Mary I của Scotland
Trở về Scotland > Kết hôn với Lãnh chúa Darnley

Mary Stuart đã gặp người em họ Henry Stuart, Lãnh chúa Darnley vào tháng 2 năm 1561 khi bà đang để tang Vua Francis. Cha mẹ của Darnley, Bá tước Lennox và Margaret Douglas đều thuộc dòng dõi vương tộc của Anh và Scotland, họ đã gửi ông ta đến Pháp để chia buồn với Mary và hi vọng vào một mối mình giữa con trai họ và Mary. Cả Mary và Darnley đều là cháu của Vương hậu Margaret Tudor, chị nhà vua Henry VIII nước Anh và cũng là hậu duệ của High Stewards của Scotland. Darnley còn nằm trên một nhánh của nhà Stuart gần với vương thất hơn thông qua gia tộc Hamilton hậu duệ của Mary Stewart, Nữ Bá tước Arran, con gái vua James II của Scotland. Họ gặp nhau lần nữa vào thứ 7 ngày 17 tháng 2 năm 1565 tại Lâu đài Wemyss tại Scotland, và sau đó Mary nảy sinh tình yêu với "long lad" (cách mà Nữ vương Elizabeth gọi Darnley vì ông ta cao tới 6 feet). Họ kết hôn tại Cung điện Holyrood ngày 29 tháng 7 năm 1565.
Chính khách Anh quốc William Cecil và Bá tước Leicester đã cố gắng đàm phán để Darnley được phép đến Scotland từ nơi ở ban đầu của ông tại Anh. Mặc dù cố vấn của mình đã tác hợp hai người đến với nhau, Elizabeth cảm thấy thất vọng về cuộc hôn nhân, bởi vì nó hợp nhất hai nhánh con cháu của dì bà, do cả Mary và Darnley đều có tư cách đòi ngai vàng ở Anh và con chung của họ, nếu có, sẽ sở hữu tư cách đòi ngôi nhiều hơn nữa.
Tuy nhiên, Mary đã nhấm mạnh rằng cuộc hôn nhân xuất phát từ tình yêu chứ không đơn thuần là sự toan tính. Đại sứ nước Anh Nicholas Throckmorton bảo rằng "câu nói đó chứng tỏ rằng Nữ vương Mary bị bỏ bùa mê", và nói thêm cuộc hôn nhân chỉ có thể bị ngăn chặn "bằng bạo lực". Những người Công giáo tức điên lên vì Elizabeth, người cảm thấy rằng cuộc nhân nhân không nên diễn ra mà không có sự đồng ý của bà, vì Darnley là em họ của bà và là người nằm trong danh sách kế vị ở Anh.
Cuộc hôn nhân của Nữ vương với một người Công giáo đã ảnh hưởng đến quyền lợi của hoàng huynh là Bá tước Moray, sau đó ông ta cùng các lãnh chúa Kháng Cách khác, bao gồm, Bá tước Argyll và Glencairn, lập mưu chống đối. Mary lên đường rời Edinburgh vào ngày 26 tháng 8 năm 1565 và chuẩn bị đối đầu với họ, và ngày 30 Moray tiến vào Edinburgh, nhưng sớm phải rút quân do thất bại trong nỗ lực giành lấy tòa lâu đài. Mary trở về Edinburgh vào tháng sau để tuyển thêm quân. Trong cái chiến dịch gọi là Chaseabout Raid, Mary cùng những người chống đối và Moray hành quân khắp Scotland mà không đối đầu trực tiếp với nhau. Lực lượng của Mary được tăng lên sau khi tha tội và phục chức cho con traiLord Huntly, và sự trở về của James Hepburn, Bá tước thứ 4 xứ Bothwell, sau chuyến lưu vong ở Pháp. Không thể tập hợp đủ lực lượng, vào tháng 10 Moray rời khỏi Scotland sang tị nạn ở Anh. Mary mở rộng Hội đồng Cơ mật, phong thêm các thành viên Công giáo (Giám mục của Ross John Lesley và Thị trưởng Edinburgh Simon Preston xứ Craigmillar) và thành viên Kháng Cách (Lãnh chúa mới của Huntly, Giám mục Galloway Alexander Gordon, John Maxwell xứ Terregles và Sir James Balfour).
Sau khoảng một thời gian, Darnley trở nên kiêu ngạo. Không hài lòng với vị trí phu quân của Nữ vương, ông đòi được lên ngôi vua nếu như Mary chết trước mình. Mary từ chối yêu cầu này, và xung đột nổ ra giữa họ dù Mary mang thai vào tháng 10 năm 1565. Ông ta ganh ghét người bạn thân và là thư ký (theo Công giáo) của Nữ vương, David Rizzio, người được cho là cha thực sự của đứa bé. Tháng 3 năm 1566, Darnley bí mật tham gia vào một âm mưu của các lãnh chúa Kháng Cách, bao gồm những người từng chống lại Nữ vương trong vụ Chaseabout Raid..
Ngày 9 tháng 3, một nhóm những kẻ có mưu đồ từ trước, dẫn đầu là Darnley đã sát hại Rizzio ngay trước mặt Mary trong một bữa tiệc tối tại Cung điện Holyrood. Lúc này Mary đang mang thai tháng thứ 7. Hơn hai ngày sau, mơ ước của Darnley tan vỡ, và Mary đón Moray về ở Holyrood. Tối ngày 11-12 tháng 3, Darnley và Mary thoát khỏi cung điện, và đến trú ở Lâu đài Dunbar trước khi trở về Edinburgh ngày 18 tháng 3. Những người nổi loạn trước kia gồm Lãnh chúa Moray, Argyll và Glencairn được khôi phục chức vị trong Hội đồng.