Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
Dayandığı Temel

Tüm organizmalardaki hücreler, gen ekspresyonunu gen transkriptlerinin (tek iplikli RNA) devri ile düzenler: Bir hücrede eksprese edilen bir genin miktarı, o genin RNA transkriptinin kopya sayısı ile ölçülebilir. Küçük miktarlarda RNA'dan gen ekspresyonunu sağlam bir şekilde saptamak ve ölçmek için gen transkriptinin amplifikasyonu gereklidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), DNA'yı çoğaltmak için yaygın bir yöntemdir; RNA bazlı PCR için RNA numunesinden ilk önce ters transkriptaz ile tamamlayıcı DNA'larının (cDNA) oluşturulması gerekmektedir.
Küçük miktarlarda DNA'yı amplifiye etmek için, bir DNA şablonu, en az bir çift spesifik primer, deoksiribonükleotid, uygun bir tampon solüsyonu ve bir termo-stabil DNA polimeraz kullanılarak geleneksel PCR'deki ile aynı metodoloji kullanılır. Bir işaretli bir madde (florofor) de bu karışıma ilave edilir. PCR işlemi floroforun floresan ışımalarını ölçebilecek sensörler içerir. Yapılan ışıma, üretilen DNA miktarıyla doğru orantıı olacağından, her PCR döngüsünde amplifiye edilmiş ürünün üretim hızının ölçülmesini sağlar. Bu şekilde oluşturulan veriler, birkaç numunede nispi gen ekspresyonunu (veya mRNA kopya sayısını) hesaplamak için bilgisayar yazılımı ile analiz edilebilir Üretilen (amplifiye edilen) DNA miktarı her  döngüsünden sonra ölçüldüğünden, dolayısıyla tüpteki çift zincirli DNA molekülünün miktarı zamana bağlı olarak izlenebildiğinden bu yönteme real time PCR (yani anında veya simultane PCR) denir. RNA miktar tayini durumunda şablon ribonükleik asidin (RNA) ters transkripsiyonuyla elde edilen tamamlayıcı DNA'nın (cDNA) oluşturulması şarttır. Bu durumda kullanılan teknik, nicel RT-PCR veya Q-RT-PCR'dir.
Kantitatif (nicel) PCR ve DNA mikrodizisi, gen ekspresyonunu incelemek için kullanılan en modern yöntemlerdendir. mRNA miktarını ölçmek için kullanılan  eski yöntemler: Diferansiyel gösterim, RNaz koruma tahlili ve Northern Blot'tur . Northern blot, bir numunedeki mRNA transkriptinin bolluğunu görselleştirerek bir genin ekspresyon seviyesini tahmin etmek için sıklıkla kullanılır. Bu yöntemde saflaştırılmış RNA, agaroz jel elektroforezi ile ayrılır, katı bir matrise (naylon membran gibi) aktarılır ve ilgili gene tamamlayıcı olan spesifik bir DNA veya RNA probu ile problanır. Bu teknik hala gen ekspresyonunu değerlendirmek için kullanılsa da, nispeten büyük miktarlarda RNA gerektirir ve mRNA seviyelerine ilişkin yalnızca kalitatif veya yarı kantitatif bilgi sağlar. Dahası bu yöntemde, DNA bütünlüğü, enzim verimliliği ve diğer birçok faktörün sonucu olarak tahmin hataları görülebilir. olabilir. Bu nedenle bir dizi standardizasyon sistemi (genellikle normalizasyon yöntemleri olarak adlandırılır) geliştirilmiştir. Bazıları toplam gen ekspresyonunu ölçmek için geliştirilmiştir, ancak en yaygın olanı, neredeyse sabit ekspresyon seviyesi için seçilen normalleştirici gen olarak adlandırılan başka bir gen ile ilişkili olarak çalışılan spesifik genin miktarını belirlemeyi amaçlar. Bu genler genellikle temel hücresel hayatta kalma ile ilgili işlevleri normal olarak kurucu gen ekspresyonunu ifade ettiği için house-keeping genlerinden seçilir. Bu, araştırmacıların, seçilen normalleştiricinin ifadesine bölünen ilgili genlerin ifadesi için bir oran rapor etmelerini sağlar. Böylece, mutlak ifade seviyesini fiilen bilmeden öncekinin karşılaştırılmasına izin verir.
En yaygın olarak kullanılan normalleştirici genler, şu molekülleri kodlayanlardır: tubulin, gliseraldehit-3-fosfat dehidrojenaz, albümin, siklofilin ve ribozomal RNA'lar .