Lisa del Giocondo
Mona Lisa

Artikel utama: Mona Lisa
Seperti warga Firenze lainnya dalam hal keuangan, keluarga Francesco adalah pecinta dan pelindung benda seni. Putranya, Bartolommeo, meminta Antonio di Donnino Mazzieri untuk membuat sebuah lukisan di pemakaman keluarga di Basilica della Santissima Annunziata di Firenze. Andrea del Sarto melukis Madonna untuk anggota keluarganya yang lain. Francesco meminta Leonardo untuk melukis istrinya, dan Domenico Puligo untuk melukis Santo Fransiskus dari Assisi. Ia diperkirakan meminta lukisan Lisa untuk merayakan kelahiran Andrea dan pembelian rumah keluarga.
Mona Lisa mewakili sosok wanita mulia pada abad ke-15 dan awal abad ke-16. Lisa digambarkan sebagai istri yang setia melalui posisi tangan kanannya yang bertumpu di atas tangan kirinya. Melalui karyanya, Leonardo juga melukiskan Lisa sebagai wanita modis dan mapan, yang mungkin lebih baik daripada sosok Lisa yang sebenarnya. Pakaian hitam dan cadar hitamnya dipengaruhi oleh mode Spanyol yang berkelas; warna hitam ini bukanlah ungkapan rasa duka atas kepergian putri pertamanya, sebagaimana yang dikemukakan oleh para pakar sebelumnya. Lukisan ini berukuran sangat besar; ukurannya sama dengan lukisan milik patron seni yang lebih kaya pada masa itu. Para pakar mengemukakan bahwa hal ini menandakan bentuk aspirasi sosial Fransesco dan Lisa.
Leonardo tidak memiliki sumber penghasilan selama musim semi 1503, yang antara lain disebabkan oleh ketertarikannya pada lukisan potret pribadi. Namun, pada akhir tahun tersebut, Leonardo harus menunda pengerjaan Mona Lisa setelah ia menerima pembayaran untuk memulai Pertempuran Anghiari, yang pembayarannya lebih tinggi dan ia dikontrak untuk menyelesaikannya pada Februari 1505. Pada tahun 1506, Leonardo masih menganggap lukisan Mona Lisa belum selesai. Ia tidak menerima bayaran untuk karyanya tersebut dan tidak mengirimkannya kepada kliennya, Francesco. Semasa hidupnya, Leonardo membawa Mona Lisa bepergian bersama dirinya, dan lukisan tersebut baru selesai beberapa tahun kemudian di Prancis, diperkirakan pada tahun 1516.
Judul pada lukisan tersebut bertahun 1550. Salah seorang kenalan anggota keluarga Francesco, Giorgio Vasari, menulis: "Leonardo membuat lukisan, untuk Francesco del Giocondo, lukisan Mona Lisa, istrinya" (bahasa Italia: Prese Lionardo a fare per Francesco del Giocondo il ritratto di mona Lisa sua moglie.). Judul lukisan tersebut dalam bahasa Italia (La Gioconda) dan Prancis (La Joconde) adalah nama pernikahan serta panggilan Lisa; dalam bahasa Indonesia, padanan katanya adalah "gembira" atau "yang berbahagia".
Spekulasi menyatakan bahwa nama Lisa setidaknya terdapat pada empat lukisan berbeda dengan identitas sekurang-kurangnya sepuluh orang yang berbeda pula. Pada akhir abad ke-20, lukisan ini menjadi ikon global yang telah digunakan pada lebih dari 300 lukisan lainnya dan dalam 2.000 iklan yang muncul satu buah setiap minggunya.
Pada tahun 2005, seorang ahli di perpustakaan Universitas Ruprecht Karl Heidelberg menemukan sebuah catatan dalam koleksi pustaka tersebut, yang menjelaskan bahwa subjek lukisan Leonardo adalah Lisa. Catatan tersebut ditulis oleh Agostino Vespucci pada tahun 1503, yang menyebut bahwa Leonardo sedang mengerjakan lukisan Lisa del Giocondo. Mona Lisa dimiliki oleh Prancis sejak abad ke-16 setelah François I membelinya seharga 4.000 keping emas, dan dengan demikian, lukisan ini menjadi milik rakyat Prancis setelah Revolusi Prancis. Saat ini, sekitar 6 juta orang mengunjungi Mona Lisa setiap tahun di Louvre, Paris, tempat lukisan tersebut menjadi koleksi nasional Prancis.