Wilhelm I, Hoàng đế Đức
Quốc vương Phổ > Chiến tranh Bảy tuần

Mối quan hệ được cải thiện giữa Phổ và Áo, thành quả của cuộc chiến chống Đan Mạch, đã mau chóng đổ vỡ do mâu thuẫn về việc kiểm soát Schleswig và Holstein. Đồng thời, chính quyền Bismarck muốn buộc Áo khẳng định bá quyền của Phổ ở miền Bắc Đức. Để chuẩn bị chiến tranh, Thủ tướng cô lập Áo về ngoại giao và thiết lập liên minh với Ý vào tháng 4 năm 1866. Để đáp trả, vào ngày 1 tháng 6 năm 1866, Áo kiến nghị Nghị viện Liên minh các quốc gia Đức ban hành giải pháp cuối cùng đối với tình hình Schleswig-Holstein. Phổ tuyên bố yêu cầu này vi phạm Thỏa ước Gastein. Ngày 14 tháng 6, khi phần lớn các quốc gia Liên minh Đức đồng ý đứng về phía Viên khai chiến chống Berlin, đại biểu Phổ tuyên bố giải thể Liên minh. Vào ngày 16 tháng 6, trong bài tuyên cáo "Hỡi người dân Đức của ta", Wilhelm I lên án Liên minh chia rẽ Đức và tuyên bố Phổ "quyết định gánh vác cuộc đấu tranh vì nền thống nhất dân tộc Đức giờ đang bị ngăn cản bởi quyền lợi riêng của các bang đơn lẻ".
Cùng ngày một tập đoàn quân Phổ dưới sự chỉ huy của tướng Eduard Vogel von Falckenstein đã tràn vào các bang ở phía Bắc. Các lực lượng Phổ đánh chiếm nhanh chóng các bang này và vào ngày 28 tháng 6, Hannover bị buộc phải đầu hàng. Nhưng các hoạt động ở phía Đông mới quyết định đến cục diện của cuộc chiến: ngày 18 tháng 6, triều đình Berlin tuyên chiến với các quốc gia còn lại của Liên minh, trong đó có Áo. Trái với truyền thống từ thời Friedrich Đại đế rằng nhà vua là người tổng chỉ huy tối cao duy nhất của na quân, Wilhelm đã trao cho Moltke thực quyền chỉ đạo chiến dịch vào ngày 2 tháng 6 năm 1866 khi ông cho phép vị tướng được ban bố mệnh lệnh trên danh nghĩa nhà vua. Từ đây, Moltke đứng ngang hàng với Bismarck và cùng nhà vua điều khiển các hoạt động tác chiến. Moltke tổ chức ba mũi tấn công vào lãnh thổ Böhmen của vương triều Áo. Ngày 30 tháng 6, nhà vua và Moltke đến Böhmen để trực tiếp chỉ huy chiến dịch. Trong trận đánh quyết định ở Königgrätz-Sadowa ngày 3 tháng 7, nhà vua đã dong ngựa qua các trung đoàn để động viên sĩ khí ba quân. Sự dấn thân của ông vào lửa đạn đã gây cho các võ tướng hoảng hốt. Tập đoàn quân số 1 của Friedrich Karl đã cận kề thất bại khi mà sự tiếp viện kịp thời của Tập đoàn quân số 2 do Thái tử thống lĩnh xoay chuyển tình hình và đem lại thắng lợi quyết định cho Phổ.
Sau chiến thắng, mâu thuẫn nảy sinh giữa Quốc vương và Thủ tướng. Trong niềm vui chiến thắng, Wilhelm chủ trương sáp nhập lãnh thổ từ Áo và Bayern, đồng thời tổ chức diễu binh khải hoàn ở Viên. Nhưng, với tầm nhìn chính trị-ngoại giao lâu dài của mình, Bismarck không muốn lăng nhục Áo quá mức và phản kháng gay gắt. Những cảnh tượng bão táp đã diễn ra giữa hai vị nguyên thủ. Cuối cùng, với sự giúp đỡ của Thái tử – một người có tư tưởng phản chiến, Bismarck đã buộc Wilhelm phải từ bỏ tham vọng của ông. Theo Hòa ước sơ bộ Nikolsburg và Hòa ước Praha sau đó, Áo không bị mất một lãnh thổ nào về tay Phổ, nhưng bị loại khỏi Đức. Liên minh các quốc gia Đức bị giải tán, và phần lớn các bang Bắc Đức (trong đó có Schleswig và Holstein) bị sáp nhập vào lãnh thổ Phổ. Tháng 9 năm 1866, Wilhelm I, Bismarck, Moltke và Roon ca khúc khải hoàn trở về kinh đô Berlin trong sự chào đón nồng nhiệt của dân chúng.
Tháng 8 năm 1866, một liên minh quân sự của các bang còn lại ở Bắc Đức dưới sự bá quyền của Phổ được hình thành, đặt nền móng cho sự ra đời của Liên bang Bắc Đức vào năm 1867. Wilhelm I giờ đây là Chủ tịch, Bismarck là Thủ tướng Liên bang Bắc Đức. Ngoài ra, thắng lợi toàn diện của Phổ trong chiến tranh 1866 cuối cùng đã đặt dấu chấm hết cho cuộc xung đột giữa Quốc vương và phe tự do chủ nghĩa với phần thắng thuộc về Quốc vương.