. Upphetta kolven först måttligt, och rotera den vid behov då och då tills innehållet har förkolnat och skummet försvunnit. Upphetta sedan intensivare tills vätskan kommit i konstant kokning. Värmen är tillräcklig om den kokande syran kondenserar på kolvens väggar. Se till att kolvens väggar inte blir överhettade och att organiska partiklar inte fastnar på dem. När lösningen har blivit klar och ljusgrön fortsätts kokningen i ytterligare två timmar, varefter lösningen får svalna. 5.2 Destillation Tillsätt försiktigt tillräckligt med vatten för att sulfaterna ska lösas upp fullständigt. Låt svalna. Tillsätt sedan några korn zinkgranulat (3.3) om så behövs. Fortsätt enligt 5.2.1 eller 5.2.2. 5.2.1 Destillation till svavelsyra Tillför en exakt uppmätt mängd av 25 ml svavelsyra (3.5) eller (3.7), beroende på den förmodade kvävehalten, till destillationsapparatens uppsamlingskolv. Tillsätt några droppar metylrött (3.8). Förbind kolven med destillationsapparatens kylare och sänk ned kylarens ände minst 1 cm (se anmärkning 8.3) i vätskan i uppsamlingskolven. Häll långsamt 100 ml natriumhydroxidlösning (3.9) i kolven utan att ammoniak försvinner (se anmärkning 8.1). Upphetta kolven tills ammoniaken har destillerats färdigt. 5.2.2 Destillation till borsyra Om destillatets ammoniakinnehåll titreras manuellt används nedanstående förfarande. Om destillationsenheten är helautomatisk och inkluderar titrering av destillatets ammoniakinnehåll, ska tillverkarens bruksanvisning följas. Ställ en uppsamlingskolv innehållande 25–30 ml borsyralösning (3.18) under kylarens utlopp på ett sådant sätt att utloppsröret mynnar under ytan i ett överskott av borsyralösning. Ställ in destillationsenheten så att 50 ml natriumhydroxidlösning (3.9) tillsätts. Använd destillationsenheten enligt tillverkarens bruksanvisning och destillera av den ammoniak som frigjorts genom tillsatsen av natriumhydroxidlösning. Samla upp destillatet i borsyralösningen. Mängden destillat (tiden för ångdestillation) beror på mängden kväve i provet. Följ tillverkarens bruksanvisning. Anmärkning: I en halvautomatisk destillationsenhet sker såväl tillsats av ett överskott av natriumhydroxid som ångdestillation automatiskt. 5.3 Titrering Fortsätt enligt 5.3.1 eller 5.3.2. 5.3.1 Svavelsyra Överskottet av svavelsyra titreras i uppsamlingskolven med natriumhydroxidlösning (3.10 eller 3.11), beroende på vilken koncentration av svavelsyra som använts, tills ekvivalenspunkten är nådd. 5.3.2 Borsyra Uppsamlingskolvens innehåll titreras med standardlösning av saltsyra (3.19) eller med standardlösning av svavelsyra (3.6) med hjälp av en byrett. Den använda mängden titrator avläses. Vid kolorimetrisk bestämning av ekvivalenspunkten nås denna så snart provet börjar skifta färg till rosa. Avläs byretten med 0,05 ml noggrannhet. En upplyst magnetomrörare eller en fotometer kan göra det lättare att påvisa färgomslaget. Detta kan också göras automatiskt med hjälp av en ångdestillationsapparat med automatisk titrering. Följ tillverkarens bruksanvisning för den använda destillationsapparaten eller destillations-/titreringsapparaten. Anmärkning: Om automatisk titrering används, inleds titreringen omedelbart efter det att destillationen har börjat, och 1 % borsyralösning (3.18) används. Med en helautomatisk destillationsenhet kan man också göra en potentiometrisk titrering av ammoniak, där ekvivalenspunkten bestäms genom kontinuerlig pH-mätning. I så fall används en automatisk titreringsapparat med en pH-meter som med hjälp av standardmetoder är noggrant kalibrerad i intervallet pH 4–7. Ekvivalenspunkten nås vid pH 4,6 där titrerkurvan är som brantast (inflexionspunkten). 5.4 Blankprov För att säkerställa att reagensen är fria från kväve utförs ett blankprov (uppslutning, destillation och titrering) med 1 g sackaros (3.14) i stället för provet. 6. Beräkning av resultat Beräkningarna görs enligt 6.1 eller 6.2. 6.1 Beräkning för titrering enligt 5.3.1 Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln där: V 0 = volymen (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) i blankprovet V 1 = volymen (ml) NaOH (3.10 eller 3.11) vid titreringen av provet c = koncentrationen (mol/l) av natriumhydroxid (3.10 eller 3.11) m = provets vikt i gram. 6.2 Beräkning för titrering enligt 5.3.2 6.2.1 Titrering med saltsyra Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln där: m = provets vikt i gram c = koncentrationen (mol/l) av saltsyra i standardlösningen (3.19) V 0 = volymen (ml) saltsyra i blankprovet V 1 = volymen (ml) saltsyra i provet. 6.2.2 Titrering med svavelsyra Råproteinhalten i viktprocent beräknas med formeln där: m = provets vikt i gram c = koncentrationen (mol/l) av svavelsyra i standardlösningen (3.6) V 0 = volymen (ml) svavelsyra (3.6) i blankprovet V 1 = volymen (ml) svavelsyra (3.6) i provet. 7. Verifiering av metoden 7.1 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 0,2 % i absoluta tal för råproteinhalter under 20 %, — 1,0 % av det högre värdet för råproteinhalter på 20–40 %, — 0,4 % i absoluta tal för råproteinhalter över 40 %. 7.2 Noggrannhet Utför analysen (uppslutning, destillation och titrering) på 1,5–2,0 g acetanilid (3.13) i närvaro av 1 g sackaros (3.14). 1 g acetanilid förbrukar 14,80 ml svavelsyra (3.5). Utbytet ska vara minst 99 %. 8. Anmärkningar 8.1 Den använda apparaten kan vara manuell, halvautomatisk eller automatisk. Om apparaten kräver att materialet flyttas mellan uppslutnings- och destillationsstegen måste flyttningen ske utan förlust. Om destillationsapparaturens kolv inte är försedd med en dropptratt ska natriumhydroxiden tillsättas omedelbart innan kolven ansluts till kylaren, varvid vätskan långsamt hälls ned längs kolvens vägg. 8.2 Om det uppslutna materialet tjocknar görs bestämningen om med en större mängd svavelsyra (3.4) än den ovan angivna. 8.3 För produkter med låg kvävehalt kan volymen svavelsyra (3.7) som tillsätts i uppsamlingskolven vid behov minskas till 10–15 ml, varefter vatten fylls på till 25 ml. 8.4 För rutinanalyser kan alternativa metoder för bestämning av råprotein användas, men Kjeldahlmetoden som beskrivs i denna del C är referensmetoden. De resultat som erhålls med den alternativa metoden (t.ex. Dumas) måste för varje matris individuellt visas vara likvärdiga jämfört med referensmetoden. Resultaten kan dock skilja sig något från resultat erhållna med referensmetoden även om likvärdigheten har kontrollerats. Därför måste analysrapporten ange vilken metod som använts för bestämning av råprotein. D. BESTÄMNING AV UREA 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan ureahalten i foder bestämmas. 2. Princip Provet slammas upp i vatten med klarmedel. Suspensionen filtreras. Ureahalten i filtratet bestäms efter tillsats av 4-dimetylaminobensaldehyd (4-DMAB) genom mätning av absorbansen vid våglängden 420 nm. 3. Reagens 3.1 Lösning av 4-dimetylaminobensaldehyd: lös upp 1,6 g 4-DMAB i 100 ml 96 % etanol och tillsätt 10 ml saltsyra (ρ 20 = 1,19 g/ml). Denna reagens håller sig i högst två veckor. 3.2 Carrez-lösning I: lös upp 21,9 g zinkacetat, Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.3 Carrez-lösning II: lös upp 10,6 g kaliumferrocyanid, K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.4 Aktivt kol som inte absorberar urea (ska kontrolleras). 3.5 Urea, 0,1 % lösning (w/v). 4. Utrustning 4.1 Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut. 4.2 Provrör: 160 × 16 mm med slipade glasproppar. 4.3 Spektrofotometer. 5. Utförande 5.1 Analys av provet Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2 g av provet i en 500 ml mätkolv tillsammans med 1 g aktivt kol (3.4). Tillsätt 400 ml vatten och 5 ml Carrez-lösning I (3.2), blanda i ca 30 sekunder och tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (3.3). Blanda i 30 minuter på skakapparaten. Späd med vatten till full volym, skaka om och filtrera. För över 5 ml av de transparenta, färglösa filtraten till provrör med slipade glasproppar, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) och blanda. Ställ provrören i ett vattenbad som håller 20 o C (+/– 4 o C). Mät efter 15 minuter provlösningens absorbans med spektrofotometer vid 420 nm. Jämför med blankprovslösningen av reagensen. 5.2 Kalibreringskurva För över volymer på 1, 2, 4, 5 och 10 ml av urealösningen (3.5) till 100 ml mätkolvar och späd med vatten till full volym. Avlägsna 5 ml från varje lösning, tillsätt 5 ml 4-DMAB-lösning (3.1) till var och en av dem, homogenisera och mät absorbansen enligt ovan jämfört med en kontrollösning som innehåller 5 ml 4-DMAB-lösning och 5 ml ureafritt vatten. Konstruera kalibreringskurvan. 6. Beräkning av resultat Bestäm ureamängden i provet med hjälp av kalibreringskurvan. Uttryck resultatet i procent av provet. 7. Anmärkningar 7.1 Om ureahalten överstiger 3 %, reducera provet till 1 g eller späd den ursprungliga lösningen så att det inte finns mer än 50 mg urea per 500 ml. 7.2 Om ureahalten är låg, öka provmängden så mycket som kan ske med bibehållen transparens och färglöshet hos filtratet. 7.3 Om provet innehåller enkla kväveföreningar som aminosyror ska absorbansen mätas vid 435 nm. E. BESTÄMNING AV FLYKTIGA KVÄVEFÖRENINGAR I. GENOM MIKRODIFFUSION 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i foder. 2. Princip Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs genom mikrodiffusion med kaliumkarbonatlösning, samlas upp i borsyrelösning och titreras med svavelsyra. 3. Reagens 3.1 Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v). 3.2 Indikator: lös 33 mg bromkresolgrönt och 65 mg metylrött i 100 ml etanol 95–96 % (v/v). 3.3 Borsyralösning: lös 10 g borsyra i en 1 000 ml mätkolv med 200 ml etanol 95–96 % (v/v) och 700 ml vatten. Tillsätt 10 ml indikator (3.2). Blanda och justera vid behov lösningens färg till ljusrött genom att tillsätta natriumhydroxidlösning. 1 ml av lösningen fixerar maximalt 300 μg NH 3 . 3.4 Mättad kaliumkarbonatlösning: lös 100 g kaliumkarbonat i 100 ml kokande vatten. Låt svalna och filtrera. 3.5 Svavelsyra, 0,01 mol/l. 4. Utrustning 4.1 Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut. 4.2 Conwayceller av glas eller plast (se diagram). 4.3 Mikrobyretter graderade i 1/100 ml. 5. Utförande Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper. Tillsätt med pipett 1 ml borsyrelösning (3.3) i den inre delen av Conwaycellen och 1 ml av provfiltratet i cellens krona. Täck delvis med det infettade locket. Droppa snabbt 1 ml mättad kaliumkarbonatlösning (3.4) i kronan och tillslut locket lufttätt. Rotera försiktigt cellen i horisontellt läge så att de två reagensen blandas. Inkubera antingen vid rumstemperatur i minst fyra timmar eller vid 40 o C i en timme. Titrera med hjälp av en mikrobyrett (4.3) de flyktiga föreningarna i borsyralösningen med svavelsyra (3.5). Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov. 6. Beräkning av resultat 1 ml 0,01 M H 2 SO 4 motsvarar 0,34 mg ammoniak. Uttryck resultatet i procent av provet. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 10 % av det högre värdet för ammoniakhalter under 1,0 %, — 0,1 % i absoluta tal för ammoniakhalter på 1,0 % eller högre. 7. Anmärkning Om provets ammoniakhalt överstiger 0,6 % ska det ursprungliga filtratet spädas ut. CONWAY CELL Scale 1/1 II. GENOM DESTILLATION 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten flyktiga kväveföreningar, uttryckt som ammoniak, bestämmas i fiskmjöl som är i det närmaste ureafritt. Den kan endast användas vid ammoniakhalter under 0,25 %. 2. Princip Provet extraheras med vatten och lösningen klaras och filtreras. De flyktiga kväveföreningarna avskiljs vid kokpunkten genom tillsats av magnesiumoxid och samlas upp i en bestämd mängd svavelsyra. Överskottet av svavelsyra återtitreras med natriumhydroxidlösning. 3. Reagens 3.1 Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v). 3.2 Magnesiumoxid. 3.3 Skumdämpande emulsion (t.ex. silikon). 3.4 Svavelsyra, 0,05 mol/l. 3.5 Natriumhydoxidlösning, 0,1 mol/l. 3.6 Metylröttlösning, 0,3 %, i 95–96 % (v/v) etanol. 4. Utrustning 4.1 Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut. 4.2 Destillationsapparat av Kjeldahltyp. 5. Utförande Väg upp 10 g av provet med en noggrannhet av 1 mg och överför det tillsammans med 100 ml vatten till en 200 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i 30 minuter. Tillsätt 50 ml triklorättiksyralösning (3.1), späd med vatten till full volym, skaka om kraftigt och filtrera genom ett veckat filtrerpapper. Ta ut klart filtrat i en volym avpassad för den förmodade halten flyktiga kväveföreningar (100 ml brukar vara lämpligt). Späd till 200 ml och tillsätt 2 g magnesiumoxid (3.2) och några droppar skumdämpande emulsion (3.3). Lösningen ska ge basisk reaktion med lackmuspapper; om så inte är fallet tillsätts lite magnesiumoxid (3.2). Fortsätt enligt 5.2 och 5.3 i analysmetoden för bestämning av råproteinhalten (del C i denna bilaga). Utför ett blankprov med samma metod men utan analysprov. 6. Beräkning av resultat 1 ml 0,05 mol/l H 2 SO 4 motsvarar 1,7 mg ammoniak. Uttryck resultatet i procent av provet. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % (relativt värde). F. BESTÄMNING AV AMINOSYROR (UTOM TRYPTOFAN) 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan fria aminosyror (syntetiska och naturliga) och totalhalten aminosyror (peptidbundna och fria) i foder bestämmas med hjälp av en aminosyraanalysator. Den är tillämplig på följande aminosyror: cyst(e)in, metionin, lysin, treonin, alanin, arginin, asparaginsyra, glutaminsyra, glycin, histidin, isoleucin, leucin, fenylalanin, prolin, serin, tyrosin och valin. Metoden skiljer inte mellan aminosyrornas salter och kan inte skilja mellan aminosyrornas D- och L-former. Den är inte användbar för bestämning av tryptofan eller hydroxyanaloger av aminosyror. 2. Princip 2.1 Fria aminosyror De fria aminosyrorna extraheras med utspädd saltsyra. Samextraherade kvävehaltiga makromolekyler fälls ut med sulfosalicylsyra och avlägsnas genom filtrering. Den filtrerade lösningens pH justeras till 2,20. Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm genom reaktion med ninhydrin. 2.2 Totalhalt aminosyror Valet av förfarande beror på vilka aminosyror som ska bestämmas. Cyst(e)in och metionin måste oxideras till cysteinsyra respektive metioninsulfon före hydrolys. Tyrosin måste bestämmas i hydrolysat av ooxiderade prov. Alla övriga aminosyror som räknas upp i punkt 1 kan bestämmas i antingen det oxiderade eller ooxiderade provet. Oxidation utförs vid 0 o C med en blandning av permyrsyra och fenol. Överskott av oxidationsreagens avlägsnas genom tillsats av dinatriumdisulfit. Det oxiderade eller ooxiderade provet hydrolyseras med saltsyra (3.20) i 23 timmar. Hydrolysatet justeras till pH 2,20. Aminosyrorna separeras genom jonbyteskromatografi och bestäms fotometriskt vid 570 nm (440 nm för prolin) genom reaktion med ninhydrin. 3. Reagens Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm). 3.1 Väteperoxid, w = 30 % (w/w). 3.2 Myrsyra, w = 98–100 % (w/w). 3.3 Fenol. 3.4 Dinatriumdisulfit 3.5 Natriumhydroxid. 3.6 5-sulfosalicylsyradihydrat. 3.7 Saltsyra, densitet ca 1,18 g/ml. 3.8 Trinatriumcitratdihydrat. 3.9 2,2'-tiodietanol (tiodiglykol). 3.10 Natriumklorid. 3.11 Ninhydrin. 3.12 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 o C. 3.13 Norleucin eller annan förening lämplig som intern standard. 3.14 Kvävgas (< 10 ppm syrgas). 3.15 1-oktanol. 3.16 Aminosyror. 3.16.1 Referenssubstanser enligt listan i punkt 1. Rena substanser, fria från kristallvatten. Torka i vakuum över P 2 O 5 eller H 2 SO 4 i 1 vecka före användning. 3.16.2 Cysteinsyra. 3.16.3 Metioninsulfon. 3.17 Natriumhydroxidlösning, c = 7,5 mol/l: Lös 300 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter. 3.18 Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l: Lös 40 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter. 3.19 Myrsyra-fenollösning: Blanda 889 g myrsyra (3.2) med 111 g vatten och tillsätt 4,73 g fenol (3.3). 3.20 Hydrolysblandning, c = 6 mol HCl/l innehållande 1 g fenol/l: Tillsätt 1 g fenol (3.3) till 492 ml HCl (3.7) och späd med vatten till 1 liter. 3.21 Extraktionsblandning, c = 0,1 mol HCl/l innehållande 2 % tiodiglykol: Ta 8,2 ml HCl (3.7), späd med ca 900 ml vatten, tillsätt 20 ml tiodiglykol (3.9) och späd med vatten till 1 liter (blanda inte 3.7 och 3.9 direkt). 3.22 5-sulfosalicylsyra, ß = 6 %: Lös 60 g 5-sulfosalicylsyra (3.6) i vatten och späd till 1 liter. 3.23 Oxidationsblandning (permyrsyra-fenol): Blanda 0,5 ml väteperoxid (3.1) med 4,5 ml myrsyra-fenollösning (3.19) i en liten bägare. Inkubera i 20–30 o C i 1 timme för att permyrsyra ska bildas, kyl sedan i isvattenbad (15 min.) före tillsats till provet. Varning: Undvik hudkontakt, använd skyddskläder. 3.24 Citratbuffert, c = 0,2 mol Na + /l, pH 2,20: Lös 19,61 g natriumcitrat (3.8), 5 ml tiodiglykol (3.9), 1 g fenol (3.3) och 16,50 ml HCl (3.7) i ca 800 ml vatten. Justera pH till 2,20. Späd med vatten till 1 liter. 3.25 Elueringsbuffertar som lämpar sig för den analysator som ska användas (4.9). 3.26 Ninhydrinreagens som lämpar sig för den analysator som ska användas (4.9). 3.27 Standardlösningar av aminosyror. Dessa lösningar ska lagras vid en temperatur under 5 o C. 3.27.1 Stamlösningar av aminosyror (3.16.1). c = 2,5 μmol/ml av var och en i saltsyra. Finns att köpa i handeln. 3.27.2 Stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon, c = 1,25 μmol/ml. Lös 0,2115 g cysteinsyra (3.16.2) och 0,2265 g metioninsulfon (3.16.3) i citratbuffert (3.24) i en 1 000 ml mätkolv och späd till märket med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 o C i högst tolv månader. Denna lösning används ej om stamlösningen (3.27.1) innehåller cysteinsyra och metioninsulfon. 3.27.3 Stamlösning av intern standard, t.ex. norleucin, c = 20 μmol/ml. Lös 0,6560 g norleucin (3.13) i citratbuffert (3.24) i en mätkolv och späd till 250 ml med citratbuffert. Kan lagras vid en temperatur under 5 o C i högst 6 månader. 3.27.4 Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater, c = 5 nmol/50 μl för cysteinsyra och metioninsulfon och c = 10 nmol/50 μl för övriga aminosyror. Lös 2,2 g natriumklorid (3.10) i en 100 ml bägare med 30 ml citratbuffert (3.24). Tillsätt 4,00 ml stamlösning av aminosyror (3.27.1), 4,00 ml stamlösning av cysteinsyra och metioninsulfon (3.27.2) och 0,50 ml stamlösning av intern standard (3.27.3) om sådan används. Justera pH till 2,20 med natriumhydroxid (3.18). Överför kvantitativt till en 50 ml mätkolv, späd till märket med citratbuffert (3.24) och blanda. Kan lagras vid en temperatur under 5 o C i högst 3 månader. Se även punkt 9.1. 3.27.5 Kalibreringslösning av standardaminosyror för användning med hydrolysater beredda enligt 5.3.3.1 och för användning med extrakt (5.2). Kalibreringslösningen bereds enligt 3.27.4 men natriumkloriden utelämnas. Kan lagras vid en temperatur under 5 o C i högst 3 månader. 4. Utrustning 4.1 100 eller 250 ml rundkolv med återloppskylare. 4.2 100 ml borosilikatglasflaska med skruvkork försedd med gummi/teflontätning (t.ex. Duran, Schott) för användning i ugn. 4.3 Ugn med fläktventilation och temperaturreglering med noggrannhet bättre än ± 2 o C. 4.4 pH-meter (tre decimalers noggrannhet). 4.5 Membranfilter (0,22 μm). 4.6 Centrifug. 4.7 Rotationsindunstare. 4.8 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare. 4.9 Aminosyraanlysator eller HPLC-utrustning med jonbytarkolonn, anordning för ninhydrin, derivatisering efter kolonnpassagen och fotometrisk detektor. Kolonnen fylls med sulfonerad polystyrenharts som kan separera aminosyrorna från varandra och från andra ninhydrinpositiva material. Flödet i buffert- och ninhydrinledningarna ombesörjs av pumpar vars flödesstabilitet är ± 0,5 % under en period som täcker både standardkalibreringskörningen och analysen av provet. Med vissa aminosyraanalysatorer kan man använda hydrolysmetoder där hydrolysatet har en natriumkoncentration på c = 0,8 mol/l och innehåller all överskottsmyrsyra från oxidationssteget. Andra ger inte en tillfredsställande separation av vissa aminosyror i hydrolysat med ett överskott av myrsyra och/eller hög natriumkoncentration. I detta fall reduceras syravolymen genom indunstning till ca 5 ml efter hydrolysen och före pH-justeringen. Indunstningen ska utföras i vakuum vid högst 40 o C. 5. Utförande 5.1 Provberedning Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 o C eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.12) före malningen. 5.2 Bestämning av fria aminosyror i foder och förblandningar Väg med 0,2 mg noggrannhet upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv och tillsätt 100,0 ml av extraktionsblandningen (3.21). Blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.8). Låt sedimentera och pipettera över 10,0 ml av supernatanten till en 100 ml bägare. Tillsätt 5,0 ml sulfosalicylsyralösning (3.22) under omrörning och fortsätt röra om med hjälp av en magnetomrörare i fem minuter. Filtrera eller centrifugera supernatanten för att avlägsna eventuella fällningar. Överför 10,0 ml av den kvarvarande lösningen till en 100 ml bägare och justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18), överför till en mätkolv av lämplig volym med citratbuffert (3.24) och späd till märket med buffertlösningen (3.24). Om en intern standard används, tillsätt 1,00 ml av denna (3.27.3) för varje 100 ml färdig lösning och späd till märket med buffertlösningen (3.24). Gå vidare till kromatografin enligt 5.4. Om extrakten inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 o C. 5.3 Bestämning av totalhalt aminosyror. 5.3.1 Oxidation Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1–1 g av det beredda provet (5.1) i — en 100 ml rundkolv (4.1) för öppen hydrolys (5.3.2.3) eller, — en 250 ml rundkolv (4.1) om en låg natriumkoncentration är nödvändig (5.3.3.1) eller, — en 100 ml flaska med skruvkork (4.2) för sluten hydrolys (5.3.2.4). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve, och vattenhalten får inte överstiga 100 mg. Ställ kolven/flaskan i ett isvattenbad och kyl till 0 o C, tillsätt 5 ml oxidationsblandning (3.23) och blanda med hjälp av en glasspatel med böjd spets. Tillslut kolven/flaskan innehållande spateln med en lufttät folie, ställ isvattenbadet innehållande den tillslutna behållaren i ett kylskåp vid 0 o C och låt stå i 16 timmar. Avlägsna provet ur kylskåpet efter 16 timmar och avlägsna överskottet av oxidationsreagens genom tillsats av 0,84 g dinatriumdisulfit (3.4). Fortsätt till 5.3.2.1. 5.3.2 Hydrolys 5.3.2.1 Hydrolys av oxiderade prov Tillsätt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) till det oxiderade prov som beretts enligt 5.3.1. Skölj ned eventuella provrester som fastnat på kärlets sidor och på spateln. Fortsätt enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4, beroende på vilken hydrolysmetod som används. 5.3.2.2 Hydrolys av ooxiderade prov Väg med 0,2 mg noggrannhet upp 0,1–1 g av det beredda provet (5.1) i antingen en 100 ml eller 250 ml rundkolv (4.1) eller en 100 ml flaska med skruvkork (4.2). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt försiktigt 25 ml av hydrolysblandningen (3.20) och blanda med provet. Fortsätt enligt antingen 5.3.2.3 eller 5.3.2.4. 5.3.2.3 Öppen hydrolys Tillsätt tre glaspärlor till blandningen i kolven (beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2) och återloppskoka i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, skölj kylaren med 5 ml citratbuffert (3.24). Koppla bort kolven och kyl den i ett isvattenbad. Fortsätt enligt 5.3.3. 5.3.2.4 Sluten hydrolys Sätt in flaskan med blandningen, beredd enligt 5.3.2.1 eller 5.3.2.2, i en ugn (4.3) vid 110 o C. För att förhindra tryckökning (på grund av gasutveckling) och explosion bör skruvkorken sättas löst på flaskan under den första timmen. Tillslut inte flaskan med skruvkorken. Efter 1 timme dras skruvkorken åt och flaskan med får stå i ugnen (4.3) i 23 timmar. Efter fullbordad hydrolys, ta ut flaskan ur ugnen, öppna försiktigt skruvkorken och ställ flaskan i ett isvattenbad. Låt svalna. Beroende på metod för pH-justering (5.3.3), överför flaskans innehåll kvantitativt till en 250 ml bägare eller till en 250 ml rundkolv med citratbuffert (3.24). Fortsätt enligt 5.3.3. 5.3.3 Justering av pH Beroende på aminosyraanalysatorns (4.9) natriumtolerans, fortsätt enligt 5.3.3.1 eller 5.3.3.2 för pH-justeringen. 5.3.3.1 Kromatografiska system (4.9) som kräver en låg natriumkoncentration Det är tillrådligt att använda en stamlösning av intern standard (3.27.3) om aminosyraanalysatorn kräver en låg natriumkoncentration (om syravolymen måste reduceras). Tillsätt i detta fall 2,00 ml stamlösning av intern standard (3.27.3) till hydrolysatet före indunstningen. Tillsätt 2 droppar 1-oktanol (3.15) till det hydrolysat som erhållits enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4. Låt provet indunsta i rotationsindunstare (4.7) till 5–10 ml i vakuum vid 40 o C. Om volymen av någon anledning reduceras till mindre än 5 ml måste hydrolysatet kastas och analysen göras om. Justera pH till 2,20 med natriumhydroxidlösning (3.18) och fortsätt till 5.3.4. 5.3.3.2 Alla övriga aminosyraanalysatorer (4.9) Ta det hydrolysat som erhölls enligt 5.3.2.3 eller 5.3.2.4 och neutralisera det delvis genom att försiktigt och under omrörning tillsätta 17 ml natriumhydroxidlösning (3.17), och se till att temperaturen hålls under 40 o C. Justera pH till 2,20 vid rumstemperatur med natriumhydroxidlösning (först 3.17 och sedan 3.18). Fortsätt till 5.3.4. 5.3.4 Provlösning för kromatografi Överför kvantitativt det pH-justerade hydrolysatet (5.3.3.1 eller 5.3.3.2) med citratbuffert (3.24) till en 200 ml mätkolv och späd till märket med buffert (3.24). Om en intern standard inte redan använts, tillsätt 2,00 ml av denna (3.27.3) och späd till märket med citratbuffert (3.24). Blanda omsorgsfullt. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4. Om provlösningarna inte kromatograferas samma dag måste de förvaras vid en temperatur under 5 o C. 5.4 Kromatografi Före kromatografin, låt extraktet (5.2) eller hydrolysatet (5.3.4) anta rumstemperatur. Skaka blandningen och filtrera en lämplig mängd genom ett 0,22 μm membranfilter (4.5). Den klara lösning som erhålls får genomgå jonbyteskromatografi i en aminosyraanalysator (4.9). Injektionen kan utföras antingen manuellt eller automatiskt. Det är viktigt att samma mängd lösning ± 0,5 % alltid tillsätts kolonnen för analys av standardlösning och prov, utom när en intern standard används, och att kvoten natrium/aminosyra i standard- och provlösning är så lika som möjligt. Hur ofta kalibreringsprov behöver köras beror i allmänhet på ninhydrinreagensens stabilitet och typen av analyssystem. Standarden eller provet späds med citratbuffert (3.24) för att ge en topparea för standarden på 30–200 % av provets aminosyratopparea. Kromatografin av aminosyror varierar något beroende på typen av analysator och harts. Det valda systemet måste kunna separera aminosyrorna från varandra och från ninhydrinpositiva material. Kromatografisystemet bör i driftsområdet ge en linjär respons på förändringar i de aminsyramängder som tillförs kolonnen. Under kromatografisteget gäller de botten/toppkvoter som anges nedan när en ekvimolär lösning (av de aminosyror som mäts) analyseras. Denna ekvimolära lösning måste innehålla minst 30 % av den maximala mängd av varje aminosyra som med noggrannhet kan bestämmas med analyssystemet (4.9). För separering av treonin-serin bör botten/toppkvoten för den lägre av de två överlappande aminosyrorna på kromatogrammet inte överstiga 2:10. (Om endast cyst(e)in, metionin, treonin och lysin bestäms kommer otillräcklig separation från angränsande toppar att påverka bestämningen). För alla andra aminosyror måste separationen vara bättre än 1:10. Systemet måste kunna separera lysin från ”lysinartefakter” och ornitin. 6. Beräkning av resultat Arean för provets och standardens toppar mäts för varje enskild aminosyra, och mängden (X) i gram aminosyra per kg prov beräknas med formeln Om intern standard används, multiplicera med A = topparea, hydrolysat eller extrakt B = topparea, kalibreringsstandardlösning C = topparea, intern standard i hydrolysat eller extrakt D = topparea, intern standard, kalibreringsstandardlösning M = molvikt för den aminosyra som bestäms c = standardlösningens koncentration i μmol/ml m = provets vikt (g) (korrigerad till ursprungsvikten om provet torkats eller avfettats) V = ml totalt hydrolysat (5.3.4) eller ml beräknad total spädningsvolym för extraktet (6.1). Cystin och cystein bestäms båda som cysteinsyra i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som cystin (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 , molvikt 240,30 g/mol) med hjälp av molvikten 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Metionin bestäms som metioninsulfon i hydrolysat av oxiderat prov, men beräknas som metionin med hjälp av molvikten för metionin: 149,21 g/mol. Tillsatt fritt metionin bestäms efter extraktion som metionin, för beräkningen används samma molvikt. 6.1. Den totala spädningsvolymen för extrakten (F) för bestämning av fria aminosyror (5.2) beräknas med formeln V = Det färdiga extraktets volym 7. Utvärderingen av metoden Metoden testades i en internationell provningsjämförelse 1990 med fyra olika fodertyper (blandat grisfoder, foderblandning för slaktkycklingar, proteinkoncentrat, förblandning). Resultaten, efter eliminering av extremvärden, i form av medelvärden och standardavvikelser redovisas i nedanstående tabeller. Medelvärden i g/kg Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Proteinkoncentrat 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Förblandning 58,42 n= 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier. 7.1 Repeterbarhet Repeterbarheten uttryckt som ”standardavvikelse inom laboratoriet” i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell. Standardavvikelse inom laboratoriet (S r ) i g/kg Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Proteinkoncentrat 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Förblandning 1,30 n= 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier. Variationskoefficient ( %) för standardavvikelse inom laboratoriet (S r ) Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Proteinkoncentrat 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Förblandning 2,2 n= 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier. 7.2 Reproducerbarhet Standardavvikelsen mellan laboratorier i ovannämnda provningsjämförelse redovisas i nedanstående tabell. Standardavvikelse mellan laboratorier (S R ) i g/kg Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Proteinkoncentrat 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Förblandning 2,49 n= 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier. Variationskoefficient ( %) för standardavvikelse mellan laboratorier (S R ) Referensmaterial Aminosyra Treonin Cyst(e)in Metionin Lysin Grisfoder 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Foderblandning för slaktkycklingar 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Proteinkoncentrat 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Förblandning 4,3 n= 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = Antal deltagande laboratorier. 8. Användning av referensmaterial Korrekt tillämpning av metoden ska verifieras genom analys av certifierade referensmaterial om sådana finns tillgängliga. Kalibrering med godkända kalibreringslösningar för aminosyror rekommenderas. 9. Anmärkningar 9.1 På grund av skillnaderna mellan aminosyraanalysatorer bör de slutliga koncentrationerna hos kalibreringslösningarna för standardaminosyror (se 3.27.4 och 3.27.5) och hos hydrolysatet (se 5.3.4) användas som riktlinje. Det intervall där sambandet mellan det verkliga värdet och det med apparaten uppmätta värdet är linjärt, måste kontrolleras för alla aminosyror. Standardlösningen späds med citratbuffert så att man får toppar i mitten av intervallet. 9.2 I de fall HPLC används för att analysera hydrolysater måste försöksbetingelserna optimeras i enlighet med tillverkarens rekommendationer. 9.3 Om denna metod tillämpas på foder som innehåller mer än 1 % klorid (kraftfoder, mineralfoder eller tillskottsfoder) kan den uppmätta halten av metionin bli för låg. För att undvika detta måste provet behandlas på särskilt sätt. G. BESTÄMNING AV TRYPTOFAN 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan totalhalten tryptofan och halten fritt tryptofan bestämmas i foder. Ingen åtskillnad görs mellan D- och L-formerna. 2. Princip För bestämning av totalhalten tryptofan hydrolyseras provet i alkalisk miljö med mättad bariumhydroxidlösning och upphettas till 110 o C i 20 timmar. Efter hydrolysen tillsätts en intern standard. För bestämning av halten fritt tryptofan extraheras provet i lätt sur miljö i närvaro av den interna standarden. Halten av tryptofan och intern standard i hydrolysatet eller extraktet bestäms med HPLC med fluorescensdetektion. 3. Reagens 3.1 Dubbeldestillerat vatten eller vatten av likvärdig kvalitet ska användas (konduktivitet < 10 μS/cm). 3.2 Referenssubstans: tryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat under vakuum över fosforpentoxid. 3.3 Intern standard: α-metyltryptofan (renhet/halt ≥ 99 %) torkat under vakuum över fosforpentoxid. 3.4 Bariumhydroxidoktahydrat (undvik att exponera Ba(OH) 2 ·8 H 2 O för större mängder luft, eftersom det då kan bildas BaCO 3 som stör bestämningen) (jfr punkt 9.3). 3.5 Natriumhydroxid. 3.6 Ortofosforsyra, w = 85 % (w/w). 3.7 Saltsyra, ρ 20 = 1,19 g/ml. 3.8 Metanol, HPLC-kvalitet. 3.9 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 o C. 3.10 Natriumhydroxidlösning, c = 1 mol/l: Lös 40,0 g NaOH (3.5) i vatten och späd till 1 liter med vatten (3.1). 3.11 Saltsyra, c = 6 mol/l: Späd 492 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter. 3.12 Saltsyra, c = 1 mol/l: Späd 82 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter. 3.13 Saltsyra, c = 0,1 mol/l: Späd 8,2 ml HCl (3.7) med vatten till slutvolymen 1 liter. 3.14 Ortofosforsyra, c = 0,5 mol/l: Späd 34 ml ortofosforsyra (3.6) med vatten (3.1) till slutvolymen 1 liter. 3.15 Koncentrerad tryptofanlösning (3.2), c = 2,50 μmol/ml: Lös 0,2553 g tryptofan (3.2) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 o C i högst 4 veckor. 3.16 Koncentrerad lösning av intern standard, c = 2,50 μmol/ml: Lös 0,2728 g α-metyltryptofan (3.3) i saltsyra (3.13) i en 500 ml mätkolv och späd till märket med saltsyra (3.13). Lösningen kan lagras vid - 18 o C i högst 4 veckor. 3.17 Standardkalibreringslösning av tryptofan och intern standard: Tag 2,00 ml koncentrerad tryptofanlösning (3.15) och 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Späd med vatten (3.1) och metanol (3.8) till ungefär samma volym och metanolkoncentration (10–30 %) som det färdiga hydrolysatet. Denna lösning ska vara nyberedd. Den ska skyddas från direkt solljus under beredningen. 3.18 Ättiksyra. 3.19 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol. 3.20 Etanolamin, w > 98 % (w/w). 3.21 Lösning av 1 gram 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i 100 ml metanol (3.8). 3.22 Mobil fas för HPLC: 3,00 g ättiksyra (3.18) + 900 ml vatten (3.1) + 50,0 ml lösning (3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i metanol (3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (3.1). 4. Utrustning 4.1 HPLC-utrustning med en spektrofluorometrisk detektor. 4.2 HPLC-kolonn, 125 × 4 mm, C 18 , 3 μm packning, eller motsvarande. 4.3 pH-meter. 4.4 Polypropylenflaska, 125 ml, med vid hals och skruvkork. 4.5 Membranfilter, 0,45 μm. 4.6 Autoklav, 110 (± 2) o C, 1,4 (±0,1) bar. 4.7 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare. 4.8 Vortexblandare. 5. Utförande 5.1 Provberedning Provet mals så att det kan passera genom en 0,5 mm sikt. Prov med hög vattenhalt ska antingen lufttorkas vid en temperatur på högst 50 o C eller frystorkas före malningen. Prov med hög fetthalt ska extraheras med petroleumeter (3.9) före malning. 5.2 Bestämning av fritt tryptofan (extrakt) Väg med en noggrannhet av 1 mg upp en lämplig mängd (1–5 g) av det beredda provet (5.1) i en E-kolv. Tillsätt 100,0 ml saltsyra (3.13) och 5,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (3.16). Skaka eller blanda i 60 minuter med en mekanisk skakapparat eller magnetomrörare (4.7). Låt sedimentera och pipettera sedan över 10,0 ml av supernatanten till en bägare. Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Justera pH till 3 med natriumhydroxid (3.10). Tillsätt så mycket metanol (3.8) att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (ungefär samma volym som standardkalibreringslösningen [3.17]). Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4. Skydda standardlösning och extrakt från direkt solljus. Om extrakten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 o C i högst 3 dagar. 5.3 Bestämning av totalhalt tryptofan (hydrolysat) Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 0,1–1 g av det beredda provet (5.1) i en polypropylenflaska (4.4). Det invägda provet ska innehålla ca 10 mg kväve. Tillsätt 8,4 g bariumhydroxidoktahydrat (3.4) och 10 ml vatten. Blanda på en vortexblandare (4.8) eller med magnetomrörare (4.7). Lämna kvar den teflonbelagda magneten i blandningen. Skölj kärlets väggar med 4 ml vatten. Sätt på skruvkorken och skruva åt den löst. Sätt kärlet i en autoklav (4.6) med kokande vatten och låt ånga i 30–60 minuter. Stäng autoklaven och autoklavera vid 110 (± 2) o C i 20 timmar. Sänk temperaturen till strax under 100 o C innan autoklaven öppnas. Tillsätt 30 ml rumstempererat vatten till den varma blandningen för att undvika kristallisering av Ba(OH) 2 ·8 H 2 O. Skaka eller rör försiktigt. Tillsätt 2,00 ml koncentrerad lösning av intern standard (α-metyltryptofan) (3.16). Kyl kärlet i isvattenbad i 15 minuter. Tillsätt 5 ml ortofosforsyra (3.14). Låt kärlet vara kvar i kylbadet och neutralisera lösningen med saltsyra (3.11) under omrörning. Justera pH till 3,0 med saltsyra (3.12). Tillsätt så mycket metanol att koncentrationen blir 10–30 % i slutvolymen. Överför till en mätkolv av lämplig volym och späd med vatten till den volym som behövs för kromatografi (t.ex. 100 ml). Tillsatsen av metanol bör göras utan att någon fällning bildas. Filtrera några ml av lösningen genom ett 0,45 μm membranfilter (4.5) före injektion i HPLC-kolonnen. Gå vidare till kromatografin enligt 5.4. Skydda standardlösning och hydrolysat mot direkt solljus. Om hydrolysaten inte kan analyseras samma dag kan de lagras vid 5 o C i högst tre dagar. 5.4 HPLC-bestämning Följande betingelser för isokratisk eluering anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat (se även 9.1 och 9.2). HPLC kolonn (4.2): 125 × 4 mm, C 18 , 3 μm packning eller motsvarande Kolonntemperatur: Rumstemperatur Mobil fas (3.22): 3,00 g ättiksyra (3.18) + 900 ml vatten (3.1) + 50,0 ml lösning (3.21) av 1,1,1-triklor-2-metyl-2-propanol (3.19) i metanol (3.8) (1 g/100 ml). Justera pH till 5,00 med etanolamin (3.20). Späd till 1 000 ml med vatten (3.1) Flödeshastighet: 1 ml/min Total körningstid: ca 34 minuter Detektionsvåglängd: excitation: 280 nm, emission: 356 nm. Injektionsvolym: 20 μl 6. Beräkning av resultat Mängden tryptofan (X) i gram per 100 g prov beräknas med formeln A = topparea för intern standard, kalibreringsstandardlösning (3.17) B = topparea för tryptofan, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3) V 1 = volym i ml (2 ml) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17) c = koncentration i μmol/ml (= 2,50) av koncentrerad tryptofanlösning (3.15) som satts till kalibreringslösningen (3.17) V 2 = volym i ml av koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till vid extraktionen (5.2) (= 5,00 ml) eller till hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml) C = topparea för intern standard, extrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3) D = topparea för tryptofan, kalibreringsstandardlösning (3.17) V 3 = volym i ml (2,00 ml) av koncentrerad lösning av intern standard (3.16) som satts till kalibreringsstandardlösningen (3.17) m = provets vikt i gram (korrigerad till den ursprungliga vikten om provet har torkats och/eller avfettats) M = molvikt för tryptofan (= 204,23 g/mol). 7. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse inom EU (fjärde jämförelsen) analyserades tre prov av upp till tolv laboratorier för att hydrolysmetoden skulle kunna certifieras. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Prov 1 Grisfoder Prov 2 Grisfoder med tillsats av L-tryptofan Prov 3 Kraftfoder för grisar L 12 12 12 n 50 55 50 Medelvärde [g/kg] 2,42 3,40 4,22 s r [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CV r [ %] 1,9 1,6 1,9 S R [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CV R [ %] 6,3 6,0 2,2 L = antal laboratorier som lämnade in resultat n = antal återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest) s r = standardavvikelse för repeterbarhet S R = standardavvikelse för reproducerbarhet r = repeterbarhet R = reproducerbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet, % CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet, % I en annan provningsjämförelse inom EU (tredje jämförelsen) analyserades två prov av upp till tretton laboratorier för certifiering av extraktionsmetoden för fritt tryptofan. Varje prov analyserades fem gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Prov 4 Vete- och sojablandning Prov 5 Vete- och sojablandning (= prov 4) med tillsats av tryptofan (0,457g/kg) L 12 12 n 55 60 Medelvärde [g/kg] 0,391 0,931 s r [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CV r [ %] 1,34 1,34 S R [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CV R [ %] 4,71 5,11 L = antal laboratorier som lämnade in resultat n = antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest) s r = standardavvikelse för repeterbarhet S R = standardavvikelse för reproducerbarhet r = repeterbarhet R = reproducerbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet, % CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet, % I ytterligare en provningsjämförelse inom EU analyserades fyra prov av upp till sju laboratorier för certifiering av metoden för tryptofanhydrolys. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Varje prov analyserades fem gånger. Prov 1 Blandat grisfoder (CRM 117) Prov 2 Fiskmjöl med låg fetthalt (CRM 118) Prov 3 Sojamjöl (CRM 119) Prov 4 Skummjölkspulver (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Medelvärde [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 s r [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CV r [ %] 1,04 1,15 1,30 0,76 S R [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CV R [ %] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = antal laboratorier som lämnade in resultat n = antalet återstående enskilda resultat efter eliminering av extremvärden (enligt Cochran-Dixons extremvärdestest) s r = standardavvikelse för repeterbarhet S R = standardavvikelse för reproducerbarhet r = repeterbarhet R = reproducerbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet, % CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet, % 9. Anmärkningar 9.1 För att få bättre separation mellan tryptofan och α-metyltryptofan kan man prova att använda följande kromatografiska parametrar: Isokratisk eluering följt av gradientkolonnrening: HPLC-kolonn: 125 × 4 mm, C 18 , 5 μm packning eller motsvarande Kolonntemperatur: 32 o C Mobil fas: A: 0,01 mol/l KH 2 PO 4 /metanol, 95+5 (v+v) B: metanol Gradientprogram: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Flödeshastighet: 1,2 ml/min Total körningstid: ca 33 min 9.2 Kromatografin varierar beroende på typen av HPLC och vilket slags packning som används i kolonnen. Det valda systemet måste klara av att ge baslinjeseparation mellan tryptofan och intern standard. Det är också viktigt att nedbrytningsprodukter tydligt kan separeras från tryptofan och intern standard. Man bör köra hydrolysat utan intern standard för att kunna upptäcka eventuella orenheter på baslinjen under den interna standarden. Det är viktigt att körningstiden är så lång att alla nedbrytningsprodukter hinner elueras ut, annars kan sena elueringstoppar störa efterföljande körningar. Kromatografisystemet måste ge linjär respons i driftsintervallet. Den linjära responsen ska mätas med en konstant koncentration (den normala) av intern standard och varierande koncentrationer av tryptofan. Det är viktigt att topparna för både tryptofan och intern standard ligger inom det linjära intervallet för HPLC-/fluorescenssystemet. Om topparna för tryptofan och/eller intern standard är för låga eller för höga bör bestämningen göras om med annan provstorlek och/eller slutvolym. 9.3 Bariumhydroxid Bariumhydroxid blir mer svårlösligt när det åldras. Detta ger en grumlig lösning för HPLC-bestämning, vilket kan ge alltför låga värden för tryptofan. H. BESTÄMNING AV RÅFETT 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan råfetthalten i foder bestämmas. Metoden omfattar inte analys av oljeväxtfrön och oljehaltiga frukter. Beroende på fodrets egenskaper och sammansättning samt bestämningens syfte används en av nedanstående två metoder. 1.1 Metod A – direkt extraherbart råfett Denna metod är tillämplig på foderråvaror av vegetabiliskt ursprung, utom dem som omfattas av metod B. 1.2 Metod B – total råfetthalt Denna metod är tillämplig på foderråvaror av animaliskt ursprung och på alla foderblandningar. Den ska användas för alla råvaror från vilka fett inte kan extraheras helt utan föregående hydrolys, till exempel gluten, jäst, potatisprotein och produkter som genomgår processer såsom extrudering, bearbetning till flingor samt uppvärmning. 1.3 Tolkning av resultaten I samtliga fall där ett högre resultat fås genom metod B än metod A, ska resultatet av metod B räknas som det sanna värdet. 2. Princip 2.1 Metod A Provet extraheras med petroleumeter. Lösningsmedlet destilleras av och återstoden torkas och vägs. 2.2 Metod B Provet behandlas under uppvärmning med saltsyra. Blandningen kyls och filtreras. Återstoden sköljs och torkas och bestäms enligt metod A. 3. Reagens 3.1 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 o C. Bromtalet måste vara lägre än 1 och återstoden efter förångning mindre än 2 mg/100 ml. 3.2 Vattenfritt natriumsulfat. 3.3 Saltsyra, c = 3 mol/l. 3.4 Filtreringshjälpmedel, till exempel kiselgur, Hyflo-supercel. 4. Utrustning 4.1 Extraktionsutrustning. Om denna är försedd med hävert (Soxhletapparat), ska förångningstakten vara sådan att ca tio kretslopp sker per timme. Om hävert saknas ska förångningstakten vara ca 10 ml per minut. 4.2 Extraktionshylsorna måste vara fria från ämnen som är lösliga i petroleumeter och ha en porositet som överensstämmer med kraven i 4.1. 4.3 Torkugn, antingen en vakuumtorkugn inställd på 75 ± 3 o C eller en varmluftsugn inställd på 100 ± 3 o C. 5. Utförande 5.1 Metod A (se punkt 8.1) Väg 5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg, överför det till en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss. Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och extrahera i sex timmar med petroleumeter (3.1). Samla upp petroleumeterextraktet i en torr, vägd kolv med pimpstensskärvor ( 2 ) . Destillera av lösningsmedlet. Torka återstoden i 1,5 timmar i torkugnen (4.3). Kyl i en exsickator och väg. Torka igen i 30 minuter för att säkerställa att fettets vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg). 5.2 Metod B Väg upp 2,5 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg (se punkt 8.2) i en 400 ml bägare eller en 300 ml E-kolv. Tillsätt 100 ml saltsyra (3.3) och pimpstensskärvor. Täck över bägaren med ett urglas eller koppla E-kolven till en återloppskylare. Låt blandningen koka sakta i 1 timme över en svag låga eller värmeplatta. Låt inte produkten fastna på behållarens insida. Kyl och tillsätt så mycket filtreringshjälpmedel (3.4) att inget fett förloras under filtreringen. Filtrera genom ett fuktat, fettfritt, dubbelt filtrerpapper. Skölj återstoden i kallt vatten tills ett neutralt filtrat erhålls. Kontrollera att filtratet inte innehåller något fett. Om så ändå är fallet ska provet extraheras med petroleumeter, enligt metod A, före hydrolys. Lägg det dubbla filtrerpappret med återstoden på ett urglas och torka i 1,5 timmar i varmluftsugnen (4.3) vid 100 ± 3 o C. Placera det dubbla filtrerpappret med den torra återstoden i en extraktionshylsa (4.2) och täck med en fettfri bomullstuss. Placera hylsan i en extraktionsapparat (4.1) och följ anvisningarna i punkt 5.1 andra och tredje styckena. 6. Resultatangivelse Återstodens vikt uttrycks i procent av provet. 7. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överstiga — 0,2 % i absoluta tal för råfetthalter under 5 %, — 4,0 % av det högre värdet för halter på 5–10 %, — 0,4 % i absoluta tal för halter över 10 %. 8. Anmärkningar 8.1 För produkter med hög fetthalt, som är svåra att krossa eller från vilka det är svårt att få fram ett homogent reducerat prov, används följande förfarande. Väg upp 20 gram av provet med en noggrannhet av 1 mg och blanda med minst 10 gram vattenfritt natriumsulfat (3.2). Extrahera med petroleumeter (3.1) enligt punkt 5.1. Späd extraktet med petroleumeter (3.1) till 500 ml och blanda. Överför 50 ml av lösningen till en liten, torr, vägd kolv som innehåller pimpstensskärvor. Destillera bort lösningsmedlet, torka och följ anvisningarna i punkt 5.1 sista stycket. Avlägsna lösningsmedlet från extraktionsåterstoden i hylsan, krossa återstoden till 1 mm partikelstorlek, återför till extraktionshylsan (tillsätt inte natriumsulfat) och följ anvisningarna i punkt 5.1 andra och tredje styckena. Provets fetthalt i procent beräknas med formeln (10m 1 + m 2 ) × 5 där: m 1 = återstodens vikt i gram efter första extraktionen (den alikvot av extraktet som används för analys) m 2 = återstodens vikt i gram efter andra extraktionen. 8.2 För produkter med låg fetthalt kan provmängden ökas till 5 gram. 8.3 Sällskapsdjursfoder med hög vattenhalt kan behöva blandas med vattenfritt natriumsulfat före hydrolys och extraktion enligt metod B. 8.4 I punkt 5.2 kan det vara effektivare att använda varmt vatten i stället för kallt vatten för att tvätta återstoden efter filtrering. 8.5 Torktiden på 1,5 timmar kan behöva förlängas för vissa foder. För lång torktid bör undvikas eftersom detta kan leda till låga resultat. En mikrovågsugn kan också användas. 8.6 Förextraktion enligt metod A före hydrolys och upprepad extraktion enligt metod B rekommenderas om råfetthalten är högre än 15 %. Detta beror delvis på fodrets egenskaper och på typen av fett i fodret. I. BESTÄMNING AV VÄXTTRÅD 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod är det möjligt att bestämma foders halt av fettfria organiska ämnen som är olösliga i sur och basisk miljö och som vanligen betecknas växttråd. 2. Princip Provet, som vid behov avfettas, behandlas i tur och ordning med kokande lösningar av svavelsyra och kaliumhydroxid i bestämda koncentrationer. Återstoden separeras genom filtrering på ett sintrat glasfilter och sköljs, torkas, vägs och föraskas vid en temperatur på 475–500 o C. Viktförlusten efter föraskning motsvarar andelen växttråd i analysprovet. 3. Reagens 3.1 Svavelsyra, c = 0,13 mol/l. 3.2 Skumdämpningsmedel (t.ex. n-oktanol). 3.3 Filtreringshjälpmedel (Celite 545 eller motsvarande), upphettat till 500 o C i fyra timmar (8.6). 3.4 Aceton. 3.5 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 o C. 3.6 Saltsyra, c = 0,5 mol/l. 3.7 Kaliumhydroxidlösning, c = 0,23 mol/l. 4. Utrustning 4.1 Värmeenhet för uppslutning med svavelsyra och kaliumhydroxidlösning, försedd med en hållare för filterdegeln (4.2) och ett utloppsrör med kran för avtappning av vätska samt anslutning för vakuum och eventuellt tryckluft. Innan enheten tas i bruk varje dag ska den förvärmas med kokande vatten i 5 minuter. 4.2 Glasfilterdegel med insmält filterskiva av sintrat glas, porstorlek 40–90 μm. Innan degeln används första gången, värm den till 500 o C i några minuter och låt den svalna (8.6). 4.3 Cylinder på minst 270 ml med återloppskylare, lämplig för kokning. 4.4 Torkugn med termostat. 4.5 Muffelugn med termostat. 4.6 Extraktionsenhet bestående av en stödplatta för filterdegeln (4.2) och med ett utloppsrör med kran för utsläpp av vakuum och vätska. 4.7 Kopplingsringar för ihopmontering av värmeenheten (4.1), filterdegeln (4.2) och cylindern (4.3) och för anslutning av extraktionsenheten (4.6) och filterdegeln. 5. Utförande Väg med 1 mg noggrannhet upp 1 g av det beredda provet i filterdegeln (4.2), (jfr punkterna 8.1, 8.2 och 8.3) och tillsätt 1 g filtreringshjälpmedel (3.3). Montera ihop värmeenheten (4.1) och filterdegeln (4.2) och anslut sedan cylindern (4.3) till filterdegeln. Häll 150 ml kokande svavelsyra (3.1) i cylinder/degeluppställningen och tillsätt vid behov några droppar skumdämpningsmedel (3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter. Öppna kranen till utloppsröret (4.1) och vakuumfiltrera svavelsyran genom filterdegeln. Tvätta återstoden tre gånger med 30 ml kokande vatten per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning. Stäng utloppskranen och häll 150 ml kokande kaliumhydroxidlösning (3.7) i cylinder/degeluppställningen. Tillsätt några droppar skumdämpningsmedel (3.2). Koka upp vätskan inom 5 ± 2 minuter och låt koka kraftigt i exakt 30 minuter. Filtrera och tvätta på samma sätt som vid behandlingen med svavelsyra. Efter den sista tvättningen och torkningen kopplas degeln med innehåll loss och ansluts till extraktionsenheten (4.6). Anslut vakuum, tvätta återstoden i degeln tre gånger med 25 ml aceton (3.4) per gång och se till att återstoden vakuumfiltreras torr efter varje tvättning. Torka degeln till konstant vikt i ugnen vid 130 o C. Låt den svalna i exsickator efter varje torkning och väg snabbt. Sätt in degeln i en muffelugn och föraska till konstant vikt (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 2 mg) vid 475–500 o C i minst 30 minuter. Efter varje upphettning ska degeln först svalna i ugnen och sedan i exsickatorn innan den vägs. Gör ett blankprov utan provet. Viktförlusten till följd av föraskningen får inte överstiga 4 mg. 6. Beräkning av resultat Provets växttrådhalt i procent beräknas med formeln där: m = provets vikt i gram m 0 = viktförlust efter föraskning vid bestämningen, i gram m 1 = viktförlust efter föraskning vid blankprovet, i gram. 7. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 0,6 % i absoluta tal om växttrådhalten är mindre än 10 %, — 6 % av det högre värdet om växttrådhalten uppgår till 10 % eller mer. 8. Anmärkningar 8.1 Foder som innehåller mer än 10 % råfett ska före analys avfettas med petroleumeter (3.5). Anslut filterdegeln (4.2) med innehåll till extraktionsenheten (4.6), anslut vakuum, tvätta återstoden tre gånger med 30 ml petroleumeter och se till att återstoden vakuumfiltreras torr. Anslut degeln med innehåll till värmeenheten (4.1) och fortsätt enligt beskrivningen i punkt 5. 8.2 Foder som innehåller fetter som inte kan extraheras direkt med petroleumeter (3.5) ska avfettas enligt beskrivningen i 8.1 och därefter avfettas ännu en gång efter kokning med syra. Efter kokning med syra och därpå följande tvättning ansluts degeln med innehåll till extraktionsenheten (4.6) och tvättas tre gånger med 30 ml aceton per gång och därefter ytterligare tre gånger med 30 ml petroleumeter per gång. Vakuumfiltrera torrt och fortsätt analysen från och med kaliumhydroxidbehandlingen enligt punkt 5. 8.3 Om fodret innehåller mer än 5 % karbonat, uttryckt som kalciumkarbonat, ansluts degeln (4.2) med det uppvägda provet till värmeenheten (4.1). Tvätta provet tre gånger med 30 ml saltsyra (3.6) per gång. Låt provet stå ca en minut efter varje tillsats innan det filtreras. Tvätta en gång med 30 ml vatten och fortsätt sedan enligt beskrivningen i 5. 8.4 Om den utrustning som används utgörs av ett stativ (flera deglar anslutna till samma värmeenhet) får två enskilda bestämningar av samma analysprov inte ingå i samma provserie. 8.5 Om det efter kokningen är svårt att filtrera de sura och basiska lösningarna blåses tryckluft genom värmeenhetens utloppsrör, varefter filtreringen fullföljes. 8.6 För att förlänga glasfilterdeglarnas livslängd bör temperaturen vid föraskningen inte överstiga 500 o C. Var noga med att undvika alltför hastiga temperaturförändringar vid uppvärmning och avkylning. J. BESTÄMNING AV SOCKER 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod är det möjligt att bestämma halten av reducerande socker och totalhalten socker efter invertering, uttryckt som glukos eller, om så är lämpligt, sackaros med omvandlingsfaktorn 0,95. Metoden är tillämplig på foderblandningar. För andra typer av foder finns särskilda metoder. Om så krävs ska laktos bestämmas separat och tas med i resultatberäkningen. 2. Princip Sockerarterna extraheras i utspädd etanol. Lösningen klaras med Carrez-lösning I och II. Efter det att etanolen eliminerats bestäms kvantiteterna före och efter invertering med Luff-Schoorl-metoden. 3. Reagens 3.1 Etanol 40 % (v/v), densitet: 0,948 g/ml vid 20 o C, fenolftaleinneutral. 3.2 Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.3 Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.4 Metylorange, lösning 0,1 % (w/v). 3.5 Saltsyra, 4 mol/l. 3.6 Saltsyra, 0,1 mol/l. 3.7 Natriumhydoxidlösning, 0,1 mol/l. 3.8 Luff-Schoorl-reagens: Häll citronsyralösningen (3.8.2) i natriumkarbonatlösningen (3.8.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (3.8.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera. Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na 2 CO 3 1 mol/l), se punkt 5.4 sista stycket. Lösningens pH ska vara ca 9,4. 3.8.1 Kopparsulfatlösning: lös 25 g järnfritt kopparsulfat, CuSO 4 5H 2 O, i 100 ml vatten. 3.8.2 Citronsyralösning: lös 50 g citronsyra C 6 H 8 O 7 ·H 2 O i 50 ml vatten. 3.8.3 Natriumkarbonatlösning: lös upp 143,8 g vattenfritt natriumkarbonat i ca 300 ml varmt vatten. Låt svalna. 3.9 Natriumtiosulfatlösning, 0,1 mol/l. 3.10 Stärkelselösning: tillsätt en blandning av 5 g löslig stärkelse i 30 ml vatten till 1 liter kokande vatten. Koka i tre minuter, låt svalna och tillsätt vid behov 10 mg kvicksilverjodid som konserveringsmedel. 3.11 Svavelsyra, 3 mol/l. 3.12 Kaliumjodidlösning, 30 % (w/v). 3.13 Granulerad pimpsten som kokats i saltsyra, sköljts med vatten och torkats. 3.14 3-metylbutan-1-ol. 4. Utrustning Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut. 5. Utförande 5.1 Extraktion av provet Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av provet i en 250 ml mätkolv. Tillsätt 200 ml etanol (3.1) och blanda på skakapparaten i 1 timme. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.2) och rör om i ca 30 sekunder. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning II (3.3) och rör om i 1 minut. Späd med etanol (3.1) till full volym, homogenisera och filtrera. Ta undan 200 ml av filtratet och låt indunsta till ungefär halv volym så att det mesta av etanolen elimineras. Överför återstoden efter avdunstningen kvantitativt, med varmt vatten, till en 200 ml mätkolv, kyl, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera vid behov. Denna lösning används för att bestämma halten av reducerande socker och, efter invertering, totalhalten socker. 5.2 Bestämning av reducerande socker Pipettera av högst 25 ml av lösningen med ett innehåll av mindre än 60 mg reducerande socker uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande socker med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet. 5.3 Bestämning av totalhalten socker efter invertering Pipettera över 50 ml av lösningen till en 100 ml mätkolv. Tillsätt några droppar metylorangelösning (3.4) och därefter – försiktigt och under ständig omrörning – saltsyra (3.5) tills vätskan blir tydligt röd. Tillsätt 15 ml saltsyra (3.6), sänk ned kolven i ett kraftigt kokande vattenbad och låt stå i 30 minuter. Kyl hastigt till ca 20 o C och tillsätt 15 ml natriumhydroxidlösning (3.7). Späd med vatten till 100 ml och homogenisera. Avlägsna högst 25 ml av lösningen med ett innehåll av mindre än 60 mg reducerande socker uttryckt som glukos. Späd vid behov med destillerat vatten till 25 ml och bestäm halten reducerande socker med Luff-Schoorl-metoden. Resultatet uttrycks som procent glukos i provet eller, om så är lämpligt, sackaros, genom att multiplicera med faktorn 0,95. 5.4 Titrering med Luff-Schoorl-metoden Pipettera över 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) till en 300 ml E-kolv. Tillsätt exakt 25 ml av den klarade sockerlösningen. Tillsätt två korn pimpsten (3.13), hetta upp under omrörning för hand över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i cirka två minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt: Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (3.12) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (3.11). Titrera med natriumtiosulfatlösning (3.9) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (3.10) och slutför titreringen. Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.8) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (3.12) och 25 ml svavelsyra (3.11) utan kokning. 6. Beräkning av resultat Fastställ med hjälp av tabellen nedan den glukosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan resultaten av de båda titreringarna, uttryckt i mg 0,1 M natriumtiosulfat. Uttryck resultatet i procent av provet. 7. Särskilda förfaranden 7.1 För foder som innehåller mycket melass eller som inte är särskilt homogena vägs 20 g upp och överförs med 500 ml vatten till en 1 000 ml mätkolv. Blanda på skakapparaten i en timme. Gör lösningen klar med Carrez-reagens I (3.2) och Carrez-reagens II (3.3) enligt beskrivningen i 5.1 men med fyra gånger större mängd av varje reagens. Späd till full volym med etanol 80 % (v/v). Homogenisera och filtrera. Avlägsna etanolen enligt beskrivningen i 5.1. Om det inte finns någon dextrinerad stärkelse, tillsätts destillerat vatten till full volym. 7.2 För melass och foderråvaror som innehåller mycket socker och som är nästan stärkelsefria (johannesbröd, torkad betsnitsel osv.), vägs 5 g upp i en 250 ml mätkolv, varefter 200 ml destillerat vatten tillsätts och lösningen blandas på skakapparaten i en timme eller mer om så behövs. Gör lösningen klar med Carrez-reagens I (3.2) och Carrez-reagens II (3.3) enligt beskrivningen i 5.1. Späd med kallt vatten till full volym, homogenisera och filtrera. Bestäm totalhalten socker enligt beskrivningen i 5.3. 8. Anmärkningar 8.1 För att förhindra skumbildning är det lämpligt att (oberoende av volymen) tillsätta ca 1 ml 3-metylbutan-1-ol (3.14) före uppkokning med Luff-Schoorl-reagens. 8.2 Skillnaden mellan totalhalten socker efter invertering, uttryckt som glukos, och halten reducerande socker, uttryckt som glukos, multiplicerad med 0,95 ger sackaroshalten i procent. 8.3 För att bestämma halten reducerande socker med undantag av laktos kan två metoder användas: 8.3.1 För en ungefärlig beräkning multipliceras den laktoshalt som fastställts med en annan analysmetod med 0,675, och det erhållna resultatet dras från halten reducerande socker. 8.3.2 För en exakt beräkning av reducerande socker med undantag av laktos måste samma prov användas för de två slutliga bestämningarna. Den ena analysen utförs på en del av den lösning som erhållits enligt 5.1 och den andra på en del av den lösning som erhållits vid bestämningen av laktos med den metod som fastställts för detta ändamål (efter det att de andra sockerarterna jästs och lösningen klarats). I båda fallen bestäms mängden befintligt socker med Luff-Schoorl-metoden och beräknas i mg glukos. Det ena av värdena dras från det andra och skillnaden uttrycks i procent av provet. Exempel De två valda volymerna motsvarar vid varje bestämning ett prov på 250 mg. I det första fallet förbrukas 17 ml 0,1 M natriumtiosulfatlösning, vilket motsvarar 44,2 mg glukos, och i det andra fallet 11 ml, vilket motsvarar 27,6 mg glukos. Skillnaden är 16,6 mg glukos. Halten reducerande socker (med undantag av laktos) beräknad som glukos är alltså: Värdetabell för 25 ml Luff-Schoorl-reagens ml Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l, uppvärmning 2 minuter, kokning 10 minuter Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l Glukos, fruktos, invertsocker C 6 H 12 O 6 Laktos C 12 H 22 O 11 Maltos C 12 H 22 O 11 Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l ml mg skillnad mg skillnad mg skillnad ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6 3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 K. BESTÄMNING AV LAKTOS 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan laktoshalten bestämmas i foder som innehåller mer än 0,5 % laktos. 2. Princip Sockerarterna löses upp i vatten. Lösningen fermenteras med jästen Saccharomyces cerevisiae som lämnar laktosen opåverkad. Efter klarning och filtrering bestäms laktoshalten i filtratet med Luff-Schoorl-metoden. 3. Reagens 3.1 Suspension av Saccharomyces cerevisiae : slamma upp 25 g färsk jäst i 100 ml vatten. Suspensionen håller sig högst en vecka i kylskåp. 3.2 Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn (CH 3 COO) 2 2H 2 O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.3 Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.4 Luff-Schoorl-reagens: Häll citronsyralösningen (3.4.2) i natriumkarbonatlösningen (3.4.3) under noggrann omrörning. Tillsätt kopparsulfatlösningen (3.4.1) och späd med vatten till 1 liter. Låt stå över natten och filtrera. Kontrollera koncentrationen hos det erhållna reagenset (Cu 0,05 mol/l, Na 2 CO 3 1 mol/l). Lösningens pH ska vara ca 9,4. 3.4.1 Kopparsulfatlösning: lös 25 g järnfritt kopparsulfat, CuSO 4 5H 2 O, i 100 ml vatten. 3.4.2 Citronsyralösning: lös 50 g citronsyra, C 6 H 8 O 7 · H 2 O, i 50 ml vatten. 3.4.3 Natriumkarbonatlösning: lös 143,8 g vattenfritt natriumkarbonat i ca 300 ml varmt vatten. Låt svalna. 3.5 Granulerad pimpsten som kokats i saltsyra, sköljts med vatten och torkats. 3.6 Kaliumjodidlösning, 30 % (w/v). 3.7 Svavelsyra, 3 mol/l. 3.8 Natriumtiosulfatlösning, 0,1 mol/l. 3.9 Stärkelselösning: tillsätt en blandning av 5 g löslig stärkelse i 30 ml vatten till 1 liter kokande vatten. Koka i 3 minuter, låt svalna och tillsätt vid behov 10 mg kvicksilverjodid som konserveringsmedel. 4. Utrustning Vattenbad med termostaten inställd på 38–40 o C. 5. Utförande Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 1 g av provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25–30 ml vatten. Låt kolven stå i ett kokande vattenbad i 30 minuter och kyl sedan till ca 35 o C. Tillsätt 5 ml jästsuspension (3.1) och homogenisera. Låt kolven stå i vattenbad i två timmar vid en temperatur av 38–40 o C. Kyl därefter till ca 20 o C. Tillsätt 2,5 ml Carrez-lösning I (3.2), rör om i 30 sekunder och tillsätt sedan 2,5 ml Carrez-lösning II (3.3) och rör om i ytterligare 30 sekunder. Späd med vatten till 100 ml, blanda och filtrera. Pipettera upp högst 25 ml av filtratet som bör innehålla 40–80 mg laktos och överför detta till en 300 ml E-kolv. Späd vid behov med vatten till 25 ml. Utför ett blankprov på samma sätt med 5 ml jästsuspension (3.1). Fastställ laktoshalten enligt Luff-Schoorl på följande sätt: tillsätt exakt 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) och två korn pimpsten (3.5). Rör om för hand medan innehållet hettas upp över medelstor öppen låga och låt vätskan koka i ca 2 minuter. Ställ omedelbart E-kolven på ett asbestklätt trådnät med ett hål med ca 6 cm diameter under vilket en låga brinner. Lågan ska justeras så att endast E-kolvens botten hettas upp. Anslut en återloppskylare till E-kolven. Låt koka i exakt 10 minuter. Kyl omedelbart i kallt vatten och titrera efter ca 5 minuter på följande sätt: Tillsätt 10 ml kaliumjodidlösning (3.6) och omedelbart därefter (försiktigt, på grund av risken för kraftig skumbildning) 25 ml svavelsyra (3.7). Titrera med natriumtiosulfatlösning (3.8) tills en matt gul färg uppträder, tillsätt stärkelseindikatorn (3.9) och slutför titreringen. Utför samma titrering på en noggrant uppmätt blandning av 25 ml Luff-Schoorl-reagens (3.4) och 25 ml vatten efter tillsats av 10 ml kaliumjodidlösning (3.6) och 25 ml svavelsyra (3.7) utan kokning. 6. Beräkning av resultat Fastställ med hjälp av tabellen nedan den laktosmängd i mg som motsvarar skillnaden mellan resultaten av de båda titreringarna, uttryckt i ml 0,1 M natriumtiosulfat. Uttryck resultatet som halten vattenfri laktos i procent av provet. 7. Anmärkning För produkter som innehåller mer än 40 % jäsbart socker används mer än 5 ml jästsuspension (3.1). Värdetabell för 25 ml Luff-Schoorl-reagens ml Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l, uppvärmning 2 minuter, kokning 10 minuter Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l Glukos, fruktos, invertsocker C 6 H 12 O 6 Laktos C 12 H 22 O 11 Maltos C 12 H 22 O 11 Na 2 S 2 O 3 0,1 mol/l ml mg skillnad mg skillnad mg skillnad ml 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 2,4 4,8 7,2 9,7 12,2 14,7 17,2 19,8 22,4 25,0 27,6 30,3 33,0 35,7 38,5 41,3 44,2 47,1 50,0 53,0 56,0 59,1 62,2 2,4 2,4 2,5 2,5 2,5 2,5 2,6 2,6 2,6 2,6 2,7 2,7 2,7 2,8 2,8 2,9 2,9 2,9 3,0 3,0 3,1 3,1 3,6 7,3 11,0 14,7 18,4 22,1 25,8 29,5 33,2 37,0 40,8 44,6 48,4 52,2 56,0 59,9 63,8 67,7 71,7 75,7 79,8 83,9 88,0 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,7 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,9 3,9 3,9 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 3,9 7,8 11,7 15,6 19,6 23,5 27,5 31,5 35,5 39,5 43,5 47,5 51,6 55,7 59,8 63,9 68,0 72,2 76,5 80,9 85,4 90,0 94,6 3,9 3,9 3,9 4,0 3,9 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,1 4,1 4,1 4,1 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 L. BESTÄMNING AV STÄRKELSE POLARIMETRISK METOD 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod är det möjligt att bestämma halten av stärkelse och nedbrytningsprodukter av stärkelse med hög molekylvikt i foder, i syfte att kontrollera att det deklarerade energivärdet är korrekt (bestämmelser i bilaga VII) och att rådets direktiv 96/25/EG ( 3 ) efterlevs. 2. Princip Metoden omfattar två bestämningar. I den första behandlas provet med utspädd saltsyra. Efter klarning och filtrering mäts lösningens optiska rotation polarimetriskt. I den andra extraheras provet med 40 % etanol. Efter att filtratet surgjorts med saltsyra, klarats och filtrerats mäts den optiska rotationen på samma sätt som vid den första bestämningen. Genom att multiplicera skillnaden mellan de båda mätningarna med en känd faktor erhålls provets stärkelsehalt. 3. Reagens 3.1 Saltsyra, lösning 25 % (w/w), densitet: 1,126 g/ml. 3.2 Saltsyra, lösning 1,13 % (w/v). Koncentrationen måste kontrolleras genom titrering med 0,1 M natriumhydroxidlösning i närvaro av 0,1 % (w/v) metylrött i 94 % (v/v) etanol. För att neutralisera 10 ml krävs 30,94 ml 0,1 M NaOH. 3.3 Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.4 Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.5 Etanol 40 % (v/v), densitet: 0,948 g/ml vid 20 o C. 4. Utrustning 4.1 250 ml E-kolv med standardfog av slipat glas och återloppskylare. 4.2 Polarimeter eller sackarimeter. 5. Utförande 5.1 Provberedning Krossa provet tills det är tillräckligt finfördelat för att helt kunna passera genom en sikt med 0,5 mm runda maskor. 5.2 Bestämning av den totala optiska rotationen (P eller S) (se anmärkning 7.1) Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2,5 g av det krossade provet i en 100 ml mätkolv. Tillsätt 25 ml saltsyra (3.2), skaka om så att provet fördelas jämnt och tillsätt ytterligare 25 ml saltsyra (3.2). Sänk ned kolven i ett kokande vattenbad under kraftig och jämn omskakning under de tre första minuterna för att förhindra agglomeratbildning. Vattenbadet måste innehålla så mycket vatten att det fortsätter att koka då kolven sänks ned i det. Kolven får inte tas upp ur vattenbadet vid omskakningen. Ta upp kolven ur vattenbadet efter exakt 15 minuter, tillsätt 30 ml kallt vatten och kyl omedelbart till 20 o C. Tillsätt 5 ml Carrez-lösning I (3.3) och skaka i ca 30 sekunder. Tillsätt sedan 5 ml Carrez-lösning II (3.4) och skaka i ytterligare ca 30 sekunder. Späd med vatten till full volym, blanda och filtrera. Om filtratet inte är fullständigt klart (vilket är sällsynt) upprepas bestämningen med en större kvantitet Carrez-lösning I och II, till exempel 10 ml. Lösningens optiska rotation mäts i ett 200 mm rör med polarimeter eller sackarimeter. 5.3 Bestämning av den optiska rotationen (P' eller S') hos ämnen som är lösliga i 40 % etanol Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 100 ml mätkolv och tillsätt ca 80 ml etanol (3.5) (se anmärkning 7.2). Låt kolven stå i en timme i rumstemperatur och skaka under denna tid om kraftigt vid sex tillfällen så att provet blandas väl med etanolen. Späd med etanol (3.5) till full volym, blanda och filtrera. Pipettera över 50 ml av filtratet (motsvarar 2,5 g av provet) till en 250 ml E-kolv, tillsätt 2,1 ml saltsyra (3.1) och skaka kraftigt. Anslut en återloppskylare till E-kolven och sänk därefter ned E-kolven i ett kokande vattenbad. Ta efter exakt 15 minuter upp E-kolven ur vattenbadet, överför innehållet till en 100 ml mätkolv (skölj med lite kallt vatten) och kyl till 20 o C. Klara provet med Carrez-lösning I (3.3) och II (3.4), späd med vatten till full volym, blanda, filtrera och mät den optiska rotationen på det sätt som anges i 5.2 andra och tredje styckena. 6. Beräkning av resultat Stärkelsehalten ( %) beräknas på följande sätt: 6.1 Mätning med polarimeter P = total optisk rotation i vinkelgrader P' = optisk rotation i vinkelgrader för ämnen som är lösliga i 40 % (v/v) etanol = specifik optisk rotation för ren stärkelse. De konventionella numeriska värdena för denna faktor är + 185,9 o : risstärkelse + 185,7 o : potatisstärkelse + 184,6 o : majsstärkelse + 182,7 o : vetestärkelse + 181,5 o : kornstärkelse + 181,3 o : havrestärkelse + 184,0 o : andra typer av stärkelse och stärkelseblandningar i foderblandningar 6.2 Mätning med sackarimeter S = total optisk rotation i sackarimetergrader S' = optisk rotation i sackarimetergrader för ämnen som är lösliga i 40 % (v/v) etanol N = vikt (g) av sackaros i 100 ml vatten som ger en optisk rotation på 100 sackarimetergrader vid mätning med ett 200 mm rör 16,29 g för franska sackarimetrar 26,00 g för tyska sackarimetrar 20,00 g för sackarimetrar av blandtyp = specifik optisk rotation för ren stärkelse (se 6.1) 6.3 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,4 i absoluta tal om stärkelsehalten är under 40 %, och 1 % i relativt värde om stärkelsehalten är 40 % eller högre. 7. Anmärkningar 7.1 Om provet innehåller mer än 6 % karbonater, beräknat som kalciumkarbonat, måste dessa avlägsnas genom behandling med en väl avvägd mängd utspädd svavelsyra, innan den totala optiska rotationen bestäms. 7.2 För produkter med hög laktoshalt, som mjölkserum i pulverform och skummjölkspulver, används följande förfarande efter tillsats av 80 ml etanol (3.5): Anslut en återloppskylare till kolven och sänk därefter ned kolven i ett vattenbad vid 50 o C i 30 minuter. Låt svalna och fortsätt analysen enligt anvisningarna i 5.3. 7.3 Följande foderråvaror kan, om de förekommer i betydande mängder i fodret, störa bestämningen av stärkelsehalt med polarimeter och kan därigenom ge upphov till felaktiga resultat: — (Socker)betsprodukter som (socker)betmassa, (socker)betmelass, melasserad (socker)betmassa, (socker)betvinass, (bet)socker. — Citruspulpa. — Linfrön, linfröexpeller, extraherade linfrön. — Rapsfrö, rapsfröexpeller, extraherade rapsfrön, rapsfröskal. — Solrosfrön, extraherade solrosfrön, delvis skalade extraherade solrosfrön. — Kopraexpeller, extraherad kopra. — Potatispulpa. — Vattenfri jäst. — Inulinrika produkter (t.ex. snitsel och mjöl av jordärtskockor). — Fettgrevar. M. BESTÄMNING AV RÅASKA 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten råaska i foder bestämmas. 2. Princip Provet föraskas vid 550 o C. Återstoden vägs. 3. Reagens Ammoniumnitrat, lösning 20 % (w/v). 4. Utrustning 4.1 Värmeplatta. 4.2 Elektrisk muffelugn med termostat. 4.3 Deglar av kvarts, porslin eller platina; antingen rektangulära (ca 60 × 40 × 25 mm) eller cirkelformade (diameter: 60–75 mm, höjd: 20–40 mm). 5. Utförande Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet (2,5 g för produkter som har benägenhet att svälla) i en degel som först har upphettats till 550 o C, svalnat och tarerats. Ställ degeln på värmeplattan och upphetta sakta tills provet förkolnar. Föraska enligt 5.1 eller 5.2. 5.1 Sätt in degeln i den kalibrerade muffelugnen inställd på 550 o C. Håll provet vid denna temperatur tills en vit, ljusgrå eller rödaktig aska bildas som förefaller fri från kolhaltiga partiklar. Ställ degeln i en exsickator, låt svalna och väg omedelbart. 5.2 Sätt in degeln i den kalibrerade muffelugnen inställd på 550 o C. Föraska i 3 timmar. Ställ degeln i en exsickator, låt svalna och väg omedelbart. Föraska på nytt i 30 minuter för att säkerställa att askans vikt är konstant (viktförlusten mellan två på varandra följande vägningar får inte överstiga 1 mg). 6. Beräkning av resultat Beräkna återstodens vikt med taran fråndragen. Resultatet uttrycks i procent av provet. 7. Anmärkningar 7.1 Askan av ämnen som är svåra att föraska måste först genomgå en förberedande föraskning i minst 3 timmar, kylas och sedan tillsättas några droppar 20 % ammoniumnitratlösning eller vatten (försiktigt så att inte askan sprids eller klumpar bildas). Fortsätt kalcineringen efter torkning i ugn. Upprepa förfarandet så många gånger som behövs tills föraskningen är fullständig. 7.2 För ämnen som är motståndskraftiga mot den behandling som beskrivs i 7.1 förfars på följande sätt: efter föraskning i tre timmar läggs askan i varmt vatten och filtreras genom ett litet askfritt filter. Föraska filtret och dess innehåll i den ursprungliga degeln. Överför filtratet till den avsvalnade degeln, låt indunsta tills det är torrt, föraska och väg. 7.3 För oljor och fetter : väg noggrant upp ett prov på 25 g i en degel av lämplig storlek. Förkola provet genom att antända den med en remsa askfritt filtrerpapper. Fukta efter förbränning med minsta möjliga mängd vatten. Torka och föraska enligt beskrivningen i punkt 5. N. BESTÄMNING AV ASKA SOM ÄR OLÖSLIG I SALTSYRA 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten i foder av mineralämnen som är olösliga i saltsyra bestämmas. Två metoder kan användas beroende på typen av prov. 1.1 Metod A: tillämplig på organiska foderråvaror och på de flesta foderblandningar. 1.2 Metod B: tillämplig på mineralfoder och mineralfoderblandningar och på foderblandningar vilkas halt av ämnen som är olösliga i saltsyra överstiger 1 % enligt bestämning med metod A. 2. Princip 2.1 Metod A: provet föraskas, askan kokas i saltsyra och den olösliga återstoden filtreras och vägs. 2.2 Metod B: provet behandlas med saltsyra. Lösningen filtreras varpå återstoden föraskas och den aska som erhålls behandlas enligt metod A. 3. Reagens 3.1 Saltsyra, 3 mol/l. 3.2 Triklorättiksyra, lösning 20 % (w/v). 3.3 Triklorättiksyra, lösning 1 % (w/v). 4. Utrustning 4.1 Värmeplatta. 4.2 Elektrisk muffelugn med termostat. 4.3 Deglar av kvarts, porslin eller platina, rektangulära (ca 60 × 40 × 25 mm) eller cirkelformade (diameter: 60–75 mm, höjd: 20–40 mm). 5. Utförande 5.1 Metod A: Föraska provet med samma metod som för bestämning av råaska. Aska som erhållits vid den analysen kan också användas. Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (3.1). Koka upp långsamt och låt koka försiktigt i 15 minuter. Filtrera den varma lösningen genom ett askfritt filtrerpapper och skölj återstoden med varmt vatten tills ingen syrareaktion längre är märkbar. Torka filtret med återstoden och föraska i en tarerad degel vid lägst 550 o C och högst 700 o C. Kyl i exsickator och väg. 5.2 Metod B: Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 5 g av provet i en 250–400 ml bägare. Tillsätt 25 ml vatten och därefter 25 ml saltsyra (3.1), blanda och vänta tills gasutvecklingen upphör. Tillsätt ytterligare 50 ml saltsyra (3.1). Vänta tills gasutvecklingen upphör och ställ sedan bägaren i ett kokande vattenbad i 30 minuter eller längre så att eventuell stärkelse hydrolyseras fullständigt. Filtrera den fortfarande varma lösningen genom ett askfritt filter och tvätta filtret i 50 ml varmt vatten (jfr punkt 7). Lägg filtret med återstod i en degel, torka och föraska vid en temperatur av lägst 550 o C och högst 700 o C. Överför askan till en 250–400 ml bägare med 75 ml saltsyra (3.1). Fortsätt enligt beskrivningen i punkt 5.1 andra stycket. 6. Beräkning av resultat Beräkna återstodens vikt med taran fråndragen. Resultatet uttrycks i procent av provet. 7. Anmärkning Om filtreringen visar sig svår att genomföra ska analysen påbörjas på nytt, varvid de 50 ml saltsyra (3.1) ersätts med 50 ml 20 % triklorättiksyra (3.2) och filtret sköljs med en varm lösning av 1 % triklorättiksyra (3.3). O. BESTÄMNING AV KARBONATER 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan mängden karbonater, konventionellt uttryckt som kalciumkarbonat, bestämmas i de flesta fodertyper. I vissa fall (t.ex. för järnkarbonat) måste dock en särskild metod användas. 2. Princip Karbonaterna löses upp i saltsyra. Den koldioxid som frigörs samlas upp i ett mätglas, och dess volym jämförs med den som under samma förhållanden frigörs av en känd mängd kalciumkarbonat. 3. Reagens 3.1 Saltsyra, densitet 1,10 g/ml. 3.2 Kalciumkarbonat. 3.3 Svavelsyra, ca 0,05 mol/l, färgad med metylrött. 4. Utrustning Scheibler-Dietrichapparat (se figur) eller motsvarande. 5. Utförande Väg upp en provmängd som beroende på dess karbonathalt ska vara — 0,5 g för produkter som innehåller 50–100 % karbonater, uttryckt som kalciumkarbonat, — 1 g för produkter som innehåller 40–50 % karbonater, uttryckt som kalciumkarbonat, — 2–3 g för övriga produkter. Placera provet i apparatens specialkolv (4), som är utrustad med ett litet rör av okrossbart material som innehåller 10 ml saltsyra (3.1) och anslut kolven till apparaten. Vrid trevägskranen (5) så att röret (1) öppnas. Ställ in vätskenivån på nollmarkeringen med hjälp av det flyttbara röret (2) som är fyllt med färgad svavelsyra (3.3) och anslutet till mätglaset (1). Vrid kranen (5) så att rören (1) och (3) förbinds och kontrollera att nivån är noll. Luta kolven (4) så att saltsyran (3.1) sprids långsamt över provet. Jämna ut trycket genom att sänka röret (2). Skaka kolven (4) tills ingen koldioxid längre frigörs. Återställ trycket genom att justera tillbaka vätskenivån till den ursprungliga i rören (1) och (2). Avläs efter några minuter när gasvolymen har blivit konstant. Utför ett kontrolltest under samma förhållanden med 0,5 g kalciumkarbonat (3.2). 6. Beräkning av resultat Karbonathalten, uttryckt som kalciumkarbonat, beräknas med formeln där: X = % (w/w) karbonater, uttryckt som kalciumkarbonat, i provet V = ml CO 2 som frigörs av provet V 1 = ml CO 2 som frigörs av 0,5 g CaCO 3 m = provets vikt i gram. 7. Anmärkningar 7.1 Om provet väger mer än 2 g ska först 15 ml destillerat vatten tillsättas i kolven (4) och blandas med provet innan försöket påbörjas. Använd samma volym vatten vid kontrolltestet. 7.2 Om den apparat som används har andra dimensioner än Scheibler-Dietrichapparaten måste man göra motsvarande ändringar av det använda provets och kontrollsubstansens mängd samt vid resultatberäkningen. P. BESTÄMNING AV TOTALFOSFOR FOTOMETRISK METOD 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan totalfosforhalten bestämmas i foder. Metoden är särskilt lämplig för analys av produkter med låg fosforhalt. I vissa fall (fosforrika produkter) kan en gravimetrisk metod användas. 2. Princip Provet mineraliseras antingen genom torrföraskning (organiska foder) eller genom uppslutning med syra (mineralfoderblandningar och flytande foder) och läggs i en syralösning. Lösningen behandlas med molybdovanadatreagens. Absorbansen hos den gula lösning som då bildas mäts i spektrofotometer vid 430 nm. 3. Reagens 3.1 Kalciumkarbonat. 3.2 Saltsyra, ρ 20 = 1,10 g/ml (ca 6 mol/l). 3.3 Salpetersyra, ρ 20 = 1,045 g/ml. 3.4 Salpetersyra, ρ 20 = 1,38–1,42 g/ml. 3.5 Svavelsyra, ρ 20 = 1,84 g/ml. 3.6 Molybdovanadatreagens: blanda 200 ml ammoniumheptamolybdatlösning (3.6.1), 200 ml ammoniumvanadatlösning (3.6.2) och 134 ml salpetersyra (3.4) i en 1 000 ml mätkolv. Späd med vatten till full volym. 3.6.1 Ammoniumheptamolybdatlösning: lös 100 g ammoniumheptamolybdat (NH 4 ) 6Mo 7 O 24 ·4H 2 O, i varmt vatten. Tillsätt 10 ml ammoniak (densitet 0,91 g/ml) och späd med vatten till 1 liter. 3.6.2 Ammoniumvanadatlösning: lös 2,35 g ammoniumvanadat NH 4 VO 3 i 400 ml varmt vatten. Tillsätt långsamt under ständig omrörning 20 ml utspädd salpetersyra (7 ml HNO 3 [3.4] + 13 ml vatten) och späd med vatten till 1 liter. 3.7 Standardfosforlösning, 1 mg/ml: lös 4,387 g kaliumdivätefosfat KH 2 PO 4 i vatten. Späd med vatten till 1 liter. 4. Utrustning 4.1 Deglar av kvarts, porslin eller platina. 4.2 Elektrisk muffelugn med termostaten inställd på 550 o C. 4.3 250 ml Kjeldahlkolv. 4.4 Mätkolvar och precisionspipetter. 4.5 Spektrofotometer. 4.6 Provrör, ca 16 mm i diameter, med proppar, 14,5 mm i diameter, volym 25–30 ml. 5. Utförande 5.1 Beredning av lösningen Lösningen bereds enligt 5.1.1 eller 5.1.2 beroende på typ av prov. 5.1.1 Vanlig metod Väg upp 1 g eller mer av provet med en noggrannhet av 1 mg. Placera provet i en Kjeldahlkolv, tillsätt 20 ml svavelsyra (3.5), skaka om så att materialet helt impregneras med syra och så att den inte fastnar på kolvens väggar, upphetta och låt koka i 10 minuter. Låt svalna något, tillsätt 2 ml salpetersyra (3.4), upphetta försiktigt, låt svalna något, tillsätt lite mer salpetersyra (3.4) och upphetta åter till kokpunkten. Upprepa detta förfarande tills en färglös lösning erhålls. Kyl, tillsätt lite vatten, häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur Kjeldahlkolven med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera. 5.1.2 Prov som innehåller organiska ämnen och som är fria från kalcium- och magnesiumdivätefosfat Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 2,5 g av provet i en degel. Blanda provet fullständigt med 1 g kalciumkarbonat (3.1). Föraska i ugnen vid 550 o C tills en vit eller grå aska erhålls (visst inslag av träkol har ingen betydelse). Överför askan till en 250 ml bägare. Tillsätt 20 ml vatten och saltsyra (3.2) tills skumningen upphör. Tillsätt ytterligare 10 ml saltsyra (3.2). Ställ bägaren i sandbad och indunsta fullständigt så att kiseldioxiden blir olöslig. Lös åter upp återstoden i 10 ml salpetersyra (3.3) och koka på sandbadet eller på en värmeplatta i 5 minuter utan fullständig indunstning. Häll över vätskan i en 500 ml mätkolv och skölj ur bägaren flera gånger med varmt vatten. Låt svalna, späd med vatten till full volym, homogenisera och filtrera. 5.2 Färgutveckling och mätning av absorbans Späd ut en alikvot av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1 eller 5.1.2 så att en fosforhalt av högst 40 μg/ml erhålls. Överför 10 ml av denna lösning till ett provrör (4.6) och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 o C. Mät absorbansen i spektrofotometer vid 430 nm mot en lösning av 10 ml molybdovanadatreagens (3.6) i 10 ml vatten. 5.3 Kalibreringskurva Av standardlösningen (3.7) bereds lösningar som innehåller 5, 10, 20, 30 och 40 μg fosfor per ml. Ta 10 ml av var och en av dessa lösningar och tillsätt 10 ml molybdovanadatreagens (3.6). Homogenisera och låt stå i minst 10 minuter vid 20 o C. Mät absorbansen på det sätt som anges i 5.2. Konstruera kalibreringskurvan genom att avsätta absorbansvärdena mot motsvarande kvantiteter fosfor. Vid koncentrationer mellan 0 och 40 μg/ml är kurvan linjär. 6. Beräkning av resultat Bestäm mängden fosfor i provet med hjälp av kalibreringskurvan. Resultatet uttrycks i procent av provet. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 3 % av det högre värdet för fosforhalter under 5 %, — 0,15 % i absoluta tal för fosforhalter på 5 % eller mer. Q. BESTÄMNING AV KLOR I KLORIDER 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan mängden klor i vattenlösliga klorider, konventionellt uttryckt som natriumklorid, bestämmas. Metoden är tillämplig på alla foder. 2. Princip Kloriderna löses upp i vatten. Om produkten innehåller organiskt material ska den klaras. Lösningen surgörs något med salpetersyra och kloriderna fälls ut som silverklorid genom tillsats av silvernitratlösning. Överskottet av silvernitrat titreras med ammoniumtiocyanatlösning enligt Volhardmetoden. 3. Reagens 3.1 Ammoniumtiocyanatlösning 0,1 mol/l. 3.2 Silvernitratlösning 0,1 mol/l. 3.3 Mättad lösning av ammoniumjärnsulfat (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2 . 3.4 Salpetersyra, densitet 1,38 g/ml. 3.5 Dietyleter. 3.6 Aceton. 3.7 Carrez-lösning I: lös 21,9 g zinkacetat, Zn(CH 3 COO) 2 ·2H 2 O, och 3 g isättika i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.8 Carrez-lösning II: lös 10,6 g kaliumferrocyanid, K 4 Fe(CN) 6 ·3H 2 O, i vatten. Späd med vatten till 100 ml. 3.9 Aktivt kol, fritt från klorider och inte kloridabsorberande. 4. Utrustning Rotationsskakapparat: ca 35–40 varv per minut. 5. Utförande 5.1 Beredning av lösningen Beroende på typ av prov bereds en lösning enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3. Utför samtidigt ett blankprov utan det prov som ska analyseras. 5.1.1 Prov som är fria från organiskt material Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ett prov på högst 10 g som innehåller högst 3 g klor i kloridform. Överför provet och 400 ml vatten till en 500 ml mätkolv vid ca 20 o C. Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera. 5.1.2 Prov som innehåller organiskt material med undantag av produkterna i 5.1.3 Väg med en noggrannhet av 1 mg upp ca 5 g av provet tillsammans med 1 g aktivt kol i en 500 ml mätkolv. Tillsätt 400 ml vatten (ca 20 o C) och 5 ml Carrez-lösning I (3.7), rör om i 30 sekunder och tillsätt därefter 5 ml Carrez-lösning II (3.8). Blanda på skakapparaten i 30 minuter, späd till full volym, homogenisera och filtrera. 5.1.3 Kokt foder, linfrökakor och linfrömjöl, produkter med hög halt linfrömjöl och andra produkter med hög halt mucilago eller kolloider (till exempel dextrinerad stärkelse) Bered lösningen enligt beskrivningen i 5.1.2 men filtrera inte. Dekantera (centrifugera vid behov) och överför 100 ml av supernatanten till en 200 ml mätkolv. Blanda med aceton (3.6) och späd med detta lösningsmedel till full volym, homogenisera och filtrera. 5.2 Titrering Pipettera över 25–100 ml (beroende på den förmodade klorhalten) av det filtrat som erhållits enligt 5.1.1, 5.1.2 eller 5.1.3 till en E-kolv. Analysprovet får inte innehålla mer än 150 mg klor (Cl). Späd vid behov med vatten till minst 50 ml, tillsätt 5 ml salpetersyra (3.4), 20 ml mättad ammoniumjärnsulfatlösning (3.3) och två droppar ammoniumtiocyanatlösning (3.1) som tillförs med hjälp av en byrett som är fylld till nollmarkeringen. Tillför silvernitratlösningen (3.2) med en byrett så att ett överskott på 5 ml erhålls. Tillsätt 5 ml dietyleter (3.5) och skaka kraftigt så att fällningen koagulerar. Titrera överskottet av silvernitrat med ammoniumtiocyanatlösningen (3.1) tills den rödbruna färgen har bestått i 1 minut. 6. Beräkning av resultat Mängden klor (X) uttryckt som procent natriumklorid beräknas med formeln där: V 1 = ml tillsatt silvernitratlösning 0,1 mol/l V 2 = ml ammoniumtiocyanatlösning 0,1 mol/l som använts vid titreringen m = provets vikt. Om blankprovet visar att silvernitratlösning, 0,1 mol/l, har förbrukats ska detta värde dras från volymen (V 1 – V 2 ). 7. Anmärkningar 7.1. Titreringen kan även utföras potentiometriskt. 7.2. Produkter med mycket hög fetthalt ska först avfettas med dietyleter eller petroleumeter. 7.3. Vid analys av fiskmjöl kan titreringen utföras med Mohrs metod. ( 1 ) För torkning av spannmål, mjöl och gröpe måste ugnen ha så hög effekt att den vid en inställning på 131 o C åter uppnår denna temperatur på mindre än 45 minuter efter det att det maximala antalet prov har placerats i den för att torka samtidigt. Ventilationen måste vara så god att resultatet, efter två timmars torkning av så många prov av vanligt vete som ugnen rymmer, skiljer sig från resultatet efter fyra timmars torkning med mindre än 0,15 %. ( 2 ) Om fettet senare ska genomgå kvalitetstester, ersätts pimpstensskärvorna med glaspärlor. ( 3 ) EGT L 125, 23.5.1996, s. 35 . BILAGA IV ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV HALTEN GODKÄNDA FODERTILLSATSER A. BESTÄMNING AV VITAMIN A 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten av vitamin A (retinol) i foder och förblandningar bestämmas. Med vitamin A avses all-trans-retinylalkohol och dess cis-isomerer som bestäms med denna metod. Halten av vitamin A uttrycks som internationella enheter (IE) per kg, där 1 IE motsvarar aktiviteten hos 0,300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0,344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0,550 μg all-trans-vitamin A-palmitat. Kvantifieringsgränsen för vitamin A är 2 000 IE/kg. 2. Princip Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin A extraheras sedan över till petroleumeter. Lösningsmedlet får därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. Halten av vitamin A bestäms genom omvänd fas-kromatografi (RP-HPLC) med UV- eller fluorescensdetektor. De kromatografiska parametrarna väljs så att all-trans-vitamin A-alkohol inte separeras från sina cis-isomerer. 3. Reagens 3.1 Etanol, σ = 96 % 3.2 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 o C 3.3 Metanol 3.4 Kaliumhydroxidlösning, c = 50 g/100 ml 3.5 Natriumaskorbatlösning, c = 10 g/100 ml (jfr punkt 7.7) 3.6 Natriumsulfid, Na 2 S· x H 2 0, där x = 7–9 3.6.1 Natriumsulfidlösning, c = 0,5 mol/l i glycerol, ß = 120 g/l för x = 9 (jfr punkt 7.8) 3.7 Fenolftalein som lösts i etanol, c = 2 g/100 ml (3.1) 3.8 2-propanol 3.9 Mobil fas för HPLC: blandning av metanol (3,3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v). Det exakta förhållandet mellan volymerna anpassas efter kolonnens egenskaper. 3.10 Kvävgas, syrefri 3.11 All-trans-vitamin A-acetat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet, t.ex. 2,80 × 10 6 IE/g 3.11.1 Stamlösning av all-trans-vitamin A-acetat: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg vitamin A-acetat (3.11) i en 100 ml mätkolv. Lös i 2-propanol (3.8) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av vitamin A i lösningen är 1 400 IE/ml. Den exakta halten ska bestämmas enligt 5.6.3.1. 3.12 All-trans-vitamin A-palmitat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet, t.ex. 1,80 × 10 6 IE/g 3.12.1 Stamlösning av all-trans-vitamin A-palmitat: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 80 mg vitamin A-palmitat (3.12) i en 100 ml mätkolv. Lös i 2-propanol (3.8) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av vitamin A i lösningen är 1 400 IE/ml. Den exakta halten ska bestämmas enligt 5.6.3.2. 3.13 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (jfr punkt 7.5) 4. Utrustning 4.1 Rotationsindunstare 4.2 Bruna glaskärl 4.2.1 Sättkolvar eller E-kolvar, 500 ml, med slipad hals 4.2.2 Smalhalsade mätkolvar, 10, 25, 100 och 500 ml, med slipade proppar 4.2.3 Koniska separertrattar, 1 000 ml, med slipade proppar 4.2.4 Rundkolvar, 250 ml, med slipad hals 4.3 Allihn-kylare, mantellängd 300 mm, med fog av slipat glas och adapter för gasinledningsrör 4.4 Veckat filtrerpapper för fasseparation, diameter 185 mm (t.ex. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2) 4.5 HPLC-utrustning med injektionssystem 4.5.1 HPLC-kolonn, 250 × 4 mm, C 18 , 5 eller 10 μm packning eller motsvarande (prestandakriterium: en enda topp för alla isomerer av retinol vid normala HPLC-förhållanden) 4.5.2 UV- eller fluorescensdetektor, med variabel våglängd 4.6 Spektrofotometer med 10 mm kvartsceller 4.7 Vattenbad med magnetomrörare 4.8 Extraktionsapparat (se figur 1) bestående av: 4.8.1 Glascylinder, 1 liter, med slipad hals och propp. 4.8.2 Adapter av slipat glas med en sidoarm och ett justerbart rör genom mitten. Det justerbara röret bör ha U-formad nederdel och en pip i övre änden så att det övre vätskeskiktet i cylindern kan överföras till en separertratt. 5. Utförande Anmärkning: Vitamin A är känsligt för (UV-)ljus och oxidation. Alla arbetsmoment bör därför utföras i skydd från ljus (bruna glaskärl eller glaskärl insvepta i aluminiumfolie) och från syre (spola med kvävgas). Vid extraktionen ersätts luften ovanför vätskan med kvävgas (undvik övertryck genom att lätta på proppen då och då). 5.1 Provberedning Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm sikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin A måste malningen göras omedelbart innan provet vägs och förtvålas. 5.2 Förtvålning Väg med en noggrannhet av 1 mg upp 2–25 g av provet, beroende på halten av vitamin A, i en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1). Tillsätt – i tur och ordning, och samtidigt som flaskan eller kolven roteras – 130 ml etanol (3.1), ca 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Flaskan eller kolven kopplas till en kylare (4.3) och ställs därefter i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt återloppskoka i 5 minuter. Tillsätt 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och låt återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och i ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ca 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur. 5.3 Extraktion Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och överför sköljvätskan till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna bör vara omkring 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter. 5.3.1 Extraktion med separertratt (4.2.3) När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) överförs skiktet med petroleumeter till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2). Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7) (fyra tvättningar brukar räcka). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filtrerpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), späd till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt. 5.3.2 Extraktion med extraktionsapparat (4.8) När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret ska mynna precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten. Tvätta de sammanslagna extrakten av petroleumeter enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten. 5.4 Beredning av provlösning för HPLC Pipettera över en alikvot av petroleumeterlösningen (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta nästan fullständigt i en rotationsindunstare (4.1) med reducerat tryck och en temperatur på vattenbadet som inte överstiger 40 o C. Återställ atmosfärstryck genom att släppa in kvävgas (3.10) och ta sedan bort kolven från rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.10) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10–100 ml) metanol (3.3). (Halten av vitamin A bör ligga i intervallet 5–30 IE/ml.) 5.5 Bestämning med HPLC Vitamin A separeras i en kolonn för omvänd fas-kromatografi, C 18 , (4.5.1) och halten bestäms med en UV-detektor (325 nm) eller fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) (4.5.2). Injicera en alikvot (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den mobila fasen (3.9). Beräkna den genomsnittliga topphöjden (arean) för flera injektioner av samma provlösning och de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av kalibreringslösningarna (5.6.2). HPLC-betingelser Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.5.1): 250 × 4 mm, C 18 , 5 eller 10 μm packning, eller motsvarande Mobil fas (3.9): Blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v). Flödeshastighet: 1–2 ml/min Detektor (4.5.2): UV-detektor (325 nm) eller fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) 5.6 Kalibrering 5.6.1 Beredning av arbetslösningar Pipettera över 20 ml stamlösning av vitamin A-acetat (3.11.1) eller 20 ml stamlösning av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2 men utan tillsats av BHT. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter (3.2). Låt 100 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (jfr punkt 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel i en kvävgasström (3.10) och lös provet på nytt i 10,0 ml metanol (3.3). Den nominella halten av vitamin A i lösningen är 560 IE/ml. Den exakta halten ska bestämmas enligt 5.6.3.3. Arbetslösningen ska vara nyberedd. Pipettera över 2,0 ml av arbetslösningen till en 20 ml mätkolv, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i denna utspädda arbetslösning är 56 IE/ml. 5.6.2 Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva För över 1,0, 2,0, 5,0 och 10,0 ml av den utspädda arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar, späd till märket med metanol (3.3) och blanda. Den nominella halten av vitamin A i dessa lösningar är 2,8 – 5,6 – 14,0 respektive 28,0 IE/ml. Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva med beaktande av resultatet av UV-kontrollen (5.6.3.3). 5.6.3 UV-standardisering av standardlösningar 5.6.3.1 Stamlösning av vitamin A-acetat Pipettera över 2,0 ml stamlösning av vitamin A-acetat (3.11.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IE/ml. Pipettera över 3,0 ml av den utspädda vitamin A-acetatlösningen till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm. Beräkning av halten av vitamin A: Halten vitamin A (IE/ml) = E 326 × 19,0 ( för vitamin A-acetat = 1 530 vid 326 nm i 2-propanol) 5.6.3.2 Stamlösning av vitamin A-palmitat Pipettera över 2,0 ml stamlösning av vitamin A-palmitat (3.12.1) till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 56 IE/ml. Pipettera över 3,0 ml av den utspädda vitamin A-palmitatlösningen till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm. Beräkning av halten av vitamin A: Halten vitamin A (IE/ml) = E 326 × 19,0 ( för vitamin A-palmitat = 957 vid 326 nm i 2-propanol) 5.6.3.3 Arbetslösning av vitamin A Pipettera över 3,0 ml av den outspädda arbetslösning av vitamin A som beretts enligt 5.6.1 till en 50 ml mätkolv (4.2.2) och späd till märket med 2-propanol (3.8). Pipettera över 5,0 ml av denna lösning till en 25 ml mätkolv och späd till märket med 2-propanol (3.8). Den nominella halten av vitamin A i denna lösning är 6,72 IE/ml. Mät UV-spektrumet för lösningen mot 2-propanol (3.8) i en spektrofotometer (4.6) mellan 300 och 400 nm. Extinktionsmaximum ska ligga mellan 325 och 327 nm. Beräkning av halten av vitamin A: Halten vitamin A (IE/ml) = E 325 × 18,3 ( för vitamin A-alkohol = 1821 vid 325 nm i 2-propanol) 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens vitamin A-toppar för att bestämma halten i IE/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.2). Halten av vitamin A (IE/kg) i provet beräknas med formeln [UI/kg] där: c = halten av vitamin A i provlösningen (5.4) i IE/ml V 1 = provlösningens volym (5.4) i ml V 2 = volym för den uttagna alikvoten (5.4) i ml m = provets vikt i gram. 7. Anmärkningar 7.1 För prov med låg halt av vitamin A kan det vara lämpligt att slå ihop petroleumeterextrakten från två förtvålningsomgångar (uppvägd mängd: 25 g) till en enda provlösning för bestämning med HPLC. 7.2 Det prov som ska bestämmas bör inte innehålla mer än 2 g fett. 7.3 Om ingen fasseparation äger rum tillsätts ca 10 ml etanol (3.1) för att få emulsionen att skikta sig. 7.4 För torskleverolja och andra rena fetter bör förtvålningstiden förlängas till 45–60 minuter. 7.5 I stället för BHT kan man använda hydrokinon. 7.6 Retinol-isomerer kan separeras med en kolonn för normal-fas-kromatografi. Topphöjderna (areorna) för alla cis- och trans-isomerer måste då läggas ihop vid beräkningen. 7.7 I stället för natriumaskorbatlösning kan man använda ca 150 mg askorbinsyra. 7.8 I stället för natriumsulfidlösning kan man använda ca 50 mg EDTA. 7.9 Vid bestämning av vitamin A i mjölkersättning måste följande beaktas: — Vid förtvålning (5.2): Det kan vara nödvändigt att öka mängden kaliumhydroxidlösning (3.4) på grund av mängden fett i provet. — Vid extraktion (5.3): Det kan vara nödvändigt att anpassa volymförhållandet mellan vatten och etanol (2:1) till följd av emulsioner. Gör ett utbytesförsök på ett separat prov för att kontrollera att bestämningsmetoden ger tillförlitliga resultat för just denna matris (mjölkersättning). Om utbytet är lägre än 80 % måste resultatet av bestämningen korrigeras för detta. 8. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet. 9. Resultat av en provningsjämförelse ( 1 ) Förblandning Förblandat foder Mineralkoncentrat Proteinfoder Smågrisfoder L 13 12 13 12 13 N 48 45 47 46 49 Medelvärde [IE/kg] 17,02 × 106 1,21 × 106 537 100 151 800 18 070 sr [IE/kg] 0,51 × 106 0,039 × 106 22 080 12 280 682 r [IE/kg] 1,43 × 106 0,109 × 106 61 824 34 384 1 910 CVr [ %] 3,0 3,5 4,1 8,1 3,8 sR [IE/kg] 1,36 × 106 0,069 × 106 46 300 23 060 3 614 R [IE/kg] 3,81 × 106 0,193 × 106 129 640 64 568 10 119 CVR [ %] 8,0 6,2 8,6 15 20 L: : antal laboratorier n : antal enskilda värden sr : standardavvikelse för repeterbarhet sR : standardavvikelse för reproducerbarhet r : repeterbarhet R : reproducerbarhet CVr : variationskoefficient för repeterbarhet CVR : variationskoefficient för reproducerbarhet B. BESTÄMNING AV VITAMIN E 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten av vitamin E i foder och förblandningar bestämmas. Halten av vitamin E uttrycks som mg DL-alfa-tokoferolacetat/kg. 1 mg DL-alfa-tokoferolacetat motsvarar 0,91 mg DL-alfa-tokoferol (vitamin E). Kvantifieringsgränsen för vitamin E är 2 mg/kg. Denna gräns kan bara uppnås med fluorescensdetektor. Med UV-detektor ligger kvantifieringsgränsen på 10 mg/kg. 2. Princip Provet hydrolyseras med kaliumhydroxid som lösts i etanol, och vitamin E extraheras över till petroleumeter. Lösningsmedlet får därefter avdunsta, och återstoden av provet löses i metanol och späds vid behov till lämplig koncentration. Halten av vitamin E bestäms genom omvänd fas-kromatografi (RP-HPLC) med fluorescens- eller UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Etanol, σ = 96 % 3.2 Petroleumeter, kokpunktsintervall 40–60 o C 3.3 Metanol 3.4 Kaliumhydroxidlösning, c = 50 g/100 ml 3.5 Natriumaskorbatlösning, c = 10 g/100 ml (jfr punkt 7.7) 3.6 Natriumsulfid, Na 2 S· x H 2 0, där x = 7–9 3.6.1 Natriumsulfidlösning, c = 0,5 mol/l i glycerol, β = 120 g/l för x = 9 (jfr punkt 7.8) 3.7 Fenolftalein som lösts i etanol, c = 2 g/100 ml (3.1) 3.8 Mobil fas för HPLC: blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v). Det exakta förhållandet mellan volymerna anpassas efter kolonnens egenskaper. 3.9 Kvävgas, syrefri 3.10 DL-alfa-tokoferolacetat, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet 3.10.1 Stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 100 mg DL-alfa-tokoferolacetat (3.10) i en 100 ml mätkolv. Lös i etanol (3.1) och späd till märket med samma lösningsmedel. 1 ml av denna lösning innehåller 1 mg DL-alfa-tokoferolacetat. (För UV-kontroll, se 5.6.1.3; för stabilisering, se 7.4.) 3.11 DL-alfa-tokoferol, av extra hög renhetsgrad, med certifierad aktivitet 3.11.1 Stamlösning av DL-alfa-tokoferol: Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 100 mg DL-alfa-tokoferol (3.11) i en 100 ml mätkolv. Lös i etanol (3.1) och späd till märket med samma lösningsmedel. 1 ml av denna lösning innehåller 1 mg DL-alfa-tokoferol. (För UV-kontroll, se 5.6.2.3; för stabilisering, se 7.4.) 3.12 2,6-di-tert-butyl-4-metylfenol (BHT) (jfr punkt 7.5) 4. Utrustning 4.1 Rotationsindunstare 4.2 Bruna glaskärl 4.2.1 Sättkolvar eller E-kolvar, 500 ml, med slipad hals. 4.2.2 Smalhalsade mätkolvar, 10, 25, 100 och 500 ml, med slipade proppar. 4.2.3 Koniska separertrattar, 1 000 ml, med slipade proppar. 4.2.4 Rundkolvar, 250 ml, med slipad hals. 4.3 Allihn-kylare, mantellängd 300 mm, med fog av slipat glas och adapter för gasinledningsrör 4.4 Veckat filtrerpapper för fasseparation, diameter 185 mm (t.ex. Schleicher & Schuell 597 HY 1/2) 4.5 HPLC-utrustning med injektionssystem 4.5.1 HPLC-kolonn, 250 × 4 mm, C 18 , 5 eller 10 μm packning eller motsvarande. 4.5.2 Fluorescens- eller UV-detektor, med variabel våglängd. 4.6 Spektrofotometer med 10 mm kvartsceller 4.7 Vattenbad med magnetomrörare 4.8 Extraktionsapparat (se figur 1) bestående av: 4.8.1 Glascylinder, 1 liter, med slipad hals och propp. 4.8.2 Adapter av slipat glas med en sidoarm och ett justerbart rör genom mitten. Det justerbara röret bör ha U-formad nederdel och en pip i övre änden så att det övre vätskeskiktet i cylindern kan överföras till en separertratt. 5. Utförande Anmärkning: Vitamin E är känsligt för (UV-)ljus och oxidation. Alla arbetsmoment bör därför utföras i skydd från ljus (bruna glaskärl eller glaskärl insvepta i aluminiumfolie) och från syre (spola med kvävgas). Vid extraktionen ersätts luften ovanför vätskan med kvävgas (undvik övertryck genom att lätta på proppen då och då). 5.1 Provberedning Mal provet så att det kan passera genom en 1 mm sikt, men undvik friktionsvärme. För att undvika förlust av vitamin E måste malningen göras omedelbart innan provet vägs och förtvålas. 5.2 Förtvålning Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp 2–25 g av provet, beroende på halten av vitamin E, i en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1). Tillsätt – i tur och ordning, och samtidigt som flaskan eller kolven roteras – 130 ml etanol (3.1), ca 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumaskorbatlösning (3.5) och 2 ml natriumsulfidlösning (3.6). Flaskan eller kolven kopplas till en kylare (4.3) och ställs därefter i ett vattenbad med magnetomrörare (4.7). Värm till kokpunkten och låt återloppskoka i 5 minuter. Tillsätt därefter 25 ml kaliumhydroxidlösning (3.4) genom kylaren (4.3) och låt återloppskoka i ytterligare 25 minuter under omrörning och ett långsamt flöde av kvävgas. Skölj sedan kylaren med ca 20 ml vatten och kyl innehållet i flaskan eller kolven till rumstemperatur. 5.3 Extraktion Överför genom dekantering den förtvålade lösningen kvantitativt till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) eller till en extraktionsapparat (4.8) genom att skölja med sammanlagt 250 ml vatten. Skölj ur förtvålningskärlet först med 25 ml etanol (3.1) och sedan med 100 ml petroleumeter (3.2) och överför sköljvätskan till separertratten eller extraktionsapparaten. Förhållandet mellan vatten och etanol i de sammanslagna lösningarna bör vara omkring 2:1. Skaka kraftigt i 2 minuter och låt sedan stå i 2 minuter. 5.3.1 Extraktion med separertratt (4.2.3) När skikten har separerat (se punkt 7.3) överförs skiktet med petroleumeter till en annan separertratt (4.2.3). Upprepa extraktionen två gånger med 100 ml petroleumeter (3.2) och två gånger med 50 ml petroleumeter (3.2). Tvätta de sammanslagna extrakten i separertratten två gånger genom att tillsätta portioner på 100 ml vatten och sedan försiktigt rotera tratten (för att undvika att emulsioner bildas). Skaka sedan tratten upprepade gånger med portioner på 100 ml vatten, tills vattnet inte längre färgas vid tillsats av fenolftaleinlösning (3.7) (fyra tvättningar brukar räcka). Avlägsna vatten i suspension genom att filtrera det tvättade extraktet genom ett torrt veckat filtrerpapper för fasseparation (4.4) till en 500 ml mätkolv (4.2.2). Skölj ur separertratten och filtret med 50 ml petroleumeter (3.2), späd till märket med petroleumeter (3.2) och blanda omsorgsfullt. 5.3.2 Extraktion med extraktionsapparat (4.8) När skikten har separerat (jfr punkt 7.3) ersätts glascylinderns (4.8.1) propp med adaptern av slipat glas (4.8.2). Den U-formade nederdelen av det justerbara röret ska mynna precis ovanför gränsytan mellan skikten. Överför det övre skiktet av petroleumeter till en 1 000 ml separertratt (4.2.3) genom att föra in kvävgas via sidoröret. Tillsätt 100 ml petroleumeter (3.2) till glascylindern, sätt i proppen och skaka kraftigt. Låt skikten separera och överför det övre skiktet till separertratten som ovan. Upprepa extraktionen med ytterligare 100 ml petroleumeter (3.2) och sedan två gånger med 50 ml-portioner av petroleumeter (3.2). Överför petroleumeterskikten till separertratten. Tvätta de sammanslagna extrakten av petroleumeter enligt 5.3.1 och gå vidare enligt instruktionen i den punkten. 5.4 Beredning av provlösning för HPLC Pipettera över en alikvot av petroleumeterlösningen (från 5.3.1 eller 5.3.2) till en 250 ml rundkolv (4.2.4). Låt lösningsmedlet avdunsta nästan fullständigt i en rotationsindunstare (4.1) med reducerat tryck och en temperatur på vattenbadet som inte överstiger 40 o C. Återställ atmosfärstryck genom att släppa in kvävgas (3.9) och ta sedan bort kolven från rotationsindunstaren. Avlägsna återstående lösningsmedel med en kvävgasström (3.9) och lös omedelbart upp återstoden av provet i en känd volym (10–100 ml) metanol (3.3). (Halten av DL-alfa-tokoferol bör ligga i intervallet 5–30 μg/ml.) 5.5 Bestämning med HPLC Vitamin E separeras i en kolonn för omvänd fas-kromatografi, C 18 , (4.5.1) och halten bestäms med fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) eller UV-detektor (292 nm) (4.5.2). Injicera en alikvot (t.ex. 20 μl) av den metanollösning som erhölls i 5.4 och eluera med den mobila fasen (3.8). Beräkna de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av samma provlösning och de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för flera injektioner av kalibreringslösningarna (5.6.2). HPLC-betingelser Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.5.1): 250 × 4 mm, C 18 , 5 eller 10 μm packning, eller motsvarande Mobil fas (3.8): Blandning av metanol (3.3) och vatten, t.ex. 980 + 20 (v + v) Flödeshastighet: 1–2 ml/min Detektor (4.5.2) Fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) eller UV-detektor (292 nm) 5.6 Kalibrering (DL-alfa-tokoferolacetat eller DL-alfa-tokoferol) 5.6.1 Standardlösning av DL-alfa-tokoferolacetat 5.6.1.1 Beredning av arbetslösning Pipettera över 25 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1) till en 500 ml sättkolv eller E-kolv (4.2.1) och hydrolysera enligt 5.2. Extrahera sedan med petroleumeter (3.2) enligt 5.3 och späd till 500 ml med petroleumeter. Låt 25 ml av extraktet indunsta i en rotationsindunstare (jfr punkt 5.4) tills provet är nästan torrt. Avlägsna resterande lösningsmedel i en kvävgasström (3.9) och lös provet på nytt i 25,0 ml metanol (3.3). Den nominella halten av DL-alfa-tokoferol i lösningen är 45,5 μg/ml, vilket motsvarar 50 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml. Arbetslösningen ska vara nyberedd. 5.6.1.2 Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva Överför 1,0–2,0–4,0 och 10,0 ml av arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. De nominella halterna av DL-alfa-tokoferolacetat i dessa lösningar är 2,5–5,0–10,0 och 25,0 μg/ml, vilket motsvarar 2,28–4,55–9,10 respektive 22,8 μg DL-alfa-tokoferol/ml. Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva. 5.6.1.3 UV-standardisering av stamlösningen av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1) Späd 5,0 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferolacetat (3.10.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i en spektrofotometer (4.6) mellan 250 och 320 nm. Absorptionsmaximum bör ligga vid 284 nm: = 43,6 vid 284 nm i etanol 1 cm Vid denna spädning bör extinktionskoefficienten ligga mellan 0,84 och 0,88. 5.6.2 Standardlösning av DL-alfa-tokoferol 5.6.2.1 Beredning av arbetslösning Pipettera över 2 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferol (3.11.1) till en 50 ml mätkolv. Lös tokoferolet i metanol (3.3) och späd till märket med samma lösningsmedel. Den nominella halten av DL-alfa-tokoferol i lösningen är 40 μg/ml, vilket motsvarar 44,0 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml. Arbetslösningen ska vara nyberedd. 5.6.2.2 Beredning av kalibreringslösningar och konstruktion av kalibreringskurva Överför 1,0–2,0–4,0 och 10,0 ml av arbetslösningen till ett antal 20 ml mätkolvar. Späd till märket med metanol (3.3) och blanda. De nominella halterna av DL-alfa-tokoferol i dessa lösningar är 2,0–4,0–8,0 och 20,0 μg/ml, vilket motsvarar 2,20–4,40–8,79 respektive 22,0 μg DL-alfa-tokoferolacetat/ml. Injicera upprepade gånger 20 μl av varje kalibreringslösning och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna). Använd de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för att konstruera en kalibreringskurva. 5.6.2.3 UV-standardisering av stamlösningen av DL-alfa-tokoferol (3.11.1) Späd 2,0 ml stamlösning av DL-alfa-tokoferol (3.11.1) till 25,0 ml med etanol och mät UV-spektrumet för denna lösning mot etanol (3.1) i en spektrofotometer (4.6) mellan 250 och 320 nm. Absorptionsmaximum bör ligga vid 292 nm: = 75,8 vid 292 nm i etanol 1 cm Vid denna spädning bör extinktionskoefficienten ligga på 0,6. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens vitamin E-toppar för att bestämma halten i μg/ml (beräknat som alfa-tokoferolacetat) med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.1.2 eller 5.6.2.2). Halten av vitamin E, w (mg/kg) i provet beräknas med formeln [mg/kg] där: c = halten av vitamin E (uttryckt som alfa-tokoferolacetat) i provlösningen (5.4) i μg/ml V 1 = provlösningens volym (5.4) i ml V 2 = volym för den uttagna alikvoten (5.4) i ml m = provets vikt i gram. 7. Anmärkningar 7.1 För prov med låg halt av vitamin E kan det vara lämpligt att slå ihop petroleumeterextrakten från två förtvålningsomgångar (uppvägd mängd: 25 g) till en enda provlösning för bestämning med HPLC. 7.2 Det prov som ska bestämmas bör inte innehålla mer än 2 g fett. 7.3 Om ingen fasseparation äger rum tillsätts ca 10 ml etanol (3.1) för att få emulsionen att skikta sig. 7.4 Efter spektrofotometrisk bestämning av lösningen av DL-alfa-tokoferolacetat eller DL-alfa-tokoferol enligt 5.6.1.3 resp. 5.6.2.3, tillsätts ca 10 mg BHT (3.12) till denna (3.10.1 eller 3.10.2). Lösningen förvaras sedan i kylskåp (i högst 4 veckor). 7.5 I stället för BHT kan man använda hydrokinon. 7.6 Med en kolonn för normal-fas-kromatografi går det att separera alfa-, beta-, gamma- och delta-tokoferol. 7.7 I stället för natriumaskorbatlösning kan man använda ca 150 mg askorbinsyra. 7.8 I stället för natriumsulfidlösning kan man använda ca 50 mg EDTA. 7.9 Vitamin E-acetat hydrolyseras mycket snabbt i alkalisk miljö och är därför mycket känsligt för oxidation, särskilt i närvaro av spårelement som järn eller koppar. Vid bestämning av vitamin E i förblandningar som innehåller mer än 5 000 mg/kg finns det alltså en risk att vitamin E bryts ned. Därför bör en HPLC-metod med enzymatisk nedbrytning av vitamin E-beredningen utan någon alkalisk förtvålning användas för att bekräfta resultaten. 8. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet. 9. Resultat av en provningsjämförelse ( 2 ) Förblandning Förblandat foder Mineralkoncentrat Proteinfoder Smågrisfoder L 12 12 12 12 12 N 48 48 48 48 48 Medelvärde [mg/kg] 17 380 1 187 926 315 61,3 sr [mg/kg] 384 45,3 25,2 13,0 2,3 r [mg/kg] 1 075 126,8 70,6 36,4 6,4 CVr [ %] 2,2 3,8 2,7 4,1 3,8 sR mg/kg] 830 65,0 55,5 18,9 7,8 R [mg/kg] 2 324 182,0 155,4 52,9 21,8 CVR [ %] 4,8 5,5 6,0 6,0 12,7 L = antal laboratorier n = antal enskilda värden s r = standardavvikelse för repeterbarhet s R = standardavvikelse för reproducerbarhet r = repeterbarhet R = reproducerbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet C. BESTÄMNING AV SPÅRELEMENTEN JÄRN, KOPPAR, MANGAN OCH ZINK 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten av spårelementen järn, koppar, mangan och zink i foder bestämmas. Kvantifieringsgränser: — järn (Fe): 20 mg/kg — koppar (Cu): 10 mg/kg — mangan (Mn): 20 mg/kg — zink (Zn): 20 mg/kg 2. Princip Provet löses upp i saltsyra efter destruktion av eventuellt organiskt material. Grundämnena järn, koppar, mangan och zink bestäms efter lämplig spädning genom atomabsorptionsspektrometri. 3. Reagens Inledande anmärkningar Vid beredning av reagens och analyslösningar ska man använda vatten som är fritt från de katjoner som ska bestämmas, genom att det antingen har dubbeldestillerats i en destillationsapparat av borosilikatglas eller kvartsglas eller har genomgått dubbel behandling med jonbytarharts. Reagensen måste minst vara av p.a.-kvalitet. Det ska kontrolleras genom ett blankprov att de är fria från det grundämne som ska bestämmas. Om det visar sig nödvändigt måste reagensen renas ytterligare. I stället för de standardlösningar som beskrivs nedan kan i handeln förekommande standardlösningar användas, förutsatt att de är garanterade och att de kontrolleras före användning. 3.1 Saltsyra, d: 1,19 g/ml. 3.2 Saltsyra, 6 mol/l. 3.3 Saltsyra, 0,5 mol/l. 3.4 38–40 % fluorvätesyra (v/v) med en järnhalt (Fe) under 1 mg/l och en rest efter indunstning på mindre än 10 mg (i form av sulfat)/liter. 3.5 Svavelsyra (d: 1,84 g/ml). 3.6 Väteperoxid (ca 100 volymer syre [30 viktprocent]). 3.7 Standardlösning av järn (1 000 μg Fe/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): Lös upp 1 g järntråd i 200 ml 6 M saltsyra (3.2), tillsätt 16 ml väteperoxid (3.6) och späd till 1 liter med vatten. 3.7.1 Arbetslösning av järn (100 μg Fe/ml) beredd genom spädning av 1 del standardlösning (3.7) med 9 delar vatten. 3.8 Standardlösning av koppar (1 000 μg Cu/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): — Lös 1 g kopparpulver i 25 ml 6 M saltsyra (3.2), tillsätt 5 ml väteperoxid (3.6) och späd till 1 liter med vatten. 3.8.1 Arbetslösning av koppar (10 μg Cu/ml) beredd genom spädning av standardlösningen (3.8) med vatten (1:9) varefter den erhållna lösningen späds med vatten (1:9). 3.9 Standardlösning av mangan (1 000 μg Mn/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): — Lös 1 g manganpulver i 25 ml 6 M saltsyra (3.2) och späd till 1 liter med vatten. 3.9.1 Arbetslösning av mangan (10 μg Mn/ml) beredd genom spädning av standardlösningen (3.9) med vatten (1:9) varefter den erhållna lösningen späds med vatten (1:9). 3.10 Standardlösning av zink (1 000 μg Zn/ml) beredd på följande sätt (eller motsvarande kommersiellt tillgängliga lösning): — Lös 1 g zink i rems- eller bladform i 25 ml 6 M saltsyra (3.2) och späd till 1 liter med vatten. 3.10.1 Arbetslösning av zink (10 μg Zn/ml) beredd genom spädning av standardlösningen (3.10) med vatten (1:9) varefter den erhållna lösningen späds med vatten (1:9). 3.11 Lantankloridlösning: Lös 12 g lantanoxid i 150 ml vatten, tillsätt 100 ml 6 M saltsyra (3.2) och späd till 1 liter med vatten. 4. Utrustning 4.1 Muffelugn med temperaturreglering och helst med skrivare. 4.2 Glaskärlen ska vara av resistent borosilikattyp, och utrustningen bör bara användas för bestämning av spårelement. 4.3 Atomabsorptionsspektrofotometer som motsvarar metodens krav i fråga om känslighet och precision inom det aktuella mätområdet. 5. Utförande ( 3 ) 5.1 Prov som innehåller organiskt material 5.1.1 Föraskning och beredning av lösningen för analys ( 4 ) 5.1.1.1 Väg med en noggrannhet av 0,2 mg upp 5–10 g av provet i en degel av kvarts eller platina (jfr anmärkning b), torka i ugn vid 105 o C och sätt in degeln i den kalla muffelugnen (4.1). Stäng ugnen (jfr anmärkning c) och höj temperaturen gradvis till 450–475 o C under ca 90 minuter. Behåll denna temperatur under 4–16 timmar (t.ex. över natten) så att kolhaltigt material avlägsnas. Öppna därefter ugnen och låt den svalna (jfr anmärkning d). Fukta askan med vatten och för över den till en 250 ml bägare. Tvätta ur degeln med sammanlagt ca 5 ml saltsyra (3.1) och tillför sedan detta långsamt och försiktigt i bägaren. (CO 2 -bildning kan leda till en kraftig reaktion.) Tillsätt saltsyra (3.1) droppvis under skakning tills all bubbelbildning upphört. Låt provet indunsta fullständigt, under omrörning då och då med glasstav. Tillsätt 15 ml 6 M saltsyra (3.2) till återstoden, därefter ca 120 ml vatten. Rör med glasstaven, som ska stå kvar i bägaren, och täck över bägaren med ett urglas. Koka upp försiktigt och håll lösningen vid kokpunkten tills askan är fullständigt upplöst. Filtrera genom askfritt filtrerpapper och samla upp filtratet i en 250 ml mätkolv. Skölj bägaren och filtret en gång med 5 ml varm 6 M saltsyra (3.2) och två gånger med kokande vatten. Fyll mätkolven till märket med vatten (HCl-koncentration ca 0,5 M). 5.1.1.2 Om återstoden i filtret är svart (kol) sätts den in i ugnen på nytt och föraskas vid 450–475 o C. Denna föraskning, som bara tar några timmar (ca 3–5 timmar), är klar när askan blivit vit eller nästan vit. Lös upp återstoden i ca 2 ml saltsyra (3.1), låt indunsta fullständigt och tillsätt därefter 5 ml 6 M saltsyra (3.2). Lösningen upphettas och filtreras sedan över till mätkolven. Späd till märket med vatten (HCl-koncentration ca 0,5 M). Anmärkningar: a) Vid bestämning av spårelement är det viktigt att vara uppmärksam på riskerna för kontaminering, särskilt av zink, koppar och järn. Den utrustning som används vid provberedningen måste därför vara fri från dessa metaller. För att minska den allmänna risken för kontaminering ska bestämningen utföras i dammfri miljö med ytterst noggrant rengjord utrustning och omsorgsfullt diskade glaskärl. Bestämning av zink är särskilt känslig för många slag av kontaminering, t.ex. genom glas, reagens och damm. b) Vikten av det prov som ska föraskas beräknas utifrån fodrets ungefärliga halt av spårelement i förhållande till känsligheten hos den spektrofotometer som används. För vissa foder med låg halt av spårelement kan det vara nödvändigt att utgå från ett prov på 10–20 g och späda den slutliga lösningen till endast 100 ml. c) Föraskningen ska utföras i en stängd ugn utan tillförsel av luft eller syre. d) Pyrometern får inte visa högre temperatur än 475 o C. 5.1.2 Spektrofotometrisk bestämning 5.1.2.1 Beredning av kalibreringslösningar Bered, för vart och ett av de spårelement som ska bestämmas, en serie kalibreringslösningar utifrån arbetslösningarna (3.7.1, 3.8.1, 3.9.1 och 3.10.1) med en HCl-koncentration på ca 0,5 M för varje kalibreringslösning och, i fråga om järn, mangan och zink, en lantankloridkoncentration motsvarande 0,1 % La (w/v). Koncentrationerna av spårelement måste väljas så att de ligger inom känslighetsområdet för den spektrofotometer som används. Följande tabeller ger exempel på sammansättningen hos typiska serier av kalibreringslösningar. Beroende på typen av spektrofotometer och dess känslighet kan det dock vara nödvändigt att välja andra koncentrationer. Järn μg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5 ml arbetslösning (3.7.1) (1 ml = 100 μg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5 ml HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantankloridlösning (3.11); späd till 100 ml med vatten Koppar μg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml arbetslösning (3.8.1) (1 ml = 10 μg Cu) 0 1 2 4 6 8 10 ml HCl (3.2) 8 8 8 8 8 8 8 Mangan μg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 ml arbetslösning (3.9.1) (1 ml = 10 μg Mn) 0 1 2 4 6 8 10 ml HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantankloridlösning (3.11); späd till 100 ml med vatten Zink μg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 ml arbetslösning (3.10.1) (1 ml = 10 μg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8 ml HCl (3.2) 7 7 7 7 7 7 7 + 10 ml lantankloridlösning (3.11); späd till 100 ml med vatten 5.1.2.2 Beredning av lösning för analys Vid bestämning av koppar kan den lösning som beretts enligt 5.1.1 normalt sett användas direkt. Om det är nödvändigt att justera dess koncentration så att den ligger i intervallet för kalibreringslösningarna pipetteras en alikvot till en 100 ml mätkolv och späds till märket med 0,5 M saltsyra (3.3). Vid bestämning av järn, mangan och zink pipetteras en alikvot av den lösning som beretts enligt 5.1.1 till en 100 ml mätkolv. Tillsätt 10 ml lantankloridlösning (3.11) och späd till märket med 0,5 M saltsyra (3.3) (jfr punkt 8). 5.1.2.3 Blankprov Blankprovet måste omfatta samtliga moment som anges i denna metod med den enda skillnaden att analysprovet utesluts. Kalibreringslösningen ”0” får inte användas som blankprov. 5.1.2.4 Mätning av atomabsorption Mät atomabsorptionen hos kalibreringslösningarna och hos den lösning som ska analyseras med en oxiderande luft-acetylenlåga vid följande våglängder: Fe: 248,3 nm Cu: 324,8 nm Mn: 279,5 nm Zn: 213,8 nm Utför varje mätning fyra gånger. 5.2 Mineralfoder Om provet inte innehåller något organiskt material behövs ingen föregående föraskning. Följ anvisningarna från och med 5.1.1.1 andra stycket. Indunstning med fluorvätesyra kan uteslutas. 6. Beräkning av resultat Beräkna med hjälp av en kalibreringskurva halten av spårelementet i den lösning som ska analyseras och uttryck resultatet i milligram spårelement per kilogram prov (ppm). 7. Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov av samma person får inte överstiga — 5 mg/kg, i absoluta tal, för halter av spårelementet i fråga på upp till 50 mg/kg, — 10 % av det högre värdet för halter av spårelementet i fråga på 50–100 mg/kg, — 10 mg/kg, i absoluta tal, för halter av spårelementet i fråga på 100–200 mg/kg, — 5 % av det högre värdet för halter av spårelementet i fråga som överstiger 200 mg/kg. 8. Anmärkning Höga halter av fosfater kan påverka bestämningen av järn, mangan och zink. Sådana interferenser måste korrigeras genom tillsats av lantankloridlösning (3.11). Denna tillsats behöver dock inte göras, vare sig till den lösning som ska analyseras eller till kalibreringslösningarna, om viktförhållandet Ca + Mg/P i provet är > 2. D. BESTÄMNING AV HALOFUGINON DL-trans-7-brom-6-klor-3-[3-(3-hydroxi-2-piperidyl)acetonyl]quinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten av halofuginon i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 1 mg/kg. 2. Princip Efter behandling med varmt vatten extraheras halofuginon, i form av den fria basen, till etylacetat och extraheras därefter, i form av hydroklorid, till en syralösning. Extraktet renas med jonbyteskromatografi. Halten av halofuginon bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Acetonitril, HPLC-kvalitet 3.2 Amberlite XAD-2-harts 3.3 Ammoniumacetat 3.4 Etylacetat 3.5 Isättika 3.6 Halofuginon referenssubstans (DL-trans-7-brom-6-klor-3-[3-hydroxi-2-piperidyl)acetonyl]quinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid, E 764) 3.6.1 Stamlösning av halofuginon, 100 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 50 mg halofuginon (3.6) i en 500 ml mätkolv. Lös i ammoniumacetatbuffertlösning (3.18) och späd sedan med samma lösning till märket och blanda. Lösningen är stabil i tre veckor om den förvaras mörkt vid 5 o C. 3.6.2 Kalibreringslösningar För över 1,0–2,0–3,0–4,0 respektive 6,0 ml stamlösning (3.6.1) till en serie 100 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.21) och blanda. Koncentrationen av halofuginon i dessa lösningar är 1,0–2,0–3,0–4,0 respektive 6,0 μg/ml. Lösningarna ska vara nyberedda. 3.7 Saltsyra (ρ 20 ca 1,16 g/ml) 3.8 Metanol 3.9 Silvernitrat 3.10 Natriumaskorbat 3.11 Natriumkarbonat 3.12 Natriumklorid 3.13 EDTA (etylendiamintetraättiksyra, dinatriumsalt) 3.14 Vatten, HPLC-kvalitet 3.15 Natriumkarbonatlösning, c = 10 g/100 ml 3.16 Natriumkloridmättad natriumkarbonatlösning, c = 5 g/100 ml Lös 50 g natriumkarbonat (3.11) i vatten. Späd till 1 liter och tillsätt natriumklorid (3.12) tills lösningen är mättad. 3.17 Saltsyra, ca 0,1 mol/l Späd 10 ml HCl (3.7) med vatten till 1 liter. 3.18 Ammoniumacetatbuffertlösning, ca 0,25mol/l Lös 19,3 g ammoniumacetat (3.3) och 30 ml ättiksyra (3.5) i vatten (3.14) och späd till 1 liter. 3.19 Förbehandling av Amberlite XAD-2-harts Skölj en lämplig mängd amberlit (3.2) med vatten tills alla kloridjoner har tvättats ur. Detta bekräftas genom en kontroll med silvernitrat (3.20) på sköljvattnet. Skölj därefter hartsen med 50 ml metanol (3.8). Häll bort metanolen och lagra hartsen i färsk metanol. 3.20 Silvernitratlösning, ca 0,1 mol/l Lös 0,17 g silvernitrat (3.9) i 10 ml vatten. 3.21 Mobil fas för HPLC Blanda 500 ml acetonitril (3.1) med 300 ml ammoniumacetatbuffertlösning (3.18) och 1 200 ml vatten (3.14). Justera pH till 4,3 med ättiksyra (3.5). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.8) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter). Lösningen är stabil i en månad om den förvaras mörkt i ett slutet kärl. 4. Utrustning 4.1 Ultraljudsbad 4.2 Rotationsindunstare 4.3 Centrifug 4.4 HPLC-utrustning med UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor 4.4.1 HPLC-kolonn, 300 × 4 mm, C 18 , 10 μm packning, eller en motsvarande kolonn 4.5 Glaskolonn (300 × 10 mm) med sintrat glasfilter och avstängningsventil 4.6 Glasfiberfilter, diameter 150 mm 4.7 Membranfilter, 0,45 μm 4.8 Membranfilter, 0,22 μm 5. Utförande Anmärkning: Halofuginon som fri bas är instabil i alkaliska lösningar och etylacetatlösningar. Det bör därför inte vara i etylacetat i mer än 30 minuter. 5.1 Allmänt 5.1.1 Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken halofuginon eller störande ämnen är närvarande. 5.1.2 Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd halofuginon som finns i provet. För spikning på nivån 3 mg/kg tillsätts 300 μl stamlösning (3.6.1) till 10 g av blankprovet. Blanda och vänta i 10 minuter innan extraktionen (5.2) påbörjas. Anmärkning: Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet. Vid analys ska halofuginon inte kunna påvisas. 5.2 Extraktion Väg med en noggrannhet av 0,1 g upp 10 gram av det beredda provet i ett 200 ml centrifugrör. Tillsätt 0,5 g natriumaskorbat (3.10), 0,5 g EDTA (3.13) samt 20 ml vatten och blanda. Ställ röret i vattenbad (80 o C) i 5 minuter. Låt svalna till rumstemperatur. Tillsätt därefter 20 ml natriumkarbonatlösning (3.15) och blanda. Tillsätt omedelbart därefter 100 ml etylacetat (3.4) och skaka röret kraftigt för hand i 15 sekunder. Ställ röret i ultraljudsbadet (4.1) i 3 minuter och lossa proppen. Centrifugera i 2 minuter och dekantera etylacetatfasen genom ett glasfiberfilter (4.6) till en 500 ml separertratt. Upprepa extraktionen av provet med en ny volym på 100 ml etylacetat. Tvätta de kombinerade extrakten i 1 minut med 50 ml natriumkloridmättad natriumkarbonatlösning (3.16). Häll bort vattenskiktet. Extrahera det organiska skiktet i 1 minut med 50 ml saltsyra (3.17). Det undre syraskiktet tappas av till en 250 ml separertratt. Extrahera det organiska skiktet en gång till i 1,5 minuter med ytterligare 50 ml saltsyra och slå samman med det första extraktet. Tvätta de kombinerade syraextrakten genom att rotera kärlet i ca 10 sekunder med 10 ml etylacetat (3.4). Överför vattenskiktet kvantitativt till en 250 ml rundkolv och häll bort den organiska fasen. Avlägsna allt resterande etylacetat från syralösningen i en rotationsindunstare (4.2). Vattenbadets temperatur bör inte överstiga 40 o C. Vid ett tryck på ca 25 mbar avdunstar allt resterande etylacetat inom 5 minuter vid 38 o C. 5.3 Rening 5.3.1 Förberedelse av amberlitkolonnen Förbered en XAD-2-kolonn för varje provextrakt. För över 10 g förbehandlad amberlit (3.19) till en glaskolonn (4.5) med metanol (3.8). Sätt en liten propp av glasull i toppen av hartskolonnen. Låt metanolen rinna ur kolonnen och skölj hartsen med 100 ml vatten. Stoppa flödet när vätskan når toppen av hartskolonnen. Låt kolonnen komma i jämvikt i 10 minuter före användning. Se till att kolonnen aldrig torkar ut. 5.3.2 Rening av prov För över extraktet (5.2) kvantitativt till toppen av den förberedda amberlitkolonnen (5.3.1) och eluera. Häll bort eluatet. Flödeshastigheten vid elueringen bör inte överskrida 20 ml/minut. Skölj rundkolven med 20 ml saltsyra (3.17) som därefter används för att skölja hartskolonnen. Avlägsna kvarvarande syralösning med en luftström. Häll bort sköljresterna. Tillsätt 100 ml metanol (3.8) i kolonnen och eluera 5–10 ml. Samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv. Vänta i 10 minuter så att den återstående metanolen kommer i jämvikt med hartsen. Fortsätt elueringen med en flödeshastighet på högst 20 ml/minut och samla upp eluatet i samma rundkolv. Låt metanolen avdunsta i en rotationsindunstare (4.2). Vattenbadets temperatur bör inte överskrida 40 o C. Överför återstoden kvantitativt till en 10 ml mätkolv genom att använda den mobila fasen (3.21). Späd med den mobila fasen till märket och blanda. En alikvot av lösningen filtreras genom ett membranfilter (4.7). Denna lösning används sedan för HPLC-bestämningen (5.4). 5.4 HPLC-bestämning 5.4.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.4.1) Mobil fas för HPLC (3.21) Flödeshastighet: 1,5–2 ml/minut Detektionsvåglängd: 243 nm Injektionsvolym: 40–100 μl. Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera en kalibreringslösning (3.6.2) med koncentrationen 3,0 μg/ml tills topphöjder (areor) och retentionstider är konstanta. 5.4.2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringslösning (3.6.2) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjder (areor) längs y-axeln och motsvarande koncentrationerna i μg/ml längs x-axeln. 5.4.3 Provlösning Provextraktet (5.3.2) injiceras upprepade gånger, varvid samma volym ska användas som för kalibreringslösningarna. Bestäm därefter den genomsnittliga topphöjden (arean) för halofuginon. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens halofuginontoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan. Provets halofuginonhalt w (mg/kg) beräknas med formeln där: c : provlösningens halofuginonkoncentration i μg/ml m : provets vikt i gram. 7. Validering av resultat 7.1 Identitet Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.6.2) som innehåller 6,0 μg/ml jämförs. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.6.2). Mängden tillsatt halofuginon bör motsvara den uppskattade mängden halofuginon i provextraktet. Endast halofuginontoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden. 7.1.2 Diod-array-detektion Resultaten utvärderas enligt följande kriterier: a) Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm. b) Mellan 225 och 300 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans. c) Mellan 225 och 300 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen. Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats. 7.2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 0,5 mg/kg för halofuginonhalter till och med 3 mg/kg. 7.3 Utbyte För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 80 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse ( 5 ) analyserades tre prov av åtta laboratorier. Resultat Prov A (blankprov) Vid mottagandet Prov B (mjöl) Prov C (pellets) Vid mottagandet Efter två månader Vid mottagandet Efter två månader Medelvärde [mg/kg] ND 2,80 2,42 2,89 2,45 S R [mg/kg] — 0,45 0,43 0,40 0,42 CV R [ %] — 16 18 14 17 Utbyte [ %] 86 74 88 75 ND = analyten har ej påvisats S R = standardavvikelse för reproducerbarhet CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet, % E. BESTÄMNING AV ROBENIDIN 1,3-bis[(4-klorbensyliden)amin]guanidinhydroklorid 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan robenidinhalten i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 5 mg/kg. 2. Princip Provet extraheras med surgjord metanol. Extraktet torkas och en alikvot renas i en kolonn med aluminiumoxid. Robenidinet elueras från kolonnen med metanol och koncentreras. Den erhållna lösningen späds med en lämplig volym av den mobila fasen. Halten av robenidin bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Metanol 3.2 Surgjord metanol För över 4,0 ml saltsyra ( ρ 20 = 1,18 g/ml) till en 500 ml mätkolv. Späd med metanol (3.1) till märket och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd. 3.3 Acetonitril, HPLC-kvalitet 3.4 Molekylsikt Typ 3A, 8–12 mesh (1,6–2,5 mm kulor, kristallint aluminiumsilikat, pordiameter 0,3 nm). 3.5 Aluminiumoxid, sur, aktivitetsgrad I, för kolonnkromatografi För över 100 g aluminiumoxid till ett lämpligt kärl och tillsätt 2,0 ml vatten. Förslut kärlet och skaka i ca 20 minuter. Förvara sedan i ett väl tillslutet kärl. 3.6 Kaliumdivätefosfatlösning, c = 0,025 mol/l Lös 3,40 g kaliumdivätefosfat i vatten (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket och blanda. 3.7 Dinatriumvätefosfatlösning, c = 0,025 mol/l Lös 3,55 g vattenfri (eller 4,45 g dihydrat eller 8,95 g dodekahydrat) dinatriumvätefosfat i vatten (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket och blanda. 3.8 Mobil fas för HPLC Blanda följande reagens: 650 ml acetonitril (3.3), 250 ml vatten (HPLC-kvalitet), 50 ml kaliumdivätefosfatlösning (3.6), 50 ml dinatriumvätefosfatlösning (3.7). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.6) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter). 3.9 Referenssubstans Rent robenidin: 1,3-bis[(4-klorbensyliden)amin]guanidin-hydroklorid. 3.9.1 Stamlösning av robenidin: 300 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 30 mg referenssubstans av robenidin (3.9). Lös i surgjord metanol (3.2) i en 100 ml mätkolv. Späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie och förvara mörkt. 3.9.2 Arbetsstandardlösning av robenidin: 12 μg/ml För över 10,0 ml stamlösning (3.9.1) till en 250 ml mätkolv. Späd till märket med mobil fas (3.8) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie och förvara mörkt. 3.9.3 Kalibreringslösningar För över 5,0–10,0–15,0–20,0 respektive 25,0 ml arbetsstandardlösning (3.9.2) till en serie 50 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.8) och blanda. Koncentrationen av robenidin i dessa lösningar är 1,2–2,4–3,6–4,8 respektive 6,0 μg/ml. Lösningarna ska vara nyberedda. 3.10 Vatten, HPLC-kvalitet 4. Utrustning 4.1 Glaskolonn Kolonn i brunt glas, med avstängningsventil och en behållare med ca 150 ml volym, invändig diameter 10–15 mm, längd 250 mm. 4.2 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare 4.3 Rotationsindunstare 4.4 HPLC-utrustning med UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor för intervallet 250–400 nm 4.4.1. HPLC-kolonn: 300 × 4 mm, C 18 , 10 μm packning eller motsvarande 4.5 Glasfiberfilter (Whatman GF/A eller motsvarande) 4.6 Membranfilter, 0,22 μm 4.7 Membranfilter, 0,45 μm 5. Utförande Anmärkning: Robenidin är ljuskänsligt. Bruna glaskärl bör därför användas vid alla arbetsmoment. 5.1 Allmänt 5.1.1 Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken robenidin eller störande ämnen är närvarande. 5.1.2 Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov (5.1.1) som spikats med ungefär samma mängd robenidin som finns i provet. För spikning på nivån 60 mg/kg överförs 3,0 ml stamlösning (3.9.1) till en 250 ml E-kolv. Indunsta lösningen till ca 0,5 ml i en kvävgasström. Tillsätt 15 g av blankprovet, blanda och vänta i 10 minuter innan extraktionen (5.2) påbörjas. Anmärkning: Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet. Vid analys ska robenidin inte kunna påvisas. 5.2 Extraktion Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp ca 15 gram av det beredda provet och för över till en 250 ml E-kolv. Tillsätt 100,0 ml surgjord metanol (3.2), tillslut kolven och låt stå i 1 timme i skakapparat (4.2). Filtrera lösningen genom ett glasfiberfilter (4.5) och samla upp allt filtrat i en 150 ml E-kolv. Tillsätt 7,5 g molekylsikt (3.4), tillslut kolven och skaka i 5 minuter. Filtrera omedelbart genom ett glasfiberfilter. Spara lösningen för reningen (5.3). 5.3 Rening 5.3.1 Förberedelse av aluminiumoxidkolonnen Sätt en liten propp av glasull i glaskolonnens (4.1) nedre öppning och pressa ihop den med en glasstav. Väg upp 11,0 g av den förbehandlade aluminiumoxiden (3.5) och för över till kolonnen. Försök minimera exponeringen för luft under detta arbetsmoment. Knacka försiktigt på kolonnens nederdel så att aluminiumoxiden sätter sig. 5.3.2 Rening av prov Pipettera över 5,0 ml av det provextrakt som beretts enligt 5.2 till kolonnen. Håll pipettens spets nära kolonnväggen och låt lösningen absorberas av aluminiumoxiden. Eluera robenidinet från kolonnen med 100 ml metanol (3.1), flödeshastighet 2–3 ml/minut, och samla upp eluatet i en 250 ml rundkolv. Låt metanollösningen indunsta fullständigt i rotationsindunstaren (4.3) under reducerat tryck vid 40 o C. Lös upp återstoden i 3–4 ml mobil fas (3.8) och överför kvantitativt till en 10 ml mätkolv. Skölj kolven med flera volymer mobil fas om 1–2 ml och överför sköljvätskan till mätkolven. Späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. En alikvot av lösningen filtreras genom ett 0,45 μm membranfilter (4.7). Denna lösning används sedan för HPLC-bestämningen (5.4). 5.4 HPLC-bestämning 5.4.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.4.1), Mobil fas för HPLC (3.8), Flödeshastighet: 1,5–2 ml/minut, Detektionsvåglängd: 317 nm, Injektionsvolym: 20–50 μl. Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera en kalibreringslösning (3.9.3) med koncentrationen 3,6 μg/ml tills topphöjder och retentionstider är konstanta. 5.4.2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringslösning (3.9.3) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjder (areor) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln. 5.4.3 Provlösning Provextraktet (5.3.2) injiceras upprepade gånger, varvid samma volym ska användas som för kalibreringslösningarna. Bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för robenidin. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens robenidintoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.4.2). Provets robenidinhalt w (mg/kg) beräknas med formeln där: c = provlösningens robenidinkoncentration i μg/ml m = provets vikt i gram. 7. Validering av resultat 7.1 Identitet Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.9.3) som innehåller 6 μg/ml jämförs. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.9.3). Mängden tillsatt robenidin bör motsvara den uppskattade mängden robenidin i provextraktet. Endast robenidintoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden 7.1.2 Diod-array-detektion Resultaten utvärderas enligt följande kriterier: a) Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm. b) Mellan 250 och 400 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans. c) Mellan 250 och 400 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen. Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats. 7.2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet för robenidinhalter över 15 mg/kg. 7.3 Utbyte För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 85 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse inom EU fick tolv laboratorier analysera fyra prov av fjäderfä- och kaninfoder i form av mjöl eller pellets. För varje prov gjordes dubbla analyser. Resultaten redovisas i nedanstående tabell: Fjäderfä Kanin Mjöl Pellets Mjöl Pellets Medelvärde [mg/kg] 27,00 27,99 43,6 40,1 s r [mg/kg] 1,46 1,26 1,44 1,66 CV r [ %] 5,4 4,5 3,3 4,1 S R [mg/kg] 4,36 3,36 4,61 3,91 CV R [ %] 16,1 12,0 10,6 9,7 Utbyte [ %] 90,0 93,3 87,2 80,2 s r = standardavvikelse för repeterbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet, % S R = standardavvikelse för reproducerbarhet CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet, % F. BESTÄMNING AV DICLAZURIL (+)-4-klorfenyl [2,6-diklor-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten av diclazuril i foder och förblandningar bestämmas. Detektionsgränsen är 0,1 mg/kg och kvantifieringsgränsen 0,5 mg/kg. 2. Princip Efter tillsats av intern standard extraheras provet med surgjord metanol. För foder renas en alikvot av extraktet på en C 18 -kolonn för fastfasextraktion. Diclazuril elueras från kolonnen med en blandning av surgjord metanol och vatten. Efter indunstning löses återstoden i DMF/vatten. För förblandningar indunstas extraktet och återstoden löses i DMF/vatten. Diclazurilhalten bestäms med ternär-gradient omvänd fas-kromatografi (HPLC) med UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Vatten, HPLC-kvalitet. 3.2 Ammoniumacetat 3.3 Tetrabutylammoniumvätesulfat (TBHS) 3.4 Acetonitril, HPLC-kvalitet 3.5 Metanol, HPLC-kvalitet 3.6 N, N-dimetylformamid (DMF) 3.7 Saltsyra, ρ 20 = 1,19 g/ml 3.8 Referenssubstans: diclazuril II-24: (+)-4-klorfenyl [2,6-diklor-4-(2,3,4,5-tetrahydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-yl)fenyl]acetonitril med garanterad renhet, E771 3.8.1 Stamlösning av diclazuril, 500 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg av diclazuril referenssubstans (3.8) i en 50 ml mätkolv. Lös i DMF (3.6), späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 o C. 3.8.2 Standardlösning av diclazuril, 50 μg/ml Överför 5,00 ml stamlösning (3.8.1) till en 50 ml mätkolv, späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i en månad vid högst 4 o C. 3.9 Intern standard: 2,6-diklor-(4-klorfenyl)-4-(4,5-dihydro-3,5-dioxo-1,2,4-triazin-2-(3H)-yl)-metylbensen-acetonitril 3.9.1 Stamlösning av intern standard, 500 μg/ml Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp 25 mg intern standard (3.9) i en 50 ml mätkolv. Lös i DMF (3.6), späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 o C. 3.9.2 Intern standardlösning, 50 μg/ml Överför 5,00 ml stamlösning av intern standard (3.9.1) till en 50 ml mätkolv, späd till märket med DMF (3.6) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 o C. 3.9.3 Intern standardlösning för förblandningar, p/1 000 mg/ml (p = nominell halt av diclazuril i förblandningen i mg/kg) Väg med en noggrannhet av 0,1 mg upp p/10 mg intern standard i en 100 ml mätkolv, lös i DMF (3.6) i ett ultraljudsbad (4.6), späd till märket med DMF och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd en kolv av brunt glas. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i 1 månad vid högst 4 o C. 3.10 Kalibreringslösning, 2 μg/ml. Pipettera över 2,00 ml diclazurilstandardlösning (3.8.2) och 2,00 ml intern standardlösning (3.9.2) till en 50 ml mätkolv. Tillsätt 16 ml DMF (3.6), späd till märket med vatten och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd. 3.11 C 18 -fastfasextraktionskolonn, t.ex. Bond Elut, storlek: 1 cm 3 , sorbent: 100 mg. 3.12 Extraktionsmedel: surgjord metanol. Pipettera 5,0 ml saltsyra (3.7) till 1 000 ml metanol (3.5) och blanda. 3.13 Mobil fas för HPLC 3.13.1 Eluent A: ammoniumacetat–tetrabutylammoniumvätesulfatlösning. Lös 5 g ammoniumacetat (3.2) och 3,4 g TBHS (3.3) i 1 000 ml vatten (3.1) och blanda. 3.13.2 Eluent B: acetonitril (3.4). 3.13.3 Eluent C: metanol (3.5). 4. Utrustning 4.1 Mekanisk skakapparat. 4.2 Utrustning för ternär-gradient-HPLC 4.2.1 HPLC-kolonn, Hypersil ODS, 3 μm packning, 100 × 4,6 mm, eller motsvarande 4.2.2 UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor. 4.3 Rotationsindunstare 4.4 Membranfilter, 0,45 μm 4.5 Vakuumgrenrör 4.6 Ultraljudsbad 5. Utförande 5.1 Allmänt 5.1.1 Blankprov Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken diclazuril eller störande ämnen är närvarande. Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet och varken diclazuril eller störande ämnen ska kunna påvisas i det. 5.1.2 Utbytesförsök Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd diclazuril som finns i provet. För spikning på nivån 1 mg/kg, sätt 0,1 ml stamlösning av intern standard (3.8.1) till 50 g av ett blankprov, blanda noga och låt stå i 10 minuter. Blanda sedan flera gånger före extraktionen (5.2). Om ett blankprov av samma typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1) kan ett utbytesförsök göras med standardadditionsmetoden. Denna innebär att det prov som ska analyseras spikas med ungefär samma mängd diclazuril som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det ospikade provet, och utbytet beräknas sedan genom subtraktion. 5.2 Extraktion 5.2.1 Foder Väg med 0,01 g noggrannhet upp ca 50 g prov. Överför detta till en 500 ml E-kolv, tillsätt 1,00 ml intern standardlösning (3.9.2) och 200 ml extraktionsmedel (3.12) och tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4.1) över natten. Låt stå i 10 minuter. Överför en 20 ml alikvot av supernatanten till ett lämpligt glaskärl och späd med 20 ml vatten. Överför denna lösning till en extraktionskolonn (3.11) och låt den passera genom kolonnen med hjälp av vakuum (4.5). Tvätta kolonnen med 25 ml av en blandning av extraktionsmedel (3.12) och vatten, 65 + 35 (v + v). Kasta de uppsamlade fraktionerna och eluera ämnena med 25 ml av en blandning av extraktionsmedel (3.12) och vatten, 80 + 20 (v + v). Indunsta denna fraktion i en rotationsindunstare (4.3) vid 60 o C tills den precis har torkat. Lös återstoden i 1,0 ml DMF (3.6), tillsätt 1,5 ml vatten och blanda. Filtrera genom ett membranfilter (4.4). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3). 5.2.2 Förblandningar Väg med 0,001 g noggrannhet upp ca 1 g prov. Överför detta till en 500 ml E-kolv, tillsätt 1,00 ml intern standardlösning (3.9.3) och 200 ml extraktionsmedel (3.12) och tillslut kolven. Skaka blandningen i skakapparaten (4.1) över natten. Låt stå i 10 minuter. Överför en alikvot på 10 000/p ml (p = nominell halt av diclazuril i förblandningen i mg/kg) av supernatanten till en rundkolv av lämplig storlek. Indunsta i en rotationsindunstare (4.3) under reducerat tryck vid 60 o C tills återstoden precis har torkat. Lös återstoden i 10,0 ml DMF (3.6), tillsätt 15,0 ml vatten (3.1) och blanda. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3). 5.3 HPLC-bestämning 5.3.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.2.1): 100 × 4,6 mm, Hypersil ODS, 3 μm packning, eller motsvarande Mobil fas : Eluent A (3.13.1): Vattenlösning av ammonium-acetat och tetrabutylammonium-vätesulfat Eluent B (3.13.2): acetonitril Eluent C (3.13.3): metanol Elueringssätt: — linjär gradient — utgångsförhållanden: A + B + C = 60 + 20 + 20 (v + v + v) — efter 10 minuters gradienteluering i 30 min. till: A + B + C = 45 + 20 + 35 (v + v + v). Skölj med B i 10 min. Flödeshastighet: 1,5–2 ml/min Injektionsvolym: 20 μl Detektorvåglängd: 280 nm Kontrollera det kromatografiska systemets stabilitet genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.10), som innehåller 2 μg/ml, till dess att topphöjder och retentionstider är konstanta. 5.3.2 Kalibreringslösning Injicera 20 μl av kalibreringslösningen (3.10) upprepade gånger och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för diclazuril och den interna standarden. 5.3.3 Provlösning Injicera 20 μl av provlösningen (5.2.1 eller 5.2.2) upprepade gånger och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för diclazuril och den interna standarden. 6. Beräkning av resultat 6.1 Foder Provets diclazurilhalt w (mg/kg) beräknas med formeln [mg/kg] där: h d, s = topphöjd (area) för diclazuril i provlösningen (5.2.1) h i, s = topphöjd (area) för den interna standarden i provlösningen (5.2.1) h d, c = topphöjd (area) för diclazuril i kalibreringslösningen (3.10) h i, c = topphöjd (area) för den interna standarden i kalibreringslösningen (3.10) c d, c = diclazurilkoncentration i kalibreringslösningen i μg/ml (3.10) m = provets vikt i gram V = provextraktets volym i ml (= 2,5 ml), se 5.2.1. 6.2 Förblandningar Provets diclazurilhalt w (mg/kg) beräknas med formeln [mg/kg] där: h d, c = topphöjd (area) för diclazuril i kalibreringslösningen (3.10) h i, c = topphöjd (area) för den interna standarden i kalibreringslösningen (3.10) h d, s = topphöjd (area) för diclazuril i provlösningen (5.2.2) h i, s = topphöjd (area) för den interna standarden i provlösningen (5.2.2) c d, c = diclazurilkoncentration i kalibreringslösningen i μg/ml (3.10) m = provets vikt i gram V = provextraktets volym i ml (= 25 ml), se 5.2.2 p = nominell halt av diclazuril i mg/kg i förblandningen. 7. Validering av resultaten 7.1 Identitet Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet (5.2.1 eller 5.2.2) och kalibreringslösningen (3.10) jämförs. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt (5.2.1 eller 5.2.2) spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.10). Mängden tillsatt diclazuril bör vara samma som den mängd diclazuril som finns i provextraktet. Endast höjden på diclazuriltoppen och på den topp som motsvarar den interna standarden ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden på toppen för diclazuril eller för den interna standarden i det ospikade provextraktet. 7.1.2 Diod-array-detektion Resultaten utvärderas enligt följande kriterier: a) Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm. b) Mellan 230 och 320 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans. c) Mellan 230 och 320 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen. Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats. 7.2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 30 % av det högre värdet för diclazurilhalter på 0,5–2,5 mg/kg — 0,75 mg/kg för diclazurilhalter på 2,5–5 mg/kg — 15 % av det högre värdet för diclazurilhalter över 5 mg/kg 7.3 Utbyte För ett spikat (blank)prov ska utbytet vara minst 80 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse analyserades fem prov av elva laboratorier. Proven utgjordes av två förblandningar, en blandad med en organisk matris (O 100) och den andra med en oorganisk matris (A 100). Den teoretiska halten är 100 mg diclazuril per kg. De tre foderblandningarna för fjäderfä kom från tre olika företag (NL) (L1/Z1/K1). Den teoretiska halten är 1 mg diclazuril per kg. Laboratorierna instruerades att göra en eller två analyser av varje prov. (Närmare upplysningar om provningsjämförelsen finns i Journal of AOAC International , volym 77, nr 6, 1994, s. 1359–1361). Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Prov 1 A 100 Prov 2 O 100 Prov 3 L1 Prov 4 Z1 Prov 5 K1 L 11 11 11 11 6 n 19 18 19 19 12 Medelvärde 100,8 103,5 0,89 1,15 0,89 S r (mg/kg) 5,88 7,64 0,15 0,02 0,03 CV r ( %) 5,83 7,38 17,32 1,92 3,34 S R (mg/kg) 7,59 7,64 0,17 0,11 0,12 CV R ( %) 7,53 7,38 18,61 9,67 13,65 Nominell halt (mg/kg) 100 100 1 1 1 L = antal laboratorier n = antal enskilda värden S r = standardavvikelse för repeterbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet S R = standardavvikelse för reproducerbarhet CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet 9. Anmärkningar Diclazurilresponsen måste tidigare ha visats vara linjär i det koncentrationsintervall mätningarna gäller. G. BESTÄMNING AV NATRIUMLASALOCID Ett natriumsalt av en polyeter-monokarboxylsyra som produceras av Streptomyces lasaliensis 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten natriumlasalocid bestämmas i foder och förblandningar. Detektionsgränsen är 5 mg/kg och kvantifieringsgränsen 10 mg/kg. 2. Princip Natriumlasalocid extraheras från provet med surgjord metanol och en bestämning görs med omvänd fas-kromatografi (HPLC) och en spektrofluorometrisk detektor. 3. Reagens 3.1 Kaliumdivätefosfat (KH 2 PO 4 ) 3.2 Ortofosforsyra, w = 85 % (w/w) 3.3 Lösning av ortofosforsyra, c = 20 % Späd 23,5 ml ortofosforsyra (3.2) med vatten till 100 ml. 3.4 6-metyl-2-heptylamin (1,5-dimetylhexylamin), w = 99 % (w/w) 3.5 Metanol, HPLC-kvalitet. 3.6 Saltsyra, densitet = 1,19 g/ml 3.7 Fosfatbuffertlösning, c = 0,01 mol/l Lös 1,36 gram KH 2 PO 4 (3.1) i 500 ml vatten (3.11). Tillsätt 3,5 ml ortofosforsyra (3.2) och 10,0 ml 6-metyl-2-heptylamin (3.4). Justera pH till 4,0 med ortofosforsyralösningen (3.3) och späd med vatten (3.11) till 1 000 ml. 3.8 Surgjord metanol För över 5,0 ml saltsyra (3.6) till en 1 000 ml mätkolv. Späd till märket med metanol (3.5) och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd. 3.9 Mobil fas för HPLC: lösning av fosfatbuffert och metanol 5 + 95 (v + v) Blanda 5 ml fosfatbuffertlösning (3.7) med 95 ml metanol (3.5). 3.10 Natriumlasalocid referenssubstans med garanterad renhet, C 34 H 53 O 8 Na (ett natriumsalt av en polyeter-monokarboxylsyra som produceras av Streptomyces lasaliensis ), E763 3.10.1 Stamlösning av natriumlasalocid, 500 μg/ml Väg upp 50 mg natriumlasalocid (3.10) med en noggrannhet av 0,1 mg i en 100 ml mätkolv. Lös natriumlasalociden i surgjord metanol (3.8), späd till märket med samma lösningsmedel och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd. 3.10.2 Arbetsstandardlösning av natriumlasalocid, 50 μg/ml Pipettera 10,0 ml stamlösning (3.10.1) till en 100 ml mätkolv. Späd till märket med surgjord metanol (3.8) och blanda. Denna lösning ska vara nyberedd. 3.10.3 Kalibreringslösningar Överför 1,0–2,0–4,0–5,0 och 10,0 ml arbetsstandardlösning (3.10.2) till en serie 50 ml mätkolvar. Späd till märket med surgjord metanol (3.8) och blanda. De erhållna lösningarna innehåller 1,0–2,0–4,0–5,0 respektive 10,0 μg natriumlasalocid per ml. Dessa lösningar ska vara nyberedda. 3.11 Vatten, HPLC-kvalitet. 4. Utrustning 4.1 Termostatreglerat ultraljudsbad (eller skakapparat med vattenbad) 4.2 Membranfilter, 0,45 μm 4.3 HPLC-utrustning med injektor, anpassad för volymer på 20 μl 4.3.1 HPLC-kolonn, 125 × 4 mm, omvänd fas, C 18 , 5 μm packning eller motsvarande 4.3.2 Spektrofluorometer med variabel excitations- och emissionsvåglängd 5. Utförande 5.1 Allmänt 5.1.1 Blankprov Inför utbytesförsöket (5.1.2) analyseras ett blankprov för att kontrollera att varken natriumlasalocid eller störande ämnen är närvarande. Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet och varken natriumlasalocid eller störande ämnen ska kunna påvisas i det. 5.1.2 Utbytesförsök Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd natriumlasalocid som finns i provet. För spikning på nivån 100 mg/kg överförs 10,0 ml stamlösning (3.10.1) till en 250 ml E-kolv och får indunsta till dess att ca 0,5 ml återstår. Tillsätt 50 g av blankprovet, blanda ordentligt, låt stå i 10 minuter och blanda igen flera gånger före extraktionen (5.2). Om ett blankprov av liknande typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1), kan ett utbytesförsök göras med standardadditionsmetoden. Det prov som ska analyseras spikas då med ungefär samma mängd natriumlasalocid som finns i provet. Det erhållna provet analyseras sedan tillsammans med ett prov som inte spikats, och utbytet beräknas genom subtraktion. 5.2 Extraktion 5.2.1 Foder Väg upp 5–10 g av provet med en noggrannhet av 0,01 gram i en 250 ml E-kolv med propp. Tillsätt med pipett 100,0 ml surgjord metanol (3.8). Sätt i proppen löst och rotera kolven för att dispergera provet. Ställ kolven i ett ca 40 o C ultraljudsbad (4.1) i 20 minuter. Ta upp kolven ur badet och låt den svalna till rumstemperatur. Låt stå i ca 1 timme så att de suspenderade partiklarna sjunker till botten. Filtrera en alikvot genom ett 0,45 μm membranfilter (4.2) till ett lämpligt kärl. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3). 5.2.2 Förblandningar Väg med en noggrannhet av 0,001 gram upp ca 2 gram av den omalda förblandningen i en 250 ml mätkolv. Tillsätt 100,0 ml surgjord metanol (3.8) och rotera kolven för att dispergera provet. Ställ kolven med innehåll i ett ca 40 o C ultraljudsbad (4.1) i 20 minuter. Ta upp kolven ur badet och låt den svalna till rumstemperatur. Späd till märket med surgjord metanol (3.8) och blanda omsorgsfullt. Låt stå i 1 timme så att de suspenderade partiklarna sjunker till botten. Filtrera en alikvot genom ett 0,45 μm membranfilter (4.2). Späd en lämplig volym av klart filtratet med surgjord metanol (3.8) så att en slutlig provlösning erhålls som innehåller ca 4 μg natriumlasalocid/ml. Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3). 5.3 HPLC-bestämning 5.3.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.3.1): 125 × 4 mm, omvänd fas C 18 , 5 μm packning eller motsvarande Mobil fas (3.9): Blandning av fosfatbuffertlösning (3.7) och metanol (3.5), 5+95 (v+v) Flödeshastighet: 1,2 ml/min Detektionsvåglängder: Excitation: 310 nm Emission: 419 nm Injektionsvolym: 20 μl Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.10.3) med koncentrationen 4,0 μg/ml till dess att topphöjder (areor) och retentionstider är konstanta. 5.3.2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringslösning (3.10.3) upprepade gånger och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjd (area) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln. 5.3.3 Provlösning Injicera upprepade gånger de provextrakt som erhållits i 5.2.1 eller 5.2.2. Använd samma volym som för kalibreringslösningen. Bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för natriumlasalocid. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjd (area) som erhållits vid injektion av provlösningen (5.3.3) för att bestämma koncentrationen natriumlasalocid (μg/ml) med hjälp av kalibreringskurvan. 6.1 Foder Halten av natriumlasalocid, w (mg/kg) i provet beräknas med formeln [mg/kg] där: c = koncentrationen av natriumlasalocid i provlösningen (5.2.1) i μg/ml V 1 = provextraktets volym i ml (= 100 ml), se 5.2.1 m = provets vikt i gram. 6.2 Förblandningar Halten av natriumlasalocid, w (mg/kg) i provet beräknas med formeln [mg/kg] där: c = koncentrationen av natriumlasalocid i provlösningen (5.2.1) i μg/ml V 2 = provextraktets volym i ml (= 250 ml), se 5.2.2 f = spädningsfaktor, se 5.2.2 m = provets vikt i gram. 7. Validering av resultaten 7.1 Identitet Metoder som grundar sig på spektrofluorometri medför inte samma problem med interferenser som metoder med UV-detektion. Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt (5.2.1 eller 5.2.2) spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.10.3). Mängden tillsatt natriumlasalocid bör vara ungefär lika stor som den ursprungliga mängden natriumlasalocid i provextraktet. Endast natriumlasalocidtoppens höjd ska öka i förhållande till mängden tillsatt natriumlasalocid och provextraktets spädning. Toppens bredd på halva höjden får inte avvika mer än ± 10 % från värdet för den ursprungliga topp som motsvarar det ospikade provextraktet. 7.2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 15 % av det högre värdet, för halter av natriumlasalocid på 30–100 mg/kg, — 15 mg/kg, för halter på 100–200 mg/kg, — 7,5 % av det högre värdet, för halter som överstiger 200 mg/kg. 7.3 Utbyte För det spikade (blank)provet ska utbytet vara minst 80 %. För de spikade förblandningsproven ska utbytet vara minst 90 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse ( 6 ) analyserades två förblandningar (prov 1 och 2) och fem fodertyper (prov 3–7) av tolv laboratorier. Varje prov analyserades två gånger. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Prov 1 Förblandning för kyckling Prov 2 Förblandning för kalkon Prov 3 Pellets för kalkon Prov 4 Kycklingfoder Prov 5 Kalkonfoder Prov 6 Fjäderfäfoder A Prov 7 Fjäderfäfoder B L 12 12 12 12 12 12 12 n 23 23 23 23 23 23 23 Medelvärde [mg/kg] 5 050 16 200 76,5 78,4 92,9 48,3 32,6 s r [mg/kg] 107 408 1,71 2,23 2,27 1,93 1,75 CV r [ %] 2,12 2,52 2,24 2,84 2,44 4,00 5,37 s R [mg/kg] 286 883 3,85 7,32 5,29 3,47 3,49 CV R [ %] 5,66 5,45 5,03 9,34 5,69 7,18 10,70 Nominell halt [mg/kg] 5 000 ( 7 ) 16 000 ( 7 ) 80 ( 7 ) 105 ( 7 ) 120 ( 7 ) 50 ( 8 ) 35 ( 8 ) L = antal laboratorier n = antal enskilda värden s r = standardavvikelse för repeterbarhet s R = standardavvikelse för reproducerbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet, % CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet, % ( 1 ) Genomförd av arbetsgruppen för foder inom Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA). ( 2 ) Genomförd av arbetsgruppen för foder inom Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA). ( 3 ) Andra metoder för uppslutning (t.ex. uppslutning med mikrovågor, under tryck) får användas om man kunnat visa att de ger liknande resultat. ( 4 ) Grönfoder (färskt eller torkat) innehåller ofta stora mängder silikater. Dessa måste avlägsnas, eftersom spårelement annars riskerar att kvarhållas. Prov från sådant foder måste därför behandlas enligt följande modifierade förfarande: Utför steg 5.1.1.1 till och med filtreringen. Skölj filtrerpapperet med den olösliga återstoden två gånger med kokande vatten, och lägg det sedan i en degel av kvarts eller platina. Glödga i muffelugnen (4.1) vid en temperatur lägre än 550 o C tills allt kolhaltigt material har försvunnit. Låt svalna. Tillsätt några droppar vatten, följt av 10–15 ml fluorvätesyra (3.4) och låt vätskan avdunsta fullständigt vid ca 150 o C. Eventuella kvarvarande silikater i återstoden löses upp i några milliliter fluorvätesyra (3.4) som därefter får avdunsta fullständigt. Tillsätt fem droppar svavelsyra (3.5) och upphetta tills ingen vit rök längre avges. Tillsätt 5 ml 6 M saltsyra (3.2) samt ca 30 ml vatten och upphetta på nytt. Filtrera över lösningen till en 250 ml mätkolv och späd till märket med vatten (HCl-koncentration ca 0,5 M). Fortsätt sedan bestämningen enligt punkt 5.1.2. ( 5 ) The Analyst 108, 1983, s. 1252–1256. ( 6 ) Analyst , 1995, 120, 2175–2180. ( 7 ) Halt deklarerad av tillverkaren. ( 8 ) Foder berett i laboratoriet. BILAGA V ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV FRÄMMANDE ÄMNEN I FODER A. BESTÄMNING AV HALT FRI GOSSYPOL OCH TOTALHALT GOSSYPOL 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten fri gossypol, totalhalten gossypol och kemiskt besläktade ämnen bestämmas i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrökakor samt i foderblandningar som innehåller dessa foderråvaror, om halten av fri gossypol, totalhalten gossypol och kemiskt besläktade ämnen överstiger 20 mg/kg. 2. Princip Gossypol extraheras i närvaro av 3-amino-1-propanol, antingen med en blandning av 2-propanol och hexan (vid bestämning av fritt gossypol) eller med dimetylformamid (vid bestämning av totalhalt gossypol). Gossypol omvandlas med anilin till gossypol-dianilin, vars absorbans mäts vid 440 nm. 3. Reagens 3.1 Blandning av 2-propanol och hexan: blanda 60 volymdelar 2-propanol med 40 volymdelar n -hexan. 3.2 Lösningsmedel A: Tillsätt ca 500 ml 2-propanol-hexanblandning (3.1), 2 ml 3-amino-1-propanol, 8 ml isättika och 50 ml vatten i en 1 000 ml mätkolv. Späd med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till full volym. Lösningen är stabil i en vecka. 3.3 Lösningsmedel B: Pipettera över 2 ml 3-amino-1-propanol och 10 ml isättika till en 100 ml mätkolv. Kyl till rumstemperatur och späd med N, N-dimetylformamid till full volym. Lösningen är stabil i en vecka. 3.4 Anilin: Om blankprovets absorbans överstiger 0,022 , destilleras anilinet över zinkpulver och de första och sista tio procenten av destillatet kastas. Om detta reagens kylförvaras i en brun glaskolv med propp är det hållbart i flera månader. 3.5 Standardgossypollösning A: Tillsätt 27,9 mg gossypolacetat i en 250 ml mätkolv. Lös upp och späd med lösningsmedel A (3.2) till full volym. Pipettera över 50 ml av denna lösning till en 250 ml mätkolv och späd med lösningsmedel A till full volym. Gossypolkoncentrationen i denna lösning är 0,02 mg/ml. Låt lösningen stå 1 timme i rumstemperatur innan den används. 3.6 Standardgossypollösning B: Tillsätt 27,9 mg gossypolacetat i en 50 ml mätkolv. Lös upp och späd med lösningsmedel B (3.3) till full volym. Gossypolkoncentrationen i denna lösning är 0,5 mg/ml. Standardgossypollösningarna A och B är stabila i 24 timmar om de skyddas från ljus. 4. Utrustning 4.1 Rotationsskakapparat: ca 35 varv per minut. 4.2 Spektrofotometer. 5. Utförande 5.1 Analysprov Analysprovets storlek beror på den antagna gossypolhalten i provet. Det är bäst att arbeta med ett litet analysprov och en relativt stor alikvot av filtratet så att man får en tillräckligt stor mängd gossypol för att kunna göra en exakt fotometrisk mätning. Vid bestämning av fri gossypol i bomullsfrö, bomullsfrömjöl och bomullsfrökakor bör analysprovet väga högst 1 gram. När det gäller foderblandningar kan provet väga upp till 5 g. I de flesta fall är det lämpligt med en alikvot på 10 ml av filtratet som bör innehålla 50–100 μg gossypol. Vid bestämning av totalhalt gossypol bör analysprovet väga 0,5–5 g så att en alikvot på 2 ml av filtratet innehåller 40–200 μg gossypol. Analysen bör utföras vid rumstemperatur, ca 20 o C. 5.2 Bestämning av fri gossypol Placera analysprovet i en 250 ml kolv med slipad hals där kolvens botten täckts med krossat glas. Tillsätt med pipett 50 ml lösningsmedel A (3.2), tillslut kolven och blanda i 1 timme på skakapparaten. Filtrera genom torrt filter och samla upp filtratet i en liten kolv med slipad hals. Täck tratten med urglas under filtreringen. Pipettera över identiska alikvoter av filtratet med en gossypolhalt på 50–100 μg till två 25 ml mätkolvar (A och B). Späd vid behov med lösningsmedel A (3.2) till 10 ml. Späd därefter innehållet i kolv A med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till full volym. Denna lösning används som referenslösning för provlösningens mätvärden. Pipettera över 10 ml av lösningsmedel A (3.2) till var och en av två andra 25 ml mätkolvar (C och D). Späd innehållet i kolv C med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till full volym. Denna lösning används som referenslösning för blankprovlösningens mätvärden. Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till kolvarna D och B. Upphetta i 30 minuter på kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, späd med 2-propanol-hexanblandning (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå 1 timme. Bestäm dels blankprovlösningens (D) absorbans genom att jämföra med referenslösningen (C), dels provlösningens (B) absorbans genom att jämföra med referenslösningen (A) i spektrofotometern vid 440 nm med 1 cm glasceller. Subtrahera blankprovlösningens absorbans från provlösningens (korrigerad absorbans). Beräkna utifrån det erhållna värdet halten fri gossypol enligt anvisningarna i punkt 6. 5.3 Bestämning av totalhalt gossypol Placera ett analysprov som innehåller 1–5 mg gossypol i en 50 ml mätkolv och tillsätt 10 ml lösningsmedel B (3.3). Bered samtidigt ett blankprov genom att tillföra 10 ml lösningsmedel B (3.3) i en annan 50 ml mätkolv. Upphetta de två kolvarna i 30 minuter på kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur och späd innehållet i båda kolvarna med 2-propanol-hexanblandningen till full volym (3.1). Homogenisera och låt stå i 10–15 minuter. Filtrera därefter och samla upp filtraten i kolvar med slipad hals. Pipettera över 2 ml av provfiltratet till var och en av två 25 ml mätkolvar, och 2 ml av blankprovfiltratet till två andra 25 ml mätkolvar. Späd innehållet i en kolv från varje serie med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till 25 ml. Dessa lösningar används som referenslösningar. Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av de andra två kolvarna. Upphetta i 30 minuter på kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, späd med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till 25 ml, homogenisera och låt stå 1 timme. Bestäm absorbansen enligt anvisningarna i punkt 5.2 för fri gossypol. Beräkna utifrån det erhållna värdet totalhalten gossypol enligt anvisningarna i punkt 6. 6. Beräkning av resultat Resultaten kan beräknas antingen från den specifika absorbansen (6.1) eller med hjälp av en kalibreringskurva (6.2). 6.1 Från den specifika absorbansen Den specifika absorbansen blir enligt de beskrivna villkoren följande: Fri gossypol Totalhalt gossypol Halten fri gossypol eller totalhalten gossypol beräknas med formeln % gossypol: där: E = korrigerad absorbans, bestämd enligt 5.2 p = provets vikt i gram a = alikvot av filtratet i ml. 6.2 Från en kalibreringskurva 6.2.1 Fri gossypol Ställ i ordning två serier med fem 25 ml mätkolvar. Pipettera över 2,0–4,0–6,0–8,0 respektive 10,0 ml standardgossypollösning A (3.5) till vardera serien av mätkolvar. Späd med lösningsmedel A (3.2) till 10 ml. Komplettera varje serie med en 25 ml mätkolv som endast innehåller 10 ml lösningsmedel A (3.2) (blankprov). Späd innehållet i den första serien mätkolvar (inklusive den med blankprovet) till 25 ml med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) (referensserie). Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av mätkolvarna i den andra serien (inklusive den med blankprovet). Upphetta i 30 minuter på kokande vattenbad så att färgen framträder. Kyl till rumstemperatur, späd med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå 1 timme (standardserie). Bestäm enligt 5.2 absorbansen för lösningarna i standardserien genom att jämföra med motsvarande lösningar i referensserien. Konstruera kalibreringskurvan genom att avsätta absorbansvärdena mot motsvarande kvantiteter gossypol (i μg). 6.2.2 Totalhalt gossypol Ställ i ordning sex stycken 50 ml mätkolvar. Tillsätt 10 ml lösningsmedel B i den första mätkolven (3.3) och 2,0–4,0–6,0–8,0 respektive 10,0 ml standardgossypollösning B i de övriga (3.6). Späd innehållet i varje mätkolv till 10 ml med lösningsmedel B (3.3). Upphetta i 30 minuter på kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur, späd med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till full volym och homogenisera. Överför 2,0 ml av dessa lösningar till två serier med vardera sex 25 ml mätkolvar. Späd innehållet i den första seriens kolvar till 25 ml med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) (referensserie). Tillsätt 2 ml anilin (3.4) till var och en av kolvarna i den andra serien. Upphetta i 30 minuter på kokande vattenbad. Kyl till rumstemperatur, späd med 2-propanol-hexanblandningen (3.1) till full volym, homogenisera och låt stå 1 timme (standardserie). Bestäm enligt 5.2 absorbansen för lösningarna i standardserien genom att jämföra med motsvarande lösningar i referensserien. Konstruera kalibreringskurvan genom att avsätta absorbansvärdena mot motsvarande kvantiteter gossypol (i μg). 6.3 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten av två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 15 % av det högre värdet för gossypolhalter under 500 ppm, — 75 ppm i absoluta tal för halter på 500–750 ppm, — 10 % av det högre värdet för halter över 750 ppm. B. BESTÄMNING AV DIOXINHALTER (PCDD/PCDF) OCH HALTER AV DIOXINLIKA PCB I. PROVTAGNINGSMETODER OCH TOLKNING AV ANALYSRESULTAT 1. Syfte och tillämpningsområde Provtagning för offentlig kontroll av halter av dioxiner (polyklorerade dibensodioxiner (PCDD) och polyklorerade dibensofuraner (PCDF) och dioxinlika polyklorerade bifenyler (PCB) ( 1 ) i foder ska göras i enlighet med bilaga I. De kvantitativa kraven i fråga om kontroll av ämnen eller produkter som är jämnt fördelade i fodret enligt punkt 5.A i bilaga I ska uppfyllas. De erhållna samlingsproven ska betraktas som representativa för de partier eller delpartier från vilka de tas. Bedömningen av om gränsvärdena enligt Europaparlamentets och rådets direktiv 2002/32/EG ( 2 ) överskrids eller inte ska göras på grundval av de halter som bestäms i laboratorieproven. 2. Partiets eller delpartiets överensstämmelse med specifikationen Partiet godkänns om resultatet av en enkelanalys inte överskrider tillämpligt gränsvärde enligt direktiv 2002/32/EG, med hänsyn tagen till mätosäkerheten. Partiet överensstämmer inte med högsta tillåtna halt enligt direktiv 2002/32/EG om det är ställt utom rimligt tvivel att analysresultatet avseende övre koncentrationer ( 3 ) , bekräftat genom dubbelanalys ( 4 ) , överskrider den högsta tillåtna halten med hänsyn tagen till mätosäkerheten. För att ta hänsyn till mätosäkerheten kan någon av följande metoder användas: — Beräkning av den utvidgade osäkerheten, varvid en täckningsfaktor på 2 används vilket ger en konfidensgrad av omkring 95 %. Ett parti uppfyller inte kraven om det uppmätta värdet minus U överstiger det högsta tillåtna värdet. Om det har gjorts en separat bestämning av dioxiner och dioxinlika PCB ska summan av den uppskattade utvidgade mätosäkerheten för de enskilda analysresultaten avseende dioxiner och dioxinlika PCB användas för summan av dioxiner och dioxinlika PCB. — Fastställande av beslutsgränsen (CCα) enligt kommissionens beslut 2002/657/EG ( 5 ) (punkt 3.1.2.5 i bilagan – ämnen med en fastställd gräns). Ett parti uppfyller inte kraven om det uppmätta värdet är lika med eller högre än CCα-värdet. Dessa tolkningsregler ska tillämpas på de resultat som fås vid analys av prov för offentlig kontroll. De påverkar inte medlemsstaternas rätt att tillämpa nationella regler på analyser som görs för överklagande eller referensändamål. II. PROVBEREDNING OCH KRAV PÅ ANALYSMETODER FÖR OFFENTLIG KONTROLL AV DIOXINHALTER (PCDD/PCDF) OCH HALTER AV DIOXINLIKA PCB 1. Syfte och tillämpningsområde Dessa krav ska tillämpas när foderråvaror och foder analyseras för bestämning av halterna av dioxiner (polyklorerade dibenso-p-dioxiner [PCDD] och polyklorerade dibensofuraner [PCDF]) och dioxinlika polyklorerade bifenyler (PCB). Förekomsten av dioxiner i foder kan övervakas genom användning av screeningmetoder för urval av prov där halten av dioxiner och dioxinlika PCB ligger mindre än 25 % under eller överstiger den givna nivån. Dioxinkoncentrationerna i dessa prov med betydande halter ska bestämmas/bekräftas med en konfirmeringsmetod. Screeningmetoder är metoder som används för att påvisa förekomst av dioxiner och dioxinlika PCB på en given nivå. Dessa metoder har en hög provkapacitet och används för att undersöka ett stort antal prov för att sålla fram eventuellt positiva resultat. De är särskilt utformade för att undvika falskt negativa resultat. Konfirmeringsmetoder är metoder som ger fullständig eller kompletterande information så att dioxiner och dioxinlika PCB otvetydigt kan identifieras och kvantifieras på den givna nivån. 2. Bakgrund Eftersom miljöprov och biologiska prov (bl.a. prov från foderråvaror eller foder) i regel innehåller komplexa blandningar av olika dioxinkongener har begreppet ekvivalensfaktorer för toxicitet (TEF – Toxic Equivalency Factors ) utvecklats för att underlätta riskbedömningen. Dessa TEF-värden har fastställts för att man ska kunna ange halten för blandningar av 2,3,7,8-substituerade PCDD och PCDF och vissa non-orto- och mono-orto-klorsubstituerade PCB med dioxinlika egenskaper i toxicitetsekvivalenter (TEQ) av 2,3,7,8-TCDD. Koncentrationerna av de enskilda ämnena i ett visst prov ska multipliceras med ämnenas respektive TEF-värde och därefter adderas så att man får fram den totala koncentrationen av dioxinlika föreningar, uttryckt som toxicitetsekvivalenter (TEQ). Vid tillämpning av denna förordning ska den godtagna särskilda kvantifieringsgränsen av en enskild kongen vara den koncentration av en analyt i ett provextrakt som ger ett instrumentutslag vid de två skilda joner som ska kontrolleras, med ett S/N-förhållande (signal-brusförhållande) på 3:1 för den mindre känsliga signalen, och som uppfyller grundkraven såsom retentionstid och isotopkvot enligt det bestämningsförfarande som beskrivs i den amerikanska miljöskyddsmyndighetens ( Environment Protection Agency ) metod 1613, revidering B. 3. Krav på kvalitetssäkring vid beredning av prov De allmänna bestämmelserna i bilaga II om beredning av analysprov ska tillämpas. Dessutom ska följande krav uppfyllas: — Proven ska förvaras och transporteras i behållare av glas, aluminium, polypropylen eller polyeten. Spår av pappersdamm ska avlägsnas från provbehållaren. Behållare av glas ska sköljas med lösningsmedel som tidigare kontrollerats med avseende på förekomst av dioxiner. — En analys med blankprov ska göras genom att hela analysen utförs men utan analysprov. — Vikten på det prov som extraheras ska vara tillräckligt hög för att kraven på känslighet ska uppfyllas. 4. Krav på laboratorier — Laboratorierna ska påvisa en metods prestanda inom intervallet för den givna nivån, t.ex. 0,5 ×, 1 × och 2 × den givna nivån med en godtagbar variationskoefficient för upprepade analyser. Närmare uppgifter om kraven för godtagande finns i punkt 5. — Kvantifieringsgränsen för en konfirmeringsmetod ska motsvara ungefär en femtedel av den givna nivån, så att de godtagbara variationskoefficienterna inte överskrids i området kring den givna nivån. — Regelbundna blankprov och spikningsförsök eller analys av kontrollprov (helst med certifierat referensmaterial om sådant finns) ska utföras som interna åtgärder för kvalitetskontroll. — Bästa sättet att styrka kompetensen när det gäller enskilda analysmetoder är ett framgångsrikt deltagande i provningsjämförelser för bedömning av laboratoriekompetens. Ett framgångsrikt deltagande i sådana jämförelser när det gäller t.ex. analys av prov från jord eller avloppsvatten behöver dock inte innebära att det också finns kompetens för prov från livsmedel eller foder där föroreningshalterna är lägre. Det är därför obligatoriskt att fortlöpande delta i provningsjämförelser för bestämning av halten av dioxiner och dioxinlika PCB i den foder- eller livsmedelsmatris det gäller. — Laboratorierna ska ackrediteras av ett godkänt ackrediteringsorgan som verkar enligt ISO Guide 58 för att säkerställa att de tillämpar kvalitetssäkring vid analyser. Laboratorierna bör ackrediteras enligt standarden ISO/IEC/17025. 5. Krav på analysmetoder för dioxiner och dioxinlika PCB Grundläggande krav för godtagande av analysmetoder — Hög känslighet och låg detektionsgräns. Eftersom vissa typer av PCDD och PCDF är extremt toxiska måste detektionsgränsen för dessa ämnen ligga i storleksordningen pikogram TEQ (10 -12 g). Det är känt att PCB brukar förekomma i högre halter än PCDD och PCDF. För de flesta PCB-kongener räcker det att känsligheten ligger i storleksordningen nanogram (10 -9 g). Vid mätning av mer toxiska dioxinlika PCB-kongener (särskilt non-ortosubstituerade kongener) måste dock samma känslighet uppnås som för PCDD och PCDF. — Hög selektivitet (specificitet). PCDD, PCDF och dioxinlika PCB måste kunna skiljas från en stor mängd andra föreningar som extraheras samtidigt och ingår i koncentrationer flerfaldigt högre än hos den givna analyten och som kan störa analysen. Metoder som bygger på gaskromatografi i kombination med masspektrometri (GC-MS) måste kunna särskilja mellan olika kongener, exempelvis mellan toxiska sådana (t.ex. de sjutton 2,3,7,8-substituerade PCDD och PCDF samt dioxinlika PCB) och andra, icke-toxiska. Med bioassay ska det vara möjligt att fastställa TEQ-värden selektivt som summan av PCDD, PCDF och dioxinlika PCB. — Hög noggrannhet (riktighet och precision). Bestämningen ska ge en giltig och tillförlitlig uppskattning av den sanna halten i ett prov. En hög noggrannhet (med mätningens noggrannhet avses hur väl mätresultatet överensstämmer med provets sanna eller angivna halt) krävs för att resultatet av en provanalys inte ska avvisas på grund av dålig tillförlitlighet när det gäller uppskattningen av TEQ-värdet. Noggrannheten uttrycks som riktighet (skillnaden mellan det medelvärde som har uppmätts för en analyt i ett certifierat material och dess certifierade värde, uttryckt som ett procenttal av detta värde) och precision (RSD R , dvs. den relativa standardavvikelsen beräknad utifrån de resultat som erhållits under reproducerbara förhållanden). Screeningmetoderna kan vara bioassaytekniker och metoder som bygger på gaskromatografi i kombination med masspektrometri (GC-MS). Konfirmeringsmetoder är metoder som bygger på högupplösande gaskromatografi i kombination med högupplösande masspektrometri (HRGC/HRMS). Följande krav måste uppfyllas för det totala TEQ-värdet: Screeningmetoder Konfirmeringsmetoder Falskt negativa resultat < 1 % Riktighet -20 % till + 20 % Precision, RSD R < 30 % < 15 % 6. Särskilda krav på metoder för gaskromatografi och masspektrometri för screening- eller konfirmeringsmetoder — Interna standarder i form av 13 C-märkt 2,3,7,8-klorsubstituerat PCDD/F och i form av 13 C-märkta dioxinlika PCB-standarder ska tillsättas alldeles i början av analysen, t.ex. före extraktionen, för att validera analysmetoden. Minst en kongen för varje tetra- till oktaklorerad homolog grupp av PCDD/F och minst en kongen för varje homolog grupp av dioxinlika PCB ska tillsättas (alternativt tillsätts minst en kongen för varje masspektrometrisk SIR-funktion [selektiv jonregistrering], som används för att kontrollera PCDD/F och dioxinlika PCB). Det avgjort bästa, särskilt för konfirmeringsmetoder, är att använda alla de sjutton 13 C-märkta 2,3,7,8-substituerade interna PCDD/F-standarderna och alla de tolv 13 C-märkta interna dioxinlika PCB-standarderna (om dioxinlika PCB ska bestämmas). — Med hjälp av lämpliga kalibreringslösningar ska relativa responsfaktorer också bestämmas för de kongener till vilka ingen 13 C-märkt analog tillsätts. — För foder av vegetabiliskt eller animaliskt ursprung som innehåller mindre än 10 % fett ska interna standarder tillsättas innan extraktionen görs. För foder av animaliskt ursprung som innehåller mer än 10 % fett kan interna standarder tillsättas antingen före eller efter extraktionen av fett. Extraktionens effektivitet ska valideras på lämpligt sätt med hänsyn till i vilket skede de interna standarderna tillsätts och till om resultaten rapporteras på grundval av produkten eller fettet. — Före en GC-MS-analys ska en eller två utbytesstandarder (surrogat) tillsättas. — En kontroll av utbytet är nödvändig. För konfirmeringsmetoder ska utbytet av de enskilda interna standarderna ligga i intervallet 60–120 %. Lägre eller högre utbyte för enskilda kongener – särskilt för vissa hepta- och oktaklorerade dibensodioxiner och dibensofuraner – kan godtas under förutsättning att deras bidrag till det totala TEQ-värdet inte överstiger 10 % (bygger på summan av PCDD/F och dioxinlika PCB). För screeningmetoder ska utbytet ligga i intervallet 30–140 %. — Dioxiner ska separeras från störande klorföreningar såsom icke-dioxinlika PCB och klorerade difenyletrar med hjälp av en lämplig kromatografisk teknik (lämpligtvis med hjälp av en florisil-, aluminiumoxid- och/eller kolkolonn). — Gaskromatografisk separation av isomerer är tillräcklig (< 25 % mellan två toppar för 1,2,3,4,7,8-HxCDF och 1,2,3,6,7,8-HxCDF). — Bestämningen ska göras enligt den amerikanska miljöskyddsmyndighetens ( Environment Protection Agency ) metod 1613, revidering B: Tetra-through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMS eller någon annan metod som uppfyller motsvarande krav. — Skillnaden mellan den övre och den lägre gränsen bör inte överstiga 20 % för foder med en dioxinhalt omkring eller över gränsvärdet. För foder med kontamineringsgrader som är klart lägre än den högsta tillåtna halten kan skillnaden ligga i intervallet 25–40 %. 7. Metoder för screeninganalys 7.1 Inledning Olika analysmodeller kan användas för en screeningmetod: enkel screening eller kvantitativ bestämning. Enkel screening Provens respons jämförs med responsen från referensprovet vid den givna nivån. Prov vars respons ligger under referensprovets ska betraktas som negativa, medan de som uppvisar starkare respons ska ses som misstänkt positiva. Följande krav gäller: — Varje testserie ska innehålla ett blankprov och ett referensprov. Proven i serien ska extraheras och testas samtidigt under identiska förhållanden. Referensprovet måste visa klart högre respons än blankprovet. — Ytterligare referensprov på 0,5 och 2 gånger den givna nivån bör tas med för att påvisa analysens tillförlitlighet inom ett relevant intervall för kontrollen av den givna nivån. — När andra matriser testas ska referensprovens användbarhet påvisas, helst genom att man tar med prov som vid bestämning med HRGC-HRMS visat sig innehålla ungefär samma TEQ-halt som referensprovet, eller ett blankprov där motsvarande mängd tillsatts. — Eftersom inga interna standarder kan användas i bioassay, är tester för att kontrollera repeterbarheten mycket viktiga för att bedöma standardavvikelsen inom en testserie. Variationskoefficienten ska vara lägre än 30 %. — För bioassay bör det definieras vilka ämnen som detekteras, möjliga interferenser samt de högsta värden för blankprov som är godtagbara. Kvantitativ bestämning Den kvantitativa bestämningen kräver standardspädningsserier, dubbel eller tredubbel rening och mätning samt kontroll av blankprov och utbyte. Resultatet kan uttryckas som ett TEQ-värde, varvid det antas att de föreningar som ger upphov till signalen följer TEQ-principen. I detta syfte används TCDD (eller en standardblandning av dioxiner, furaner och dioxinlika PCB) för att konstruera en kalibreringskurva, och med hjälp av denna beräknas sedan TEQ-värdet i extraktet, och därigenom i själva provet. Det erhållna TEQ-värdet korrigeras därefter för det TEQ-värde som beräknats för ett blankprov (för att beakta föroreningar från lösningsmedel och andra kemikalier som använts) och ett utbyte (beräknat utifrån TEQ-värdet i ett prov för kvalitetskontroll som ungefär motsvarar den givna nivån). Det är viktigt att observera att en del av den synbara utbytesförlusten kan bero på matriseffekter och/eller skillnader mellan TEF-värdena i bioassay och de officiella TEF-värden som WHO fastställt. 7.2 Krav på analysmetoder vid screening — GC-MS-metoder för analys samt bioassay kan användas vid screening. För GC-MS-metoder ska kraven i punkt 6 tillämpas. För cellbaserad bioassay fastställs särskilda krav i punkt 7.3 och för bioassay i form av kit i punkt 7.4. — Det är nödvändigt med information om antalet falskt positiva och falskt negativa resultat från ett stort antal prov, vars halter ligger under respektive över de högsta tillåtna halterna eller åtgärdsgränserna, i jämförelse med de TEQ-värden som bestämts med en konfirmeringsmetod. Den faktiska frekvensen av falskt negativa resultat bör vara lägre än 1 %. Frekvensen av falskt positiva prov bör vara så låg att det lönar sig att använda en screeningmetod. — Positiva resultat ska alltid kontrolleras med en konfirmeringsmetod – högupplösande gaskromatografi (HRGC) och högupplösande masspektrometri (HRMS). Prov från ett stort TEQ-intervall bör dessutom kontrolleras med HRGC-HRMS (ca 2–10 % av de negativa proven). Uppgifter om överensstämmelse mellan resultaten från bioassay respektive HRGC-HRMS bör finnas tillgängliga. 7.3 Särskilda krav på cellbaserad bioassay — När en bioassay används ska varje testkörning omfatta en serie av referenskoncentrationer av TCDD eller en dioxin-furanblandning (fullständig dos-responskurva där R 2 > 0,95). För screening kan dock en utvidgad lågnivåkurva för analys av prov med låga halter användas. — En TCDD-referenskoncentration (motsvarande ungefär 3 gånger kvantifieringsgränsen) på ett kvalitetskontrollformulär bör användas för resultatet från bioassay under en konstant tidsperiod. Ett alternativ skulle kunna vara den relativa responsen från ett referensprov i jämförelse med TCDD-kalibreringskurvan, eftersom cellernas respons kan bero på många faktorer. — Kvalitetskontrolldiagram för varje typ av referensmaterial bör framställas och kontrolleras för att säkerställa att resultatet är i enlighet med de fastställda riktlinjerna. — Särskilt när det gäller kvantitativa beräkningar ska induktionen av det utspädda provet befinna sig inom den linjära delen av responskurvan. Prov ovanför den linjära delen av responskurvan ska spädas ut och testas på nytt. Därför rekommenderas det att minst tre spädningar testas samtidigt. — Standardavvikelsen bör inte överstiga 15 % vid tredubbel bestämning för varje provspädning och inte 30 % mellan tre oberoende försök. — Detektionsgränsen kan sättas till 3 gånger standardavvikelsen för blankprovlösningen eller bakgrundsresponsen. Ett annat tillvägagångssätt är att använda en respons som ligger över bakgrunden (induktionsfaktor 5 gånger blankprovlösningen) som beräknats från samma dags kalibreringskurva. Kvantifieringsgränsen kan sättas till 5–6 gånger standardavvikelsen för blankprovlösningen eller bakgrundsresponsen eller så kan man använda en respons som ligger klart över bakgrunden (induktionsfaktor 10 gånger blankprovlösningen) som beräknats från samma dags kalibreringskurva. 7.4 Särskilda krav på bioassay i form av kit — Bioassay i form av kit ska vara tillräckligt känsliga och tillförlitliga för att få användas på livsmedel. — Tillverkarens anvisningar för provberedning och analyser ska följas. — Testkit ska inte användas efter utgångsdatum. — Material eller komponenter som utformats för användning med andra kit ska inte användas. — Testkit ska förvaras inom angivet intervall för lagringstemperatur och användas vid angiven användningstemperatur. — Detektionsgränsen för immunoassay bestäms som summan av medelvärdet och 3 gånger standardavvikelsen vid 10 upprepade analyser av blankprovet, delat med lutningskoefficienten för den linjära regressionsekvationen. — Referensstandarder ska användas för laboratorietester för att säkerställa att responsen för standarden ligger inom ett godtagbart intervall. 8. Rapportering av resultat I den utsträckning den använda analysmetoden medger det ska analysresultaten innehålla halterna av de enskilda PCDD/F- och PCB-kongenerna rapporterade som lägre koncentrationer, övre koncentrationer och mellanvärde för att vid resultatrapporteringen lämna så mycket information som möjligt så att resultaten kan tolkas utifrån särskilda krav. Rapporten bör också innehålla uppgifter om provets fetthalt samt om vilken fettextraktionsmetod som använts. Utbytena av de enskilda interna standarderna ska redovisas om utbytena ligger utanför det intervall som anges i punkt 6, eller när de högsta tillåtna halterna överskrids, samt i övriga fall på begäran. Eftersom mätosäkerheten ska beaktas vid bedömning av om ett prov uppfyller kraven, bör också denna parameter anges. Analysresultatet bör rapporteras som x +/- U, där x är analysresultatet och U den utvidgade mätosäkerheten, beräknad med en täckningsfaktor på 2, vilket ger en konfidensgrad på ca 95 %. Om det har gjorts en separat bestämning av dioxiner och dioxinlika PCB ska summan av den uppskattade utvidgade mätosäkerheten för de enskilda analysresultaten avseende dioxiner och dioxinlika PCB användas för summan av dioxiner och dioxinlika PCB. Om CCα har använts för att fastställa mätosäkerheten (se avsnitt I.2 i denna del B) ska denna parameter anges. ( 1 ) Tabell över TEF-värden (ekvivalensfaktorer för toxicitet) för dioxiner, furaner och dioxinlika PCB: Kongen TEF-värde Kongen TEF-värde Dibenso-p-dioxiner (PCDD) Dioxinlika PCB: 2,3,7,8-TCDD 1 1,2,3,7,8-PeCDD 1 Non-orto-PCB 1,2,3,4,7,8-HxCDD 0,1 PCB 77 0,0001 1,2,3,6,7,8-HxCDD 0,1 PCB 81 0,0001 1,2,3,7,8,9-HxCDD 0,1 PCB 126 0,1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDD 0,01 PCB 169 0,01 OCDD 0,0001 Mono-orto PCB PCB 105 0,0001 Dibenzofuraner (PCDF) PCB 114 0,0005 2,3,7,8-TCDF 0,1 PCB 118 0,0001 1,2,3,7,8-PeCDF 0,05 PCB 123 0,0001 2,3,4,7,8-PeCDF 0,5 PCB 156 0,0005 1,2,3,4,7,8-HxCDF 0,1 PCB 157 0,0005 1,2,3,6,7,8-HxCDF 0,1 PCB 167 0,00001 1,2,3,7,8,9-HxCDF 0,1 PCB 189 0,0001 2,3,4,6,7,8-HxCDF 0,1 1,2,3,4,6,7,8-HpCDF 0,01 1,2,3,4,7,8,9-HpCDF 0,01 OCDF 0,0001 Förkortningar: T = tetra, Pe = penta, Hx = hexa, Hp = hepta, O = okta, CDD = klordibenso-p-dioxin, CDF = klordibensofuran, CB = klorbifenyl. ( 2 ) EGT L 140, 30.5.2002, s. 10 . ( 3 ) Begreppet ”övre koncentrationer” kräver att man använder kvantifieringsgränsen för bidraget från varje icke kvantifierad kongen till TEQ-värdet (toxicitetsekvivalenter). Begreppet ”lägre koncentrationer” innebär att bidraget från varje icke kvantifierad kongen till TEQ-värdet sätts till noll. Begreppet ”mellanvärde” kräver användning av halva kvantifieringsgränsen vid beräkning av bidraget från varje icke kvantifierad kongen till TEQ-värdet. ( 4 ) Två analyser behövs för att utesluta möjligheten av intern korskontamination eller oavsiktlig hopblandning av prov. Den första analysen, där mätosäkerheten beaktas, används för kontroll av att kraven är uppfyllda. Om analysen utförs i samband med en incident där kontaminering med dioxin har ägt rum, kan bekräftelse med hjälp av dubbelanalys utelämnas om de prov som utvalts för analys genom spårbarhet kan kopplas till incidenten. ( 5 ) EGT L 221, 17.8.2002, s. 8 . BILAGA VI ANALYSMETODER FÖR BESTÄMNING AV BESTÅNDSDELAR AV ANIMALISKT URSPRUNG FÖR OFFENTLIG KONTROLL AV FODER Villkor för mikroskopisk påvisning, identifiering eller uppskattning av beståndsdelar av animaliskt ursprung i foder 1. Syfte och tillämpningsområde Följande villkor ska uppfyllas för mikroskopisk påvisning av beståndsdelar av animaliskt ursprung (definierade som produkter från beredning av kroppar och kroppsdelar av däggdjur, fjäderfä och fisk) i foder inom ramen för det samordnade kontrollprogrammet enligt Europaparlamentets och rådets förordning (EG) 882/2004. Förutsatt att metoderna i denna bilaga används i alla officiella tester, får ett andra test göras med avvikande eller alternativa metoder i syfte att med större tillförlitlighet kunna påvisa vissa typer av animaliska beståndsdelar eller ytterligare specificera de animaliska beståndsdelarnas ursprung. En avvikande metod får dessutom användas då särskilda animaliska beståndsdelar undersöks, t.ex. plasma eller ben i talg (se även punkt 9), under förutsättning att dessa analyser endast kompletterar de analyser som föreskrivs i det samordnade kontrollprogrammet. 2. Känslighet Beroende på de animaliska beståndsdelarnas beskaffenhet kan mycket små mängder (< 0,1 %) i foder påvisas. 3. Princip Ett representativt prov, uttaget enligt bilaga I och berett på lämpligt sett, ska användas vid identifieringen. Följande metod lämpar sig för hantering av foder med låg vattenhalt. Foder med en vattenhalt över 14 % ska torkas (kondenseras) före hantering. Specialfoder och vissa foderråvaror (till exempel fetter och oljor) kräver särskild behandling (se punkt 9). Beståndsdelar av animaliskt ursprung identifieras utifrån typiska kännetecken som kan urskiljas vid mikroskopering (t.ex. muskelfibrer och andra köttpartiklar, brosk, ben, horn, hår, borst, blod, fjädrar, äggskal, fiskben och fjäll). Identifieringen ska göras både på siktfraktionen (6.1) och på det koncentrerade sedimentet (6.2) av provet. 4. Reagens 4.1 Inbäddningsmedel 4.1.1 Kloralhydrat (vattenlösning, 60 % w/v). 4.1.2 Lut (NaOH 2,5 % w/v eller KOH 2,5 % w/v) för siktfraktioner. 4.1.3 Paraffinolja eller glycerol (viskositet: 68–81) för mikroskopering av sedimentet. 4.2 Sköljmedel 4.2.1 Alkohol, 96 %. 4.2.2 Aceton. 4.3 Koncentreringsmedel 4.3.1 Tetrakloreten (densitet 1,62). 4.4 Färgreagens 4.4.1 Jod-kaliumjodidlösning (lös upp 2 g kaliumjodid i 100 ml vatten och tillsätt 1 g jod under regelbunden omskakning). 4.4.2 Alizarin (blanda 2,5 ml 1 M saltsyra med 100 ml vatten och tillsätt 200 mg alizarin till denna lösning). 4.4.3 Cystinreagens (2 g blyacetat, 10 g NaOH/100 ml H 2 O). 4.4.4 Jod-kaliumjodidlösning (löst i 70 % etanol). 4.5 Blekmedel 4.5.1 I handeln förekommande natriumhypokloritlösning (9,6 % aktivt klor). 5. Utrustning och tillbehör 5.1 Analysvåg (noggrannhet 0,01 g, för koncentrerat sediment dock 0,001 g). 5.2 Utrustning för malning (kvarn eller mortel, särskilt för foder som innehåller mer än 15 % fett vid analystillfället). 5.3 Sikt med kvadratiska maskor på högst 0,50 mm. 5.4 Separertratt eller sedimentbägare med konisk botten. 5.5 Stereomikroskop (minst 40 ggr förstoring). 5.6 Mikroskop (minst 400 ggr förstoring), genomfallande eller polariserat ljus. 5.7 Laboratorieglas av standardtyp. All utrustning ska vara noggrant rengjord. Separertrattar och glasvaror ska rengöras i maskin. Siktar ska rengöras med borste med styva hår. 6. Utförande Foderpellets får siktas före analys om båda fraktionerna analyseras som separata prov. Minst 50 g av provet ska behandlas (vid behov malas noga med lämplig utrustning [5.2] för att det ska få lämplig struktur). Två representativa delar tas från det malda materialet, en för siktfraktionen (minst 5 g) (6.1) och en för det koncentrerade sedimentet (minst 5 g) (6.2). Färgreagens (6.3) kan också användas för att underlätta identifieringen. För att ange typ av animaliskt protein och partiklarnas ursprung kan man använda ett beslutstödssystem, t.ex. Aries, och dokumentera referensprover. 6.1 Identifiering av beståndsdelar av animaliskt ursprung i siktfraktionerna Minst 5 g av provet delas genom siktning (5.3) i två fraktioner. Siktfraktionen (eller en representativ del av fraktionen) med de stora partiklarna appliceras i ett tunt lager på lämpligt underlag och undersöks systematiskt i stereomikroskop (5.5) i olika förstoringsgrader med avseende på beståndsdelar av animaliskt ursprung. Objektglas med siktfraktionen med de små partiklarna undersöks systematiskt i mikroskop (5.6) i olika förstoringsgrader med avseende på beståndsdelar av animaliskt ursprung. 6.2 Identifiering av beståndsdelar av animaliskt ursprung i koncentrerat sediment Minst 5 g (med en noggrannhet av 0,01 g) av provet förs över i en separertratt eller en sedimentbägare med konisk botten och behandlas med minst 50 ml tetrakloreten (4.3.1). Blandningen rörs om eller skakas flera gånger. — Om en separertratt med lock används ska sedimentet stå tillräckligt länge (minst 3 minuter) innan det avskiljs. Sedan skakas det igen och får stå i ytterligare minst 3 minuter. Därefter avskiljs sedimentet på nytt. — Om en öppen bägare används ska sedimentet få stå i minst 5 minuter innan det avskiljs. Den totala mängden sediment torkas och vägs (med en noggrannhet på 0,001 g). Vägning behövs endast om det krävs en uppskattning. Om sedimentet består av många stora partiklar kan det siktas (5.3) i två fraktioner. Det torkade sedimentet undersöks med avseende på benfragment i stereomikroskop (5.5) och i mikroskop (5.6). 6.3 Användning av inbäddningsmedel och färgreagens Mikroskopisk identifiering av beståndsdelar av animaliskt ursprung kan underlättas med hjälp av särskilda inbäddningsmedel och färgreagens. Kloralhydrat (4.1.1): Genom försiktig uppvärmning kan cellstrukturerna ses tydligare eftersom stärkelsekornen gelatiniseras och oönskat cellinnehåll avlägsnas. Lut (4.1.2): Natriumhydroxid eller kaliumhydroxid renar foderråvaran och gör det lättare att påvisa muskelfibrer, hår och andra vävnader som innehåller keratin. Paraffinolja och glycerol (4.1.3): Ingående benfragment kan tydligt identifieras i detta inbäddningsmedel eftersom de flesta håligheterna förblir luftfyllda och syns som svarta hål på 5–15 μm. Jod-kaliumjodidlösning (4.4.1): Används för att påvisa stärkelse (blåviolett färg) och protein (gulorange färg). Lösningarna kan spädas vid behov. Alizarinlösning (4.4.2): Röd-rosa färgning av ben, fiskben och fjäll. Innan sedimentet torkas (se avsnitt 6.2) överförs allt sediment till ett provrör och sköljs två gånger med ca 5 ml alkohol (4.2.1) (använd varje gång en vortexblandare, låt lösningsmedlet klarna i ca 1 minut och häll därefter av det). Innan färgreagensen används ska sedimentet blekas genom tillsats av minst 1 ml natriumhypokloritlösning (4.5.1). Reaktionen får pågå i 10 minuter. Provröret fylls med vatten, och låt sedimentet avsätta sig i 2–3 minuter. Därefter hälls vattnet och de suspenderade partiklarna av. Sedimentet sköljs ytterligare två gånger med ca 10 ml vatten (använd vortexblandare, låt sedimentet avsätta sig och häll av vattnet varje gång). 2–10 droppar (beroende på mängden rester) alizarinlösning tillsätts. Blandningen skakas och reaktionen får pågå några sekunder. Det infärgade sedimentet sköljs två gånger med ca 5 ml alkohol (4.2.1) och sedan en gång med aceton (4.2.2) (använd varje gång en vortexblandare, låt lösningsmedlet klarna och häll därefter av det). Därefter är sedimentet klart för torkning. Cystinreagens (4.4.3): Vid försiktig uppvärmning blir beståndsdelar som innehåller cystin (hår, fjädrar m.m.) brunsvarta. 6.4 Undersökning av foder som kan innehålla fiskmjöl Minst ett objektglas från den fina siktfraktionen och ett från den fina fraktionen av sedimentet ska undersökas i mikroskop (5.6) (se avsnitten 6.1 och 6.2). Om fodret enligt märkningen innehåller fiskmjöl, eller om man misstänker eller påvisar förekomst av fiskmjöl vid den inledande undersökningen, ska ytterligare minst två objektglas från den fina siktfraktionen av det ursprungliga provet samt hela sedimentfraktionen undersökas. 7. Beräkning och bedömning Medlemsstaterna ska se till att metoderna i denna punkt används vid officiella analyser för att uppskatta mängden (inte bara förekomst av) animaliska beståndsdelar. Beräkningen kan endast göras om beståndsdelarna av animaliskt ursprung innehåller benfragment. Benfragment av varmblodiga landdjur (t.ex. däggdjur och fåglar) kan i objektglaset särskiljas från olika typer av fiskben genom typiska håligheter. Andelen beståndsdelar av animaliskt ursprung i de olika proven bedöms på grundval av — den uppskattade andelen (viktprocent) benfragment i det koncentrerade sedimentet, och — andelen (viktprocent) ben i beståndsdelarna av animaliskt ursprung. Bedömningen ska grundas på minst tre (om möjligt) objektglas och minst fem fält per objektglas. I foderblandningar innehåller det koncentrerade sedimentet i regel inte bara benfragment från landdjur och fiskbensfragment, utan också andra partiklar med hög specifik vikt, t.ex. mineraler, sand, förvedade växtfragment och liknande. 7.1 Uppskattad procentandel benfragment % benfragment från landdjur = (S × c)/W % fiskbens- och fjällfragment = (S × d)/W (S = sedimentvikt (mg), c = korrektionsfaktor ( %) för den uppskattade andelen benfragment från landdjur i sedimentet, d = korrektionsfaktor ( %) för den uppskattade andelen fiskbens- och fjällfragment i sedimentet, W = vikt av provmaterial till sedimentering (mg)) 7.2 Uppskattad mängd beståndsdelar av animaliskt ursprung Andelen ben i animaliska produkter kan variera kraftigt. (Andelen ben i benmjöl är ca 50–60 % och i köttmjöl ca 20–30 %. I fiskmjöl varierar andelen ben och fjäll beroende på fiskmjölets typ och ursprung, vanligtvis är den ca 10–20 %.) Om typen av djurmjöl i provet är känd kan innehållet uppskattas på följande sätt: Uppskattat innehåll av beståndsdelar av landdjursprodukter ( %) = (S × c)/(W × f) × 100 Uppskattat innehåll av beståndsdelar av fiskprodukter ( %) = (S × d)/(W × f) × 100 (S = sedimentvikt (mg), c = korrektionsfaktor ( %) för den uppskattade andelen benfragment från landdjur i sedimentet, d = korrektionsfaktor ( %) för den uppskattade andelen fiskbens- och fjällfragment i sedimentet, f = korrektionsfaktor för andelen ben i beståndsdelarna av animaliskt ursprung i det undersökta provet, W = vikt av provmaterial till sedimentering (mg)) 8. Redovisning av undersökningsresultatet Rapporten ska åtminstone ange om det förekommer beståndsdelar av landdjur eller fiskmjöl. De olika fallen kan rapporteras på följande sätt: 8.1 Förekomst av beståndsdelar av landdjur: — Inga beståndsdelar av landdjur har påvisats vid mikroskopisk undersökning av det inlämnade provet, eller — beståndsdelar av landdjur har påvisats vid mikroskopisk undersökning av det inlämnade provet. 8.2 Förekomst av fiskmjöl: — Inga beståndsdelar av fisk har påvisats vid mikroskopisk undersökning av det inlämnade provet, eller — beståndsdelar av fisk har påvisats vid mikroskopisk undersökning av det inlämnade provet. Om beståndsdelar av fisk eller landdjur påvisas kan rapporten vid behov även innehålla en uppskattning av de påvisade beståndsdelarna (x %, < 0,1 %, 0,1–0,5 %, 0,5–5 % eller > 5 %), ytterligare specifikation av typen av landdjur om möjligt och av de identifierade beståndsdelarna (muskelfibrer, brosk, ben, horn, hår, borst, blod, fjädrar, blod, äggskal, fiskben och fjäll). Om mängden animaliska beståndsdelar uppskattas, ska den korrektionsfaktor f som använts anges. Om benfragment från landdjur identifieras ska även följande anges i rapporten: ”Det kan inte uteslutas att ovannämnda beståndsdelar kommer från däggdjur.” Denna kompletterande angivelse behövs inte om benfragment från landdjur specificeras som benfragment från fjäderfä och benfragment från däggdjur. 9. Fakultativ metod för analys av fett eller olja Följande metod får användas för analys av fett eller olja: — Om fettet är fast värms det tills det blir flytande, t.ex. i en mikrovågsugn. — Med pipett överförs 40 ml av fettet från botten av provet till ett centrifugrör. — Centrifugera i 10 minuter med 4 000 varv per minut. — Om fettet är fast efter centrifugeringen värms det på nytt i ugn tills det blir flytande. Upprepa centrifugeringen i 5 minuter med 4 000 varv per minut. — Med en liten sked eller spatel överförs hälften av de dekanterade föroreningarna till en liten petriskål eller ett objektglas för mikroskopisk identifiering av eventuell förekomst av animaliska beståndsdelar (köttfibrer, fjädrar, benfragment m.m.). Som inbäddningsmedel för mikroskopundersökningen rekommenderas paraffinolja eller glycerol. — De återstående föroreningarna används för sedimentering enligt beskrivning i punkt 6.2. BILAGA VII METOD FÖR BERÄKNING AV ENERGIVÄRDET I FODER TILL FJÄDERFÄ 1. Beräkningsmetod och angivelse av energivärde Energivärdet i foderblandningar till fjäderfä ska beräknas enligt formeln nedan på grundval av visst analyserat innehåll i procent. Värdet ska anges i megajoule (MJ) omsättbar energi (OE), med korrigering för kväve, per kilo foderblandning: MJ/kg OE = 0,1551 × % råprotein +0,3431 × % råfett +0,1669 × % stärkelse +0,1301 × % totalhalt socker (uttryckt som sackaros). 2. Toleranser som är tillämpliga på deklarerade värden Om den officiella kontrollen visar en avvikelse (högre eller lägre energivärde i fodret) mellan kontrollresultatet och det deklarerade värdet ska en minimitolerans på 0,4 MJ/kg omsättbar energi tillåtas. 3. Resultatangivelse Det resultat som fås med hjälp av ovanstående formel ska anges med en decimal. 4. Provtagnings- och analysmetoder Provtagning av foderblandningen och bestämning av de beståndsdelar som anges i beräkningsmetoden ska utföras enligt gemenskapens metoder för provtagning och analys vid officiell foderkontroll. Följande metoder ska användas: — För bestämning av råfetthalt: metod B för bestämning av råfett i bilaga III del H. — För bestämning av stärkelsehalt: den polarimetriska metod som anges i bilaga III del L. BILAGA VIII ANALYSMETODER FÖR KONTROLL AV FÖREKOMST AV OTILLÅTNA FODERTILLSATSER Viktig anmärkning:Känsligare analysmetoder än de som anges i denna bilaga får användas för att påvisa otillåten förekomst av fodertillsatser som inte längre är tillåtna.Analysmetoderna i denna bilaga ska användas som konfirmeringsmetoder. A. BESTÄMNING AV METYLBENSOKVAT 7-bensyloxi-6-butyl-3-metoxikarbonyl-4-kinolon 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten metylbensokvat i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 1 mg/kg. 2. Princip Metylbensokvat extraheras från provet med en lösning av metansulfonsyra i metanol. Extraktet renas med diklormetan, genom jonbyteskromatografi och därefter åter med diklormetan. Metylbensokvathalten bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med en UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Diklormetan 3.2 Metanol, HPLC-kvalitet 3.3 Mobil fas för HPLC Blandning av metanol (3.2) och vatten (HPLC-kvalitet) 75 + 25 (v + v). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.5) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter). 3.4 Metansulfonsyralösning, c = 2 % Späd 20,0 ml metansulfonsyra till 1 000 ml med metanol (3.2). 3.5 Saltsyrelösning, c = 10 % Blanda 100 ml saltsyra (ρ 20 1,18 g/ml) med vatten till 1 000 ml. 3.6 Katjonbytarharts Amberlite CG-120 (Na), 100–200 mesh Hartset behandlas före användning: slamma upp 100 g harts i 500 ml saltsyrelösning (3.5) och värm under konstant omrörning på en värmeplatta tills det kokar. Låt svalna och dekantera av syran. Vakuumfiltrera genom ett filtrerpapper. Tvätta hartset två gånger med 500 ml vatten per gång och därefter med 250 ml metanol (3.2). Skölj hartset med ytterligare 250 ml metanol och torka genom att lufta filterkakan. Förvara det torkade hartset i en tillsluten flaska. 3.7 Referenssubstans: ren metylbensokvat (7-bensyloxi-6-butyl-3-metoxikarbonyl-4-kinolon) 3.7.1 Stamlösning av metylbensokvat, 500 μg/ml: Väg upp 50 mg metylbensokvat referenssubstans (3.7) med 0,1 mg noggrannhet. Lös upp i metansulfonsyralösning (3.4) i en 100 ml mätkolv. Fyll till märket och blanda. 3.7.2 Arbetsstandardlösning av metylbensokvat, 50 μg/ml: Överför 5,0 ml stamlösning av metylbensokvat (3.7.1) till en 50 ml mätkolv. Späd till märket med metanol (3.2) och blanda. 3.7.3 Kalibreringslösningar Överför 1,0–2,0–3,0–4,0 respektive 5,0 ml arbetsstandardlösning (3.7.2) till en serie 25 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.3) och blanda. De erhållna lösningarna har en metylbensokvatkoncentration på 2,0–4,0–6,0–8,0 respektive 10,0 μg/ml. Dessa lösningar ska vara nyberedda. 4. Utrustning 4.1 Skakapparat. 4.2 Rotationsindunstare. 4.3 Glaskolonn (250 × 15 mm) med avstängningsventil och en behållare med ca 200 ml volym. 4.4 HPLC-apparat med UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor. 4.4.1 HPLC-kolonn: 300 × 4 mm, C 18 , 10 μm packning eller motsvarande. 4.5 Membranfilter, 0,22 μm. 4.6 Membranfilter, 0,45 μm. 5. Utförande 5.1 Allmänt 5.1.1 Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken metylbensokvat eller störande ämnen är närvarande. 5.1.2 Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd metylbensokvat som finns i provet. För spikning på nivån 15 mg/kg, tillsätt 600 μl stamlösning (3.7.1) till 20 g av blankprovet, blanda och vänta i 10 minuter före extraktion (5.2). Anmärkning: För denna metod bör blankprovet vara av samma typ som analysprovet och metylbensokvat ska inte kunna påvisas. 5.2 Extraktion Väg med en noggrannhet av 0,01 g upp ca 20 gram av det beredda provet och överför till en 250 ml E-kolv. Tillsätt 100,0 ml metansulfonsyralösning (3.4) och skaka i skakapparat (4.1) i 30 minuter. Filtrera lösningen genom ett filtrerpapper och spara filtratet för vätskeextraktionen (5.3). 5.3 Vätskeextraktion Överför 25,0 ml av filtratet (se 5.2) till en 500 ml separertratt med 100 ml saltsyrelösning (3.5). Tillsätt 100 ml diklormetan (3.1) till separertratten och skaka i 1 minut. Låt skikten separera och tappa av det undre skiktet (diklormetan) i en 500 ml rundkolv. Upprepa extraktionen av vattenfasen med ytterligare två portioner om 40 ml diklormetan och överför dessa till det första extraktet i rundkolven. Indunsta diklormetanextraktet i en rotationsindunstare (4.2) under reducerat tryck vid 40 o C tills det är torrt. Lös upp återstoden i 20–25 ml metanol (3.2), tillslut kolven och spara allt extrakt för jonbyteskromatografin (5.4). 5.4 Jonbyteskromatografi 5.4.1 Beredning av katjonbytarkolonnen För in en glasullstuss i glaskolonnens nedre del (4.3). Slamma upp 5,0 g av det behandlade katjonbytarhartset (3.6) med 50 ml saltsyra (3.5), överför till glaskolonnen och låt sedimentera. Tappa av överskottet av syra till precis över hartsytan. Tvätta kolonnen med vatten tills eluatet är lackmusneutralt. Tillsätt 50 ml metanol (3.2) till kolonnen och låt rinna ned till hartsytan. 5.4.2 Kolonnkromatografi Pipettera försiktigt över det extrakt som fåtts fram enligt punkt 5.3 till kolonnen. Skölj rundkolven med två portioner på 5–10 ml metanol (3.2) och överför dessa sköljvätskor till kolonnen. Låt extraktet rinna ned till hartsytan och tvätta kolonnen med 50 ml metanol. Se till att flödeshastigheten inte överstiger 5 ml per minut. Häll bort eluatet. Eluera metylbensokvatet från kolonnen med 150 ml metansulfonsyralösning (3.4) och samla upp kolonneluatet i en 250 ml E-kolv. 5.5 Vätskeextraktion Överför det eluat som erhållits enligt punkt 5.4.2 till en 1 liters separertratt. Skölj E-kolven med 5–10 ml metanol (3.2) och blanda sköljvätskorna med innehållet i separertratten. Tillsätt 300 ml saltsyrelösning (3.5) och 130 ml diklormetan (3.1). Skaka i 1 minut och låt faserna separera. Tappa av det undre skiktet (diklormetan) i en 500 ml rundkolv. Upprepa extraktionen i vattenfasen med ytterligare två portioner på 70 ml diklormetan och blanda dessa extrakt med det första i rundkolven. Indunsta diklormetanextraktet i rotationsindunstaren (4.2) under reducerat tryck vid 40 o C tills det är torrt. Lös upp återstoden i kolven i ca 5 ml metanol (3.2) och överför denna lösning kvantitativt till en 10 ml mätkolv. Skölj rundkolven med ytterligare två portioner på 1–2 ml metanol och överför dessa till mätkolven. Späd med metanol till märket och blanda. Filtrera en alikvot av lösningen genom ett membranfilter (4.6). Spara denna lösning för HPLC-bestämning (5.6). 5.6 HPLC-bestämning 5.6.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. — HPLC-kolonn (4.4.1). — Mobil fas för HPLC: metanol-vattenblandning (3.3). — Flödeshastighet: 1–1,5 ml/minut. — Detektionsvåglängd: 265 nm. — Injektionsvolym: 20–50 μl. Kontrollera att kromatografisystemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.7.3) på 4 μg/ml, till dess att topphöjder (areor) och retentionstider är konstanta. 5.6.2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringslösning (3.7.3) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjder (areor) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln. 5.6.3 Provlösning Injicera provextraktet (5.5) upprepade gånger med samma volym som för kalibreringslösningarna, och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för metylbensokvat. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens metylbensokvattoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.6.2). Provets metylbensokvathalt w (mg/kg) beräknas med formeln där: c = provlösningens metylbensokvatkoncentration i μg/ml m = provets vikt i gram. 7. Validering av resultat 7.1 Identitet Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.7.3) som innehåller 10 μg/ml jämförs. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt spikas genom tillsats av lämplig mängd arbetsstandardlösning (3.7.2). Mängden tillsatt metylbensokvat bör vara ungefär lika stor som den uppskattade mängden metylbensokvat i provextraktet. Endast metylbensokvattoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom 10 % av den ursprungliga bredden. 7.1.2 Diod-array-detektion Resultaten utvärderas enligt följande kriterier: a) Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm. b) Mellan 220 och 350 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans. c) Mellan 220 och 350 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen. Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats. 7.2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 10 % av det högre värdet för metylbensokvathalter på 4–20 mg/kg. 7.3 Utbyte För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 90 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse Fem prov analyserades av tio laboratorier. Varje prov analyserades två gånger. Blankprov Mjöl 1 Pellet 1 Mjöl 2 Pellet 2 Medelvärde [mg/kg] ND 4,50 4,50 8,90 8,70 s r [mg/kg] –– 0,30 0,20 0,60 0,50 CV r [ %] –– 6,70 4,40 6,70 5,70 s R [mg/kg] –– 0,40 0,50 0,90 1,00 CV R [ %] –– 8,90 11,10 10,10 11,50 Utbyte [ %] –– 92,00 93,00 92,00 89,00 ND = analyten har ej påvisats s r = standardavvikelse för repeterbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet, % s R = standardavvikelse för reproducerbarhet CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet, % B. BESTÄMNING AV OLAKINDOX 2-[N-2'-(hydroxietyl)karbamoyl]-3-metylkinoxalin-N 1 ,N 4 -dioxid 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan halten olakindox i foder bestämmas. Kvantifieringsgränsen är 5 mg/kg. 2. Princip Provet extraheras med en vatten-metanolblandning. Olakindoxhalten bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med en UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Metanol. 3.2 Metanol, HPLC-kvalitet. 3.3 Vatten, HPLC-kvalitet. 3.4 Mobil fas för HPLC. Blandning av vatten (3.3) och metanol (3.2), 900 + 100 (v + v). 3.5 Referenssubstans: ren olakindox 2-[N-2'-(hydroxietyl)karbamoyl]-3-metylkinoxalin-N 1 ,N 4 -dioxid, E 851. 3.5.1 Stamlösning av olakindox, 250 μg/ml Väg med 0,1 mg noggrannhet upp 50 mg olakindox (3.5) i en 200 ml mätkolv och tillsätt ca 190 ml vatten. Ställ kolven i ett ultraljudsbad (4.1) i 20 minuter. Låt därefter lösningen anta rumstemperatur, späd till märket med vatten och blanda. Slå in mätkolven i aluminiumfolie och förvara den i kylskåp. Denna lösning ska beredas på nytt varje månad. 3.5.2 Arbetsstandardlösning av olakindox, 25 μg/ml Överför 10,0 ml stamlösning (3.5.1) till en 100 ml mätkolv, späd till märket med den mobila fasen (3.4) och blanda. Slå in mätkolven i aluminiumfolie och förvara den i kylskåp. Denna lösning ska beredas på nytt varje dag. 3.5.3 Kalibreringslösningar Överför 1,0–2,0–5,0–10,0–15,0 respektive 20,0 ml arbetsstandardlösning (3.5.2) till ett antal 50 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.4) och blanda. Slå in mätkolvarna i aluminiumfolie. Dessa lösningar har en olakindoxhalt på 0,5–1,0–2,5–5,0–7,5 respektive 10,0 μg/ml. Lösningarna ska beredas på nytt varje dag. 4. Utrustning 4.1 Ultraljudsbad. 4.2 Mekanisk skakapparat. 4.3 HPLC-utrustning med UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor. 4.3.1 HPLC-kolonn, 250 × 4 mm, C 18 , 10 μm packning eller motsvarande. 4.4 Membranfilter, 0,45 μm. 5. Utförande Anmärkning: Olakindox är ljuskänsligt. Utför alla moment i dämpad belysning eller använd bruna glaskärl. 5.1 Allmänt 5.1.1 Ett blankprov analyseras för att kontrollera att varken olakindox eller störande ämnen är närvarande. 5.1.2 Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd olakindox som finns i provet. För spikning på nivån 50 mg/kg, överför 10,0 ml stamlösning (3.5.1) till en 250 ml E-kolv och indunsta till ca 0,5 ml. Tillsätt 50 g av blankprovet, blanda ordentligt och låt stå i 10 minuter och rör sedan om igen flera gånger före extraktionen (5.2). Anmärkning: För denna metod bör blankprovet vara av samma typ som analysprovet och olakindox ska inte kunna påvisas. 5.2 Extraktion Väg med 0,01 g noggrannhet upp ca 50 g av provet. Överför materialet till en 1 000 ml E-kolv, tillsätt 100 ml metanol (3.1) och ställ kolven i ett ultraljudsbad (4.1) i 5 minuter. Tillsätt 410 ml vatten och låt kolven stå i badet ytterligare 15 minuter. Ta kolven ur badet, skaka den i 30 minuter i skakapparaten (4.2) och filtrera genom ett veckat filter. Överför 10,0 ml av filtratet till en 20 ml mätkolv, späd med vatten till märket och blanda. Filtrera en alikvot genom ett membranfilter (4.4). (Jfr punkt 9.) Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3). 5.3 HPLC-bestämning 5.3.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. Analyskolonn (4.3.1) Mobil fas (3.4): blandning av vatten (3.3) och metanol (3.2), 900 + 100 (v + v). Flödeshastighet: 1,5–2 ml/min. Detektionsvåglängd: 380 nm. Injektionsvolym: 20–100 μl. Kontrollera att kromatografisystemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.5.3) på 2,5 μg/ml, till dess att topphöjder och retentionstider är konstanta. 5.3.2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringslösning (3.5.3) upprepade gånger och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjd (area) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln. 5.3.3 Provlösning Injicera provextraktet (5.2) upprepade gånger med samma volym som för kalibreringslösningarna och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för olakindox. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens olakindoxtoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan. Provets olakindoxhalt w (mg/kg) beräknas med formeln: där: c = provextraktets olakindoxkoncentration (5.2) i μg/ml m = provets vikt i g (5.2). 7. Validering av resultat 7.1 Identitet Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet (5.2) och den kalibreringslösning (3.5.3) som innehåller 5,0 μg/ml jämförs. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt (5.2) spikas genom tillsats av lämplig mängd kalibreringslösning (3.5.3). Mängden tillsatt olakindox bör vara ungefär lika stor som mängden olakindox i provextraktet. Endast olakindoxtoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden på olakindoxtoppen i det ospikade provextraktet. 7.1.2 Diod-array-detektion Resultaten utvärderas enligt följande kriterier: a) Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm. b) Mellan 220 och 400 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans. c) Mellan 220 och 400 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen. Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats. 7.2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga 15 % av det högre värdet för olakindoxhalter på 10–200 mg/kg. 7.3 Utbyte För ett spikat blankprov ska utbytet vara minst 90 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse inom EU analyserades fyra prov från smågrisfoder, inklusive ett blankprov, av upp till tretton laboratorier. Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 L 13 10 11 11 n 40 40 44 44 Medelvärde [mg/kg] — 14,6 48,0 95,4 S r [mg/kg] — 0,82 2,05 6,36 S R [mg/kg] — 1,62 4,28 8,42 CV r [ %] — 5,6 4,3 6,7 CV R [ %] — 11,1 8,9 8,8 Nominell halt [mg/kg] — 15 50 100 Utbyte % — 97,3 96,0 95,4 L = antal laboratorier n = antal enskilda värden S r = standardavvikelse för repeterbarhet S R = standardavvikelse för reproducerbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet. 9. Anmärkning Även om metoden inte har validerats för foder med en olakindoxhalt över 100 mg/kg, bör man kunna få tillfredsställande resultat genom att ta en mindre mängd prov och/eller späda extraktet (5.2) så att man får en koncentration inom kalibreringskurvans område. C. BESTÄMNING AV AMPROLIUM 1-[(4-amino-2-propyl-5-pyrimidylmetyl]-2-metyl-pyridiniumkloridhydroklorid 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan amproliumhalten i foder och förblandningar bestämmas. Detektionsgränsen är 1 mg/kg och kvantifieringsgränsen 5 mg/kg. 2. Princip Provet extraheras med en metanol-vattenblandning. Efter spädning med den mobila fasen och membranfiltrering bestäms amproliumhalten genom katjonbyteskromatografi (HPLC) med UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Metanol. 3.2 Acetonitril, HPLC-kvalitet. 3.3 Vatten, HPLC-kvalitet. 3.4 Natriumdivätefosfatlösning, c = 0,1 mol/l. Lös 13,80 g natriumdivätefosfatmonohydrat i vatten (3.3) i en 1 000 ml mätkolv, späd till märket med vatten (3.3) och blanda. 3.5 Natriumperkloratlösning, c =1,6 mol/l. Lös 224,74 g natriumperkloratmonohydrat i vatten (3.3) i en 1 000 ml mätkolv, späd till märket med vatten (3.3) och blanda. 3.6 Mobil fas för HPLC (jfr punkt 9.1). Blandning av acetonitril (3.2), natriumdivätefosfatlösning (3.4) och natriumperkloratlösning (3.5), 450+450+100 (v+v+v). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm membranfilter (4.3) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad [4.4] i minst 15 minuter) före användning. 3.7 Referenssubstans: rent amprolium, 1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)metyl]-2-metyl-pyridiniumkloridhydroklorid, E 750 (jfr punkt 9.2). 3.7.1 Stamlösning av amprolium, 500 μg/ml Väg med 0,1 mg noggrannhet upp 50 mg amprolium (3.7) i en 100 ml mätkolv, lös upp i 80 ml metanol (3.1) och ställ kolven i ett ultraljudsbad i 10 min (4.4). Låt därefter lösningen anta rumstemperatur, späd till märket med vatten och blanda. Lösningen är stabil i en månad vid högst 4 o C. 3.7.2 Arbetsstandardlösning av amprolium, 50 μg/ml Pipettera över 5,0 ml stamlösning (3.7.1) till en 50 ml mätkolv, späd till märket med extraktionsmedlet (3.8) och blanda. Lösningen är stabil i en månad vid högst 4 o C. 3.7.3 Kalibreringslösningar Överför 0,5–1,0 respektive 2,0 ml arbetsstandardlösning (3.7.2) till tre 50 ml mätkolvar. Späd till märket med den mobila fasen (3.6) och blanda. De erhållna lösningarna har en amproliumhalt på 0,5–1,0 respektive 2,0 μg/ml. Dessa lösningar ska vara nyberedda. 3.8 Extraktionsmedel. Blandning av metanol (3.1) och vatten 2+1 (v+v). 4. Utrustning 4.1 HPLC-utrustning med injektionssystem avpassad för injektionsvolymer på 100 μl. 4.1.1 HPLC-kolonn 125 × 4 mm, katjonbytare Nucleosil 10 SA, 5 eller 10 μm packning, eller motsvarande. 4.1.2 UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor. 4.2 Membranfilter, PTFE-material, 0,45 μm. 4.3 Membranfilter, 0,22 μm. 4.4 Ultraljudsbad. 4.5 Mekanisk skakapparat eller magnetomrörare. 5. Utförande 5.1 Allmänt 5.1.1 Blankprov Inför utbytesförsöket (5.1.2) analyseras ett blankprov för att kontrollera att varken amprolium eller störande ämnen är närvarande. Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet och varken amprolium eller störande ämnen ska kunna påvisas i det. 5.1.2 Utbytesförsök Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov som spikats med ungefär samma mängd amprolium som finns i provet. För spikning på nivån 100 mg/kg, överför 10,0 ml stamlösning (3.7.1) till en 250 ml kolv och indunsta till ca 0,5 ml. Tillsätt 50 g av blankprovet, blanda ordentligt och låt stå i 10 minuter och rör sedan om igen flera gånger före extraktionen (5.2). Om ett blankprov av liknande typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1), kan ett utbytesförsök göras med standardadditionsmetoden. Det prov som ska analyseras spikas då med ungefär samma mängd amprolium som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det ospikade provet och utbytet kan beräknas genom subtraktion. 5.2 Extraktion 5.2.1 Förblandningar (< 1 % amprolium) och foder Väg med 0,01 g noggrannhet upp 5–40 g av provet, beroende på amproliumhalten, i en 500 ml E-kolv och tillsätt 200 ml extraktionsmedel (3.8). Ställ kolven i ultraljudsbad (4.4) och låt stå i 15 minuter. Ta kolven ur badet och skaka eller rör om i 1 timme med hjälp av skakapparat eller magnetomrörare (4.5). Späd en alikvot av extraktet med den mobila fasen (3.6) till en amproliumhalt på 0,5–2 μg/ml och blanda (se anmärkning 9.3). Filtrera 5–10 ml av denna utspädda lösning genom ett membranfilter (4.2). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3). 5.2.2 Förblandningar (≥ 1 % amprolium) Väg med 0,001 g noggrannhet upp 1–4 g av förblandningen, beroende på amproliumhalten, i en 500 ml E-kolv och tillsätt 200 ml extraktionsmedel (3.8). Ställ kolven i ultraljudsbad (4.4) och låt stå i 15 minuter. Ta kolven ur badet och skaka eller rör om i 1 timme med hjälp av skakapparat eller magnetomrörare (4.5). Späd en alikvot av extraktet med den mobila fasen (3.6) till en amproliumhalt på 0,5–2 μg/ml och blanda. Filtrera 5–10 ml av denna utspädda lösning genom ett membranfilter (4.2). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.3). 5.3 HPLC-bestämning 5.3.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.1.1): 125 × 4 mm, katjonbytare Nucleosil 10 SA, 5 eller 10 μm packning, eller motsvarande. Mobil fas (3.6): Blandning av acetonitril (3.2), natriumdivätefosfatlösning (3.4) och natriumperkloratlösning (3.5), 450+450+100 (v+v+v). Flödeshastighet: 0,7–1 ml/min Detektionsvåglängd: 264 nm Injektionsvolym: 100 μl Kontrollera att kromatografisystemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.7.3) på 1,0 μg/ml, till dess att topphöjder och retentionstider är konstanta. 5.3.2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringslösning (3.7.3) upprepade gånger och bestäm de genomsnittliga topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjd (area) längs y-axeln och motsvarande koncentrationer i μg/ml längs x-axeln. 5.3.3 Provlösning Injicera provextraktet (5.2) upprepade gånger med samma volym som för kalibreringslösningarna och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för amprolium. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens amproliumtoppar för att bestämma koncentrationen i g/ml med hjälp av kalibreringskurvan. Provets amproliumhalt w (mg/kg) beräknas med formeln [mg/kg] där: V = extraktionsmedlets (3.8) volym i ml enligt 5.2 (dvs. 200 ml) c = provextraktets amproliumkoncentration (5.2) i μg/ml f = spädningsfaktor enligt 5.2 m = provets vikt i gram. 7. Validering av resultat 7.1 Identitet Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet (5.2) och den kalibreringslösning (3.7.3) som innehåller 2,0 μg/ml jämförs. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt (5.2) spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.7.3). Mängden tillsatt amprolium bör vara ungefär lika stor som mängden amprolium i provextraktet. Endast amproliumtoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd ska på halva höjden ligga inom ± 10 % av den ursprungliga bredden på amproliumtoppen i det ospikade provextraktet. 7.1.2 Diod-array-detektion Resultaten utvärderas enligt följande kriterier: a) Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm. b) Mellan 210 och 320 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans. c) Mellan 210 och 320 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen. Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats. 7.2 Repeterbarhet Skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov får inte överstiga — 15 % av det högre värdet för amproliumhalter på 25–500 mg/kg, — 75 mg/kg för amproliumhalter på 500–1 000 mg/kg, — 7,5 % av det högre värdet för amproliumhalter på över 1 000 mg/kg. 7.3 Utbyte För ett spikat (blank)prov ska utbytet vara minst 90 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse analyserades tre olika fjäderfäfoder (prov 1–3), ett mineralfoder (prov 4) och en förblandning (prov 5). Resultaten redovisas i nedanstående tabell. Prov 1 (blankprov) Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 L 14 14 14 14 15 n 56 56 56 56 60 Medelvärde [mg/kg] — 45,5 188 5 129 25 140 s r [mg/kg] — 2,26 3,57 178 550 CVr [ %] — 4,95 1,90 3,46 2,20 s R [mg/kg] — 2,95 11,8 266 760 CV R [ %] — 6,47 6,27 5,19 3,00 Nominell halt [mg/kg] — 50 200 5 000 25 000 L = antal laboratorier n = antal enskilda värden s r = standardavvikelse för repeterbarhet CV r = variationskoefficient för repeterbarhet s R = standardavvikelse för reproducerbarhet CV R = variationskoefficient för reproducerbarhet. 9. Anmärkningar 9.1 Om provet innehåller tiamin kommer tiamintoppen i kromatogrammet att ligga strax före amproliumtoppen. Med denna metod måste amprolium och tiamin separeras. Om amprolium och tiamin inte separeras med den kolonn (4.1.1) som används för den här metoden ska upp till 50 % av acetonitrildelen av den mobila fasen (3.6) ersättas med metanol. 9.2 Enligt den brittiska farmakopén har amproliumlösningens spektrum (c = 0,02 mol/l) i saltsyra (c = 0,1 mol/l) maximum vid 246 och 262 nm. Absorbansen ska vara 0,84 vid 246 nm och 0,80 vid 262 nm. 9.3 Extraktet ska alltid spädas med den mobila fasen, annars kan retentionstiden för amproliumtoppen förändras väsentligt på grund av ändrad jonstyrka. D. BESTÄMNING AV KARBADOX Metyl-3-(2-kinoxalinylmetylen)karbazat-N 1 ,N 4 -dioxid 1. Syfte och tillämpningsområde Med denna metod kan karbadoxhalten i foder, förblandningar och foderberedningar bestämmas. Detektionsgränsen är 1 mg/kg och kvantifieringsgränsen 5 mg/kg. 2. Princip Provet jämviktas med vatten och extraheras med metanol-acetonitril. För foder renas en alikvot av det filtrerade extraktet på en aluminiumoxidkolonn. För förblandningar och foderberedningar späds en alikvot av det filtrerade extraktet till lämplig koncentration med vatten, metanol och acetonitril. Karbadoxhalten bestäms genom omvänd fas-kromatografi (HPLC) med en UV-detektor. 3. Reagens 3.1 Metanol. 3.2 Acetonitril, HPLC-kvalitet. 3.3 Ättiksyra, w = 100 %. 3.4 Aluminiumoxid: neutral, aktivitetsgrad I. 3.5 Metanol-acetonitril 1 + 1 (v + v). Blanda 500 ml metanol (3.1) med 500 ml acetonitril (3.2). 3.6 Ättiksyra, σ = 10 %. Späd 10 ml ättiksyra (3.3) till 100 ml med vatten. 3.7 Natriumacetat. 3.8 Vatten, HPLC-kvalitet. 3.9 Acetatbuffertlösning, c = 0,01 mol/l, pH = 6,0. Lös 0,82 g natriumacetat (3.7) i 700 ml vatten (3.8) och justera pH till 6,0 med ättiksyra (3.6). Överför till en 1 000 ml mätkolv, späd med vatten (3.8) till märket och blanda. 3.10 Mobil fas för HPLC. Blanda 825 ml acetatbuffert (3.9) med 175 ml acetonitril (3.2). Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm filter (4.5) och avlufta den (t.ex. i ultraljudsbad i 10 minuter). 3.11 Referenssubstans. Ren karbadox: Metyl-3-(2-kinoxalinylmetylen)karbazat-N1,N4-dioxid, E 850. 3.11.1 Stamlösning av karbadox, 100 μg/ml (jfr anmärkning under punkt 5 Utförande): Väg med 0,1 mg noggrannhet upp 25 mg av karbadox referenssubstans (3.11) i en 250 ml mätkolv. Lös i metanol-acetonitril (3.5) med hjälp av ultraljud (4.7). Låt lösningen därefter anta rumstemperatur, späd till märket med metanol-acetonitril (3.5) och blanda. Slå in kolven i aluminiumfolie eller använd bruna glaskärl. Förvara i kylskåp. Lösningen är stabil i en månad vid högst 4 o C. 3.11.2 Kalibreringslösningar Överför 2,0–5,0–10,0 respektive 20,0 ml stamlösning (3.11.1) till ett antal 100 ml mätkolvar. Tillsätt 30 ml vatten, späd till märket med metanol-acetonitril (3.5) och blanda. Slå in mätkolvarna i aluminiumfolie. Dessa lösningar har en karbadoxhalt på 2,0–5,0–10,0 respektive 20,0 μg/ml. Kalibreringslösningarna ska vara nyberedda. Anmärkning: För bestämning av karbadox i foder som innehåller mindre än 10 mg/kg ska kalibreringslösningar med en koncentration under 2,0 μg/ml användas. 3.12 Blandning av vatten och [metanol-acetonitril] (3.5), 300 + 700 (v + v). Blanda 300 ml vatten med 700 ml metanol-acetonitrilblandning (3.5). 4. Utrustning 4.1 Skakapparat eller magnetomrörare. 4.2 Glasfiberfilter (Whatman GF/A eller motsvarande). 4.3 Glaskolonn (längd 300–400 mm, inre diameter ca 10 mm) med sintrat glas och med avtappningskran. Anmärkning: En glaskolonn med stängningsventil eller med avsmalnande ände kan också användas. I så fall ska en glasullstuss föras in i kolvens nedre del med hjälp av en glasstav. 4.4 HPLC-utrustning med injektionssystem, avpassad för injektionsvolymer på 20 μl. 4.4.1 HPLC-kolonn: 300 × 4 mm, C 18 , 10 μm packning eller motsvarande. 4.4.2 UV-detektor med variabel våglängd eller diod-array-detektor för intervallet 225–400 nm. 4.5 Membranfilter, 0,22 μm. 4.6 Membranfilter, 0,45 μm. 4.7 Ultraljudsbad. 5. Utförande Anmärkning: Karbadox är ljuskänsligt. Utför alla moment i dämpad belysning eller använd bruna glaskärl eller glaskärl insvepta i aluminiumfolie. 5.1 Allmänt 5.1.1 Blankprov Inför utbytesförsöket (5.1.2) analyseras ett blankprov för att kontrollera att varken karbadox eller störande ämnen är närvarande. Blankprovet bör vara av liknande typ som analysprovet och varken karbadox eller störande ämnen ska kunna påvisas i det. 5.1.2 Utbytesförsök Gör ett utbytesförsök genom analys av ett blankprov (5.1.1) som spikats med ungefär samma mängd karbadox som finns i provet. För spikning på nivån 50 mg/kg, överför 5,0 ml stamlösning (3.11.1) till en 200 ml E-kolv. Indunsta lösningen till ca 0,5 ml i ett kvävgasflöde. Tillsätt 10 g av blankprovet, blanda och vänta i 10 minuter före extraktion (5.2). Om ett blankprov av liknande typ som provet inte finns att tillgå (se 5.1.1), kan ett utbytesförsök göras med standardadditionsmetoden. Det prov som ska analyseras spikas då med ungefär samma mängd karbadox som finns i provet. Detta prov analyseras tillsammans med det ospikade provet och utbytet kan beräknas genom subtraktion. 5.2 Extraktion 5.2.1 Foder Väg med 0,01 g noggrannhet upp 10 gram av provet och för över till en 200 ml E-kolv. Tillsätt 15,0 ml vatten, blanda och jämvikta i 5 minuter. Tillsätt 35,0 ml metanol-acetonitrilblandning (3.5), tillslut kolven och skaka eller rör om i 30 minuter med hjälp av skakapparat eller magnetomrörare (4.1). Filtrera lösningen genom ett glasfiberfilter (4.2). Spara lösningen för reningen (5.3). 5.2.2 Förblandningar (0,1–2,0 %) Väg med 0,001 g noggrannhet upp 1 g omalt prov och överför till en 200 ml E-kolv. Tillsätt 15,0 ml vatten, blanda och jämvikta i 5 minuter. Tillsätt 35,0 ml metanol-acetonitrilblandning (3.5), tillslut kolven och skaka eller rör om i 30 minuter med hjälp av skakapparat eller magnetomrörare (4.1). Filtrera lösningen genom ett glasfiberfilter (4.2). Pipettera över en alikvot av filtratet till en 50 ml mätkolv. Tillsätt 15,0 ml vatten, fyll till märket med metanol-acetonitril (3.5) och blanda. Karbadoxkoncentrationen i den slutliga lösningen bör vara ca 10 μg/ml. Filtrera en alikvot genom ett 0,45 μm membranfilter (4.6). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.4). 5.2.3 Foderberedningar (> 2 %) Väg med 0,001 g noggrannhet upp 0,2 g omalt prov och för över till en 250 ml E-kolv. Tillsätt 45,0 ml vatten, blanda och jämvikta i 5 minuter. Tillsätt 105,0 ml metanol-acetonitrilblandning (3.5), tillslut kolven och homogenisera. Ultraljudsbehandla (4.7) provet i 15 minuter och skaka eller rör om i 15 minuter (4.1). Filtrera lösningen genom ett glasfiberfilter (4.2). Späd en alikvot av filtratet med vatten-metanol-acetonitrilblandningen (3.12) till en slutlig karbadoxkoncentration på 10–15 μg/ml (för en 10 % lösning blir spädningsfaktorn 10). Filtrera en alikvot genom ett 0,45 μm membranfilter (4.6). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.4). 5.3 Rening 5.3.1 Beredning av aluminiumoxidkolonnen Väg upp 4 g aluminiumoxid (3.4) och överför det till glaskolonnen (4.3). 5.3.2 Rening av prov Tillsätt 15 ml av det filtrerade extraktet (5.2.1) i aluminiumoxidkolonnen och häll bort de första 2 ml eluat. Samla upp följande 5 ml och filtrera en alikvot genom ett 0,45 m filter (4.6). Gå vidare till HPLC-bestämningen (5.4). 5.4 HPLC-bestämning 5.4.1 Parametrar Följande betingelser anges som vägledning. Andra betingelser kan väljas om de ger likvärdiga resultat. HPLC-kolonn (4.4.1): 300 × 4 mm, C 18 , 10 μm packning eller motsvarande Mobil fas (3.10): Blandning av acetatbuffertlösning (3.9) och acetonitril (3.2), 825 + 175 (v+v) Flödeshastighet: 1,5–2 ml/min Detektionsvåglängd: 365 nm Injektionsvolym: 20 μl Kontrollera att det kromatografiska systemet är stabilt genom att upprepade gånger injicera kalibreringslösningen (3.11.2) på 5,0 μg/ml till dess att topphöjder (areor) och retentionstider är konstanta. 5.4.2 Kalibreringskurva Injicera varje kalibreringslösning (3.11.2) upprepade gånger och mät topphöjderna (areorna) för varje koncentration. Konstruera en kalibreringskurva med kalibreringslösningarnas genomsnittliga topphöjd (area) längs y-axeln och de motsvarande koncentrationerna i μg/ml längs x-axeln. 5.4.3 Provlösning Injicera provextraktet (se 5.3.2 för foder, 5.2.2 för förblandningar och 5.2.3 för foderberedningar) upprepade gånger och bestäm den genomsnittliga topphöjden (arean) för karbadox. 6. Beräkning av resultat Använd den genomsnittliga topphöjden (arean) för provlösningens karbadoxtoppar för att bestämma koncentrationen i μg/ml med hjälp av kalibreringskurvan (5.4.2). 6.1 Foder Provets karbadoxhalt w (mg/kg) beräknas med formeln [mg/kg] där: c = provextraktets karbadoxkoncentration (5.3.2) i μg/ml V 1 = extraktionsvolym i ml (dvs. 50) m = provets vikt i gram. 6.2 Förblandningar och beredningar Provets karbadoxhalt w (mg/kg) beräknas med formeln [mg/kg] där: c = provextraktets karbadoxkoncentration (5.2.2 eller 5.2.3) i μg/ml V 2 = extraktionsvolym i ml (dvs. 50 för förblandningar, 150 för beredningar) f = spädningsfaktor enligt 5.2.2 (förblandningar) eller 5.2.3 (beredningar) m = provets vikt i gram. 7. Validering av resultat 7.1 Identitet Analytens identitet kan bekräftas genom co-kromatografi eller genom användning av en diod-array-detektor med vars hjälp spektrumen för provextraktet och den kalibreringslösning (3.11.2) som innehåller 10,0 μg/ml jämförs. 7.1.1 Co-kromatografi Ett provextrakt spikas genom tillsats av en lämplig mängd kalibreringslösning (3.11.2). Mängden tillsatt karbadox bör vara ungefär lika stor som mängden karbadox i provextraktet. Endast karbadoxtoppens höjd ska öka efter det att hänsyn tagits till både den tillsatta mängden och spädningen av extraktet. Toppens bredd på halva höjden ska ligga inom 10 % av den ursprungliga bredden. 7.1.2 Diod-array-detektion Resultaten utvärderas enligt följande kriterier: a) Våglängderna för prov- och standardspektrumens absorptionsmaximum, i toppens spets på kromatogrammet, ska ligga inom en marginal som beror på detektionssystemets upplösningsförmåga. För diod-array-detektion är denna i allmänhet ± 2 nm. b) Mellan 225 och 400 nm får prov- och standardspektrumen, i toppens spets på kromatogrammet, inte skilja sig åt för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan de två spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av standardanalytens absorbans. c) Mellan 225 och 400 nm får spektrumen för den uppåtgående delen, spetsen och den nedåtgående delen av toppen från provextraktet inte skilja sig från varandra för de delar av spektrumet där den relativa absorbansen är 10–100 %. Detta kriterium är uppfyllt om samma maximum observeras och avvikelsen mellan spektrumen inte vid någon mätpunkt överstiger 15 % av absorbansen vid spetsen. Om något av dessa kriterier inte är uppfyllt har analytens förekomst inte bekräftats. 7.2 Repeterbarhet För innehåll på minst 10 mg/kg får skillnaden mellan resultaten från två parallella bestämningar som utförs på samma prov inte överskrida 15 % av det högre värdet. 7.3 Utbyte För ett spikat (blank)prov ska utbytet vara minst 90 %. 8. Resultat av en provningsjämförelse I en provningsjämförelse analyserades sex fodertyper, fyra förblandningar och tre foderberedningar av åtta laboratorier. Varje prov analyserades två gånger. (Närmare uppgifter om provningsjämförelsen finns i Journal of the AOAC , volym 71, 1988, s. 484–490). Resultaten (efter eliminering av extremvärden) redovisas i nedanstående tabell. Tabell 1 Resultat av provningsjämförelsen för foder Prov 1 Prov 2 Prov 3 Prov 4 Prov 5 Prov6 L 8 8 8 8 8 8 n 15 14 15 15 15 15 Medelvärde (mg/kg) 50,0 47,6 48,2 49,7 46,9 49,7 Sr (mg/kg) 2,90 2,69 1,38 1,55 1,52 2,12 CVr (%) 5,8 5,6 2,9 3,1 3,2 4,3 SR (mg/kg) 3,92 4,13 2,23 2,58 2,26 2,44 CVR ( %) 7,8 8,7 4,6 5,2 4,8 4,9 Nominell halt (g/kg) 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 50,0 Tabell 2 Resultat av provningsjämförelsen för förblandningar och foderberedningar Förblandningar Foderberedningar A B C D A B C L 7 7 7 7 8 8 8 n 14 14 14 14 16 16 16 Medelvärde (g/kg) 8,89 9,29 9,21 8,76 94,6 98,1 104 Sr (g/kg) 0,37 0,28 0,28 0,44 4,1 5,1 7,7 CVr (%) 4,2 3,0 3,0 5,0 4,3 5,2 7,4 SR (g/kg) 0,37 0,28 0,40 0,55 5,4 6,4 7,7 CVR (%) 4,2 3,0 4,3 6,3 5,7 6,5 7,4 Nominell halt (g/kg) 10,0 10,0 10,0 10,0 100 100 100 L = antal laboratorier n = antal enskilda värden Sr = standardavvikelse för repeterbarhet CVr = variationskoefficient för repeterbarhet SR = standardavvikelse för reproducerbarhet CVR = variationskoefficient för reproducerbarhet. BILAGA IX JÄMFÖRELSETABELLER SOM AVSES I ARTIKEL 6 1. Direktiv 71/250/EEG Direktiv 71/250/EEG Denna förordning Artikel 1 första stycket Artikel 3 Artikel 1 andra stycket Artikel 2 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan, del 1 Bilaga II Bilagan, del 2 –– Bilagan, del 3 –– Bilagan, del 4 Bilaga III, del O Bilagan, del 5 Bilaga III, del M Bilagan, del 6 Bilaga III, del N Bilagan, del 7 Bilaga III, del Q Bilagan, del 9 Bilaga III, del K Bilagan, del 10 –– Bilagan, del 11 –– Bilagan, del 12 Bilaga III, del J Bilagan, del 14 Bilaga III, del D Bilagan, del 16 –– 2. Direktiv 71/393/EEG Direktiv 71/393/EEG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan, del I Bilaga III, del A Bilagan, del II Bilaga III, del E Bilagan, del III Bilaga III, del P Bilagan, del IV Bilaga III, del H 3. Direktiv 72/199/EEG Direktiv 72/199/EEG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Artikel 4 –– Bilaga I, del 1 Bilaga III, del L Bilaga I, del 2 Bilaga III, del C Bilaga I, del 3 –– Bilaga I, del 4 –– Bilaga I, del 5 Bilaga V, del A Bilaga II –– 4. Direktiv 73/46/EEG Direktiv 73/46/EEG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 3 –– Artikel 4 –– Bilaga I, del 1 Bilaga III, del B Bilaga I, del 2 –– Bilaga I, del 3 Bilaga III, del I 5. Direktiv 76/371/EEG Direktiv 76/371/EEG Denna förordning Artikel 1 Artikel 1 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan Bilaga I 6. Direktiv 76/372/EEG Direktiv 76/372/EEG Denna förordning Artikel 1 –– Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan –– 7. Direktiv 78/633/EEG Direktiv 78/633/EEG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan, del 1 –– Bilagan, del 2 –– Bilagan, del 3 Bilaga IV, del C 8. Direktiv 81/715/EEG Direktiv 81/715/EEG Denna förordning Artikel 1 –– Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan –– 9. Direktiv 84/425/EEG Direktiv 84/425/EEG Denna förordning Artikel 1 –– Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan –– 10. Direktiv 86/174/EEG Direktiv 86/174/EEG Denna förordning Artikel 1 Artikel 4 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan Bilaga VII 11. Direktiv 93/70/EEG Direktiv 93/70/EEG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan Bilaga IV, del D 12. Direktiv 93/117/EG Direktiv 93/117/EG Denna förordning Artikel 1 Artiklarna 3 och 5 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Bilagan, del 1 Bilaga IV del E Bilagan, del 2 Bilaga VIII, del A 13. Direktiv 98/64/EG Direktiv 98/64/EG Denna förordning Artikel 1 Artiklarna 3 och 5 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Artikel 4 –– Bilagan, del A Bilaga III, del F Bilagan, del C Bilaga VIII, del B 14. Direktiv 1999/27/EG Direktiv 1999/27/EG Denna förordning Artikel 1 Artiklarna 3 och 5 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Artikel 4 –– Artikel 5 –– Artikel 6 –– Artikel 7 –– Bilagan, del A Bilaga VIII, del C Bilagan, del B Bilaga IV, del F Bilagan, del C Bilaga VIII, del D 15. Direktiv 1999/76/EG Direktiv 1999/76/EG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Artikel 4 –– Bilagan Bilaga IV, del G 16. Direktiv 2000/45/EG Direktiv 2000/45/EG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Artikel 4 –– Bilagan, del A Bilaga IV, del A Bilagan, del B Bilaga IV, del B Bilagan, del C Bilaga III, del G 17. Direktiv 2002/70/EG Direktiv 2002/70/EG Denna förordning Artikel 1 Artikel 1 Artikel 2 Artiklarna 2 och 3 Artikel 3 –– Artikel 4 –– Artikel 5 –– Bilaga I Bilaga I och bilaga V del B (I) Bilaga II Bilaga II och bilaga V del B (II) 18. Direktiv 2003/126/EG Direktiv 2003/126/EG Denna förordning Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 –– Artikel 3 –– Artikel 4 –– Artikel 5 –– Artikel 6 –– Bilagan Bilaga VI