Thư viện Alexandria
Dưới sự bảo trợ của Nhà Ptolemaios > Hoạt động tiếp theo và sự mở rộng

Vị quản thủ thư viện thứ ba của Thư viện là Eratosthenes của Cyrene (sống vào khoảng 280–194 TCN), ông được biết đến nhiều nhất nhờ vào các công trình khoa học, ngoài ra ông còn là một học giả về lĩnh vực văn học. Tác phẩm quan trọng nhất của Eratosthenes là chuyên luận Geographika, ban đầu gồm ba tập. Bản thân tác phẩm này đã không còn tồn tại cho tới ngày nay, nhưng nhiều đoạn của nó đa được bảo tồn cho đến ngày nay thông qua trích dẫn trong các tác phẩm của nhà địa lý học Strabo sau này. Eratosthenes là học giả đầu tiên áp dụng toán học vào địa lý và lập bản đồ, trong luận thuyết Liên quan đến Kích thước của Trái Đất của mình, ông đã tính được gần chính xác chu vi của Trái Đất và chỉ sai số vài trăm km. Eratosthenes còn tạo ra một tấm bản đồ về toàn bộ thế giới được biết đến vào lúc đó, bao gồm thông tin lấy từ các nguồn sách trong Thư viện, các dữ kiện từ chiến dịch của Alexandros Đại đế ở Ấn Độ, và những báo cáo được viết bởi các thành viên trong đoàn săn voi của nhà Ptolemaios từ các cuộc thám hiểm của họ dọc theo bờ biển Đông Phi.
Eratosthenes là người đầu tiên đưa địa lý phát triển theo hướng trở thành một ngành khoa học. Eratosthenes cho rằng bối cảnh của các bài thơ Homer hoàn toàn là tưởng tượng, ông lập luận rằng mục đích của thơ ca chỉ là "bắt giữ linh hồn" các học giả, thay vì đưa ra một lý giải chính xác về các sự kiện lịch sử có thực. Strabo trích lời Eratosthenes khi bình luận một cách mỉa mai, "một người có thể tìm thấy những chốn lang thang của Odysseus, nếu ngày đó đến chỉ khi anh ta tìm thấy được người thợ da khâu da dê của gió." Trong khi đó, các học giả khác tại Thư viện Alexandria cũng thể hiện sự quan tâm của họ đến các đề tài khoa học. Bacchius của Tanagra, người cùng thời với Eratosthenes đã chỉnh sửa và bình luận về các tác phẩm y học trong tuyển tập của Hippocrates. Các bác sĩ Herophilus (sống khoảng 335–280 TCN) và Erasistratus (304–250 TCN) đã nghiên cứu cơ thể con người, nhưng công việc nghiên cứu của họ đã bị cản trở bởi những cuộc phản đối chống lại việc mổ xẻ xác chết, vì hành động đó bị cho là vô đạo đức.
Theo Galen, vào cùng thời gian đó, vua Ptolemaios III đã yêu cầu người Athen cho mượn các bản thảo gốc của Aeschylus, Sophocles và Euripides, và người Athen đã yêu cầu trả mười lăm talents kim loại quý (1.000 lb, 450 kg) để đảm bảo rằng vì vua sẽ trả lại các bản thảo. Ptolemaios III đã có được các bản sao đắt giá về các vở kịch được ghi chép trên giấy cói chất lượng cao nhất và gửi trả cho người Athen các bản sao, giữ bản thảo gốc mà vua đã mượn cho thư viện, và vị vua nói với người Athen rằng họ có thể giữ lại số talents. Câu chuyện này cũng cho thấy sức mạnh của Alexandria đối với Athens dưới triều đại Ptolemaios. Chi tiết này xuất phát từ việc Alexandria là cảng hai chiều nhân tạo giữa đất liền và đảo Pharos, nắm thương mại từ phía Đông đến phía Tây, nó là trung tâm thương mại quốc tế, điểm sản xuất giấy cói hàng đầu và sách vở từ rất sớm. Đến khi số lượng cuộn giấy trong Thư viện gia tăng thì nó dần không còn không gian để chứa, vì vậy dưới triều đại Ptolemaios III Euergetes, vị vua này đã mở một kho tàng phụ tại Serapeum của Alexandria, đây là một ngôi đền của vị thần Hy Lạp-Ai Cập là Serapis và nó nằm gần cung điện hoàng gia.