X ışını kristalografisi
Kristalleştirme

Kristalografinin saf olmayan ya da
düzensiz bir kristaldeki bozukluğu tanımlamada kullanılabilmesine rağmen,
kristalografi atomların karmaşık bir dizisinin yapısını çözmek için genellikle
yüksek düzenlilikte bir kristal gerektirir. Saf, düzenli kristaller bazen
metal, mineral ve başka makroskopik materyal örnekleri gibi doğal ya da
sentetik malzemelerden elde edilebilir. Bu tür kristallerin düzenliliği bazen
makromoleküler tavlama ve diğer yöntemlerle iyileştirilebilir. Bununla
birlikte, pek çok durumda, kırınımı-kaliteli bir kristal temini onun
atomik-çözünüm yapısını çözmede en büyük engeldir.
Küçük-molekül ve makromoleküler
kristalografi kırınımı-kaliteli kristaller üretmede kullanılması mümkün teknikler
çeşitliliğinde farklılık gösterirler. Küçük moleküller genellikle birkaç
derecelik konformasyon serbestliğine sahiptirler ve kimyasal buhar tortulaşması
ve yeniden kristalleştirme gibi geniş bir dizi yöntemle
kristalleştirilebilirler. Bunun aksine, mKromoleküller genellikle çok sayıda
serbestlik derecesine sahiptirler ve bunların kristalleşmesi sabit bir yapıyı
sürdürecek şekilde yürütülmelidir. Örneğin proteinler ve daha büyük RNA
molekülleri üçüncül yapıları açılmadıkça kristalleştirilemez, bundan
dolayı kristalleşme koşulları çeşitliliği moleküllerin içinde katlanmış halde
bulunduğu solüsyon koşulları ile sınırlıdır.
Protein kristalleri hemen hemen daima
solüsyonda büyütülür. En yaygın yaklaşım moleküllerinin erirliğini kademeli
olarak azaltmaktır; eğer bu çok hızlı yapılırsa moleküller solüsyonda çökelir,
kabın dibinde yararsız bir toz ya da amorf bir jel oluşturur. Solüsyonda
kristal büyütme iki adımla karakterize edilir: mikroskobik bir kristalitin
(muhtemelen yalnızca 100 molekülü olan) çekirdeklenmesi, ardından bu
kristalitin idealde kırınım kalitesinde bir kristale dönüşerek büyümesi.
Birinci adıma (çekirdeklenme) uygun olan solüsyon koşulları her zaman ikinci
adıma (sonraki büyüme) uygun koşullarla aynı olmaz. Kristalografiyi yapanın
amacı tek bir büyük kristalin gelişimine uygun solüsyon koşullarını
belirlemektir, çünkü büyük kristaller molekülün daha iyi çözünürlüğünü sunar.
Sonuç olarak, solüsyon birinci adıma (çekirdekleşme) değil ikinci adıma
(büyütme) uygun olmalıdır, böylece her damlacık başına bir büyük kristal
oluşur. Eğer çekirdekleşme koşulları çok fazla uygun olursa damlacıkta bir
büyük kristal yerine bir yığın küçük kristalit oluşacaktır; eğer çok az uygun
olursa herhangi bir kristal oluşmaz.
Çekirdekleşme ya da düzenli kristaller
büyütme için iyi koşulları kestirmek son derece zordur. Uygulamada, istenilen
koşullar eleme ile belirlenir; çok geniş bir molekül yığını hazırlanır ve geniş
bir kristalleştirme solüsyonu çeşitliliği test edilir. Başarılı olanı bulana
kadar genellikle yüzlerce, hatta binlerce solüsyon koşulu test edilir. Çeşitli
koşullar molekülün erirliğini azaltacak bir ya da daha fazla fiziksel
mekanizmayı kullanabilir; örneğin bazıları pH'ı değiştirebilir, bazıları
Hofmeister serilerinin tuzlarını ya da solüsyonun dielektrik sabitini azalyan
kimyasalları içerebilir ve bazıları da hala molekülü entropik etkilerle
solüsyonun dışına çıkaran polietilen glikol gibi büyük polimerler içerir.
Ayrıca, kristalleşmeyi destekleyen farklı ısıları denemek ya da solüsyonu aşırı doymuş hale getirmek için ısıyı kademeli olarak düşürmek de yaygındır. Bu
yöntemler kristalleştirmede yüksek molekül konsantrayonları kullandıklarından
hedef moleküllerden büyük miktarlarda gerektirirler. Böyle büyük miktarlarda
(miligramlar) kristalleştirme seviyesinde protein elde edilmesindeki zorluğa
bağlı olarak 100 nanolitre hacimde kesin kristalleştirme deneme damlaları
verebilen robotlar geliştirilmiştir. Bu, deney başına ell yapılan
kristalleştirme denemelerinden (1 mikrolitre) 10 kat daha az protein
kullanılması demektir.
Kristalleşmeyi engelleyen ya da bozan
çeşitli faktörler bilinmektedir. Büyüyen kristaller genellikle sabit bir ısıda
tutulur ve kristalleşmelerini bozabilecek şok ya da vibrasyonlardan korunur.
Moleküllerin ya da kristalleşme solüsyonlarının saf olmaması çoğu kez
kristalleşmeye engel olur. Moleküldeki konformasyon esnekliği entropiye bağlı
olarak kristalleşme ihtimalini azaltır. Ne gariptir ki, kendi kendilerine
sarmal halinde birleşmeye eğilimli olan moleküller çoğu kez kristal olarak
birleşme eğilimi göstermez. Kristaller ikizlenme tarafından tarafından da
bozulabilir; ikizlenme bir birim gözesinin eşit biçimde çoklu yönlere
yoğunlaşmasıyla oluşur; fakat hesaplama yöntemlerindeki son ilerlemeler bazı
ikizlenmiş kristallerin yapılarını çözmeyi sağlayabilir. Hedef molekülü
kristalleştirmede başarısızlığa uğrayan bir kristalografi uygulayıcısı
molekülün hafifçe değiştirilmiş bir versiyonuyla yeniden deneyebilir; moleküler
özelliklerde küçük değişiklikler bile kristalleşme davranışında büyük
farklılıklara yol açabilir.