Thuộc địa Roanoke
Thuộc địa bị mất

Xem thêm: Danh sách những thực dân (chưa làm)
Bất chấp phải rời bỏ thuộc địa của Lane, Raleigh vẫn bị thuyết phục bởi Hakluyt, Harriot và White. Tuy nhiên, Đảo Roanoke sẽ không còn an toàn cho những người Anh định cư, nhất là sau những cuộc chiến giữa người của Lane và Secotan, và cái chết của Wingina. Hakluyt đề xuất Vịnh Chesapeake làm địa điểm cho một thuộc địa mới, một phần vì ông tin rằng bờ biển Thái Bình Dương nằm ngay bên ngoài các khu vực đã được khám phá của lãnh thổ Virginia. Vào ngày 7 tháng 1 năm 1587, Raleigh thông qua điều lệ công ty để thành lập "Cittie of Raleigh" với White là thống đốc và mười hai trợ lý. Khoảng 115 người đã đồng ý tham gia thuộc địa, bao gồm cả con gái của White đang mang thai là Eleanor và chồng của cô là Ananias Dare. Những người thực dân chủ yếu là người London trung lưu, có lẽ đang tìm cách trở thành quý tộc trên đất liền. Manteo và Towaye, người đã rời khỏi thuộc địa Lane cùng với hạm đội của Drake, cũng được dẫn theo. Lần này, đảng bao gồm phụ nữ và trẻ em, nhưng không có lực lượng quân đội có tổ chức.
Đoàn thám hiểm bao gồm ba con tàu: Tàu Lion do White làm thuyền trưởng với Fernandes là chủ và hoa tiêu, cùng với một chiếc thuyền bay (dưới sự chỉ huy của Edward Spicer) và một con tàu lớn với đầy đủ thiết bị (do Edward Stafford chỉ huy). Hạm đội khởi hành vào ngày 8 tháng 5.
Vào ngày 22 tháng 7, hạm đội neo tại Đảo Croatoan. White dự định đưa bốn mươi người lên tàu nhỏ đến Roanoke, nơi anh ta sẽ tham khảo ý kiến của mười lăm người đóng quân ở Grenville, trước khi tiếp tục đến Vịnh Chesapeake. Tuy nhiên, khi anh ta đã lên tới đỉnh núi, một "quý ông" trên hạm đại diện cho Fernandes đã ra lệnh cho các thủy thủ bỏ lại những thực dân trên Roanoke.
Sáng hôm sau, nhóm của White xác định vị trí thuộc địa của Lane. Pháo đài đã bị tháo dỡ, trong khi những ngôi nhà bỏ trống và cây dưa mọc um tùm. Không có dấu hiệu nào cho thấy người của Grenville đã từng đến đó ngoại trừ những bộ xương người mà White tin rằng là hài cốt của một trong số họ, bị giết bởi người Mỹ bản địa.
Sau sự xuất hiện của chiếc thuyền cuối cùng trong hạm đội vào ngày 25 tháng 7, tất cả những người thuộc địa đã xuống tàu. Ngay sau đó, thực dân George Howe bị một người bản địa giết chết khi một mình đi tìm cua ở Albemarle Sound
White cử Stafford thiết lập lại quan hệ với Croatan, với sự giúp đỡ của Manteo. Croatan được mô tả là một liên minh các bộ lạc đại lục, dẫn đầu bởi Wanchese, đã tấn công đội của Grenville. Những người thuộc địa đã cố gắng đàm phán một hiệp định đình chiến thông qua Croatan, nhưng không nhận được phản hồi. Vào ngày 9 tháng 8, White dẫn đầu một cuộc tấn công phủ đầu vào Dasamongueponke, nhưng kẻ thù (sợ bị trả thù vì cái chết của Howe) đã rút khỏi làng, và người Anh vô tình tấn công những kẻ cướp bóc Croatan. Manteo một lần nữa làm êm dịu mối quan hệ giữa thực dân và người Croatan. Để phục vụ thuộc địa, Manteo đã được rửa tội và được đặt tên là "Chúa tể của Roanoke và Dasamongueponke".
Vào ngày 18 tháng 8 năm 1587, Eleanor Dare sinh một cô con gái, được đặt tên là "Virginia" để vinh danh là "Cơ đốc nhân đầu tiên sinh ra ở Virginia". Hồ sơ cho thấy Margery Harvye sinh con ngay sau đó, mặc dù không có gì khác về đứa con của cô.
Khi mà hạm đội chuẩn bị trờ về Anh, những thực dân tại Roanoke quyết định tái định cư tại 50 dặm phía trên  Albemarle Sound.Những người thực dân thuyết phục Thống đốc White quay trở lại Anh để giải thích tình hình tuyệt vọng của thuộc địa và yêu cầu giúp đỡ.White miễn cưỡng đồng ý và khởi hành cùng hạm đội vào ngày 27 tháng 8 năm 1587.