Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu
Füzyon sıcaklığı analizi > Modelleme

Son nokta PCR'ından (geleneksel PCR) farklı olarak, gerçek zamanlı PCR, floresansı ölçerek amplifikasyon sürecinin herhangi bir noktasında istenen ürünün izlenmesine izin verir (gerçek zaman çerçevesinde, belirli bir eşiğin üzerindeki seviyesinin ölçümü yapılır). Gerçek zamanlı PCR ile yaygın olarak kullanılan bir DNA niceleme yöntemi, logaritmik bir ölçekte döngü sayısına karşı floresan grafiği çizmeye dayanır. DNA bazlı floresan tespiti için bir eşik, arka planın üzerindeki sinyal gürültüsünün standart sapmasının 3–5 katı olarak ayarlanır. Floresan eşiğini aştığı döngü sayısı MIQE kılavuzları, miktar döngüsü göre, eşik döngüsü (Ct) ya da <sub id="mwqg">(Cq)</sub> olarak adlandırılır
Üstel amplifikasyon aşamasında, hedef DNA şablonunun (amplikon) miktarı her döngüde ikiye katlanır. Örneğin, en Cq değeri bir diğerini 3 döngü bakımından geçen bir numune  2 3 = 8 kat daha fazla şablon ihtiva etmektedir. Bununla birlikte, amplifikasyonun verimliliği, primerler ve şablonlar arasında genellikle değişkendir. Bu nedenle, bir primer-kalıp kombinasyonunun verimliliği, her seyreltme ile (<sub id="mwsw">Cq</sub>)' deki değişimin standart bir eğrisini oluşturmak için DNA şablonunun seri dilüsyonları ile bir titrasyon deneyinde değerlendirilir. Lineer regresyonun eğimi daha sonra amplifikasyonun verimini belirlemek için kullanılır, eğer 1:2'lik bir seyreltme 1'lik bir (<sub id="mwtw">Cq</sub>) farkla sonuçlanırsa verim %100'dür. Döngü eşiği yöntemi, reaksiyon mekanizmasının birkaç varsayımını yapar ve amplifikasyon profilinin düşük sinyal-gürültü bölgelerinden gelen verilere güvenir ve veri analizi sırasında önemli farklılıklar ortaya çıkarabilir.
Gen ekspresyonunu ölçmek için ilgili genin DNA veya RNA'sı için elde edilen <sub id="mwvA">(Cq)</sub> değeri aynı deney kurgusunda analizi gerçekleştirilen house-keeping genin DNA veya RNA'sı için ölçülen <sub id="mwvg">(Cq)</sub> değerinden çıkarılır. Bu normalleştirme prosedürüne genel olarak ΔC t- yöntemi olarak isimlendirilir ve ilgili bir genin ifadesinin farklı numuneler arasında karşılaştırılmasına izin verir. Bununla birlikte, böyle bir karşılaştırma için, normalleştirici referans geninin ifadesinin tüm numunelerde çok benzer olması gerekir. Bu kriteri karşılayan bir referans genin seçilmesi bu nedenle çok önemlidir ve çoğu zaman zordur, çünkü sadece çok az gen bir dizi farklı koşul veya dokuda eşit düzeyde ekspresyon gösterir. Döngü eşiği analizi birçok ticari yazılım sistemiyle entegre olmasına rağmen, tekrarlanabilirliğin önemli olduğu durumlarda dikkate alınması gereken amplifikasyon profili verilerini analiz etmenin daha doğru ve güvenilir yöntemleri vardır.
Mekanizma tabanlı qPCR niceleme yöntemleri de önerilmiştir ve niceleme için standart bir eğri gerektirmeme avantajına sahiptir. MAK2 gibi yöntemlerin standart eğri yöntemlerine eşit veya daha iyi nicel performansa sahip olduğu gösterilmiştir. Bu mekanizmaya dayalı yöntemler, orijinal numune konsantrasyonunun tahminlerini oluşturmak için polimeraz amplifikasyon süreci hakkındaki bilgileri kullanır. Bu yaklaşımın bir uzantısı, yüksek sinyal-gürültü verilerinin kullanımına ve analizden önce veri kalitesini doğrulama yeteneğine izin veren tüm PCR reaksiyon profilinin doğru bir modelini içerir.
Ruijter ve arkadaşlarının araştırmasına göre. MAK2, PCR reaksiyonu sırasında sabit amplifikasyon verimliliğini varsayar. Bununla birlikte, MAK2'nin türetildiği polimeraz zincir reaksiyonunun teorik analizi, amplifikasyon etkinliğinin PCR boyunca sabit olmadığını ortaya çıkarmıştır. MAK2 kantifikasyonu, normal qPCR koşulları altında bir numunedeki hedef DNA konsantrasyonunun güvenilir tahminlerini sağlarken, MAK2, rakip ölçüm cihazlarıyla qPCR testleri için hedef konsantrasyonu güvenilir bir şekilde ölçmez.