Yüksek performanslı sıvı kromatografisi
Çalışma Prensibi

Ayrışacak veya analizlenecek numune, cihaza çok küçük hacimlerde (tipik olarak mikrolitre seviyesinde) kromatograftaki mobil faz akışına verilir. Akan mobil faz, bu maddeleri kolona taşır. Numunenin içindeki analitler türlerine göre farklı hızlarda hareket ederler ve bu hız farkının belirlenmesinde sabit faz-analit etkileşimi (fiziksel etkileşimler) önemli bir rol oynar. Analitlerin taşınma hızı, analitlerin kimyasal doğasına, sabit fazın (kolon) kimyasal yapısına ve de mobil fazın bileşimine bağlıdır. Analitin kolondan çıkma süresine alıkonma zamanı (genelde RT ile gösterilir) denir. Alıkonma zamanı genelde analizdeki analitin karakterini belirlemede kullanılan önemli bir bilgidir.
Çok çeşitli HPLC kolonları piyasada mevcuttur. Bir HPLC kolonun niteliğini bir takım özellikleri belirler ve bu özelliklerden en önemlisi sabit fazının kimyasal yapısı, bir başka deyişle bu sabit fazı oluşturan partiküllerin türü ve büyüklüğüdür. HPLC kolonlarında partiküllerin boyutunun küçük olması kolondan gelen geri basıncı (ing. backpressure) artırır,. Kısacası partikül boyutunun düşmesi, geri basıncı da doğru orantılı olarak artırır. Tipik olarak, kolondaki küçük boyutlu partiküller, yüzey alanını artırdığından beraberinde analitlerin daha etkili bir biçimde ayrılışmasını (resolusyon) sağlar. Resolüsyon, kromatografide elde edilen ardışık analit piklerinin ayrışma derecesi olarak tanımlanabilir. Ek olarak, bu sorbent partikülleri hidrofobik veya polar olabilir.
Mobil fazlar incelendiğinde, genel olarak su ve suyla çözünebilen organik bir solvent kullanılır. Bu solventlerden de en yaygın olarak kullanılanları metanol ve asetonitrildir. Bazı HPLC teknikleri içinde suyun bulunnmadığı mobil fazlar da kullanılır (Normal faz sıvı kormatografisi). Genellikle mobil fazın içerisinde formik asit, fosforik asit veya trifloroasetik asit gibi veya bazı tuzlar da eklenir. Bu eklenen kimyasallar kromatografi operasyonuna, yani analitlerin ayrışmasına yardımcı olur. Mobil fazın bileşimi analiz sırasınca sabit tutulabilir ve bu işleme isokratik elüsyon denir. Mobil faz bileşiminin zamana bağlı değiştiği analizlere de gradyan elüsyon denir. İsokratik analizler genellikle kimyasal özellikleri tamamen farklı veya sabit faza farklı derecelerde ilgi gösteren molekülerin bulunduğu karışımları ayırmada kullanılır. Gradiyent analizlerde analitlerden elüsyon kuvveti az olandan çok olana doğru bir moleküler ayrışma gözlenir. Bir başka deyişle, analitler sabit faza yüksek afinite gösterdiklerinde, sabit fazla daha çok etkileşirler ve kolon içerisinde daha çok zaman geçirerek detektöre daha geç ulaşırlar, fakat bazı analitler de sabit fazla fazla etkileşmez ve daha hızlı bir biçimde detektöre ulaşırlar. Bu farklılık, farklı zamanlarda elde edilen sinyallere neden olur ve bu ilgili analitlerin kromatografik pikleri, kromatogramda farklı zamanlarda çıkar. Tipik bir ters faz kromatografi gradyan analizi %5 asetonitrile ile başlar ve doğrusal olarak 5-25 dakika içerisinde, %95'e kadar çıkar. Mobil fazın bileşimin değsımediği periyotlar da analiz profilinde yer alabilir. Örneğin, mobil faz 1-3 dakika boyunca %5 asetonitril seviyesinde kalabilir ve daha sonra doğrusal olarak ilerleyen dakikalarda %95'e çıkabilir.
Bu hususta, mobil fazın bileşiminin belirlenmesinde, mobil faz analit etkileşimi ve analit sabit faz (kolon) etkileşimleri göz önünde bulundurulur. Örneğin ters faz HPLC'de hidrofobik etkileşimler görülür. Analitlerin mobil faz ve sabit faza olan ilgisi (affinıtiesi) ve farklı analitlerin farklı derecelerde olan etkileşimleri sonucunda kromatografik ayrışma gerçekleşir. Bir başka deyişle, analitlerin sabit faz ve mobil fazdaki partisyonu kromatografik ayrışmada önemli rol oynar. Sıvı-sıvı ekstraksiyonunda da benzer prensip görülse de HPLC de bu işlem süreklidir, ekstraksiyonda ise adımlar şeklindedir. HPLC örneğinde, su/asetonitril mobil fazi kullanıldığında, hidrofobisitesi yüksek olan analitler kolondan daha geç ayrılacaklardır. Bunun sebebi ise, gradiyen bir metod kullanıldığı var sayıldığında, mobil fazdaki asetonitril miktarı zamanla artacaktır ve sonucunda da analitler kolonla daha çok etkileşeceklerdir. Mobil faz bileşenlerinin belirlenmesi, eklenmesi gereken tuz ve asitlerin seçilmesi, kolon seçimi, gradiyen zamanlarının belirlenmesi analizlerden önce dikkatle belirlenir ve bu aşamaya metod geliştirme denir.