คณะอัศวินบริบาล
อัศวินแห่งมอลตา

บทความหลัก: การล้อมมอลตา (ค.ศ. 1565)
หลังจากที่เร่ร่อนจากที่หนึ่งไปอีกที่หนึ่งอยู่ 7 ปีในยุโรป อัศวินก็ก่อตั้งใหม่ในปี ค.ศ. 1530 เมื่อสมเด็จพระเจ้าชาร์ลส์ที่ 5 แห่งสเปนในฐานะพระมหากษัตริย์แห่งซิซิลีก็พระราชทานมอลตาให้แก่คณะ พร้อมทั้งโกโซ (Gozo) และทริโปลี (Tripoli) เมืองท่างของแอฟริกาเหนือในการเป็นอาณาจักรเป็นการแลกเปลี่ยนกับเหยี่ยวมอลตาหนึ่งตัวต่อปีที่ต้องนำมามอบให้แก่อุปราชแห่งซิซิลี ผู้เป็นผู้แทนพระองค์ในวัน “All Souls Day” ของทุกปี (ข้อมูลนี้นำไปใช้เป็นโครงเรื่องของนวนิยายที่มีชื่อเสียงเรื่อง  “The Maltese Falcon” โดยดาชิลล์ แฮมเม็ทท์)
อัศวินบริบาลก็ยังคงต่อสู้กับฝ่ายมุสลิมอยู่ และโดยเฉพาะกับกลุ่มโจรสลัดบาร์บารี แม้ว่าจะมีกองเรือเพียงไม่กี่ลำแต่ก็ทำให้เป็นที่เคืองพระทัยของสุลต่านออตโตมัน ที่เห็นว่าอัศวินบริบาลสามารถไปหาที่มั่นใหม่ได้ ในปี ค.ศ. 1565 สุลต่านสุลัยมานจึงทรงส่งกองทัพจำนวน 40,000 คนมาล้อมอัศวิน 700 คนและทหารอีก 8,000 คนเพื่อจะกำจัดอัศวินออกจากมอลตา
ในช่วงแรกของการรุกราน สถานะการณ์ดูเหมือนจะซ้ำรอยกับที่โรดส์ที่ฝ่ายบริบาลเพลี่ยงพล้ำ เมืองต่าง ๆ เกือบทุกเมืองถูกทำลายและอัศวินครึ่งหนึ่งถูกสังหาร เมื่อวันที่ 18 สิงหาคม สถานะการณ์ของฝ่ายอัศวินก็ถึงจุดวิกฤติ ทหารถูกฆ่าตายไปเป็นจำนวนมากและอ่อนกำลังลงทุกวัน แต่เมื่อสภาสงครามเสนอให้ทิ้งอิลบอร์โก (Il Borgo) และเซ็งเกลีย (Senglea) และถอยไปยังป้อมเซนต์แอนเจโล (Fort St. Angelo) แกรนด์มาสเตอร์ ฌอง ปาริโซต์ เดอ ลา วาเลตต์ (Jean Parisot de la Valette) ปฏิเสธ
อุปราชแห่งซิซิลีก็ไม่ส่งกองหนุนมาช่วยซึ่งอาจจะเป็นเพราะพระราชโองการจากพระเจ้าฟิลลิปที่ 2 แห่งสเปนคลุมเครือที่ทำให้การตัดสินใจช่วยหรือไม่ช่วยตกอยู่ในความรับผิดชอบของอุปราช ถ้าตัดสินใจผิดก็หมายถึงการพ่ายแพ้และทำให้ซิซิลีและเนเปิลส์ตกอยู่ในอันตรายจากฝ่ายออตโตมัน ตัวอุปราชเองก็ทิ้งลูกชายไว้กับวาเลตต์บนเกาะ ฉะนั้นจึงไม่ใช่การตัดสินใจที่ง่ายนัก แต่ไม่ว่าจะด้วยสาเหตุใดอุปราชก็ลังเลในการส่งกองกำลังไปช่วยจนกระทั่งผลของการถูกโจมตีแทบจะอยู่ในมือของอัศวินที่ถูกละทิ้งอยู่บนเกาะ
เมื่อวันที่ 23 สิงหาคมก็มีการโจมตีครั้งใหญ่ครั้งสุดท้ายโดยผู้ที่มาล้อม สถานะการณ์คับขันจนแม้แต่ทหารผู้บาดเจ็บก็ต้องร่วมเข้าต่อสู้ป้องกันด้วย แต่การโจมตีของฝ่ายออตโตมันก็ไม่รุนแรงนักนอกจากที่ป้อมเซนต์เอลโม ซึ่งทำให้ป้อมต่าง ๆ ยังต่อต้านอยู่ได้ ทางฝ่ายอัศวินก็ซ่อมแซมกำแพงส่วนที่ถูกตีแตกทั้งกลางวันและกลางคืน  สำหรับฝ่ายออตโตมันการยึดมอลตาดูจะยากขึ้นทุกวัน กองกำลังที่พักอยู่ในที่แคบจำกัดก็ล้มป่วยและเสียชีวิตกันมากมายระหว่างช่วงฤดูร้อน อาวุธและอาหารก็เริ่มร่อยหรอลงและกำลังใจในการต่อสู้ของทางฝ่ายออตโตมันก็เริ่มลดถอยลงเพราะความพ่ายแพ้ในการพยายามโจมตีหลายครั้งที่ได้รับ นอกจากนั้นแล้วเมื่อวันที่ 23 มิถุนายนทางฝ่ายออตโตมันก็สูญเสียเทอร์กุต ไรส์ (Turgut Reis) ผู้เป็นแม่ทัพเรือผู้มีประสิทธิภาพซึ่งเป็นการสูญเสียครั้งใหญ่ แม่ทัพสองคนที่เหลืออยู่ ปิยาเล ปาชา (Piyale Pasha) และลาลา คารา มุสตาฟา ปาชา (Lala Kara Mustafa Pasha) เป็นผู้มีความเลินเล่อ ทั้งสองมีกองทัพเรือขนาดใหญ่ที่ใช้อย่างมีประสิทธิภาพเพียงครั้งเดียว, ขาดการติดต่อกับฝั่งอาฟริกา และไม่พยายามระวังการโจมตีจากแนวหลังโดยซิซิลี
เมื่อวันที่ 1 กันยายน ปิยาเลและลาลาก็พยายามเป็นครั้งสุดท้าย แต่กำลังขวัญของทหารฝ่ายออตโตมันก็อยู่ในสภาพที่ย่ำแย่ ซึ่งทำให้การโจมตีเป็นไปอย่างไม่เต็มใจเท่าใดนัก ทำให้อัศวินผู้ที่ถูกล้อมมีกำลังใจดีขึ้นและเริ่มมองเห็นทางที่จะได้รับชัยชนะ ทางฝ่ายออตโตมันมีความตกประหวั่นเมื่อได้ข่าวว่าทางซิซิลีส่งกำลังมาช่วยโดยหาทราบไม่ว่าเป็นเพียงกองกำลังเพียงกองเล็ก ๆ แต่ก็มีผลทำให้ละทิ้งการล้อมเมื่อวันที่ 8 กันยายน การล้อมมอลตาจึงเป็นชัยชนะครั้งสุดท้ายของอัศวินแห่งเซนต์จอห์น
เมื่อฝ่ายออตโตมันถอยทัพไปแล้วบริบาลก็เหลือกำลังคนอยู่เพียง  600 คนที่ถืออาวุธได้ การสันนิษฐานที่เชื่อถือได้กล่าวว่าฝ่ายออตโตมันตอนที่มีกำลังคนสูงสุดมีถึง 40,000 คนและเหลือ 15,000 คนกลับไปคอนสแตนติโนเปิล การล้อมเป็นภาพที่บันทึกไว้บนจิตรกรรมฝาผนังโดยมัตเตโอ เปเรซ ดาลเล็ชชิโอ (Matteo Perez d'Aleccio) ในท้องพระโรงเซนต์ไมเคิลและเซนต์จอร์จหรือที่เรียกว่าท้องพระโรงพระราชบัลลังก์ (Throne Room) ในวังของแกรนด์มาสเตอร์ในวาเล็ตตา ความเสียหายที่ได้รับจากการล้อมเมืองทำให้ต้องสร้างเมืองใหม่ - เมืองปัจจุบันวาเล็ตตาเพื่อเป็นอนุสรณ์แก่แกรนด์มาสเตอร์ผู้ต่อต้านการล้อมโดยไม่ยอมถอย
ในปี ค.ศ. 1607 แกรนด์มาสเตอร์บริบาลก็ได้รับฐานะเป็น “Reichsfürst” (เจ้าชายแห่งจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์ แม้ว่าดินแดนของบริบาลจะอยู่ทางใต้ของจักรวรรดิโรมันอันศักดิ์สิทธิ์) ในปี ค.ศ. 1630 แกรนด์มาสเตอร์ก็ได้รับแต่งตั้งให้มีฐานะทางศาสนาเท่าเทียมกับพระคาร์ดินัลที่ใช้คำนำหน้าที่เป็นเอกลักษณ์ว่า “His Most Eminent Highness” ที่แสดงถึงความสมฐานะในการเป็นเจ้าชายแห่งคริสตจักร (Prince of the Church)