Phản ứng tổng hợp chuỗi polymerase thời gian thực
Phân tích nhiệt độ dung hợp > Mô hình hóa

Không giống như PCR điểm cuối (PCR thông thường), PCR thời gian thực cho phép theo dõi sản phẩm mong muốn tại bất kỳ thời điểm nào trong quá trình khuếch đại bằng cách đo huỳnh quang (trong khung thời gian thực, phép đo được thực hiện ở mức của nó trên một ngưỡng nhất định). Một phương pháp định lượng DNA thường được sử dụng bằng PCR thời gian thực dựa vào việc lập biểu đồ huỳnh quang theo số chu kỳ trên thang logarit. Ngưỡng phát hiện huỳnh quang dựa trên DNA được đặt 3–5 lần độ lệch chuẩn của nhiễu tín hiệu trên nền. Số chu kỳ mà huỳnh quang vượt quá ngưỡng được gọi là chu kỳ ngưỡng (Ct) hoặc theo hướng dẫn MIQE, chu kỳ định lượng (C q).
Trong giai đoạn khuếch đại theo cấp số nhân, số lượng mẫu DNA đích (khuếch đại) tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ. Ví dụ: một mẫu DNA có Cq đi trước mẫu khác 3 chu kỳ chứa mẫu nhiều hơn 23 = 8 lần. Tuy nhiên, hiệu quả khuếch đại thường khác nhau giữa các đoạn mồi và mẫu. Do đó, hiệu quả của sự kết hợp mồi-mẫu được đánh giá trong thí nghiệm chuẩn độ với các pha loãng nối tiếp của mẫu DNA để tạo ra đường cong chuẩn về sự thay đổi trong (C< sub>q) với mỗi độ pha loãng. Sau đó, độ dốc của hồi quy tuyến tính được sử dụng để xác định hiệu suất khuếch đại, là 100% nếu độ pha loãng 1:2 dẫn đến (Cq) chênh lệch bằng 1. Phương pháp ngưỡng chu kỳ đưa ra một số giả định về cơ chế phản ứng và dựa vào dữ liệu từ các vùng tín hiệu trên tạp âm thấp của cấu hình khuếch đại có thể tạo ra sự khác biệt đáng kể trong quá trình phân tích dữ liệu .
Để định lượng biểu hiện gen, (Cq) đối với RNA hoặc DNA từ gen quan tâm sẽ được trừ khỏi ( Cq) của RNA/DNA từ gen giữ nhà trong cùng một mẫu để chuẩn hóa sự thay đổi về số lượng và chất lượng RNA giữa các mẫu khác nhau. Quy trình chuẩn hóa này thường được gọi là phương thức ΔCt và cho phép so sánh sự biểu hiện của gen quan tâm giữa các mẫu khác nhau. Tuy nhiên, để so sánh như vậy, sự biểu hiện của gen tham chiếu chuẩn hóa cần phải rất giống nhau trên tất cả các mẫu. Do đó, việc chọn một gen tham chiếu đáp ứng tiêu chí này có tầm quan trọng cao và thường là thách thức vì chỉ có rất ít gen thể hiện mức độ biểu hiện như nhau trên nhiều tình trạng hoặc mô khác nhau. Mặc dù phân tích ngưỡng chu kỳ được tích hợp với nhiều hệ thống phần mềm thương mại, nhưng có các phương pháp phân tích dữ liệu hồ sơ khuếch đại chính xác và đáng tin cậy hơn cần được xem xét trong trường hợp cần quan tâm đến khả năng tái tạo.
Các phương pháp định lượng qPCR dựa trên cơ chế cũng đã được đề xuất và có ưu điểm là chúng không yêu cầu đường cong chuẩn để định lượng. Các phương pháp như MAK2 đã được chứng minh là có hiệu suất định lượng tương đương hoặc tốt hơn so với các phương pháp đường cong tiêu chuẩn. Các phương pháp dựa trên cơ chế này sử dụng kiến thức về quá trình khuếch đại polymerase để ước tính nồng độ mẫu ban đầu. Phần mở rộng của phương pháp này bao gồm một mô hình chính xác của toàn bộ cấu hình phản ứng PCR, cho phép sử dụng dữ liệu có tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu cao và khả năng xác thực chất lượng dữ liệu trước khi phân tích.
Theo nghiên cứu của Ruijter et al. MAK2 giả định hiệu suất khuếch đại không đổi trong quá trình phản ứng PCR. Tuy nhiên, phân tích lý thuyết về phản ứng chuỗi polymerase, từ đó tạo ra MAK2, đã tiết lộ rằng hiệu suất khuếch đại không cố định trong suốt PCR. Trong khi định lượng MAK2 cung cấp ước tính đáng tin cậy về nồng độ DNA mục tiêu trong mẫu trong điều kiện qPCR bình thường, thì MAK2 không định lượng đáng tin cậy nồng độ mục tiêu cho xét nghiệm qPCR bằng máy đo cạnh tranh.