Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik
Deteksi virus > Koronavirus 2019

Organisasi Kesehatan Dunia menjadikan reaksi berantai polimerase transkripsi balik sebagai tes pilihan dalam pengujian sampel pernapasan. Sensitivitas yang bervariasi bergantung pada asal spesimen tersebut diambil. Penyebaran virus/tingkat positif dapat bervariasi antara kedua kasus dan selama perjalanan penyakit. Maka suatu tes negatif tunggal tidak mengeksklusi kemungkinan infeksi. Selain itu, Organisasi Kesehatan Dunia juga memberikan rekomendasi diagnosis infeksi SARS-CoV-2 menggunakan reaksi berantai polimerase transkripsi balik. Jumlah DNA komplemen SARS-CoV-2 dalam spesimen pasien dapat dihitung, karena deteksi menggunakan primer yang khusus menargetkan genom SARS-CoV-2.
Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik diterapkan pada pengujian sampel koronavirus. Metode untuk pengujian asam nukleat ini secara umum terbagi menjadi 2 tahapan, yaitu proses transkripsi balik dari RNA menjadi DNA komplemen. Selanjutnya dilakukan tahap amplifikasi DNA komplemen.Secara umum, area dari genom SARS-CoV-2 yang menjadi target amplifikasi adalah gen protein E, gen protein N dan gen RdRP yang terdapat pada area rangka baca terbuka ORF1ab. Konfirmasi hasilnya dapat diperoleh melalui sekuensing. Spesifisitas tes dapat ditingkatkan pada target berjumlah lebih dari satu. Identifikasi virus dapat dilakukan dalam spesimen dengan jumlah virus yang sedikit. Selama tahap awal atau akhir koronavirus, kurangnya jumlah virus dapat terjadi pada orang tanpa gejala. Hal ini juga dapat terjadi karena proses pengumpulan spesimen yang tidak tepat. Kemampuan reaksi dalam mendeteksi koronavirus juga dipengaruhi oleh jenis sampel yang digunakan.
Reaksi berantai polimerase transkripsi-balik mampu memeriksa banyak sampel sekaligus sehingga menyingkat waktu pengujian. Namun pemeriksaannya memerlukan teknisi profesional dengan kemampuan analisis data yang tepat. Selain itu, pengerjaan yang lebih rumit membutuhkan peralatan khusus. Kesalahan diagnostik dapat terjadi akibat kesalahan pengerjaan yang tidak sesuai dengan prosedur. Terjadinya kesalahan dapat dimulai sebelum proses analisa seperti identifikasi sampel dan pengambilan sampel yang tidak benar, kualitas spesimen yang buruk atau hanya mengandung sampel dengan jumlah yang sangat sedikit, kondisi pengiriman dan penyimpanan sampel yang tidak akurat, kontaminasi sampel, atau kesalahan pipeting selama persiapan sampel manual atau aliquot. Kesalahan juga dapat terjadi selama tahap analisa yang memungkinkan adanya hasil negatif palsu. Kesalahan ini dapat disebabkan oleh kontaminasi silang, pengujian di luar jendela diagnostik atau pada fase infeksi, ketidaksesuaian primer dan probe, penggabungan nukleotida yang salah, serta penempelan pada target non spesifik sebagai risiko rekombinasi aktif dan mutasi .
Karakteristik deteksi RNA koronavirus dengan reaksi berantai polimerase transkripsi-balik adalah sebagai berikut:
| Deteksi RNA |
| --- | --- |
Jenis deteksi: Antigen berupa RNA virus
Jenis sampel: Usap orofaring, usap nasofaring, sputum, cairan BAL
Batas kemapuan deteksi terendah: 0,5 salinan/μL
Durasi pengujian sampel: 2–3 jam
Daya guna alat pengujian: Deteksi sampel dalam jumlah besar
Standar minimal keahlian petugas: Memerlukan keahlian khusus dengan tingkat keterampilan tinggi
Kebutuhan peralatan dan ruangan: Memerlukan alat dan ruangan laboratorium khusus. Standar minimalnya yaitu BSL-2
Biaya peralatan dan pemeriksaan: Mahal
Risiko paparan virus ke petugas: Risiko tinggi
Uji SARS-CoV-2 dilakukan dengan beberapa metode reaksi yang dikembangkan oleh beberapa negara maju. Metode pertama dibuat oleh Center for Disease Control and Prevention. Metode ini dikembangkan di Amerika Serikat. Gen dalam sekuen N protein dan RdRP ditargetkan menggunakan campuran primer N1 dan N2  serta pasangan primer RP. Primer 2019-nCoV digunakan untuk kontrol positif. Applied Biosystems 7500 Fast Dx Real-Time PCR digunakan untuk amplifikasi DNA komplemen. Sedangkan analisis data menggunakan perangkat lunak SDS versi 1.4. Metode kedua dikembangkan oleh Charité Germany di Jerman. Tahapan analisisnya terbagi menjadi tiga. Pertama, tahap skrining menggunakan primer gen E. Tujuannya untuk mendeteksi semua jenis SARS. Tahpa kedua yaitu konfirmasi menggunakan primer gen RdRp dengan  dua probes yang berbeda dan dua macam primer. Sedangkan tahap terakhir disebut dengan tahap diskriminasi, karena mengunakan probe yang hanya bisa mendeteksi SARS-CoV-2. Metode ketiga dikembangkan di Institut Pasteur, Paris. Metode ini menargetkan gen RdRp dengan menggunakan primer dan probe. Primer E digunakan sebagai konfirmasi yang mengikuti protokol Charité. Universitas Hong Kong dan BGI Group di Beijing mengembangkan metode Chinese National Institute for Viral Disease Control and Prevention. Metode Altona Diagnostics digunakan di Hamburg, Jerman. Singapura membuat metode uji  SARS-CoV-2 di Agency for Science, Technology and Research dan MiRXES. Sedangkan di Berlin, uji SARS-CoV-2 dikembangkan oleh TIB Molbiol.