Che Guevara
Guatemala, Árbenz, dan United Fruit

Artikel utama: Kudeta Guatemala 1954
Pada tanggal 7 Juli 1953, Guevara kembali melakukan perjalanan, kali ini ke Bolivia, Peru, Ekuador, Panama, Kosta Rika, Nicaragua, Honduras, dan El Salvador. Pada tanggal 10 Desember 1953, sebelum berangkat ke Guatemala, Guevara mengirimkan kabar dari San José, Kosta Rika, kepada bibinya, Beatriz. Dalam surat tersebut, Guevara menjelaskan soal perjalanannya ke daerah-daerah operasi United Fruit Company, sebuah perjalanan yang kelak akan membuatnya sangat berkeyakinan bahwa sistem kapitalisme perusahaan tersebut adalah sistem yang buruk. Kebencian ini bersifat agresif seperti yang sebelumnya pernah ia luapkan untuk menakut-nakuti kerabat-kerabatnya yang lebih konservatif, dan pada akhirnya Guevara pun bersumpah di atas gambar almarhum Josef Stalin bahwa ia tidak akan berhenti sampai "gurita-gurita tersebut telah dimusnahkan". Pada akhir bulan tersebut, Guevara tiba di Guatemala yang dipimpin oleh Jacobo Árbenz Guzmán, seorang presiden yang terpilih secara demokratis dan mencoba mengakhiri sistem latifundia. Untuk mewujudkan hal tersebut, Presiden Árbenz mencanangkan program reformasi lahan besar-besaran, sehingga semua bagian lahan yang belum digarap disita oleh pemerintah dan diberikan kepada para petani tak berlahan. Pemilik lahan terbesar dan salah satu yang paling terkenal dampak reformasi tersebut adalah United Fruit Company, dan pemerintahan Árbenz sendiri telah menyita lebih dari 225.000 ekar (91.054 ha) lahan yang belum digarap dari perusahaan tersebut. Guevara merasa puas dengan kebijakan ini, dan ia memutuskan untuk menetap di Guatemala untuk "menyempurnakan diri dan menyelesaikan apa yang diperlukan untuk menjadi seorang pejuang revolusi yang sesungguhnya."
Di Kota Guatemala, Guevara bertemu dengan Hilda Gadea Acosta, seorang ekonom Peru yang memiliki hubungan politik yang kuat karena ia adalah anggota Alianza Popular Revolucionaria Americana (APRA, Aliansi Revolusioner Populer Amerika) yang berhaluan kiri. Acosta memperkenalkan Guevara dengan sejumlah pejabat tingkat tinggi di pemerintahan Arbenz. Guevara kemudian menjalin hubungan dengan kelompok pengasingan Kuba yang memiliki keterkaitan dengan Fidel Castro melalui serangan terhadap barak-barak Moncada di Santiago de Cuba pada tanggal 26 Juli 1953. Pada masanya di Guatemala, Guevara memperoleh julukan yang melekat dengan namanya, karena ia sering menggunakan silabel pengisi khas Argentina, che (sebuah penanda diskursus serba guna, seperti pengucapan "eh" dalam bahasa Inggris Kanada). Pada masa ini, Guevara juga dibantu oleh tokoh-tokoh Amerika Tengah lainnya yang berada di pengasingan, seperti Helena Leiva de Holst yang menyediakan makanan dan tempat bernaung. Kepada Guevara, Helena juga membahas perjalanannya untuk mempelajari Marxisme di Rusia dan Tiongkok, dan Guevara sendiri mempersembahkan sebuah puisi untuk Helena yang berjudul "Invitación al camino".
Pada Mei 1954, pemerintahan Komunis Cekoslowakia mengirimkan persenjataan infantri dan artileri ringan buatan kepada pemerintahan Arbenz, dan persenjataan-persenjataan tersebut kemudian tiba di Puerto Barrios. Pemerintah Amerika Serikat (yang sudah menugaskan CIA untuk melancarkan Operasi PBSUCCESS untuk melengserkan Arbenz) menanggapi hal tersebut dengan membanjiri Guatemala dengan propaganda anti-Arbenz melalui radio serta selebaran-selebaran yang dijatuhkan dari udara, dan mereka juga melakukan mengeboman dengan menggunakan pesawat. Selain itu, Amerika Serikat mendukung pasukan dari luar negeri (terdiri dari ratusan orang-orang Guatemala di pengasingan dan tentara bayaran) yang dipimpin oleh Castillo Armas untuk menjatuhkan pemerintahan Arbenz. Akhirnya, pada tanggal 27 Juni, Arbenz memutuskan untuk mengundurkan diri. Maka dari itu, Armas dan pasukannya yang didukung oleh CIA dapat memasuki Kota Guatemala dan mendirikan sebuah junta militer; junta tersebut lalu memilih Armas sebagai presiden pada tanggal 7 Juli. Rezim Armas kemudian mengukuhkan kekuasaan dengan memenjarakan dan menghukum mati orang-orang yang terduga komunis, dan pada saat yang sama juga menghancurkan serikat-serikat buruh dan membatalkan reformasi lahan yang telah dicanangkan oleh Arbenz.
Guevara sendiri mendukung Arbenz dan bergabung dengan milisi bersenjata yang dibentuk oleh kelompok Pemuda Komunis, tetapi ia merasa frustrasi karena kelompok tersebut tidak mengambil tindakan, sehingga ia kembali melakukan tugas-tugas medis. Seusai kudeta, ia kembali menjadi sukarelawan tempur, tetapi tidak lama sesudahnya Arbenz mengungsi ke Kedutaan Besar Meksiko dan meminta kepada para pendukung asingnya untuk meninggalkan Guatemala. Ujaran Guevara untuk tetap melawan diendus oleh para pendukung kudeta, dan nyawa Guevara pun diincar. Setelah Hilda Gadea ditangkap, Guevara berlindung di konsulat Argentina, dan ia bertahan di situ sampai ia diperbolehkan lewat beberapa minggu kemudian dan lalu pergi ke Meksiko.
Pelengseran rezim Arbenz dan pendirian kediktatoran sayap kanan di Guatemala semakin mengukuhkan pandangan Guevara bahwa Amerika Serikat adalah kekuatan imperialis yang harus dilawan, dan bahwa Amerika Serikat menentang dan berupaya menghancurkan pemerintahan manapun yang mencoba mengurangi jurang antara yang kaya dan miskin, yang merupakan masalah yang mendalam di Amerika Latin dan negara-negara berkembang lainnya. Saat sedang membahas peristiwa kudeta ini, Guevara menyatakan bahwa "Demokrasi revolusioner Amerika Latin yang terakhir – yaitu demokrasi Jacobo Arbenz – gagal akibat agresi terencana yang berdarah dingin yang dilakukan oleh Amerika Serikat."
Kudeta ini juga memperkuat keyakinan Guevara bahwa Marxisme hanya dapat diwujudkan melalui perjuangan bersenjata dan dipertahankan oleh rakyat yang bersenjata. Gadea kemudian menulis bahwa "Guatemala-lah yang akhirnya membuatnya yakin akan perlunya perjuangan bersenjata dan pengambilan inisiatif dalam melawan imperialisme. Pada saat ia pergi, ia merasa yakin akan hal ini."