Karbonik anhidraz
Karbonik Anhidraz Araştırmalarında Uygulanan Yöntemler > Karbonik Anhidraz İzoenzimlerinin Kromatografik Ayrılması

Karbonik anhidrazın memeli türlerinden izolasyonunda kaynak ve izoenzime göre farklı yöntem uygulanmaktadır. Üzerinde en fazla çalışma yapılmış olan izoenzimler sitoplazmik karbonik anhidraz I ve karbonik anhidraz II dir. Bu iki izoenzimin en kolay elde edilebilir kaynağı eritrositlerdir. Yapılan çalışmalarda eritrositlerde fazla miktarda bulunan hemoglobin, kloroform – etanol çöktürmesi, amonyum sülfat çöktürmesi ya da ısı ile denatürasyon yöntemleriyle uzaklaştırılabilmiştir. Bunların yanında üç-faz ayrışma yöntemide bir alternatif olmuştur. Bu yöntemde amonyum sülfat gibi bir tuz tert-butanol – su – protein karışımına ilave edilmiş ve böylece hemoglobin ve miyoglobin denatüre edilerek ayrılabilmiştir. Daha sonra amonyum sülfatın %90 doygunluğa ulaştırılmasıyla kalan proteinler jelimsi orta fazda toplanmıştır. Bu fazda karbonik anhidrazın yanında katalaz ve süperoksit dismütaz da bulunur.
Karbonik anhidraz I ve II'nin izolasyonunda en çok kullanılan yöntem afinite kromatografisidir. İlk defa 1970 lerde uygulanmaya başlamış olan bu yöntemle sonraları karbonik anhidraz I ve II izoenzimleri başarılı bir şekilde birbirinden ayrılabilmiştir. Bu yöntemlerde destek maddesi olan jele enzimin güçlü bir şekilde bağlandığı inhibitörleri takılmakta ve enzimin bu moleküller aracılığıyla kolonda tutulması sağlanmaktadır. Bu anlamda en çok kullanılan inhibitör de sülfanilamiddir.
Mutasyon teknikleriyle hazırlanan inaktif karbonik anhidraz II'nin izolasyonunda inhibitörlerle bağlanmanın olmadığı durumlarda alternatif yöntemler uygulanmıştır. Önce %40 doygunlukta amonyum sülfat ile diğer safsızlıklar uzaklaştırılmış sonra %90 amonyum sülfat doygunluğunda insan karbonik anhidraz II çöktürülmüştür. Diyalizi takiben DEAE-Sephacel kolonundan geçirme ve sonra S-Sepharose ile kromatografi uygulanarak enzim %98 saflıkta elde edilmiştir. Bir grup araştırmacı da mutant enzim izolasyonunda S-Sepharose ile anyon değişimini, sonra fenil-Sepharose ile hidrofobik etkileşim kromatografisini ve son olarak da Sephacryl S-100 ile jel filtrasyonunu kullanmışlardır. 
Karbonik anhidraz III'ün afinite kromatografisinde kullanılan inhibitörlere bağlanmasının çok zayıf olmasından dolayı bu izoenzim önceleri farklı yöntemlerle izole edilmiştir. Sonraları bu izoenzimin p-aminobenzen sülfonamide yeteri derecede bağlandığı gösterilmiş ve bu inhibitör kullanılarak enzim afinite kromatografisi ile izole edilebilmiştir. Benzer şekilde membrana bağlı bir izoform olan karbonik anhidraz IV'te p-aminobenzen sülfonamid afinite kromatografisiyle izole edilmiştir.
Mitokondriyel bir enzim olan karbonik anhidraz V izolasyonunda, mitokondrilerin bütün sitosolik bileşenlerden ayrılmasını takiben dondurucuda bekletilip santrifüjlenmesi ve elde edilen tamamen çözünür durumdaki mitokondriyel matriks, p-aminobenzen sülfonamidin CM Biogel A'ya takılmasıyla hazırlanmış jelin bulunduğu kolondan geçirilmiştir. Daha sonra enzim sodyum azidür (NaN) ile elue edilerek başarılı bir şekilde izole edilmiştir.
Salgılanan bir enzim olan karbonik anhidraz VI, inhibitörlerle karbonik anhidraz II'ye benzer şekilde etkileşmektedir ve bu nedenle afinite kromatografisi izolasyon amacıyla rahatlıkla kullanılabilmiştir.
Memeli izoenzimlerinin haricinde diğer karbonik anhidraz izoformları da özellikle p-aminobenzen sülfonamid kullanılarak afinite kromatografisiyle izole edilebilmektedir. Bu izoenzimlerin izolasyonunda birçok farklı yöntem de uygulanmıştır. Bunlar arasında Sephadex G-75 ile jel-permeasyon kromatografisi, CM-selüloz katyon değişimi kromatografisi, DEAE Sephadex A-50 anyon değişimi kromatografisi, DEAE-selüloz kromatografisi, DEAE-hidroksilapatit kromatografisi sayılabilir. Bu yöntemler tek başlarına değil genellikle birkaç tanesi ardışık olarak uygulanmıştır. Bu yöntemlerin uygulandığı çalışmalarda istenmeyen proteinlerden kurtulmak için birinci basamakta etanol-kloroform çöktürmesi sıklıkla uygulanmaktadır.