Polihistidin etiketi
Uygulamalar > Protein saflaştırma

Polihistidin-etiketleri sıklıkla E. Coli' de ve diğer prokaryotik anlatım sistemlerinde, anlatımı gerçekleştirilmiş polihistidin-etiketli rekombinant proteinlerin afinite saflaştırması için kullanılır. Bakteri hücreleri santrifüj edilir ve elde edilen hücre peletleri ya fiziksel ya da detejanlar ve enzimler(lizozim gibi) veya bunların kombinasyonu ile lize edilir. Bu adımda lizat rekombinant proteinlerin yanında aynı zamanda bakteriyal hosttan gelen proteinleri de içerir. Karışım divalent nikel veya kobalt iyonlarının bağlı olarak bulunduğu afinite rezininde bekletilir. Afinite rezininin farklı çeşitleri ticari olarak mevcuttur. Nikel ve kobalt benzer özelliklere sahiptir, ikisi de 4. periyod geçiş metallerine komşudur. Rezin genelde sefaroz/agarozdur. Rezin bir şelator (Nikel için iminodiasetik asit (Ni-IDA) ve nitrilotriasetik asit (Ni-NTA), kobalt için ise karboksilmetilaspartat (Co-CMA)) ile işlev kazanır. Şelator polihistidin-etikete mikromolar afinite ile bağlanır. Ardından nikel veya kobalta sipesifik olarak bağlanmamış olan proteinleri kaldırmak amaçlı rezin fosfat tamponu yıkanır. Nikel temelli yöntemlerde, yıkamanın verimini artırmak amacı ile tampona 20 mM imidazol (genelde 150-300 mM imidazolde proteinler elenmiş olur) ilave edilir. Genelde nikel kullanan rezinler daha yüksek bağlanma kapasitesine sahip olurken kobalt temelli rezinler yüksek saflık vadeder. Proteinin saflığı ve miktarı SDS-PAGE veya Western blot ile öğrenilebilir. [kaynak belirtilmeli]
Polihistidin etiketi kullanılarak yapılan afinite saflaştırmaları, rekombinant protein prokaryot bir organizmadan elde edilmiş ise, saf protein eldesi ile sonuçlanır. Sonraki adımdaki yapılacak uygulamaya(protein ilişkilerinin çalışılması için protein komplekslerinin izolasyonu, mantar veya diğer yüksek ökaryot organizmalardan yapılacak saflaştırmalar gibi) göre değişmekle beraber -saflığı yükseltmek amaçlı iki etiket kullanan- ardışık afinite saflaştırmaya ihtiyaç duyulabilir. Alternatif olarak, nikel iyonları yerine kobalt iyonları sabitlenmiş rezini kullanan tek-adımda saflaştırma yöntemi saflıkta önemli ölçüde yükselme sağlarken his-etiketli proteinlerin elenmesinde kullanılan imidazol miktarını da düşürür.
Polihistidin-etiketleme çalışma prensibi gereğince proteinlere sadece ve sadece birincil yapısına bağlı olarak etkir. Bundan dolayı denature edici koşullarda bulunan rekombinant proteinlerin saflaştırılması için bir seçenek haline gelir. Örneğin, yoğun bir biçimde bir içerme kesinde eksprese olan ve çözünür olarak elde edilemeyen rekombinant proteinler bile üre veya guanidin hidroklorür ile denaturasyon ile saflaştırılabilir. Bunun gibi denature edici durumlarda histidin bağlanması imidazol bağlanması yerine pH kullanılarak titre edilir. Yüksek pH' da histidin nikel veya kobalta bağlanabilirken düşük pH' da (kobalt için ~6, nikel ~4) bağlanma gerçekleşmeş çünkü histidin protone olur. GST saflaştırması ve antikor saflaştırılmasının uygulanması için proteinin katlanmış halde olmasını gerekir. Diğer yandan, His etiketi diğer etiketlere göre toplanmaya ve çözünürlüğünü kaybetmeye daha çok eğilimlidir.
Polihistidin-etiket sütunun bazı proteinleri safsızlık olarak barındırır. Bu safsızlıklardan biri yaklaşık 25kDa ağırlığındaki FKBP-tipi peptidil prolil izomerazdır (SlyD). Sıklıkla, safsızlıklardan kurtulmak için ya ikinci bir kromatografik teknik kullanılır veya rekombinant proteinin anlatımı SlyD- yoksunu bir E.koli sujunda gerçekleştirilir. Başka bir çözüm ise kobalt rezinin SlyD' ye (E. coli) karşı afinitesinin daha düşük olması sebebi ile tercih edilmesidir, bazı durumlarda faydalı olduğu belirtilmiştir.