Frederick Sanger
Sự nghiệp > Xác định trình tự insulin

Khi giáo sư Neuberger chuyển đến Viện Nghiên cứu Y khoa Quốc gia (tiếng Anh: National Institute for Medical Research hay NIMR) ở London, Sanger vẫn quyết định ở lại Cambridge. Năm 1943, Sanger gia nhập nhóm nghiên cứu của Charles Chibnall, một nhà hóa học protein, người mới vừa đảm nhận vị trí trưởng khoa tại Khoa Hóa sinh. Chibnall đã thực hiện một số nghiên cứu về thành phần axit amin của insulin bò và đề nghị Sanger tìm hiểu các nhóm amin có trong protein đó. Thời bấy giờ, insulin có thể được mua từ chuỗi hiệu thuốc Boots và là một trong số rất ít protein có sẵn ở dạng tinh khiết. Cho đến thời điểm này, Sanger đã tự chi trả cho các hoạt động học tập và nghiên cứu của chính mình tại Đại học. Khi trở thành thành viên của nhóm của Chibnall, ông ban đầu được hỗ trợ bởi Hội đồng Nghiên cứu Y khoa (tiếng Anh: Medical Research Council hay MRC), và sau đó từ năm 1944 đến năm 1951, bởi Học bổng Beit Memorial về Nghiên cứu Y khoa.
Thành công đầu tiên của Sanger là xác định được trình tự axit amin hoàn chỉnh của hai chuỗi polypeptit của insulin bò, A và B, lần lượt vào năm 1952 và 1951. Trước đó, các nhà khoa học đã cho rằng protein không có một cấu trúc cụ thể. Khi xác định các trình tự axit amin này, Sanger đã chứng minh rằng protein có thành phần hóa học xác định.
Để đạt được thành công này, Sanger đã cải tiến phương pháp sắc ký phân vùng do Richard Laurence Millington Synge và Archer John Porter Martin lần đầu phát triển để xác định thành phần của các axit amin trong sợi len. Sanger đã sử dụng thuốc thử hóa học 1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (hiện nay, còn được gọi là thuốc thử Sanger, fluorodinitrobenzene, FDNB hoặc DNFB), có nguồn gốc từ nghiên cứu khí độc của Bernhard Charles Saunders tại Khoa Hóa học tại Đại học Cambridge. Thuốc thử của Sanger tỏ ra hiệu quả trong việc đánh đấu nhóm amin ở đầu N của chuỗi polypeptit. Sau đó, ông thủy phân một phần insulin thành các đoạn peptit ngắn bằng axit clohydric hoặc một loại enzym như trypsin. Sau đó, hỗn hợp các peptit này được phân phân tách trong không gian hai chiều trên một tờ giấy lọc. Cụ thể hơn, tờ giấy lọc chứa hỗn hợp peptit sẽ được điện di theo một chiều ngang, và sau đó, phương pháp sắc ký được áp dụng để peptit phân tách theo chiều dọc (vuông góc với chiều của điện di). Các đoạn peptit khác nhau của insulin, được đánh dấu bằng ninhydrin, di chuyển đến các vị trí khác nhau trên giấy, tạo ra một mẫu riêng biệt mà Sanger gọi là "dấu vân tay". Có thể nhận đoạn peptit ở đầu N bằng cách xác định vị trí của màu vàng, được tạo thành bởi phản ứng hóa học của chât FDNB, trên tờ giấy lọc. Đoạn axit amin này có thể được xác định bằng cách thủy phân hoàn toàn bằng axit và xác định loại axit amin đinitrophenyl nào được tạo thành. [6 ]
Khi lặp lại loại quy trình này, Sanger có thể xác định trình tự của các đoạn peptit ngắn được tạo ra bằng cách sử dụng các phương pháp khác nhau trong quá trình thủy phân ban đầu. Sau đó, chúng có thể được tập hợp thành các chuỗi dài hơn để suy ra cấu trúc hoàn chỉnh của insulin. Cuối cùng, vì chuỗi A và B không hoạt động về mặt sinh lý nếu không có ba liên kết cầu disulfua (hai cầu giữa chuỗi A và B, một cầu giữa các axit amin trên chuỗi A), Sanger và đồng nghiệp của ông đã quyết định kết thúc thí nghiệm của họ vào năm 1955. Kết luận chính của Sanger là hai chuỗi polypeptide của protein insulin có một trình tự axit amin xác định, và rộng hơn, mỗi protein đều có một trình tự nhất định. Chính thành tích này đã mang về cho ông giải Nobel Hóa học đầu tiên vào năm 1958. Đồng thời, khám phá này góp phần quan trọng đối với Giả thuyết Trình tự (tiếng Anh: Sequence Hypothesis) sau này của Crick để phát triển các ý tưởng về cách ADN mã hóa thành protein.