Karl V của Thánh chế La Mã
Tranh bá châu Âu > Chiến tranh Liên minh Cognac

Sau khi được thả, François I đã phá bỏ hiệp ước vì khi bị bắt, ông đã bị ép phải chấp thuận. Mặt khác, ông đã thành công trong việc thành lập một liên minh chống Karl, đó là Liên minh Thần thánh Cognac. Liên minh này bao gồm Giáo hoàng, Venezia, Firenze và cuối cùng là Milano. Công quốc Bayern cũng thuộc về phe đối lập chống lại Habsburg. Chiến tranh nổ ra và tình hình trở nên nguy hiểm hơn với Karl khi người Thổ lăm le các vùng đất cốt lõi của dòng họ Habsburg ở Áo vào năm 1526.
Điều đã thay đổi lại cán cân quyền lực ở châu Âu là cuộc bành trướng của Đế quốc Ottoman. Những cuộc tấn công, xâm lược của quân đội Ottoman dọc theo bờ biển Địa Trung Hải và ở khu vực Balkan hướng về phía Viên đã đe doa lãnh thổ của dòng họ Habsburg và nền hoà bình ở Âu châu. Năm 1521, người Thổ chiếm được thành Beograd. Năm 1526, người Thổ đánh bại quân đội Hungari trong trận Mohács, khiến vua Lajos II tử trận. Cũng nhờ đó mà Ferdinand có được quyền thừa kế Böhmen và Hungari. Để tranh giành Hungari, nhà Habsburg đã phải giao tranh với người Thổ. Quân Thổ đã vây hãm thành Viên năm 1529 với một đội quân lên tới 120.000 người. Karl V vì đang phải lo đại sự ở Ý nên không thể tương cứu em trai. Ferdinand chỉ có thể kiểm soát được một phần nhỏ của Hungari.
Cuộc chiến với Pháp ngày càng vắt kiệt Quốc khố. Lực lượng Landsknecht ở vùng Thượng Ý trở nên không hài lòng. Thủ lĩnh của họ là Georg von Frundsberg bị tai biến mạch máu não khi đang cố gắn ngăn chặn cuộc binh biến của binh sĩ của mình. Đội quân tiến đến Rôma, thành phố bị họ gọi là "Con điếm Babylon". Viên chỉ huy của đội quân, Charles de Bourbon, mất lúc công phá thành Rôma vào ngày 5 tháng 5 năm 1527. Mất tướng, đội quân Hoàng gia cướp phá thành phố, sử gọi là "Sacco di Roma". Đây thực sự là một đòn đau đối với thành Rôma, phải mất nhiều thời gian nó mới khôi phục lại được. Giáo hoàng Clêmentê VII phải lui về Lâu đài Thiên Thần cố thủ, nhưng cũng phải đầu hàng vào đầu tháng 6 năm 1527. Và một lần nữa, một đối thủ của hoàng đế lại nằm trong tay ông và Karl lại tiếp tục tự đối xử với đối thủ một cách nhẹ nhàng. Dù Karl không phải là người đứng sau vụ cướp này, nhưng sự kiện này lại được xem như là bằng chứng cho mối đe doạ dành cho Chế độ Giáo hoàng bởi Hoàng đế và cho chính sách bạo lực của hoàng đế ở Ý. Bởi vậy mà liên minh chống liên minh chống Karl ở Ý lại càng mạnh và đế quốc La Mã Thần thánh ngày càng bị uy hiếp. Vận may đã đến với Karl V khi đô đốc Andrea Doria gia nhập phe của Hoàng đế cùng Hạm đội Genova, sau khi nền độc lập của Genova được bảo đảm. Như vậy, nguồn cung ứng lương thực của quân Pháp và Đồng minh ở Ý đã bị cắt đứt và liên quân chống Karl đã phải hứng chịu một thất bại quân sự. Vua François I lại một lần nữa phải cầu hoà với Karl.
Hòa ước Cambrai được ký kết tại Pháp năm 1529, đã khẳng định việc Pháp sẽ từ bỏ lãnh thổ Ý. Việc từ bỏ tuyên bố chủ quyền phong kiến ​​của Pháp ở Flanders và Artois cũng được khẳng định. Về phần mình, hoàng đế đã từ bỏ yêu cầu trả lại công quốc Bourgogne. Với hoà bình đạt được, sự thống trị ở Ý của Karl và những người kế nhiệm ông đã được đảm bảo cho đến cuối thế kỷ 16. Tại hoà ước Barcelona, ​​Charles đã ban cho Đức Giáo hoàng điều kiện hòa bình thuận lợi và thiết lập một liên minh phòng vệ với nhau. Tuy nhiên, Karl đã không thể thành công trong việc vận động một hội đồng để cải cách Giáo hội. Sự hoà giải với Đức Giáo hoàng đã giúp Karl được trao vương miện sắt của người Lombard từ tay của Đức Giáo hoàng Clêmentê VII vào ngày 22 tháng 2 năm 1530 và ông đã đăng quang ngai vị Hoàng đế La Mã vào ngày 24 tháng 2 năm 1530 tại Vương cung thánh đường San Petronio ở Bologna. Karl V là vị hoàng đế La Mã-Đức cuối cùng được đăng quang bởi Giáo hoàng.