血液脳関門
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サイズ選択性の認められる薬理学的な血液脳関門制御にはRNA干渉によるもの、タイトジャンクション蛋白質の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体やペプチドによるもの、細菌毒素断片によるもの、タイトジャンクション蛋白質を間接的に制御するペプチドや化学物質によるものなどが知られている。
前述のようにCambellらはマウスにクローディン5を標的とするsiRNAを全身投与し一時的にin vivoでクローディン5の発現を抑制して血液脳関門の透過性を上げることに成功している。この研究でクローディン5をノックダウンしたマウスの血液脳関門を分子量742程度の低分子は通過できたが分子量4400の物質は通過しなかった。クローディン5とオクルディンを標的とするsiRNAをマウスに共投与し、脳微小血管内皮細胞で両者をノックダウンすると約3～5kDa程度の分子が血液脳関門を通過する報告がある。このノックダウンによる低分子の透過亢進は3日程度持続し、1週間以内にバリアー機能が回復する。さらにクローディン5のノックダウンを繰り返しても重篤な副作用が認められなかった。クローディン5のノックアウトを行うと小分子の透過性のみ亢進するため、クローディン5の制御によって小分子の薬物輸送や水の透過性制御による脳浮腫の治療などが行える可能性がある。恒常的に1kDa以下の低分子が脳内に流入し続けると脳内環境が破綻し致命的な脳内炎症が生じることが示唆されている。脳微小血管内皮細胞のクローディン5の発現を抑制すると海馬でフィブリノーゲン（340kDa）の血管外漏出が増加すること、末梢で産生されたIL-6(21kDa)が脳実質へ分布することが報告されている。
膜蛋白質を標的とした創薬では、抗体などの細胞外領域に結合する分子が第一選択となる。しかしクローディンの細胞外領域に結合する抗体の開発は難渋した。ウエスタンブロット法や免疫染色で用いられる抗クローディン抗体の多くはC末端の細胞内領域配列由来と考えられている。そのためフローサイトメトリーや免疫細胞染色で使用する場合に固定と透過処理が必要である。細胞外領域に結合する抗体の開発に難渋した理由は2つ考えられている。ひとつはクローディンなど膜蛋白質を大量に生産する技術が未発達なことと、クローディンの細胞外領域の免疫原性が低いことと考えられている。モノクローナル抗体の開発には免疫やスクリーニング、機能解析のために良質な抗原蛋白質が大量に必要である。しかし複数回膜貫通蛋白質の生産や機能解析は一般的に困難である。複数回膜蛋白質の多くは複雑な構造をもち、シグナル伝達や物質輸送、形態形成など細胞にとって重要な役割を担っている。そのため、複数回膜貫通蛋白質を細胞で過剰発現させると正しい構造を取れず凝集することがあり、細胞が増殖や蛋白質合成自体を止めてしまうことがしばしば起こり、正しい構造と機能を保持した組み換え膜蛋白質分子を得るのは非常に困難である。クローディンの細胞外領域は非常に小さい上に種間の相同性が高く免疫原性が非常に低かった。
大阪大学大学院薬学研究科の岡田欣晃、近藤昌夫、愛媛大学プロテオサイエンスセンタープロテオ創薬科学部門の竹田浩之らの共同研究でクローディン5の細胞外領域に対する抗体を作成した。彼らはまずは愛媛大学のコムギ無細胞タンパク質合成系を用いてクローディン5の大量発現系を開発した。コムギ無細胞タンパク質合成系は翻訳活性の高いコムギ胚芽から抽出した翻訳機構に鋳型であるmRNA、基質であるアミノ酸、エネルギー源であるATPやGTPなどを加えることで試験管内で翻訳反応を行った。膜タンパク質を合成する際にはコムギ無細胞タンパク質合成系にリポソームを添加した。翻訳された膜タンパク質がフォールディングにより疎水的な膜貫通領域を形成すると、リポソーム脂質膜と相互作用し、膜に埋め込まれ、安定化する。この方法を用いてGPCRを大量発現させ抗体を作成したという報告もある。
クローディン5のmRNAはGC含量が局所的に80%を超え、mRNAが高次構造をとりやすく、この方法では十分な翻訳ができなかった。彼らはコドンを入れ替えることで、翻訳産物のアミノ酸配列を変えることなくクローディン5のmRNAのGC含量を50%前後に低下、平均化した。改変したmRNAとコムギ無細胞タンパク質合成系を用いて世界で初めてクローディン5の大量合成に成功した。免疫原性が低いため大量合成したクローディン5から細胞外領域認識抗体を作成することはできなかった。そのため彼らはクローディン5の配列をもとに新たな人工膜蛋白質を設計した。1つ目はヒトとマウスのクローディン5を融合させたキメラクローディン5であり、もうひとつがクローディン5の細胞外配列を両側に対称に配置したシンメトリッククローディン5である。このふたつの人工膜蛋白質をコムギ無細胞タンパク質合成系を用い合成し、それをマウスに免疫することでクローディン5の細胞外領域に対する抗体を作成した。さらにDNA免疫を用いて別のクローディン5の細胞外領域に対する抗体も作成した。
2つの方法を用いて作成されたクローディン5の細胞外領域に対する抗体は20種類以上に及んだ。彼らの作成した抗体は大まかにクローディン5のECL1のD68近辺を認識するものとECL2のS151近辺を認識するもの、結合部位不明なものの3つに分類された。
抗体以外にクローディン5の細胞外領域に結合するペプチドも知られている。C5C2と呼ばれるペプチドはマウスのクローディン5の細胞外領域に結合しガドリニウムの血液脳関門透過性を亢進させると報告されている。しかしペプチドのクローディン5選択性は乏しいと考えられる。
吸収促進薬であるカプリン酸ナトリウムなども過去には検討された。
ウェルシュ菌エンテロトキシンのC末端であるC-CPEはクローディン3とクローディン4に結合する。C-CPEとクローディンの複合体は細胞内に取り込まれて分解されると考えられている。クローディン5への親和性をもつC-CPE変異体も開発されている。クローディン5への親和性をもつC-CPEは血液脳関門を通過する薬物送達を可能にすると考えられている。
ウェルシュ菌のイオタ毒素由来のリコンビナント蛋白質angubindin-1はアンギュリン1とアンギュリン3に結合する。angubindin-1は血液脳関門を制御してアンチセンス核酸を中枢神経系に送達するという報告がある。
細菌毒素断片は細菌由来であり、さらに20～40kDaと大きく高い抗原性をもっている。臨床応用には分子サイズを小さくする必要があると考えられている。C-CPEとangubindin-1は吸収促進薬としても知られている。
キナーゼを介してタイトジャンクション蛋白質を制御するペプチドや化学物質がある。これらのモジュレーターはキナーゼを介して傍細胞経路を開く。この経路は非常に強力な血液脳関門透過性亢進作用をもつがクローディンファミリーやTAMPファミリーへの特異性が乏しい。そのため細胞骨格の収縮を招くおそれがある。具体的にはブラジキニン受容体、スフィンゴシン1リン酸受容体、アデノシン受容体を介するものなどが知られている。
アデノシン受容体のアゴニストを修飾したデンドリマーを用いることで血液脳関門に発言するGタンパク質共役型アデノシン受容体（A2A受容体）の活性化を介して密着結合が開口する方法が考案され、分子量45,000の高分子デキストランの脳への移行が増大すると報告されている。
| モジュレーター | 受容体 | キナーゼ |
| --- | --- | --- |
| RMP-7 | ブラジキニン受容体 | PKCα |
| AT-1002 | プロテインキナーゼ活性化受容体 | PKCα |
| NIBR-0213 | スフィンゴシン1リン酸受容体 | Rho-associated protein kinase (ROCK) |
| Lexiscan | アデノシン受容体 | Rho-associated protein kinase (ROCK) |
| NS1619 | カルシウム活性化カリウムチャネル | Rho-associated protein kinase (ROCK) |
| グルタミン酸 | NMDA受容体 | Rho-associated protein kinase (ROCK) |
| Gintonin | リゾホスファジン酸受容体 | Rho-associated protein kinase (ROCK) |