Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực
Nền tảng

Tế bào ở tất cả các sinh vật điều hòa biểu hiện gen bằng cách luân chuyển các bản phiên mã gen (chuỗi đơn RNA): Số lượng gen biểu hiện trong tế bào có thể được đo bằng số lượng bản sao của bản phiên mã RNA của gen đó có mặt trong một mẫu. Để phát hiện và định lượng mạnh mẽ biểu hiện gen từ một lượng nhỏ RNA, việc khuếch đại bản phiên mã gen là cần thiết. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là phương pháp phổ biến để khuếch đại DNA; đối với PCR dựa trên RNA, mẫu RNA trước tiên được sao chép ngược thành DNA bổ sung (cDNA) với Enzyme phiên mã ngược.
Để khuếch đại một lượng nhỏ DNA, phương pháp tương tự được sử dụng như trong PCR thông thường sử dụng mẫu DNA, ít nhất một cặp mồi cụ thể, deoxyribonucleotide triphosphate, một loại thích hợp dung dịch đệm và DNA polymerase ổn định nhiệt. Một chất được đánh dấu bằng fluorophore được thêm vào hỗn hợp này trong máy quay vòng nhiệt có chứa cảm biến để đo huỳnh quang của fluorophore sau khi nó được kích thích ở mức yêu cầu. Bước sóng cho phép đo tốc độ tạo ra cho một hoặc nhiều sản phẩm cụ thể.
Điều này cho phép đo tốc độ tạo ra sản phẩm khuếch đại ở mỗi chu kỳ PCR. Do đó, dữ liệu được tạo ra có thể được phân tích bằng phần mềm máy tính để tính toán biểu hiện gen tương đối (hoặc số bản sao mRNA) trong một số mẫu. PCR định lượng cũng có thể được áp dụng để phát hiện và định lượng DNA trong các mẫu để xác định sự hiện diện và độ phong phú của một chuỗi DNA cụ thể trong các mẫu này. Phép đo này được thực hiện sau mỗi chu kỳ khuếch đại và đây là lý do tại sao phương pháp này được gọi là PCR thời gian thực (nghĩa là PCR ngay lập tức hoặc đồng thời).
PCR định lượng và DNA microarray là các phương pháp hiện đại để nghiên cứu biểu hiện gen. Các phương pháp cũ hơn đã được sử dụng để đo mức độ phong phú của mRNA: hiển thị vi sai, xét nghiệm bảo vệ RNase và phương pháp thấm northern. Phương pháp thấm northern thường được sử dụng để ước tính mức độ biểu hiện của gen bằng cách hình dung mức độ phong phú của bản phiên mã mRNA của nó trong một mẫu. Trong phương pháp này, RNA tinh khiết được phân tách bằng điện di trên gel agarose, chuyển sang nền rắn (chẳng hạn như màng nylon) và được thăm dò bằng đầu dò DNA hoặc RNA cụ thể là bổ sung cho gen quan tâm. Mặc dù kỹ thuật này vẫn được sử dụng để đánh giá biểu hiện gen nhưng nó đòi hỏi lượng RNA tương đối lớn và chỉ cung cấp thông tin định tính hoặc bán định lượng về mức độ mRNA. Lỗi ước tính phát sinh từ những thay đổi trong phương pháp định lượng có thể là kết quả của tính toàn vẹn DNA, hiệu suất enzyme và nhiều yếu tố khác. Vì lý do này, một số hệ thống tiêu chuẩn hóa (thường được gọi là phương pháp chuẩn hóa) đã được phát triển. Một số đã được phát triển để định lượng tổng số biểu hiện gen, nhưng phổ biến nhất là nhằm mục đích định lượng gen cụ thể đang được nghiên cứu liên quan đến một gen khác gọi là gen bình thường hóa, được chọn lọc để có mức độ biểu hiện gần như không đổi. Những gen này thường được chọn từ gen quản lý vì chức năng của chúng liên quan đến sự sống sót cơ bản của tế bào thường bao hàm biểu hiện gen cấu thành. Điều này cho phép các nhà nghiên cứu báo cáo tỷ lệ biểu hiện của các gen quan tâm chia cho biểu hiện của bộ chuẩn hóa đã chọn, từ đó cho phép so sánh bộ chuẩn hóa trước đó mà không thực sự biết mức độ biểu hiện tuyệt đối của nó.
Các gen chuẩn hóa được sử dụng phổ biến nhất là những gen mã hóa cho các phân tử sau: tubulin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, albumin, cyclophilin và các RNA ribosome.