Denitrifikasyon
Denitrifikasyonun mekanizması ve üzerinde etkili faktörler

Denitrifikasyon olayında, nitratın elementer azota indirgenmesi dört basamakta gerçekleşmekte (NO3 − NO2 − NO− N2O – N2) ve Bu basamakların her biri ayrı bir enzim sistemi tarafından katalizlenmektedir. Denitrifikasyon bakterilerinde membrana bağlı olan bu enzimlerin sentezi anaerobik şartlarda gerçekleştirilir. İlk basamağı oluşturan nitratların nitritlere indirgenmesinde, molibden içeren membrana Bağlı "nitrat redüktaz" enzimi rol almakta, nitritlerin indirgenmesini ise, birinin merkezinde bakır, diğerinin merkezinde ise iki tane hem grubu olan iki farklı "nitrit redüktaz" enzimi tarafından yürütülmektedir.
Diğer taraftan azot oksitlerin (NO) indirgenmesindeki enzimatik olaylar aydınlığa kavuşturulmamakla beraber, denitrifikasyonun son safhasını oluşturan N2O'In elementer azota indirgenmesinde "N2O redüktaz" denen enzimin görev aldığı ve bu enzimin bakır içeren bir sitoplazmik enzim olduğU belirtilmektedir.
Denitrifikasyon enzimleriyle ilgili çalışmalar daha çok Paracoccus denitrificans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa ve Pseudomonas stutzeri türleri üzerinde yapılmıştır. Bu ayrıntılı çalışmalar sonucunda "nitrat redüktaz" enziminin a, b ve d olmak üzere üç alt üniteden meydana geldiği, bunlardan a-alt ünitesinin molibden kofaktörünü taşıdığı, b-alt ünitesinin FeS gruplarını içerdiği ve d-alt ünitesinin ise sitokrom-B taşıdığı saptanmıştır. Oldukça yüksek çözünebilirlikte olan enzim membrana bağlı, molibdo-proteindir, sadece anaerobik şartlar altında sentezlenmektedir. Nitrit redüktaz, bakır Içeren hemgrubu bulunmayan bir enzimdir. Bundan Başka nitrik oksit redüktaz henüz saflaştırılmamıştır. Nitroz oksit redüktaz ise hem-grubu Içermeyen, bakır Içeren bir enzimdir.
Denitrifikasyonun genetik temeli de araştırılmış ve en az 40 genin Bu olay üzerinde etkili olduğu sonucuna varılmıştır. Bazı bakteri türlerinin enzim sistemleri üzerinde yapılan ayrıntılı araştırmalar sonucunda, enzimlerin sentezlenmesi ve baskılanmasını etkileyen faktörlerin genel olmadığı, Bu durumun ise denitrifikasyonda rol alan bakterilerin genetik çeşitliliğinden ve dolayısıyla metabolik farklılıklarından kaynaklandığı belirlenmiştir. Örneğin Paracoccus denitrificans türü ile yapılan çalışmalarda "nitrat redüktaz" ve "nitrit redüktaz" üretiminin ayrı substratlarla başlatıldığı bildirilmektedir. Nitrat redüktaz enzimi, oksijen ya da nitrit tarafından (0,1 mm) inhibe edilmezken, nitrit redüktazın aktivitesi, oksijen varlığında önemli ölçüde inhibe edilmiştir. Ortamda her iki enzimin bulunması durumunda ise, nitratın nitrite tercih edildiği kaydedilmiştir.
Denitrifikasyon yapma yeteneğine sahip mikroorganizmalar, nitratlardan üç şekilde yararlanmaktadır:
Azot kaynağı olarak,
Nitratı nitrite, nitriti de amonyağa indirgemek suretiyle nitrat asimilasyonunda,
Nitratı, oksijen yerine son elektron AlıcıSı olarak.
Denitrifikasyon, bir solunum olayı olduğundan, enerji kaynağı olarak oksitlenebilir bir substrat ya da elektron vericisine ihtiyaç vardır. Denitrifiye edici bakteriler çoğunlukla heterotrof olup, kompleks organik maddeleri oksitlenebilir substrat olarak kullanırlar. Ancak bazı denitrifikasyon bakterileri ise ototrofturlar ve H2, CO2 ya da Kükürt bileşiklerini enerji kaynağı olarak kullanırlar.
Heterotrofik denitrifikasyonda metanol, etanol, glikoz, asetik asit ve formik asit gibi birçok organik madde karbon kaynağı olarak kullanılmaktadır. Ayrıca metan ve karbonmonoksit gibi gaz halindeki organik maddeler de substrat olarak kullanılabilmektedir. Metan gazının elektron vericisi olarak kullanıldığı denitrifikasyonun mekanizması hakkındaki bilgiler birtakım çelişkiler içermekle beraber, gaz halindeki karbon kaynakları içerisinde en kapsamlı çalışılan substrat, metandır.
Araştırıcılar, metan oksidasyonunun aerobik ya da mikroaerofilik şartlara ihtiyaç duyduğunu ileri sürmüşler ve bu denitrifikasyonun farklı iki mikroorganizmanın simbiyotik ilişkisi sonucu gerçekleşebildiğini belirtmişlerdir. Karbonmonoksitin kullanıldığı çalışmalar ise çok daha az sayıdadır. Yukarıda da belirtildiğI gibi denitrifikasyon olayı, hidrojen ve çeşitli indirgenmiş Kükürt bileşiklerini enerji kaynağı olarak kullanabilen ototrofik bakteri türleri tarafından da gerçekleştirilmektedir (ototrofik denitrifikasyon). Ototrofik üreme koşullarında herhangi bir dış organik karbon kaynağına ihtiyaç duyulmamakta, daha çok karbondioksit ve bikarbonat, hücre sentezi için karbon kaynağı olarak kullanılmaktadır. Diğer taraftan Paracoccus denitrificans ve Thiobacillus denitrificans gibi bazı bakteri türleri hem ototrofik hem de heterotrofik denitrifikasyon yapabilmektedir. Ayrıca Ferrobacillus, Gallionella, Leptothrix ve Sphaerotilus cinslerine ait bakteriler 〖Fe〗^(+3)' ü enerji kaynağı olarak kullanmak suretiyle denitrifikasyon yapmaktadırlar. Aşağıda sırasıyla hidrojen, tiyosülfat ve elementer Kükürt kullanımına ilişkin sitokiyometrik bağıntılar verilmiştir. 2NO3 + 5H2→ N2 + 4H2O + 2OH
Biyolojik denitrifikasyonun azot çevrimindeki rolüne ilâveten içme sularında biyolojik NO3 arıtımı Için de kullanılabileceğinin anlaşılması, işlemi daha verimli hale getirmek Için optimum parametrelerin belirlenmesi çalışmalarını da hızlandırmıştır. Yapılan araştırmalar, denitrifikasyon bakterilerinin metabolizmasında elektron alıcısı olarak nitratla rekabet eden oksijenin önemli bir inhibitör olduğunu ve 0,2Mg/L'nin üzerindeki oksijen konsantrasyonlarında nitrat indirgenmesinin gerçekleşmediğini göstermiştir. Ancak Pseudomonas ve Bacillus cinslerine ait birkaç mikroorganizmanın aerobik şartlarda da NO3'ı elektron alıcıSı olarak kullanmak suretiyle denitrifiye edebileceğI belirtilmektedir. Diğer taraftan, denitrifikasyon sırasında hücrelerdeki NADH dehidrogenaz, suksinat dehidrogenaz ve metanol dehidrogenaz gibi H2 koparılmasını katalizleyen enzimlerin de rol oynadıkları belirlenmiştir.
Araştırıcılar, denitrifikasyon Için optimum pH aralığının pH5−8, SıcaklıK sınırlarının ise 4-60 °C olduğunu, Bu sınırlar dışındaki değerlerde ise denitrifikasyonun gerçekleşmediğini kaydetmişlerdir.
BunlarıN dışında oksijen seviyesi, C/N oranları, nitrat konsantrasyonu, tuz, iz elementler gibi çoğu çevresel faktöründe denitrifikasyon üzerinde etkili olduğU rapor edilmiştir.
Denitrifikasyon üzerinde inhibitör etkisi olan bileşiklerin başında Kükürt bileşikleri gelmektedir. Aynı zamanda, çok az miktarlarda bulunsa bile nitratın NO → N2O dönüşümünü, enzim aktivitesini baskılamak suretiyle engellediği belirtilmektedir.