複製起点
真核生物

真核生物における複製起点の構成や指定、そしてその活性化は細菌や古細菌のものよりもはるかに複雑であり、原核生物で確立された複製開始のパラダイムとは大きく異なっている。真核生物細胞のゲノムサイズは大きく（出芽酵母Saccharomyces cerevisiaeでは12 Mbp、ヒトでは3 Gbp）、各細胞周期の間に全ての染色体のDNA複製を完了するためには数百か所（出芽酵母）から数万か所（ヒト）の複製起点からDNA複製を開始する必要がある。出芽酵母と関連するサッカロミケス亜門Saccharomycotinaの種を除いて、真核生物の複製起点にはコンセンサス配列は存在しないが、それらの位置はDNAの局所的なトポロジー、構造的特徴、クロマチン環境などの文脈からの指示の影響を受ける。一方で、真核生物の複製起点の機能は細胞周期のM期終盤からG1期にかけてDNAへ複製ヘリカーゼをロードする、保存されたイニシエータータンパク質にやはり依存しており、この過程は複製起点のライセンス化（licensing）と呼ばれる。細菌のものとは異なり、真核生物の複製ヘリカーゼは不活性な二重六量体型として複製起点の二本鎖DNAへロードされ、それらの一部のみ（哺乳類細胞では10%から20％）がS期に活性化される。この過程は複製起点の発火（firing）と呼ばれる。そのため、真核生物では活性型の複製起点は、可能性のある起点全てに印をつけるライセンス化と、複製装置の組み立とDNA合成の開始が可能となる起点を選択する発火という、少なくとも2つの異なるレベルで決定される。ライセンス化された余剰の複製起点はバックアップとして機能し、近接する複製フォークの進行が遅くなったり停止したりした場合に活性化され、細胞が複製ストレスに遭遇した場合でもDNA複製が完了されるよう保証している。ストレスが存在しない場合には、余剰の複製起点の発火は複製と関係したシグナル伝達機構によって抑制される。このように、余剰のライセンス化複製起点の存在と、細胞周期における複製起点のライセンス化と発火の厳密な制御は、複製の過不足を防ぎ、真核生物のゲノムの完全性を維持するための2つの重要な戦略となっている。
出芽酵母での初期の研究では、真核生物の複製起点も原核生物のもののようにDNA配列特異的に認識されている可能性が示されていた。出芽酵母では、レプリケーターの探索により、染色体外DNAでの効率的なDNA複製開始を補助するARS（autonomously replicating sequences）が同定された。こうしたARS領域は約100–200 bpの長さで、分節化された構成をしており、A、B1、B2、そして時によりB3と呼ばれるエレメントがともに複製起点の機能に必要不可欠な役割を果たしている。Aエレメントは保存された11 bpのACS（ARS consensus sequence）を含み、B1エレメントとともに、真核生物の複製イニシエーターであるヘテロ六量体型複製起点認識複合体（ORC）の主結合部位を構成する。ORCは、5つのサブユニットが保存されたAAA+ ATPアーゼとウィングドヘリックスフォールドを持ち、DNAを囲む五量体リングへと組み立てられると考えられている。出芽酵母のORCでは、ATPアーゼドメインとウィングドヘリックスドメインのDNA結合エレメントは、ORCサブユニットの一部に存在する塩基性パッチ領域とともに、ORCリングの中心部のポアに配置され、ATP依存的にACSの配列特異的認識を補助する。対照的に、B2エレメントとB3エレメントの役割は明確にはされていない。B2領域の配列はACSと類似しており、特定の条件下で2番目のORC結合部位となるか、または複製ヘリカーゼのコアの結合部位となることが示唆されている。B3エレメントは転写因子Abf1をリクルートするが、B3は出芽酵母の全ての複製起点に存在するわけではなく、Abf1の結合も複製起点の機能に必要不可欠ではないようである。
出芽酵母やその近縁種以外の真核生物における複製起点の認識は、複製起点の保存されたDNAエレメントの配列特異的な読み出しという形では行われていない。より一般的に真核生物種における染色体のレプリケーター配列を単離する試みは、遺伝学的手法とイニシエーターの結合や複製開始部位のゲノムワイドマッピングによる手法のいずれにおいても、複製起点の明確なコンセンサス配列の同定には成功していない。そのため、出芽酵母における配列特異的なDNA-イニシエーター間相互作用は、真核生物における複製起点の特定の典型的な様式ではなく、この系の特殊な様式を表しているものであると考えられる。しかしながら、DNA複製は非連続的なの特定の部位から開始され、それらは真核生物のゲノム上にランダムに分布しているわけではないことから、染色体上の複製起点の位置を決定する代替的手法が存在すると考えられる。こうした機構は、DNAのアクセス性、ヌクレオチド配列の偏り（ATに富む配列とCpGアイランドの双方が複製起点と関連付けられている）、ヌクレオソームの配置、エピジェネティックな特徴、DNAのトポロジー、DNAの構造的特徴（G4モチーフなど）の間の複雑な連携や、調節タンパク質や転写による干渉などが関与する。また、複製起点の性質は生物種間や種内の複製起点間でも異なるだけでなく、一部は発生や細胞分化の過程でも変化する。ショウジョウバエDrosophilaの毛包細胞のchorion遺伝子座は、複製開始の空間的かつ発生過程での制御の確立された例である。この領域は卵形成（英語版）の特定の段階でDNA複製依存的な遺伝子増幅が行われる。その過程は複製起点の適切な時期かつ特異的な活性化に依存しており、複製起点特異的なシスエレメントと、Myb（英語版）複合体、E2F1（英語版）、E2F2（英語版）などいくつかのタンパク質因子によって調節される。このように、後生動物の複製起点は多くの要素の組み合わせによって指定され、多くの因子によって調節されていることから、より一般的に真核生物全体における複製開始部位の位置を決定する、統一的な特徴を同定することは困難であった。
複製開始や複製起点の認識を促進するため、さまざまな種のORCは特殊な付属的ドメインを進化させている。これらは染色体上の複製起点、またはより一般的に染色体へのイニシエーターの標的化を促進すると考えられている。例えば、分裂酵母Schizosaccaromyces pombeのORCのOrc4サブユニットにはいくつかのATフック（英語版）が存在し、ATに富むDNAに選択的に結合する。一方、後生動物のORCでは、Orc6のTFIIB様ドメインが同様の機能を果たすと考えられている。また、後生動物のOrc1にはBAHドメイン（英語版）（bromo-adjacent homology domain）を持ち、H4K20me2修飾を持つヌクレオソームと相互作用する。特に哺乳類細胞では、H4K20のメチル化は効率的な複製開始に必要であることが報告されており、Orc1のBAHドメインはORCの染色体への結合を促進するほか、エプスタイン-バールウイルスの複製起点依存的な複製も促進する。少なくとも一部の後生動物において、これらの観察結果が機械的に関連しているかどうかは興味深い点であるが、さらなる研究が必要である。特定のDNAやエピジェネティックな特徴の認識に加えて、ORCは直接的または間接的にいくつかのパートナータンパク質（LRWD1、PHIP（DCAF14）、HMGA1aなど）と結合し、イニシエーターのリクルートを促進していると考えられる。ショウジョウバエのORCは出芽酵母と同様にDNAを屈曲させること、またこの複合体のDNAへの結合は負の超らせんによって強化されることが報告されており、DNAの形状や展性が後生動物のゲノムへのORCの結合部位に影響を与えている可能性が示唆される。ORCのDNA結合領域が、出芽酵母のような特定のDNA配列ではなく、後生動物のDNA二本鎖の構造的性質の読み出しをどのように補助しているのかについての分子的な理解には、DNAに結合した後生動物のイニシエーターの高分解能の構造情報が必要である。同様に、さまざまなエピジェネティックな因子が後生動物のイニシエーターのリクルートに寄与しているかどうか、またどのように寄与しているかについても、十分に理解されておらず、より詳細に記載されるべき重要な問題である。
ORCとそのコファクターであるCdc6（英語版）とCdt1は複製起点にリクルートされると、Mcm2-7複合体のDNAへの配置を駆動する。古細菌の複製ヘリカーゼのコアと同様に、Mcm2-7はhead-to-head型の二重六量体として、複製起点のライセンス化のためにDNAへロードされる。S期には、ライセンス化複製起点の一部でDbf4依存性キナーゼ（DDK）とサイクリン依存性キナーゼ（CDK）がMcm2-7のいくつかのサブユニットと他の開始因子をリン酸化し、ヘリカーゼのコアクチベーターであるCdc45（英語版）とGINSのリクルート、DNAの融解、そして最終的には双方向的なレプリソームの組み立てを促進する。酵母と後生動物の双方において、複製起点はヌクレオソームが無いか枯渇した状態であり、この性質はMcm2-7のローディングに重要である。このことは、複製起点のクロマチン状態はイニシエーターのリクルートだけでなく、ヘリカーゼのローディングも調節することを示している。クロマチンがpremissiveな状態にあることは複製起点の活性化に重要であり、複製起点の効率と発火の時期の双方の調節と関係していることが示唆されている。ユークロマチンの複製起点は一般的に活性型のクロマチン標識を含んでおり、早期に複製され、そして一般的に抑制型の標識によって特徴づけられ、より後の時点で複製されるヘテロクロマチンの複製起点よりも高効率である。いくつかのクロマチンリモデリング因子やクロマチン修飾酵素が複製起点や特定の開始因子に結合することが知られているが、これらの活性がさまざまな複製開始イベントにどのように影響を与えているのかはほとんど明らかにされていない。また哺乳類細胞では、シスに作用するECRE（early replication control element）と呼ばれる配列が複製のタイミングの調節を補助し、ゲノムの三次元的構造に影響を与えていることが近年同定された。ゲノムの三次元的な組織化、局所的および高次のクロマチン構造と複製開始の間の複雑な相互作用を調整する分子的および生化学的な機構の理解は、今後の研究の興味深い点である。
後生動物の複製起点は多くの場合プロモーター領域と共局在していることがショウジョウバエや哺乳類の細胞で観察されており、また複製と転写を担う分子装置間の衝突はDNA損傷をもたらす場合があるため、転写と複製を適切に調整することはゲノムの安定性の維持に重要であると示唆される。また近年の研究では、染色体へのMcm2-7のローディングの阻害またはロードされたMcm2-7の移動のいずれかの形で、転写が複製起点の位置に影響を与える、より直接的な役割が指摘されている。配列非依存的な（しかし必ずしもランダムではない）イニシエーターのDNAへの結合は、ヘリカーゼのローディング部位を柔軟に指定することを可能にする。また、転写による干渉やライセンス化された複製起点の活性化効率のばらつきとともに、複製起点の位置の決定や、発生や細胞運命の転換時のDNA複製と転写プログラムの共調節に寄与していると考えられる。分裂酵母の開始イベントの計算機モデリングの結果や、後生動物における細胞種特異的かつ発生過程で調節される起点の同定は、この考えと符合している。1つの集団内のさまざまな細胞間では複製起点の選択に大きな柔軟性が存在するが、複製起点の利用の不均一性をもたらす分子機構はまだ明確になっていない。後生動物の系において1細胞での複製起点のマッピングを行い、これらの開始イベントと1細胞での遺伝子発現やクロマチン状態とを関連付けることは、複製起点の選択が純粋に確率的なものなのか、それとも明確な方法で制御されているのかを明らかにする上で重要である。